CN110022853B

CN110022853B - 蛋白质l-异天冬氨酸甲基转移酶活化用组合物

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Publication number: CN110022853B
Application number: CN201780074469.1A
Authority: CN
Inventors: 北川小百合
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: TWI776836B; TW201828918A; JP2021176855A; CN110022853A; JPWO2018124002A1; JP6944957B2; WO2018124002A1; JP7213307B2

Abstract

本发明的目的在于提供可以活化蛋白质L‑异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)的PIMT活化用组合物，用于评估皮肤的复原或修复活性的新指标及皮肤的抗老化活性的新指标，以及使用此指标对皮肤的复原或修复活性的评估方法及对皮肤的抗老化活性的评估方法。本发明的蛋白质L‑异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)活化用组合物含有选自桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物、菊科山金车属植物及蔷薇科桃属植物中的1种以上的植物的萃取物。

Description

蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶活化用组合物

技术领域

本发明涉及蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)活化用组合物。本发明还涉及含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进用组合物。本发明进一步涉及PIMT的活化方法，以及含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进方法。本发明还涉及皮肤的复原或修复活性的评估方法、皮肤的抗老化活性的评估方法以及用于存在于皮肤中的PIMT的活化等的有效成分的筛选方法。

背景技术

使皮肤保持健康且年轻的状态，对多数人而言是高度关心的问题。然而，伴随年龄增长皮肤各项机能降低等内在主要因素，以及紫外线暴露等外在主要因素会引起皱纹、松弛、缺乏弹力、暗沉及皮肤粗糙等皮肤的老化现象。尤其，作为外在主要因素的紫外线带来的皮肤伤害是积累性的，会加速年龄增长导致的皮肤老化的进行，导致老化达到更深刻的状态等，对皮肤造成重大的影响。

已知蛋白质中的L型天冬酰胺(L-Asn)残基、天冬氨酸(L-Asp)残基容易发生异构化，其结果是产生D型天冬氨酸(D-Asp)残基、D型或L型异天冬氨酸(D-或L-isoAsp)残基。该蛋白质中的氨基酸的异构化引起蛋白质机能损伤，启示了该异构化是阿尔兹海默症等疾病的发病或者各式各样的老化现象的主要原因的可能性。非专利文献1中记载，在高龄者的皮肤、眼睛的晶状体、骨头及牙齿等组织中检测出D-Asp，在皮肤组织中由紫外线曝光部位检测出D-Asp。

在动物的脑组织、红细胞等中已发现蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT:Protein L–isoaspartyl methyltransferase)。PIMT可以特异性的识别L-isoAsp中游离的α-羧基或者D-Asp中游离的β-羧基，是辅酶S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基迁移反应的催化酶，促进蛋白质中的L-isoAsp以及D-Asp向L-Asp的转化。已报告在PIMT基因敲除小鼠的脑、心脏、肝脏以及红细胞中，含有异构化天冬氨酸残基的蛋白质会增加(非专利文献2)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:Fujii N.Biol Pharm Bull 28(9):1585-1589(2005)

非专利文献2:Kim E.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94,6132-6137(1997)

发明内容

因年龄增长以及紫外线暴露，含有D-Asp，L-isoAsp(L-β-Asp)等异构化天冬氨酸(异构化Asp)的蛋白质(异构化蛋白质)在体内增加，及因该氨基酸的异构化而蛋白质的立体结构发生变化从而原有机能受损，因而认为蛋白质中氨基酸的异构化和皮肤等的老化也有关联。例如，一般认为如果能促进皮肤蛋白质中的异构化氨基酸残基转化成正常的L-氨基酸，即可使由于该异构化而变性的蛋白质机能修复，进而，可以使由于该异构化而受损的皮肤的诸项机能等恢复。

然而，皮肤中的异构化蛋白质的修复机制尚不明确。并且尚无报告指出对于皮肤中的含有该异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复有促进作用的物质。

本发明的目的在于提供一种PIMT活化用组合物，其可活化蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)。

本发明的其他目的在于提供一种用于评估皮肤的复原或修复活性的新指标及皮肤的抗老化活性的新指标，以及使用此指标对皮肤的复原或修复活性的评估方法及对皮肤的抗老化活性的评估方法。

本发明者为了解决上述课题进行了深入研究，明确了在人类皮肤细胞中，作为促进异构化蛋白质的复原或修复的酶的蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(以下称PIMT)会进行表达，有助于皮肤中的异构化蛋白质的修复机制的事实。在皮肤细胞中PIMT的表达，是本发明者最初发现的见识。本发明者还发现，用紫外线照射来自皮肤的蛋白质，会诱导该蛋白质中的Asp的异构化，异构化蛋白质增多。本发明者进一步发现皮肤细胞中PIMT的表达由于年龄增长、紫外线暴露等主要因素而降低。根据这些见识，明确了皮肤中的PIMT活性由于年龄增长、紫外线等导致皮肤老化的主要因素而降低，从而考虑到通过活化存在于皮肤中的PIMT，来促进由于氨基酸的异构化而变性的皮肤蛋白质的复原或者修复。基于这些见识，通过对提高PIMT活性的物质进行研究，发现特定植物的萃取物对该PIMT的活化有效。

本发明者还考虑到，以皮肤中的PIMT表达量或其活性为指标可以评估皮肤的复原或修复活性，以及，皮肤的抗老化活性。进一步考虑到，以皮肤中的PIMT表达量或活性为指标，可筛选出针对存在于皮肤中的PIMT的活化，皮肤复原或修复，以及，皮肤的抗老化有效的物质。

即，本发明包含以下PIMT活性化组合物，皮肤复原或修复活性的评估方法等。

本发明的蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)活化用组合物，含有选自桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物、菊科山金车属植物及蔷薇科桃属植物中的1种以上的植物的萃取物。

上述植物的萃取物具有活化PIMT的作用。

本发明中的PIMT活化用组合物，优选为存在于皮肤中的PIMT的活化用组合物。上述植物的萃取物对于存在于皮肤中的(皮肤中的)PIMT的活化有用。

上述植物的萃取物优选选自白桦、葡萄、大豆、啤酒花、薰衣草、鼠尾草、延命草、香橙、紫苏、菖蒲、山金车以及桃中的1种以上的植物的萃取物。这些植物的萃取物对PIMT活化有较高的作用，因而优选。从对PIMT活化有特别高的作用的角度出发，上述植物的萃取物更优选为选自白桦、葡萄、大豆、薰衣草、鼠尾草以及延命草中的1种以上的植物的萃取物。

本发明的PIMT活化用组合物，优选为皮肤外用剂，更优选为化妆料。此外，作为本发明的其他优选方式的一个例子，PIMT活化用组合物亦优选为饮食品。

本发明的含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进用组合物，含有选自桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物、菊科山金车属植物及蔷薇科桃属植物中的1种以上的植物的萃取物。

本发明的含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进用组合物，优选为皮肤中的含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进用组合物。

作为上述植物的萃取物，优选选自白桦、葡萄、大豆、啤酒花、薰衣草、鼠尾草、延命草、香橙、紫苏、菖蒲、山金车以及桃中的1种以上的植物的萃取物，更优选选自白桦、葡萄、大豆、薰衣草、鼠尾草以及延命草中的1种以上的植物的萃取物。由于这些植物的萃取物对PIMT活化的作用较高，因而对含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进作用较高。

本发明的蛋白质的复原或者修复促进用组合物，优选为皮肤外用剂，更优选为化妆料。

此外，作为本发明的其他优选方式的一个例子，本发明的蛋白质的复原或者修复促进用组合物，亦优选为饮食品。

本发明亦包含一种蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)的活化方法，其特征在于，将选自桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物、菊科山金车属植物及蔷薇科桃属植物中的1种以上的植物的萃取物应用于动物。

本发明亦包含一种蛋白质的复原或修复的促进方法，所述蛋白质含有异构化氨基酸，其特征在于，将选自桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物、菊科山金车属植物以及蔷薇科桃属植物中的1种以上的植物的萃取物应用于动物。

本发明亦包含一种蛋白质的复原或修复促进方法，所述蛋白质是皮肤中含有异构化氨基酸的蛋白质，其特征在于，对存在于人类皮肤中的蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)进行活化。

本发明的皮肤的复原或修复活性的评估方法，以皮肤细胞中的蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)的表达量或活性为指标。

本发明的皮肤的复原或修复活性的评估方法中，上述皮肤细胞优选为表皮细胞及/或真皮细胞。

作为上述皮肤的复原或修复活性，可列举针对紫外线及/或年龄增长导致的皮肤老化的皮肤的复原或者修复活性。本发明的评估方法，适合用于针对紫外线及/或年龄增长导致的氨基酸异构化的皮肤复原或修复活性的评估。

本发明的皮肤的抗老化活性的评估方法，以皮肤细胞中的蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)的表达量或活性为指标。

本发明的皮肤的抗老化活性的评估方法中，上述抗老化活性优选为针对紫外线及/或年龄增长导致的皮肤老化的抗老化活性。本发明的皮肤抗老化活性的评估方法，适合用于针对紫外线及/或年龄增长导致的皮肤老化的抗老化活性的评估。

本发明亦包含一种筛选方法，筛选存在于皮肤中的PIMT的活化、皮肤的复原或修复促进，或皮肤的抗老化的有效的成分，其特征在于，以皮肤细胞中蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)的表达量或活性为指标。

本发明的筛选方法，通过以皮肤细胞中PIMT的表达量或活性为指标，可筛选对存在于皮肤中的PIMT有活化作用的物质、对皮肤的复原或修复有促进作用的物质或对皮肤有抗老化作用的物质。

本发明的筛选方法，优选包含将上述皮肤细胞与被试验物质接触，并测定所述皮肤细胞中PIMT的表达量或活性的步骤，以及，

与上述被试验物质接触的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性相比于未与上述被试验物质接触的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性较大时，将上述被试验物质选为有效成分的步骤。

上述皮肤细胞优选为培养皮肤细胞。

将皮肤细胞中的蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)的表达量或活性作为评估皮肤复原或修复活性或者皮肤抗老化活性的指标而使用也是本发明的一项。皮肤中的PIMT的表达量或活性，作为评估皮肤复原或修复活性或者皮肤抗老化活性的指标是有用的。

本发明还包含以下应用。

一种应用，为植物的萃取物的应用，其特征在于，为了活化蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)而应用选自桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物、菊科山金车属植物及蔷薇科桃属植物中的1种以上的植物的萃取物。

一种应用，为植物的萃取物的应用，其特征在于，为了促进含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复而应用选自桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物、菊科山金车属植物及蔷薇科桃属植物中的1种以上的植物的萃取物。

根据本发明，可以提供一种可活化PIMT的PIMT活化用组合物。由于本发明活化存在于皮肤的PIMT，从而可以促进皮肤中含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复。

此外，根据本发明，可提供用于评估皮肤复原或修复活性的新指标，以及，用于评估皮肤的抗老化活性的新指标。根据本发明，可提供以皮肤细胞中PIMT的表达量或活性为指标，评估皮肤复原或修复活性的方法、评估皮肤的抗老化活性的方法。由本发明可以客观的评估皮肤的复原或修复活性，或皮肤的抗老化活性，有助于选择对于与皮肤老化关联的症状等的适当处理。此外，通过以皮肤细胞中PIMT的表达量或活性为指标，可以筛选对存在于皮肤的PIMT有活化作用的物质、对皮肤的复原或修复有促进作用的物质以及对皮肤有抗老化作用的物质。

附图说明

图1为表示皮肤细胞中的PIMT表达量的图表。

图2为表示由紫外线B波(UVB)照射而引起的每蛋白质量的SAH生成量的图表。

图3为表示继代数不同的皮肤成纤维细胞中的PIMT的表达量的图表。

图4为表示因压力负荷而引起的皮肤成纤维细胞中的PIMT的表达量的变化的图表。

具体实施方式

本说明书中，所谓的异构化后的氨基酸(也称作异构化氨基酸)是指L-天冬氨酸(L-Asp)或L-天冬酰胺(L-Asn)发生异构化后生成的L-天冬氨酸的异构体(异构化天冬氨酸)。

更具体而言，所谓的异构化天冬氨酸(异构化Asp)，为D-天冬氨酸(D-Asp)、D型或L型异天冬氨酸(D-或L-isoAsp)，优选为D-Asp、L-isoAsp。D-isoAsp及L-isoAsp亦分别被称为D-β-Asp及L-β-Asp。

本说明书中，所谓氨基酸的异构化是指L-Asp或L-Asn转化为异构化天冬氨酸。亦将含有异构化氨基酸(氨基酸残基)的蛋白质称为异构化蛋白质。异构化蛋白质中的异构化氨基酸(异构化氨基酸残基)可为1种，亦可为2种以上。

若蛋白质中的氨基酸发生异构化，该蛋白质的立体结构则会发生变化，原有机能受损。由此，异构化蛋白质亦可以说是由氨基酸的异构化而变性的蛋白质。此蛋白质中的氨基酸的异构化被认为和各式各样老化现象等有关联。通过使异构化蛋白质中的异构化氨基酸转化为L-Asp(复原或修复)，可使由异构化而变性的蛋白质复原为本来状态(异构化前的状态，变性前的状态)或修复至与本来状态接近的状态。本发明中的异构化蛋白质的复原或修复是指，异构化蛋白质中的异构化Asp转化为L-asp，或由此而使因氨基酸异构化而变性的蛋白质复原为本来状态(异构化前的状态，变性前的状态)或修复至与本来状态接近的状态。此外，异构化蛋白质中的异构化Asp向L-Asp的转化意味着将异构化蛋白质中的异构化Asp的至少一部分转化为L-Asp，并不仅限于将所有的异构化Asp转化为L-Asp。

PIMT具有促进蛋白质中的异构化氨基酸向普通L-氨基酸转化(复原或修复)的作用。更具体而言，PIMT有促进属于异构化Asp的L-isoAsp及D-Asp转化为L-Asp的作用。从而，通过活化PIMT，可以促进异构化蛋白质的复原或修复。例如通过活化存在于皮肤的PIMT，可以促进皮肤中异构化蛋白质的复原和修复。由此认为，由L-Asp及/或L-Asn的异构化而损伤的皮肤蛋白质机能可以恢复到本来的状态或与本来状态接近的状态，进而可以抑制由该氨基酸的异构化而导致的皮肤诸项机能的降低或恢复已降低的皮肤机能。

PIMT的活化包含对PIMT表达的增强、对PIMT表达的促进、对PIMT表达降低的抑制及对PIMT表达的恢复等增强或者促进PIMT的作用的任意作用、抑制该作用降低的任意作用。

<PIMT活化用组合物，及含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进用组合物>

本发明的PIMT活化用组合物包含选自桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物、菊科山金车属植物及蔷薇科桃属植物中的1种以上的植物的萃取物。

上述植物的萃取物具有使PIMT活化的作用。从而这些植物的萃取物适合用作PIMT活化用组合物的有效成分。此外，上述植物的萃取物对含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复的促进也有效，亦适合用作该含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进用组合物的有效成分。

含有上述1种以上的植物的萃取物的含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进用组合物(以下，亦称为异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物)也是本发明的一项。本发明的PIMT活化用组合物及异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物通常是含有以上述植物的萃取物为有效成分的物质。

PIMT活化用组合物适合作为存在于皮肤中的PIMT的活化用组合物。异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物适合作为皮肤中的含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进用组合物。

本发明的PIMT活化用组合物及异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物中，可以使用上述1种或2种以上的植物的萃取物。本发明的PIMT活化用组合物及异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物含有2种以上的植物的萃取物时，这些植物可为隶属于同属的植物，也可为隶属于不同属的植物。

作为桦木科桦木属(Betulaceae Betula)植物，例如，可列举白桦(Betulapendula或Betula alba)。

作为葡萄科葡萄属(Vitaceae Vitis)植物，例如，可列举葡萄(Vitis spp.)。葡萄的品种并无特殊限定，例如，可列举卡本纳·苏维翁、康科德、梅洛及贝利A麝香等红葡萄；霞多丽、甲州等白葡萄等。其中优选红葡萄，更优选卡本纳·苏维翁、梅洛等。

作为豆科大豆属(Fabaceae Glycine)植物，可列举大豆(Glycine max)。

作为大麻科葎草属(Cannabaceae Humulus)植物，可列举啤酒花(Humuluslupulus)。

作为唇形科(Lamiaceae)植物，可列举薰衣草(Lavandula angustifolia)等薰衣草属植物(Lavandula)；鼠尾草(Salvia officinalis)等鼠尾草属植物(Salvia)；延命草(Rabdosia japonica(Isodon japonicus)或Rabdosia trichocarpa(Isodontrichocarpus))等香茶菜属(Isodon)植物；紫苏等(Perilla frutescens var.Crispa)紫苏属(Perilla)植物。

作为芸香科柑橘属(Rutaceae Citrus)植物，可列举香橙(Citrus junos)。

作为菖蒲科菖蒲属(Acoraceae Acorus)植物，可列举菖蒲(Acorus calamus)。

作为菊科山金车属(Asteroideae Arnica)植物，可列举山金车(Arnicamontana)。

作为蔷薇科桃属(Rosaceae Amygdalus)植物，可列举桃(Amygdalus persica)。

作为本发明的植物萃取物，优选桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物(优选隶属于薰衣草属、鼠尾草属或香茶菜属的植物)、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物及蔷薇科桃属植物中的1种以上植物的萃取物，更优选桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物及唇形科植物的萃取物，进一步优选桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物及唇形科植物的萃取物。

其中，从对存在于皮肤中的PIMT的高活化作用的观点来看，优选上述白桦、葡萄、大豆、啤酒花、薰衣草、鼠尾草、延命草、香橙、紫苏、菖蒲、山金车及桃的萃取物，更优选白桦、葡萄、大豆、啤酒花、薰衣草、鼠尾草、延命草及菖蒲的萃取物，更优选白桦、葡萄、大豆、啤酒花、薰衣草、鼠尾草及延命草的萃取物，进一步优选白桦、葡萄、大豆、薰衣草、鼠尾草及延命草的萃取物，更进一步优选白桦、葡萄、大豆及薰衣草的萃取物。其中，作为植物萃取物，特别优选白桦萃取物、葡萄萃取物以及大豆的萃取物，最优选白桦萃取物以及葡萄萃取物。优选使用这些中的1种或2种以上的萃取物。

在调制植物的萃取物时，可使用上述植物的任意部位，例如，根、根茎、茎、叶、枝、树皮、花、种子(包含种皮、胚芽、胚乳、胚轴及子叶等)及果实(包含果肉、果皮)。可通过用溶剂从这些植物的任意部位萃取的方法来制造植物萃取物。

作为制作植物的萃取物的优选部位，例如，可列举下述部位。作为本发明的植物萃取物，优选植物的下述部位的萃取物。

桦木科桦木属的白桦优选树皮。

葡萄科葡萄属的葡萄优选果实、种皮及/或种子，更优选果皮及种子。

豆科大豆属的大豆优选使用种子，更优选胚芽(大豆芽)。大麻科葎草属植物的啤酒花，优选花(更优选雌花蕊)。

如果为唇形科的植物，各自而言，薰衣草属的薰衣草优选花，鼠尾草属的鼠尾草以及紫苏属的紫苏优选叶，香茶菜属的延命草优选叶及/或茎。

芸香科柑橘属的香橙优选使用果实。菖蒲科菖蒲属的菖蒲优选使用根。菊科山金车属的山金车优选使用花。蔷薇科桃属的桃优选使用种子。

上述植物部位，可直接交付萃取步骤，亦可在进行粉碎，切断或干燥后交付萃取步骤。

植物的萃取方法并没有特殊限定，可以用通常植物成分的萃取所用的植物萃取方法取得。可适当设定萃取方法，萃取条件也没有特殊的限定。例如，优选在常温或加热条件下从上述植物的各部位萃取。萃取时，亦可实施适当的搅拌等操作。

可适当选取植物萃取所用溶剂(萃取剂)，可使用通常用来萃取植物成分之物。作为萃取剂，例如可列举水；甲醇、乙醇、丙醇、丁醇及戊醇等碳原子数为1～5的低级一元醇；乙二醇、丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇及2，3-丁二醇等多元醇；丙酮、甲基乙基酮等酮；乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯；四氢呋喃、二乙醚等链状及环状醚；聚乙二醇等聚醚；角鲨烷等。这些溶剂可单独使用，也可使用组合了2种以上的混合溶剂。低级一元醇优选碳原子数为1～4的一元醇，更优选碳原子数为2～4的一元醇，进一步优选乙醇。多元醇优选例如二元或三元醇，更优选二元醇。此外，多元醇优选例如碳原子数为2～4的多元醇，更优选1，3-丁二醇等。其中，作为萃取剂优选水、低级一元醇、多元醇、角鲨烷及这些中的2种以上的混合溶剂，更优选水、低级一元醇、多元醇及这些中的2种以上的混合溶剂。在一种实施方式中，作为萃取剂，例如较优选水、低级一元醇或其水溶液、多元醇或其水溶液及角鲨烷等，进一步优选水、乙醇、乙醇水溶液、1，3-丁二醇、1，3-丁二醇水溶液及角鲨烷等。例如，低级一元醇水溶液(优选乙醇水溶液等)以及多元醇水溶液优选醇浓度为10～98体积％，更优选30～95体积％，进一步优选50～95体积％。作为本发明的植物的萃取物，优选上述溶剂萃取物。

在一种实施方式中，桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物(优选隶属于薰衣草属、鼠尾草属或香茶菜属的植物)、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物及蔷薇科桃属植物的萃取物优选低级一元醇水溶液的萃取物。豆科大豆属植物的萃取物，优选水萃取物。唇形科紫苏属植物，优选多元醇水溶液的萃取物。

萃取时可添加酸或碱，调节萃取剂的pH值。

在萃取后，优选将植物残渣(萃取后的植物体或其部分)从萃取液中去除。将植物残渣从萃取液中去除的方法无特殊限定，可列举过滤、离心分离等公知的分离手段。

作为植物的萃取方法的一个例子，例如可使用以下方法。将未加工的植物或干燥物研碎，加入以质量计5～20倍的萃取剂，于常压下，室温中进行优选10分～15天，更优选30分～10天，进一步优选1小时～7天的萃取，或在萃取剂沸点附近进行优选约10分～1天(更优选10分～2小时)的萃取后过滤得到滤液。萃取时，可静置，也可适当搅拌。此外，可将得到的滤液(植物萃取液)直接作为植物的萃取物，也可根据需要进行浓缩或干燥。

本发明中，可直接将萃取所得植物萃取液作为植物的萃取物使用。此外，亦可将植物萃取液用适当的溶剂进行稀释后作为植物的萃取物，还可对其实施浓缩或干燥的步骤，作为浓缩物或干燥粉末，也可以膏状使用。对于浓缩方法、干燥方法也无特殊限定，可使用冷冻干燥、喷雾干燥等公知的方法。此外，亦可将干燥粉末溶解或悬浮于溶剂中使用。

此外，对于上述植物萃取液、其浓缩物或干燥粉末，在不损伤本发明效果的范围内，可根据需要进一步实施除臭，脱色等精制。此精制方法，只需任意选用通常所用手段即可，例如可列举使用过滤；使用离子交换树脂、合成吸附树脂及活性炭等作为载体的柱层析等各种层析法等的方法。作为层析法中所使用的载体的一个例子，列举Diaion HP-20 15L(产品名，三菱化学(株)制)，Sephadex LH-20(产品名，GE Healthcare公司制)等。

本发明的植物的萃取物包含通过上述萃取方法所获取的各种溶剂萃取液、其稀释液、其浓缩物或其干燥粉末以及这些物质的精制物。

此外，作为上述植物的萃取物，也可使用市场销售品。

通过活化PIMT，促进异构化蛋白质的复原或修复。上述植物的萃取物，可用于活化PIMT、促进含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复。例如，上述植物的萃取物，适合用于制造活化PIMT、促进异构化蛋白质的复原或者修复的化妆料(化妆料组合物)、医药品(医药品组合物)、医药部外品(医药部外品组合物)及饮食品(饮食品组合物)等。上述植物的萃取物，调配在化妆料、医药品、医药部外品及饮食品等中，可作为活化PIMT，促进异构化蛋白质的复原或修复的有效成分。上述PIMT的活化，优选存在于皮肤中的PIMT的活化。异构化蛋白质的复原或修复，优选皮肤中的异构化蛋白质的复原或修复。

如果使用该植物的萃取物，则相对于不使用上述植物萃取物的情况而言，可以活化PIMT。例如，使用上述植物的萃取物，可增加皮肤中的PIMT的表达量。此外，例如，可抑制因紫外线暴露等要因导致的皮肤中的PIMT的表达降低。上述植物萃取物可以使因紫外线暴露等要因而降低的皮肤中的PIMT的表达恢复。在本发明的一种实施方式中，上述植物萃取物可以作为用于促进皮肤中的PIMT的表达、用于抑制皮肤中的PIMT的表达降低(例如以紫外线暴露或年龄增长等为起因的表达降低)及用于恢复皮肤中已降低的PIMT的表达的有效成分。

如上所述，若对来自皮肤的蛋白质照射紫外线，则异构化蛋白质会增多。另一方面，由于年龄增长、紫外线等要因，皮肤中的PIMT表达量降低。由这些见识，可以推断年龄增长、紫外线等要因会促进皮肤中异构化蛋白质的积累。由氨基酸的异构化而导致的皮肤蛋白质的变性，被认为与皮肤的老化相关联。

由于存在于皮肤中的PIMT的活化能促进皮肤中异构化蛋白质的复原或修复，因而认为其对例如促进已老化的皮肤(皮肤状态或皮肤机能)的恢复，预防或改善皮肤老化等有效。老化包括由年龄增长所引起的老化(伴随年龄增长的生理性老化)以及由紫外线所引起的老化(由紫外线暴露所引起的光老化)中的任意一方或两方。预防包括防止、延迟症状的发症。改善包括减轻症状、抑制以及缓解症状的发展。

含有上述植物萃取物的本发明的PIMT活化用组合物以及异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物，对活化存在于皮肤中的PIMT、促进皮肤中的异构化蛋白质的复原或修复有效。上述植物萃取物，例如，适用于在意皮肤的老化的人，或希望预防或改善皮肤老化症状的人，适合用于促进皮肤的恢复，预防或改善皮肤老化等。

用于上述目的的上述植物的萃取物的使用可以是治疗性的使用，也可以是非治疗性的使用。所谓“非治疗性”是不包含医疗行为的概念，即不包含对人进行手术，治疗或诊断方法的概念。

对于本发明的PIMT活化用组合物以及异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物的形态并无特殊限定，可以为粉末状、颗粒状、膏状及固体状等，也可为液状，适当选择即可。例如，也可将上述植物的萃取物单独用作PIMT活化用组合物(也可称作PIMT活化剂)、异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物(也可称作异构化蛋白质的复原或修复促进剂)。此外，只要不影响本发明的效果，除了上述植物的萃取物之外，也可调配其他的成分作为PIMT活化用组合物、异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物。作为其他的成分，例如，可列举下述可用于医药品、医药部外品、化妆料及饮食品等的成分。这样的医药品、医药部外品、化妆料及饮食品，可根据调配成分采用通常的方法制造。

本发明的PIMT活化用组合物以及异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物，作为一个例子，可以制剂的形态提供，但是并不仅限于此形态。也可以将此制剂原样作为组合物，或者作为含有该制剂的组合物的形式来提供。

本发明的PIMT活化用组合物以及异构化蛋白质的复原或修复用组合物可用于医药品、医药部外品、化妆料及饮食品等各式各样的用途。本发明的PIMT活化用组合物以及异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物，组合物本身可作为活化PIMT、促进异构化蛋白质的复原或修复的医药品、医药部外品、化妆料及饮食品等，或者也可以作为调配入该医药品、医药部外品、化妆料及饮食品等所使用的原料或制剂等。

本发明的PIMT活化用组合物以及异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物，例如，适合用作皮肤外用剂。皮肤外用剂包含医药品、医药外部品及化妆料(化妆品)，优选化妆料。在一种实施方式中，在用于活化皮肤中的PIMT，或者促进皮肤中异构化蛋白质的复原或修复时，PIMT活化用组合物以及异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物优选制成皮肤外用剂，更优选化妆料。含有上述植物的萃取物的皮肤外用剂，适合用作存在于皮肤中的PIMT活化用皮肤外用剂；皮肤中的异构化蛋白质的复原或修复促进用皮肤外用剂。

本发明的PIMT活化用组合物，异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物，亦可作为皮肤外用剂以外的医药品或医药部外品使用。

在另一实施方式中，PIMT活化用组合物以及异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物亦优选制成饮食品。含有上述植物的萃取物的饮食品，例如，适合用于活化皮肤中的PIMT或者促进皮肤中的异构化蛋白质的复原或修复。含有上述植物的萃取物的饮食品，可作为存在于皮肤中的PIMT的活化用饮食品、皮肤中的异构化蛋白质的复原或修复促进用饮食品使用。

以下针对将本发明的PIMT活化用组合物、异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物制成医药品、医药外部品及化妆料等皮肤外用剂、饮食品等的情况进行说明。

将本发明的PIMT活化用组合物、异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物制成皮肤外用剂(PIMT活化用皮肤外用剂,异构化蛋白质的复原或修复促进用皮肤外用剂)时，针对其剂型等无特殊限定，可为例如，溶液、乳液、乳霜、凝胶、粉末、喷雾剂、薄雾、胶囊以及薄片等任意形态。皮肤外用剂优选作为化妆料。针对化妆料的产品形态也无特殊限定，例如，可列举洁面品、卸妆品、化妆水、美容液、面膜、乳液、乳霜及防晒等皮肤护理化妆料；粉底、妆前底、口红、眼影、眼线品、睫毛膏、眉笔、腮红及指甲油等的美妆化妆料；洗发水、护发素、头发造型产品、染发剂及生发剂等毛发化妆料；肥皂、沐浴露等的洗涤材料；入浴剂等。

上述化妆料，也可单独使用上述植物的萃取物。此外，在这些化妆料中，在不损伤本发明效果的范围内，可适当含有以下1种或2种以上化妆料所容许的载体、添加剂等成分，例如水、酒精类、油剂、表面活性剂、增粘剂、金属皂、凝胶剂、粉体、螯合剂、水溶性高分子、成膜剂、树脂、包接化合物、抗菌剂、除臭剂、盐类、pH调整剂、紫外线吸收剂、上述以外的来自动植物·微生物的萃取物、角质溶解剂、酵素、荷尔蒙类、其他维生素类、保湿剂、杀菌剂、消炎剂及香料等。化妆料可用一般的制造法制造。例如，可将上述植物的萃取物，和上述可用于化妆料的成分的1种或2种以上混合后，再加工成所希望的形态而获得。

将皮肤外用剂制成医药品或医药部外品时，可单独使用上述植物的萃取物，也可组合使用该植物的萃取物和医药品或医药部外品所容许的载体、添加剂等成分。作为该成分，例如可列举赋形剂、结合剂、降解剂、润滑剂、抗氧化剂及着色剂等的1种或2种以上物质，这些可根据需要使用。医药品、医药部外品可用一般的制造法制造。例如，可将上述植物的萃取物，和可用于医药品或医药部外品的成分的1种或2种以上混合后，再加工成所希望的形态而获得。

针对化妆料等皮肤外用剂中的上述植物的萃取物的含量无特殊限定，例如作为该萃取物的干燥物换算的质量，在皮肤外用剂中优选为0.0000001～100质量％，更优选为0.000001～100质量％，进一步优选为0.00001～99.9质量％，特别优选为0.00001～10质量％。

本发明的PIMT活化用组合物、异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物也可制成上述皮肤外用剂以外的医药品、医药部外品。这样的医药品或医药部外品，可以是口服投药，也可是非口服投药。医药品或医药部外品可以是口服投药制剂(内服剂)或非口服投药制剂的形态。作为口服投药制剂的形态，可列举液剂、片剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、糖衣片剂、胶囊、悬浊液、乳剂及咀嚼剂等。作为非口服投药制剂的形态，可列举注射剂、输液剂等。这样的医药品或医药部外品，可以单独使用上述植物的萃取物，也可组合使用该植物的萃取物与医药品或医药部外品所容许的载体、添加剂等成分。作为此类成分，例如，可列举赋形剂、结合剂、降解剂、润滑剂、抗氧化剂、着色剂、矫味剂等的1种或2种以上物质，这些可根据需要使用。医药品、医药部外品可用一般的制造法制造。例如，可将上述植物的萃取物，和可用于医药品或医药部外品的成分的1种或2种以上混合后，再加工成所希望的形态而获得。

针对皮肤外用剂以外的医药品或医药外部品中的上述植物的萃取物的含量无特殊限定，例如作为该萃取物的干燥物换算的质量，在医药品及医药部外品中优选为0.0000001～100质量％，更优选为0.000001～100质量％，进一步优选为0.00001～99.9质量％，特别优选为0.00001～10质量％。

将本发明的PIMT活化用组合物、异构化蛋白质的复原或修复促进用组合物制成饮食品时，对于饮食品并无特殊限定，例如可列举一般饮食品、保健食品、机能性标示食品及特定保健用食品等。对于饮食品的形态也无特殊限定。上述保健食品、机能性标示食品及特定保健用食品也可以制成例如液剂、片剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、糖衣片剂、胶囊、悬浊液、乳剂、咀嚼剂及流动食品等各种制剂的形态。

在上述饮食品中，可以单独使用上述植物的萃取物，也可调配饮食品所容许的成分，例如其他饮食品材料、调配于饮食品中的添加剂等，制成PIMT活化用饮食品(PIMT活化用饮食品组合物)、异构化蛋白质的复原或修复促进用饮食品(促进异构化蛋白质的复原或修复用饮食品组合物)。这样的饮食品可用一般的制造法制造。例如，在饮食品的制造中，在饮食品材料中调配上述植物的萃取物即可。

针对饮食品中的上述植物的萃取物的含量无特殊限定，例如作为该萃取物的干燥物换算的质量，在饮食品中优选为0.0000001～100质量％，更优选为0.000001～100质量％，进一步优选为0.00001～99.9质量％，特别优选为0.00001～10质量％。

针对上述医药品、医药部外品、化妆料或饮食品的使用量并无特殊限定，可根据对象的状态、体重、性别、年龄或其他的主要因素适当设定。若为化妆料等皮肤外用剂，例如，成人(60kg)每1人每1天，作为上述植物的萃取物(干燥物换算)，例如，优选为0.01～500mg。口服投药医药品或医药部外品时的投药量，例如成人(60kg)每1人每1天，作为植物的萃取物(干燥物换算)，例如，优选为0.01～500mg。如果是饮食品时，例如，成人(60kg)每1人每1天，作为上述植物的萃取物(干燥物换算)，例如，优选为0.01～500mg。上述剂量的植物的萃取物，可以单次或分多次摄入或投药。对于将含有上述植物的萃取物的皮肤外用剂用于皮肤的时机、摄入或投与饮食品、医药品或医药部外品的时机并无特殊限定。

对于上述医药品、医药部外品、化妆料或饮食品的适用对象并无特殊限定，可适用于人类或非人类哺乳动物等，优选人类(人)。作为适用对象，优选例如希望或者需要活化PIMT(优选活化皮肤中的PIMT)的人，希望或需要促进异构化蛋白质的复原或修复(优选促进皮肤中异构化蛋白质的复原或修复)的人。此外，在一种实施方式中，例如，优选在意皮肤的老化的人、希望或者需要预防或改善皮肤的老化症状的人及希望或需要恢复已老化的皮肤、预防或改善皮肤的老化的人。此外，对于化妆料等皮肤外用剂所适用的身体部位并无特殊限定，以上述目的而使用的情况下，例如，优选应用于在意其老化的部位的皮肤、希望预防或改善老化症状的部位的皮肤及需要预防或改善老化症状的部位的皮肤。

<PIMT的活化方法及含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进方法>

通过活化存在于人类皮肤中的PIMT，从而促进皮肤中的含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复的方法亦包含在本发明中。

如果异构化蛋白质得到复原或修复，那么由异构化而损伤的蛋白质的机能即可得到恢复。从而，本发明的方法，例如，对于促进已老化皮肤(皮肤状态或皮肤机能)的恢复，预防或改善皮肤老化等有效。

作为活化存在于人类皮肤中的PIMT的方法，可列举将上述植物萃取物应用于人的方法。更具体而言，例如，可列举将上述植物萃取物应用于人类皮肤的方法、将上述植物萃取物应用于对人类投药或摄取的方法等。优先将植物萃取物应用于人类皮肤。植物萃取物正如上述PIMT活化用组合物中记载的那样。植物萃取物，可以上述皮肤外用剂、医药品、医药部外品及饮食品等的形式应用。通过活化存在于皮肤中的PIMT，可以促进皮肤中的含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复。

将选自桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物、菊科山金车属植物及蔷薇科桃属植物中的1种以上的植物的萃取物适用于动物的PIMT的活化方法；将上述1种以上植物的萃取物适用于动物的含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进方法亦包含在本发明中。

动物优选上述人类或非人类哺乳动物，更优选人类。

上述PIMT活化方法优选作为存在于皮肤中的PIMT的活化方法。含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进方法，优选作为皮肤中的含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进方法。在皮肤中的PIMT的活化以及异构化蛋白质的复原或修复促进中，优选使上述植物萃取物与皮肤接触。在本发明的优选方式中，将上述植物的萃取物应用于动物皮肤。例如，通过将含有上述植物萃取物的皮肤外用剂应用于人类等动物的皮肤，从而使上述植物的萃取物和皮肤细胞接触。植物的萃取物及其优选形态，优选使用量等如上所述。皮肤外用剂也如上所述。在一种方式中，上述方法优选作为非治疗性的方法(不含有医疗行为的方法)。

<皮肤复原或修复活性的评估方法以及皮肤的抗老化活性的评估方法>

可将存在于皮肤中的PIMT的表达量或活性为指标，评估皮肤的复原或修复活性，皮肤的抗老化活性。

本发明的皮肤复原或修复活性的评估方法以皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性为指标。本发明的皮肤的抗老化活性的评估方法，以皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性为指标。

本说明书中，亦将本发明的皮肤复原或修复活性的评估方法以及本发明的皮肤的抗老化活性的评估方法称作本发明的评估方法。

本发明中的皮肤的复原或修复活性通常指，复原或修复由皮肤的蛋白质中的氨基酸(具体而言，L-Asp或L-Asn)发生异构化(转化为L-isoAsp或D-Asp)而变性的蛋白质的活性，促进该皮肤中异构化蛋白质的复原或修复的活性。促进皮肤中异构化蛋白质的复原或修复的活性包含，抑制由于紫外线、年龄增长等主要因素而引起的皮肤中异构化蛋白质的复原和修复活性低下的活性。由于PIMT具有促进异构化蛋白质的复原或修复的作用，皮肤细胞中的PIMT表达量或活性，作为评估上述皮肤的复原或修复活性的指标是有用的。皮肤的复原或修复活性也可换言成皮肤的复原或修复力、皮肤的复原或修复作用。皮肤的复原或修复活性，亦有助于皮肤的恢复。

此外，如上所述，由氨基酸的异构化引起的皮肤蛋白质的变性，被认为与皮肤的老化亦有关系。一般认为通过皮肤中的异构化蛋白质被复原或修复，例如，已老化的皮肤的机能会恢复。从而，皮肤细胞中PIMT的表达量或活性作为皮肤的抗老化活性指标是有用的。本发明中的抗老化，是预防或改善老化，优选皮肤的老化。老化包含因年龄增长的老化以及因紫外线的老化中的任意一方或两方。

此外，例如，虽然皮肤细胞中的PIMT的表达会因紫外线及/或年龄增长而降低，因紫外线及/或年龄增长的PIMT的表达量降低较少的皮肤，复原或修复因紫外线及/或年龄增长而异构化的皮肤蛋白质的活性较高。若以皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性为指标，那么也可以评估抑制此类紫外线及/或年龄增长而引起的复原或修复活性的降低的对于紫外线及/或年龄增长所引起的皮肤老化的复原或修复活性。

本发明的皮肤的复原或修复活性的评估方法，可用作紫外线及/或年龄增长引起的皮肤老化的皮肤的复原或修复活性的评估方法。本发明的皮肤抗老化活性的评估方法可用作紫外线及/或年龄增长而引起的皮肤老化的皮肤的抗老化活性的评估方法。

在本发明的评估方法中，将皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性用作指标。更具体而言，将PIMT的表达量或活性程度作为指标，评估皮肤的复原或修复活性的程度或变化，皮肤抗老化活性的程度或变化。

例如，如果皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性较高，则将蛋白质中的异构化Asp转化为L-Asp的活性较高。即，复原或修复异构化蛋白质的活性较高。此外，如果皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性较高，则抑制由氨基酸的异构化而引起的皮肤的诸机能降低的活性较高。因此，可以说如果皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性较高，则皮肤的复原或修复的活性(作用)较高，预防或改善皮肤老化的活性(作用)较高。

PIMT的表达量或者活性高的皮肤，由于异构化蛋白质的复原或修复活性较高，可以说皮肤的复原或修复活性以及皮肤的抗老化活性较高。此外，PIMT的表达量或者活性高的皮肤，可以说皮肤细胞的老化程度低(老化未发展)。反过来，PIMT的表达量或活性低的皮肤，可以说皮肤的复原或修复活性以及皮肤的抗老化活性较低。此外，PIMT的表达量或者活性低的情况，可以说是已老化的皮肤。

从而，以皮肤细胞中PIMT的表达量或活性为指标而使用，可以客观的评估皮肤的复原或修复活性以及皮肤的抗老化活性。此外，皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性，也可以作为评估皮肤的老化程度的指标而使用。

通过以皮肤细胞中PIMT的表达量或活性为指标，可以将被实验者的皮肤的复原或修复活性以及皮肤的抗老化活性例如与标准的皮肤的该活性进行比较，也可以评估通过皮肤护理而引起的皮肤复原或修复活性以及皮肤的抗老化活性的变化。因此，基于上述评估，例如可选择对于和皮肤老化相关联的症状的适当的处置。

本发明的评估方法中使用的皮肤细胞，只要是需要此评估的被实验者或者希望此评估的被实验者的皮肤即可，可列举人类或非人类哺乳动物的皮肤细胞，优选人类皮肤细胞。皮肤细胞通常为从被实验者身上所采集的皮肤细胞。作为皮肤细胞优选表皮细胞及/或真皮细胞。作为皮肤的复原或修复活性，以及皮肤的抗老化活性的指标，优选表皮细胞及/或真皮细胞中的PIMT的表达量或活性。其中，更优选真皮细胞。由于真皮组织积累由年龄增长、紫外线等引起损伤，所以如果以真皮细胞中的PIMT的表达量或活性为指标，可以更恰当的评估被试验者的皮肤的复原或修复活性以及皮肤的抗老化活性。此外，如果从采样角度出发，优选容易采集的表皮细胞。

对于皮肤细胞的采集方法并无特殊限定。表皮细胞，例如，可以用胶带剥离法进行采集。真皮细胞，可以用注射针来采集。此外，也可以使用例如以再生医疗为目的采集了一部分皮肤的情况或切除脂肪时多余的皮肤的细胞。

对于皮肤的部位并无特殊限定，例如，优选需要或希望评估皮肤的复原或修复活性或皮肤的抗老化活性的部位。例如，面部(额、脸颊、眼周、口周及颚)、耳后、颈部、臂、手、足及臀部等的皮肤。在一种方式中，优选为曝光部位(紫外线曝光部位)的皮肤细胞，作为曝光部位的皮肤，可列举面部(特别是脸颊等)、颈部、上臂部及手背部等。曝光部位的皮肤细胞，适合用于对紫外线所引起的皮肤的老化的皮肤的复原或修复的活性的评估，以及对紫外线所引起的皮肤的老化的抗老化活性的评估优选曝光部位的皮肤细胞。在本发明中，优选使用皮肤的复原或修复活性以及抗老化活性的评估被认为重要的面部的皮肤细胞进行评估。

本发明的评估方法，优选含有测定皮肤细胞中的PIMT的表达量或PIMT的活性的步骤。

PIMT的表达量可以由测定皮肤细胞的PIMT量或者编码PIMT的mRNA的量而测定。由于操作简便，作为PIMT的表达量，优选测定PIMT量。

测定PIMT量时，只需要从采集的皮肤细胞中萃取蛋白质并制成样本，测定该样本中的PIMT量即可。针对蛋白质的萃取方法及PIMT量的测定方法并无特殊限定。例如，可使用市场销售的蛋白质萃取剂(例如，Thermo公司制的M-PER(注册商标)Mammalian ProteinExtraction Reagent或GE Healthcare公司制的商品名为Mammalian Cell Lysis Buffer等)，从皮肤细胞中萃取出可溶于萃取剂的蛋白质，制成PIMT测定用样本。此外，从皮肤细胞中萃取蛋白质时，也可以采用渗透压震碎法、冻融法、超声波处理法及均质化等方法。

PIMT量可通过利用对PIMT有特异性的抗体的免疫测定法(例如，利用酶反应的ELISA法、蛋白质印迹法)等公知的方法测定。ELISA法，例如，可以使用市场销售的试剂盒(ELISA Kit for Homo sapiens(Human)Protein L-Isoaspartate-O-Methyltransferase(PCMT1)、CLOUD-CLONE公司制)。

mRNA的萃取、其量的测定方法，用公知的方法进行即可。mRNA的测定，例如，可以由PCR法等公知的方法实施。人类PIMT的DNA序列是已知的(NCBI Accession No.NM_005389)。只要是本领域的技术人员，就可以简单的实施用于测定编码PIMT的mRNA的引物的设计或合成、DNA的增幅等。此外，可以用于人类PIMT基因的定量的引物已在市场中销售(OriGene公司，商品编号HK25454、HK205453等)。也可以入手此类市场销售的引物，测定编码PIMT的mRNA量。

皮肤细胞中的PIMT的活性的测定可以依照可以测定PIMT的酶活性的任意方法，定量或非定量的实施。具体而言，可以由从皮肤细胞中萃取出蛋白质，由HPLC测定因PIMT的反应从S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)所产生的S-腺苷高半胱氨酸(SAH)的量的方法、将作为基质的含有isoAsp的肽以硝基苯噁二唑(NBD)进行荧光标记后，使其与PIMT反应并甲基化时以HPLC进行分离测定的方法(古地等「YAKUGAKU ZASSHI」127卷第12号1927-1936项(2007))等，测定PIMT的活性。

PIMT的表达量以及PIMT的活性的测定值，只需要根据测定法使用方便使用的值即可。例如，作为PIMT的表达量，使用PIMT量(蛋白质质量)时，PIMT表达量的测定值，可使用换算成每蛋白质量的PIMT量。

可以使用PIMT的表达量或PIMT的活性的测定值，对皮肤的复原或修复活性的程度、皮肤的抗老化活性的程度及该活性的变化进行评估。

针对以皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性为指标，评估皮肤的复原或修复活性的方法、评估皮肤的抗老化活性的方法并无特殊限定。

例如，作为实施方式的一个例子，可以实施测定被试验者的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性的步骤、将该被试验者的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性和预先测定的集团(例如，同代的集团)的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性的分布进行比较的步骤。例如，被试验者的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性相比于预先测定的集团的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性的分布高时，该被试验者被评估(判定)为皮肤的复原或修复活性及皮肤的抗老化活性较高。

此外，由于皮肤的复原或修复活性以及皮肤的抗老化活性被认为是存在个体差异的，因而例如，可在同一被试验者中，将曝光部位及非曝光部位的皮肤细胞的PIMT的表达量或活性进行比较，评估上述活性。作为此评估方法的一个例子，可列举含有测定同一被实验者的曝光部位以及非曝光部位的皮肤细胞中PIMT的表达量或活性的步骤，及比较上述曝光部位或非曝光部位的皮肤细胞中PIMT的表达量或活性的步骤的方法。皮肤细胞中的PIMT的表达或活性会因紫外线而降低。此外，由紫外线引起的损伤会累积，通常认为同一被实验者身上，曝光部位的皮肤中的PIMT相较于非曝光部位的皮肤来说，表达或活性较低。因此，如果对曝光部位和非曝光部位皮肤细胞的PIMT表达量或活性进行比较，而其差较小，那么该被试验者的皮肤的复原或修复活性以及皮肤的抗老化活性被评估为高。作为曝光部位的皮肤，可列举上述面部等的皮肤。作为非曝光部位并无特殊限定，例如可列举臀部等。

对同一被试验者的曝光部位以及非曝光部位的PIMT的表达量或活性的比较，适用于针对由紫外线引起的皮肤老化的复原或修复活性的评估，以及针对由紫外线引起的皮肤老化的抗老化活性的评估。非曝光部位的皮肤细胞中的PIMT表达量或活性与曝光部位的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性的差越小，评估为针对由紫外线引起的皮肤老化的复原或修复活性，以及针对由紫外线引起的皮肤老化的抗老化活性越高。

此外，还可以通过对皮肤细胞进行紫外线照射来比较照射前后PIMT的表达量或活性。这种情况下，例如，优选包含测定被实验者的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性的步骤，对该被试验者的皮肤细胞进行紫外线照射的步骤，测定紫外线照射后被试实验者的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性的步骤，以及比较紫外线照射前后PIMT的表达量或活性的步骤。

对紫外线照射前后的PIMT的表达量或活性的比较，适用于对由紫外线引起的皮肤老化的复原或修复活性的评估，以及对由紫外线引起的皮肤老化的抗老化活性的评估。与紫外线照射前相比，照射后的PIMT的表达量或活性的降低越小，评估为针对由紫外线引起的皮肤老化的复原或修复活性，以及针对由紫外线引起的皮肤老化的抗老化活性越高。

此外，作为其他实施方式的一个例子，可以将对皮肤进行规定的皮肤护理的情况下的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性与未进行皮肤护理的情况下的PIMT的表达量或活性进行对比。此对比也可是对皮肤护理前后的PIMT的表达量或活性的对比。由此，可以对由皮肤护理引起皮肤的复原或修复活性的变化或皮肤的抗老化活性的变化进行评估。例如，通过某种皮肤护理，相较于未实施该护理的情况，PIMT的表达量或活性增加的情况下，可以评估为该皮肤护理可以提高皮肤的复原或修复活性以及皮肤的抗老化活性。

进一步，还可以将摄入某种食品或成分时的皮肤细胞的PIMT的表达量或活性与未摄入该食品或成分时的PIMT的表达量或活性进行对比。由此，可评估由该食品或成分引起的皮肤的复原或修复活性的变化，或皮肤的抗老化活性的变化。例如，由于摄入某食品或成分，相对于未摄入该食品或成分的情况，PIMT的表达量或活性增加时，可以评估由该食品或成分的摄入，可以提高皮肤的复原或修复活性以及皮肤的抗老化活性。

具有存在于皮肤中的PIMT的活化作用的物质、具有皮肤的复原或修复促进作用的物质及具有皮肤的抗老化作用的物质，可以由下述方法进行筛选。

<用于存在于皮肤中的PIMT的活化、皮肤的复原或修复促进或皮肤的抗老化的有效成分的筛选方法>

本发明的筛选方法，是筛选用于存在于皮肤中的PIMT的活化、皮肤的复原或修复促进或皮肤的抗老化的有效成分的方法。在本发明的筛选方法中，以皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性为指标。

以皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性为指标，可以筛选用于存在于皮肤中的PIMT的活化、皮肤的复原或修复促进或皮肤的抗老化的有效成分，换言之，可筛选具有存在于皮肤中的PIMT的活化作用的物质、具有皮肤的复原或修复促进作用的物质及具有皮肤的抗老化作用的物质。

本发明的筛选方法，通常为在活体外(in vitro)实施的方法(在活体外的筛选方法)。

作为本发明的筛选方法中使用的皮肤细胞，可列举人类或非人类哺乳动物的皮肤细胞。皮肤细胞，也可以是采集于上述被试验者的细胞，优选使用培养皮肤细胞。例如，可以使用人类表皮角化细胞、人类真皮成纤维细胞等培养皮肤细胞。使用的皮肤细胞，优选使其增殖至汇合状态之物。对细胞增殖时的培养条件并无特殊限定，只需要根据细胞采用公知的条件即可。

本发明的筛选方法，优选包含使被试验物质与上述皮肤细胞接触，并测定上述皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性的步骤，以及与上述被试验物质接触的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性相比于未与上述被试验物质接触的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性较大时，将上述被试验物质选为有效成分的步骤。

对于被试验物质并无特殊限定，例如可列举植物萃取液、细胞萃取液、发酵产物、蛋白质、肽、维生素类及合成化合物等。这些可以为已知物质，也可以为新物质。

针对使被试验物质与皮肤细胞接触的方法，只要被试验物质可与该细胞接触，并无特殊限定。例如若是培养皮肤细胞，将被试验物质，添加到培养该皮肤细胞的培养基中即可。此时，优选将已添加被试验物质的培养基中的皮肤细胞培养规定的时间后，测定该细胞中的PIMT的表达量或活性。培养基、培养条件等，可以根据细胞种类等适当设定。培养时间并无特殊限定，只要根据培养条件等适当设定即可。例如，在已添加被试验物质的培养基中，将皮肤细胞培养优选5～72小时，更优选12～48小时即可。作为培养基的一个例子，可列举α-MEM培养基。培养基中，也可以添加血清(例如，牛胎儿血清)。培养基也可以使用市场销售品。

皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性的测定，可由上述方法实施。

此外，如上所述，由于皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性因紫外线而减少，例如，也可以在使被试验物质与皮肤细胞接触前或后，对该皮肤细胞照射紫外线。已照射紫外线的情况下，已接触被试验物质的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性，相对于未与上述被试验物质接触的皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性较大时，该被试验物质，可以说对存在于皮肤中的PIMT的活化作用高。此外，认为该被试验物质，抑制由紫外线引起的皮肤中的异构化蛋白质的复原或修复活性的作用、即对于由紫外线引起的皮肤的老化的皮肤复原或修复作用高。此外，认为该被试验物质，对由紫外线引起的皮肤的老化的抗老化作用高。

未与被试验物质接触的皮肤细胞为对照组。作为对照组，也可以使用已接触了用与已知的抗老化剂的有效成分等代替被试验物质的皮肤细胞。若使用与已知的抗老化剂的有效成分等接触的皮肤细胞作为对照组，可以选出比该已知的有效成分有更高的存在于皮肤中的PIMT活化作用的被试验物质，有更高的皮肤复原或修复作用的被试验物质，或者有更高的皮肤的抗老化作用的物质。

通过本发明的筛选方法得到的有效成分，可以活化皮肤中的PIMT。由此可以促进皮肤的复原或修复。此外，通过本发明的筛选方法得到的有效成分，可以预防或改善上述皮肤的老化。更具体的说，基于促进皮肤细胞中的异构化Asp转换为L-Asp的活性，可以预防或改善皮肤的老化。

本发明还包含将皮肤细胞中蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)的表达量或活性用作皮肤复原或修复活性或者皮肤的抗老化活性的指标的应用。更具体的说，可以将皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性的程度作为上述活性的程度的指标使用。皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性适合作为皮肤的复原或修复活性的指标使用。此外，皮肤细胞中的PIMT的表达量或活性适合作为皮肤的抗老化活性的指标使用。

本发明还包含以下等应用。

一种应用，其特征在于，为了活化蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)而应用选自桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物、菊科山金车属植物及蔷薇科桃属植物中的1种以上的植物的萃取物。

一种应用，其特征在于，为了促进含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复而应用选自桦木科桦木属植物、葡萄科葡萄属植物、豆科大豆属植物、大麻科葎草属植物、唇形科植物、芸香科柑橘属植物、菖蒲科菖蒲属植物、菊科山金车属植物及蔷薇科桃属植物中的1种以上的植物的萃取物。

上述应用，优选为在人类或非人类哺乳动物中的应用。应用可以是治疗性的应用，也可以是非治疗性的应用。上述应用可以是用于非治疗性的美容目的的应用。植物萃取物的优选形态如上所述。植物萃取物可以直接使用，也可以作为含有植物萃取物的组合物使用。植物萃取物可以上述皮肤外用剂、饮食品等的形态使用。

本发明也包含用于制造PIMT活化用组合物的上述植物萃取物的应用；用于制造含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复用组合物的上述植物萃取物的应用。植物萃取物的优选形态如上所述。

实施例

以下，示出能更加具体的说明本发明的实施例。另外，本发明并不仅限定于这些实施例。

以下实验中使用的蛋白质萃取试剂为Thermo公司制造，商品名为M-PER(注册商标)Mammalian Protein Extraction Reagent。在试验例中，显著性差异的测定是通过学生t-分布检验来完成的。

<试验例1>

皮肤细胞中的PIMT表达量的测定

使用来自成人的正常人类表皮角化细胞(NHEK-AD:由仓敷纺绩株式会社购入)、来自成人的正常人类真皮成纤维细胞(NHDF-AD:由仓敷纺绩株式会社购入以及NHDF-Ad:由Lonza公司购入)以及来自新生儿的人类皮肤成纤维细胞(NHDF-NB:由仓敷纺绩株式会社购入以及NHDF-Neo:由Lonza公司购入)，对人类皮肤中的蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)的蛋白质表达量进行了评估。将悬浮有各种细胞的培养基播种于100mm的培养皿，于37℃、二氧化碳浓度为5vol％中培养至汇合状态。用蛋白质萃取试剂从已达到汇合状态的细胞中将可溶性蛋白质回收至该萃取试剂，测定每蛋白质量的PIMT量。将此每蛋白质量的PIMT量作为PIMT的表达量。使用ELISA Kit for Homo sapiens(Human)Protein L-Isoaspartate-O-Methyltransferase(PCMT1)(CLOUD-CLONE公司制)，按其所附说明书对PIMT量进行了测定。此外，作为表达量的指标，将已被报告可表达PIMT的来自胎儿的人类肾细胞(HEK293)的细胞溶解液(Santa Cruz公司制)用于阳性对照。

结果如图1所示。图1为表示皮肤细胞中的PIMT表达量(每蛋白质量的PIMT量)的图表。

所有来自皮肤的NHEK细胞及NHDF细胞中，虽然如果与HEK293细胞相比则较低，但显示了PIMT会进行表达。

以下试验例2～8中使用的来自新生儿的正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF-NB)与试验例1中所使用的NHDF-NB相同。如无特别声明，细胞均于37℃、二氧化碳浓度为5vol％中培养。

<试验例2>

PIMT对于由紫外线B波(UVB)照射生成的皮肤蛋白质中的异构化天冬氨酸的修复作用的研究

使用由UVB照射而诱导了天冬氨酸异构化的来自新生儿的正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF-NB)的蛋白质，对PIMT对于皮肤蛋白质中的异构化天冬氨酸是否有修复作用的问题进行了研究。具体而言，将悬浮有NHDF-NB细胞的培养基播种于培养皿，在37℃、二氧化碳浓度为5vol％中培养至汇合状态。用蛋白质萃取试剂从达到汇合状态的细胞中回收蛋白质后，对该蛋白质进行一定时间的UVB照射，使用ISOQUANT(注册商标)IsoaspartateDetection Kit(Promega公司制)，按其所附说明书对作为异构化天冬氨酸的L-β-Asp量进行了测定。本试剂盒是利用PIMT对蛋白质或肽中的异天冬氨酸作用时，将辅酶S-adenosyl-L-methionine(SAM)的甲基转移至异天冬氨酸的α-羧基，生成SAM的脱甲基化物S-adenosylhomocystein(SAH)的事实，通过定量SAH间接的对异天冬氨酸残基进行定量的方法。此外，将已知的1个分子中仅含有1处异天冬氨酸的Delta睡眠诱导多肽(DSIP)用于阳性对照。由阳性对照的结果，确认了上述反应发生，并能确认检测出了生成的SAH。另外，定量结果以各试验样本的每蛋白质量中的SAH量算出。

结果如图2所示。图2为表示由UVB照射所引起的每蛋白质量的SAH生成量的图表。图2的数据以平均值±标准差(n＝3)表示。图2中，*表示与UVB照射时间0分有显著性差异(*:p<0.05)。SAH生成量越多意味着异构化天冬氨酸的生成量越多。

虽然在来自未照射UVB的NHDF-NB细胞的蛋白质中也检测出一定量的SAH，但依存于UVB照射时间(40分、60分)SAH量增加。NHDF-NB是真皮成纤维细胞。由此结果，显示了在来自真皮成纤维细胞的蛋白质中，UVB的照射可诱导天冬氨酸的异构化，此外，显示了PIMT对皮肤蛋白质中的异构化天冬氨酸有作用。

<试验例3>

继代数不同的真皮成纤维细胞中的PIMT表达量的评估

已知如果对细胞进行反复的继代培养，细胞老化加重，最终丧失分裂机能。因此，将反复进行继代培养的来自新生儿的正常人类皮肤成纤维细胞(真皮成纤维细胞)用作老化的模型。

为了验证因老化PIMT的表达量会如何变化，用反复继代培养的来自新生儿的正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF-NB，由仓敷纺绩株式会社购入)验证了PIMT的蛋白质表达量的变化。播种反复进行继代培养的NHDF-NB细胞(继代数(P)：3、6、10、12、15及17)，于37℃、二氧化碳浓度为5vol％中培养至汇合状态。用蛋白质萃取试剂从达到汇合状态的细胞中将可溶性蛋白质回收至该萃取试剂，并测定每蛋白质量的PIMT量。采用和试验例1相同的方法对PIMT量进行了测定。

图3为表示继代数不同的皮肤成纤维细胞中的PIMT表达量(每蛋白质量的PIMT量)的图表。证实了在反复继代培养6次以上的NHDF-NB细胞中，每蛋白质量的PIMT表达量有降低的趋势。确认在已老化的皮肤组织中异构化天冬氨酸会累积，由于老化加剧的细胞中的蛋白质中可以修复异构化天冬氨酸的PIMT的表达降低，假定异构化天冬氨酸的累积会增加。

<试验例4>

各式各样的压力负荷下PIMT表达量的变化

为了调查PIMT的表达量是否会受外界环境的影响，对来自新生儿的正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF-NB)给予UVB照射、引发炎症、营养枯竭及活性氧等刺激，验证PIMT的蛋白质表达量的变化。将细胞播种于100mm的培养皿中，于37℃、二氧化碳浓度为5vol％中培养。培养中使用含有10％牛血清(FBS)的α-MEM培养基(SIGMA公司制)。如下，使已到达汇合状态的细胞负荷各种刺激。

(1)活性氧族(过氧化氢(H₂O₂))暴露所引起的对PIMT表达量的影响验证

去除培养上清液，更换成添加过氧化氢水(Nacalai Tesque公司制)使最终浓度成为10μM的新鲜的含有FBS的α-MEM培养基。

(2)UVB暴露所引起的对PIMT表达量的影响验证

去除培养上清液，更换成汉克斯平衡盐溶液(Nacalai Tesque公司制)后，照射UVB(累积光量约5.7mJ/cm²)。照射后，更换为含有新鲜FBS的α-MEM培养基。

(3)低营养状态下对PIMT表达量的影响验证

将含有10％FBS的α-MEM培养基更换成未添加FBS的α-MEM培养基。

根据上述(1)～(3)的方法施加刺激后，从经过48小时培养的细胞中将可溶性蛋白质回收至蛋白质萃取试剂，测定每蛋白质量的PIMT量。上述PIMT量的测定用和试验例1相同的方法进行。此外，作为对照组，使用了未负荷上述(1)～(3)的刺激而更换成含有10％FBS的α-MEM培养基的细胞。

图4为表示因压力负荷而引起的皮肤成纤维细胞中的PIMT表达量(每蛋白质量的PIMT量)的变化的图表

图4的数据以平均值±标准差(n＝3)表示。*表示和对照组有显著性差异(*:p<0.05)。在过氧化氢(H₂O₂)暴露、UVB暴露及低营养下的任何一个中，与对照组的细胞比较PIMT表达量明显降低。由这些，可以假定暴露于紫外线的皮肤、暴露于活性氧族等的皮肤及伴随年龄增长营养状态降低的皮肤中，因PIMT的表达降低，异构化天冬氨酸的累积增加。

<调制例1>来自植物的萃取物的调制

用于萃取的植物以及其部位如下。

将上述(1)、(3)～(5)以及(7)～(13)的植物的粉碎物分别浸于其质量10倍量的30～90vol％乙醇水溶液中，于室温下施加1日1次的搅拌操作，萃取10分钟～7天时间。之后，通过过滤去除残渣，得到萃取液。将该萃取液浓缩后，通过冷冻干燥得到各植物的萃取物(乙醇萃取物)的粉末。将该粉末状植物萃取物用于试验例5～8的评估。

对于(2)紫苏，使用1，3-丁二醇水溶液代替乙醇水溶液以上述方法进行萃取。萃取后，通过过滤去除残渣，得到萃取液(紫苏的丁二醇萃取液)。将该萃取液浓缩后，通过冷冻干燥得到紫苏萃取物(乙二醇萃取物)的粉末。将该粉末状的紫苏萃取物用于试验例5～6的评估。

对于上述(6)的大豆，将大豆的胚芽粉碎，用其质量10倍量的热水萃取。然后，通过过滤去除残渣，得到萃取液(大豆的水萃取液)。将该萃取液浓缩后，通过冷冻干燥得到大豆萃取物(水萃取物)的粉末。将该粉末状的大豆萃取物用于试验5～6的评估。

<试验例5>

植物萃取物的添加所引起的皮肤细胞中的PIMT表达量的变化

使用来自新生儿的人类真皮成纤维细胞(NHDF-NB::由仓敷纺绩株式会社购入)，对添加调制例1中调制的植物萃取物后，人类皮肤中的PIMT蛋白质的表达量进行评估。

将细胞播种于100mm的培养皿，于37℃，二氧化碳浓度5vol％中培养至汇合状态。然后，在得到的细胞中添加表1或表2中记载的浓度为10μg/mL的各植物萃取物，并培养24小时。另外，培养基使用了未添加FBS的α-MEM培养基，植物萃取物溶解于二甲基亚砜(DMSO)，添加直至培养基中的DMSO的最终浓度为0.1质量％。此外，对照组使用含有0.1质量％DMSO的培养基。

添加植物萃取物24小时后，去除培养上清液，更换成汉克斯平衡盐溶液(NacalaiTesque公司制)，并照射UVB(累积光量约5.7mJ/cm²)。照射后，更换为添加了上述植物萃取物的DMSO溶液的含有新鲜10％FBS的α-MEM培养基(植物萃取物的最终浓度为10μg/mL、DMSO的最终浓度为0.1质量％)，并进一步培养48小时。此培养后，以从细胞中将可溶性蛋白质回收至蛋白质萃取试剂之物为样本，测定每蛋白质量的PIMT量(PIMT质量/蛋白质的质量)。使用ELISA Kit for Homo sapiens(Human)Protein L-Isoaspartate-O-Methyltransferase(PCMT1)(CLOUD-CLONE公司制)，按其所附说明书对PIMT量进行了测定。

在本实验中，按照上述顺序对各植物萃取物以n＝3调制样本。上述PIMT量的测定，对各样本各实施了2次，将其平均值作为测定值。针对各植物萃取物，将此各样本的测定值(n＝3)的平均值作为PIMT的定量结果。

结果如表1及表2所示。表1所示的(1)～(6)的植物萃取物、表2所示的(7)～(12)的植物萃取物，各自以相同的试验系统进行了试验。

表1及表2中，“对照组”是未照射UVB的对照组，“对照组(+UV)”是照射了UVB的对照组。在表1及表2中，UV照射的“-”，意味着未照射UVB，“+”意味着照射了UV。表中“*”及“**”，表示着与“对照组(+UV)”有显著性差异(*:p<0.05、**:p<0.01)。

PIMT的定量结果，以将照射了UVB的对照组(对照组(+UVB))的每蛋白质量的PIMT量(PIMT表达量)换算成100％的相对值(％)(PIMT表达量(％))的方式表示。此外，以“恢复率(％)”的形式表示针对UVB照射所引起的PIMT表达量的降低，植物萃取物显示出何种程度的恢复作用。恢复率(％)，由未照射UV的对照组的PIMT表达量(C0)、照射了UV的对照组的PIMT表达量(C1)及添加了各植物萃取物的细胞的PIMT表达量(S)，由以下计算求出。

恢复率(％)＝100×((S)-(C1))/((C0)-(C1))

在未添加植物萃取物而进行了UVB照射的细胞(对照组(+UV))中，PIMT表达量显著降低。此外，在添加了延命草、紫苏、白桦、香橙、鼠尾草、大豆、山金车、菖蒲、薰衣草、桃及啤酒花的各萃取物的细胞中，对比未添加这些植物萃取物并照射了UVB的细胞的结果，PIMT表达量较多。特别得自白桦、大豆、菖蒲、薰衣草、桃、啤酒花、鼠尾草及延命草的萃取物，其作用显著。白桦、大豆、延命草、鼠尾草及薰衣草的萃取物，确认与对照组(+UV)有显著性差异。

[表1]

样本No.	植物萃取物	UV照射	PIMT表达量(％)	恢复率(％)
					对照组	-	-	165.7	-
对照组(+UV)	-	+	100.0	0.0
					(1)	延命草	+	107.7*	11.8*
(2)	紫苏	+	108.7	13.2
					(3)	白桦	+	126.6**	40.5**
(4)	香橙	+	114.3	21.7
					(5)	鼠尾草	+	116.1*	24.6*
(6)	大豆	+	117.0**	25.8**

[表2]

样本No.	植物萃取物	UV照射	PIMT表达量 (％)	恢复率(％)
					对照组	-	-	194.4	-
对照组(+UV)	-	+	100.0	0.0
					(7)	山金车	+	110.7	11.3
(8)	杏	+	88.5	-12.2
					(9)	菖蒲	+	124.0	25.4
(10)	薰衣草	+	139.5*	41.8*
					(11)	桃	+	121.5	22.7
(12)	啤酒花	+	147.4	50.2

<试验例6>

植物萃取物的添加所引起的皮肤细胞中的PIMT表达量的变化

用调制例1中调制的白桦萃取物、鼠尾草萃取物、大豆萃取物、延命草萃取物及薰衣草萃取物进行以下的评估。

用与试验例5相同的方法，将来自新生儿的真皮成纤维细胞(NHDF-NB:由仓敷纺绩株式会社购入)培养至汇合状态。

然后，在得到的细胞中以10μg/mL的浓度添加各植物萃取物并培养24小时。另外，培养基使用未添加FBS的α-MEM培养基，植物萃取物溶解于DMSO中，添加直至培养基中的DMSO的最终浓度为0.1质量％。对照组中使用了含有0.1质量％DMSO的培养基。

添加植物萃取物24小时后，去除培养上清液，更换为添加了上述植物萃取物的DMSO溶液的新鲜的含有10％FBS的α-MEM培养基(植物萃取物的最终浓度为10μg/mL，DMSO的最终浓度为0.1质量％)，进一步培养24小时。此培养后，以从细胞中将可溶性蛋白质回收至蛋白质萃取试剂之物为样本，用与试验例5相同的方法，测定每蛋白质量的PIMT量(PIMT质量/蛋白质的质量)。

在本实验中，以上述顺序对各植物萃取物以n＝3或n＝4调制样本。PIMT量的测定，对各样本各实施了2次，将其平均值作为各样本的测定值。对于各植物萃取物，将此各样本的测定值(n＝3或n＝4)的平均值作为PIMT的定量结果。

结果如表3所示。表3在添加了各植物萃取物的情况下，以将对照组的PIMT表达量设为100％的相对值(％)(PIMT表达量(％))的方式表示。在表3中，“*”表示与对照组有显著性差异(*:p<0.05)。

[表3]

样本	PIMT表达量(％)
		对照组	100.0
白桦	108.2*
		鼠尾草	118.0
大豆	111.4
		延命草	104.1
薰衣草	106.5

如表3所示，若对皮肤细胞添加白桦、鼠尾草、大豆、延命草及薰衣草的各萃取物，与对照组相比，PIMT的表达量增加。此结果显示这些植物的萃取物具有皮肤中的PIMT的活化作用。可确认白桦萃取物与对照组有显著性差异。

<试验例7>

植物萃取物的添加所引起的皮肤细胞中的PIMT表达量的变化

针对在来自新生儿的人类真皮成纤维细胞(NHDF-NB:由仓敷纺绩株式会社购入)中添加调制例1中调制的葡萄萃取物时，人类皮肤中的PIMT的蛋白质表达量进行评估。

用与试验例5相同的方法，将细胞培养至汇合状态。然后，在得到的细胞中以2.5μg/mL、5μg/mL或10μg/mL的浓度添加葡萄萃取物并培养24小时。另外，培养基使用未添加FBS的α-MEM培养基，葡萄萃取物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，添加直至培养基中的DMSO的最终浓度为0.1质量％。对照组中使用了含有0.1质量％DMSO的培养基。

添加葡萄萃取物24小时后，去除培养上清液，更换成汉克斯平衡盐溶液(NacalaiTesque公司制)，并照射UVB(累积光量约5.7mJ/cm²)。照射后，更换为添加了葡萄萃取物的DMSO溶液的新鲜的含有10％FBS的α-MEM培养基(葡萄萃取物的最终浓度为2.5μg/mL、5μg/mL或10μg/mL，DMSO的最终浓度为0.1质量％)，并进一步培养48小时。此培养后，以从细胞中将可溶性蛋白质回收至蛋白质萃取试剂之物为样本，用和试验例5相同的方法，测定每蛋白质量的PIMT量(PIMT质量/蛋白质的质量)。

在本实验中，以上述顺序对各植物萃取物以n＝4调制样本。PIMT量的测定，对各样本各实施了2次，将其平均值作为测定值。对于各植物萃取物，将此各样本的测定值(n＝4)的平均值作为PIMT的定量结果。

结果如表4所示。表4中，“对照组”是未照射UVB的对照组，“对照组(+UV)”是照射了UVB的对照组。在表4中，UV照射的“-”，意味着未照射UVB，“+”意味着照射了UV。“**”表示与“对照组(+UV)”有显著性差异(**:p<0.01)。

PIMT的定量结果，以将照射了UVB的对照组(对照组(+UV))的每蛋白质量的PIMT量(PIMT表达量)设为100％的相对值(％)(PIMT表达量(％))的方式表示。此外，以“恢复率(％)”表示针对由UVB照射所引起的PIMT表达量的降低，葡萄萃取物显示出何种程度的恢复作用。恢复率(％)，采用和试验例5相同的方法求得。

[表4]

样本	UV照射	PIMT表达量(％)	恢复率(％)
				对照组	-	183.1	-
对照组(+UV)	+	100.0	0.0
				葡萄萃取物2.5μg/mL	+	123.6**	28.4**
葡萄萃取物5μg/mL	+	120.9**	25.2**
				葡萄萃取物10μg/mL	+	106.1	7.3

在已添加葡萄萃取物的细胞中，与未添加该萃取物并进行了UVB照射的细胞相比，PIMT表达量较多。显示了葡萄萃取物抑制由UVB照射所引起的PIMT表达量的降低。

<试验例8>

然后，在得到的细胞中以2.5μg/mL或5μg/mL的浓度添加调制例1中调制的葡萄萃取物并培养24小时。另外，培养基使用未添加FBS的α-MEM培养基，葡萄萃取物溶解于DMSO中，添加直至培养基中的DMSO的最终浓度为0.1质量％。对照组中使用了含有0.1质量％DMSO的培养基。

添加葡萄萃取物24小时后，去除培养上清液，更换为添加了葡萄萃取物的DMSO溶液的新鲜的含有10％FBS的α-MEM培养基(葡萄萃取物的最终浓度为2.5μg/mL或5μg/mL，DMSO的最终浓度为0.1质量％)，进一步培养24小时。此培养后，以从细胞中将可溶性蛋白质回收至蛋白质萃取试剂之物为样本，用与试验例5相同的方法，测定每蛋白质量的PIMT量(PIMT质量/蛋白质的质量)。

在本实验中，以上述顺序对各浓度的葡萄萃取物以n＝5调制样本。PIMT量的测定，对各样本各实施了2次，将其平均值作为测定值。将此各样本的测定值(n＝5)的平均值作为PIMT的定量结果。

结果如表5所示。表5，在添加了葡萄萃取物的情况下，以将对照组的PIMT表达量设为100％的相对值(％)(PIMT表达量(％))的方式表示。表5中，“*”表示与对照组有显著性差异(*:P<0.05)。如果在皮肤细胞中添加葡萄萃取物，那么与对照组相比，PIMT的表达量显著增加。

[表5]

样本	PIMT表达量(％)
		对照组	100.0
葡萄萃取物2.5μg/mL	108.6*
		葡萄萃取物5μg/mL	119.4*

将调配了白桦、葡萄、大豆、啤酒花、薰衣草、鼠尾草、延命草、香橙、紫苏、菖蒲、山金车及桃的各植物的萃取物的化妆料、饮食品的制造例示于以下。这些化妆料、饮食品可以作为PIMT活化用化妆料或饮食品使用，特别，适合作为存在于皮肤中的PIMT活化用化妆料或饮食品。此外，这些化妆料、饮食品可以作为异构化蛋白质的复原或修复促进用化妆料或饮食品使用，适合作为皮肤中的异构化蛋白质的复原或修复促进用化妆料或饮食品使用。

制造例1～3中使用的植物萃取物，是将调制例1中得到的各植物(白桦、葡萄、啤酒花、薰衣草、鼠尾草、延命草、香橙、菖蒲、山金车及桃)的乙醇萃取液、紫苏的丁二醇萃取液或大豆水萃取液，各自浓缩至固体成分浓度0.12质量/体积％之物。制造例4中的植物萃取物，各自使用调制例1中得到的各植物萃取物(将上述各植物的乙醇萃取液、紫苏的丁二醇萃取液或大豆水萃取液冷冻干燥后的粉末)。制造例1～4中，使用白桦、葡萄、啤酒花、薰衣草、鼠尾草、延命草、香橙、紫苏、菖蒲、山金车、桃及大豆的各萃取物作为植物萃取物，也可以组合使用这些的2种以上的植物的萃取物。

<制造例1>

化妆水

将表6所记载的原料搅拌至均匀，调制PIMT活化用化妆水。

[表6]

<制造例2>

乳液

将表7中记载的原料搅拌至均匀，调制PIMT活化用乳液。

[表7]

<制造例3>

乳霜

将表8所记载的原料搅拌至均匀，调制PIMT活化用乳霜。

[表8]

<制造例4>

使用时溶解用粉末

将表9所记载的原料搅拌至均匀，调制PIMT活化用粉末。使用时溶解用粉末，例如，可使其溶解于水、咖啡、红茶及果汁等饮料或混合至酸奶等食品中使用。

[表9]

<试验例9>

以皮肤细胞中PIMT的表达量或活性为指标，可筛选具有存在于皮肤中的PIMT的活化作用的物质、具有皮肤的复原或修复促进作用的物质或具有皮肤的抗老化作用的物质。

在试验例5～8中任一例所记载的评估方法中，使用任意的被试验物质代替植物萃取物，对添加了该被试验物质的皮肤细胞中的PIMT表达量进行评估。

已添加被试验物质并培养的细胞的PIMT表达量(每蛋白质量的PIMT量)，相比于未添加被试验物质而培养的细胞(对照组)的PIMT表达量多时，选择该被试验物质作为有效成分。作为有效成分被选出的被试验物质，可以作为用于存在于皮肤中的PIMT的活化、皮肤的复原或修复促进或皮肤的抗老化的有效成分。

产业上的可利用性

本发明在医药品、医药部外品、化妆品及饮食品等领域中有用。

Claims

1.选自白桦树皮的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、葡萄的果皮及种子的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、大豆胚芽的水萃取物、啤酒花的雌花蕊的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、薰衣草的花的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、鼠尾草的叶的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、紫苏的叶的1,3-丁二醇水溶液萃取物、延命草的叶及茎的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、香橙的果实的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、菖蒲的根的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、山金车的花的30～90vol％乙醇水溶液萃取物及桃的种子的30～90vol％乙醇水溶液萃取物中的1种以上的植物的萃取物在制造存在于人类正常皮肤中的蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶即PIMT活化用组合物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述植物的萃取物是白桦树皮的30～90vol％乙醇水溶液萃取物及/或葡萄的果皮及种子的30～90vol％乙醇水溶液萃取物。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述PIMT活化用组合物是皮肤外用剂。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述PIMT活化用组合物是化妆料。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述PIMT活化用组合物是饮食品。

6.选自白桦树皮的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、葡萄的果皮及种子的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、大豆胚芽的水萃取物、啤酒花的雌花蕊的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、薰衣草的花的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、鼠尾草的叶的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、紫苏的叶的1,3-丁二醇水溶液萃取物、延命草的叶及茎的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、香橙的果实的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、菖蒲的根的30～90vol％乙醇水溶液萃取物、山金车的花的30～90vol％乙醇水溶液萃取物及桃的种子的30～90vol％乙醇水溶液萃取物中的1种以上的植物的萃取物在制造人类正常皮肤中的含有异构化氨基酸的蛋白质的复原或修复促进用组合物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述植物的萃取物是白桦树皮的30～90vol％乙醇水溶液萃取物及/或葡萄的果皮及种子的30～90vol％乙醇水溶液萃取物。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述蛋白质的复原或修复促进用组合物是皮肤外用剂。

9.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述蛋白质的复原或修复促进用组合物是化妆料。

10.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述蛋白质的复原或修复促进用组合物是饮食品。