JP7213307B2 - プロテインl-イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ活性化用組成物 - Google Patents
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Description
本発明のプロテインL-イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ(PIMT)活性化用組成物は、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される1種以上の植物の抽出物を含む。
上記植物の抽出物は、PIMTを活性化する作用を有する。
本発明のPIMT活性化用組成物は、皮膚に存在するPIMT活性化用組成物であることが好ましい。上記植物の抽出物は、皮膚に存在する(皮膚中の)PIMT活性化のために有用である。
上記植物の抽出物は、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ユズ、シソ、ショウブ、アルニカ及びモモからなる群より選択される1種以上の植物の抽出物であることが好ましい。これらの植物の抽出物は、PIMTを活性化する作用が高いため好ましい。PIMTを活性化する作用が特に高いことから、上記植物の抽出物は、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ラベンダー、セージ及びエンメイソウからなる群より選択される1種以上の植物の抽出物であることがより好ましい。
本発明の異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物は、皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物であることが好ましい。
上記植物の抽出物としては、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ユズ、シソ、ショウブ、アルニカ及びモモからなる群より選択される1種以上の植物の抽出物が好ましく、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ラベンダー、セージ及びエンメイソウからなる群より選択される1種以上の植物の抽出物がより好ましい。これらの植物の抽出物は、PIMTを活性化する作用が高いことから、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進作用が高い。
本発明のタンパク質の復元又は修復促進用組成物は、皮膚外用剤であることが好ましく、化粧料であることがより好ましい。
また、本発明における別の好ましい態様の一例として、本発明のタンパク質の復元又は修復促進用組成物が飲食品であることも好ましい。
本発明の皮膚の復元又は修復活性の評価方法においては、上記皮膚細胞が、表皮細胞及び/又は真皮細胞であることが好ましい。
上記皮膚の復元又は修復活性として、紫外線及び/又は加齢による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性が挙げられる。本発明の評価方法は、紫外線及び/又は加齢によるアミノ酸の異性化に対する皮膚の復元又は修復活性を評価するために好適に使用される。
本発明の皮膚の抗老化活性の評価方法においては、上記抗老化活性が、紫外線及び/又は加齢による皮膚の老化に対する抗老化活性であることが好ましい。本発明の皮膚の抗老化活性の評価方法は、紫外線及び/又は加齢による皮膚の老化に対する抗老化活性を評価するために好適に使用される。
本発明のスクリーニング方法は、皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性を指標とすることにより、皮膚に存在するPIMTの活性化作用を有する物質、皮膚の復元若しくは修復促進作用を有する物質、又は、皮膚の抗老化作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
上記被験物質を接触させた皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性が、上記被験物質を接触させなかった皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性と比較して大きい場合に、上記被験物質を有効成分として選択する工程を含むことが好ましい。
上記皮膚細胞は、培養皮膚細胞であることが好ましい。
プロテインL-イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ(PIMT)を活性化するための、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される1種以上の植物の抽出物の使用。
異性化したアミノ酸を含むタンパク質を復元又は修復促進するための、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される1種以上の植物の抽出物の使用。
異性化アスパラギン酸(異性化Asp)とは、より具体的には、D-アスパラギン酸(D-Asp)、D型又はL型のイソアスパラギン酸(D-又はL-isoAsp)であり、好ましくはD-Asp、L-isoAspである。D-isoAsp及びL-isoAspは、それぞれD-β-Asp及びL-β-Aspとも呼ばれる。
PIMTの活性化は、PIMTの発現増強、PIMTの発現促進、PIMTの発現低下抑制、PIMTの発現回復等、PIMTの作用を増強又は促進する任意の作用、該作用の低下を抑制する任意の作用を包含する。
本発明のPIMT活性化用組成物は、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される1種以上の植物の抽出物を含む。
上記植物の抽出物は、PIMTを活性化する作用を有する。従ってこれらの植物の抽出物は、PIMT活性化用組成物の有効成分として好適に使用される。また、上記植物の抽出物は、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進のためにも有効であり、該異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物の有効成分としても好適に使用される。
上記1種以上の植物の抽出物を含む、異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物(以下、異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物ともいう)も、本発明の1つである。本発明のPIMT活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、通常、上記植物の抽出物を有効成分として含むものである。
PIMT活性化用組成物は、皮膚に存在するPIMT活性化用組成物として好適である。異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物として好適である。
カバノキ科カバノキ属(Betulaceae Betula)植物としては、例えば、シラカバ(Betula pendula又はBetula alba)が挙げられる。
ブドウ科ブドウ属(Vitaceae Vitis)植物としては、例えば、ブドウ(Vitis spp.)が挙げられる。ブドウの品種は特に限定されないが、例えば、カベルネ・ソーヴィニヨン、コンコード、メルロー、マスカットベリーA等の黒ブドウ;シャルドネ、甲州等の白ブドウ等が挙げられる。中でも、黒ブドウが好ましく、カベルネ・ソーヴィニヨン、メルロー等がより好ましい。
アサ科カラハナソウ属(Cannabaceae Humulus)植物としては、ホップ(Humulus lupulus)が挙げられる。
シソ科(Lamiaceae)植物としては、ラベンダー(Lavandula angustifolia)等のラヴァンドラ属(Lavandula);セージ(Salvia officinalis)等のアキギリ属(Salvia);エンメイソウ(Rabdosia japonica (Isodon japonicus)又はRabdosia trichocarpa (Isodon trichocarpus))等のヤマハッカ属(Isodon);シソ(Perilla frutescens var. Crispa)等のシソ属(Perilla)の植物が挙げられる。
ミカン科ミカン属(Rutaceae Citrus)植物としては、ユズ(Citrus junos)が挙げられる。
ショウブ科ショウブ属(Acoraceae Acorus)植物としては、ショウブ(Acorus calamus)が挙げられる。
キク科アルニカ属(Asteroideae Arnica)植物としては、アルニカ(Arnica montana)が挙げられる。
バラ科モモ属(Rosaceae Amygdalus)植物としては、モモ(Amygdalus persica)が挙げられる。
中でも、皮膚等に存在するPIMTを活性化する作用が高いことから、上記シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ユズ、シソ、ショウブ、アルニカ、モモの抽出物が好ましく、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウ、ショウブの抽出物がより好ましく、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ホップ、ラベンダー、セージ、エンメイソウの抽出物がさらに好ましく、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ラベンダー、セージ、エンメイソウの抽出物がさらに好ましく、シラカバ、ブドウ、ダイズ、ラベンダーの抽出物がさらにより好ましい。中でも、植物抽出物として、シラカバ抽出物、ブドウ抽出物及びダイズの抽出物が特に好ましく、シラカバ抽出物及びブドウ抽出物が最も好ましい。これらの1種又は2種以上の植物の抽出物を用いることが好ましい。
植物の抽出物を作製するのに好ましい部位として、例えば、以下の部位が挙げられる。本発明における植物抽出物としては、植物の下記部位の抽出物が好ましい。
カバノキ科カバノキ属のシラカバは、樹皮が好ましい。
ブドウ科ブドウ属のブドウは、果実、種皮及び/又は種子が好ましく、果皮及び種子がより好ましい。
マメ科ダイズ属のダイズは、種子を用いることが好ましく、胚芽(ダイズ芽)がより好ましい。アサ科カラハナソウ属のホップは、花(より好ましくは雌花穂)が好ましい。
シソ科植物であれば、ラヴァンドラ属のラベンダーは花を、アキギリ属のセージ及びシソ属のシソは葉を、ヤマハッカ属のエンメイソウは葉及び/又は茎を、それぞれ用いるのが好ましい。
ミカン科ミカン属のユズは、果実を用いることが好ましい。ショウブ科ショウブ属のショウブは、根を用いることが好ましい。キク科アルニカ属のアルニカは、花を用いるのが好ましい。バラ科モモ属のモモは、種子を用いるのが好ましい。
上記植物の部位は、そのまま抽出工程に付されてもよく、粉砕、切断又は乾燥された後に抽出工程に付されてもよい。
一実施態様において、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物(好ましくはラヴァンドラ属、アキギリ属又はヤマハッカ属に属する植物)、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、バラ科モモ属植物の抽出物は、低級1価アルコール水溶液の抽出物が好ましい。マメ科ダイズ属植物の抽出物は、水抽出物が好ましい。シソ科シソ属植物は、多価アルコール水溶液の抽出物が好ましい。
抽出に際して酸又はアルカリを添加し、抽出溶媒のpHを調整してもよい。
抽出後には、植物残渣(抽出後の植物体又はその部分)を抽出液から除去することが好ましい。植物残渣を抽出液から除去する方法は特に限定されず、ろ過、遠心分離等の公知の分離手段が挙げられる。
さらに、上記の植物抽出液、その濃縮物や乾燥粉末について、本発明の効果を損なわない範囲で、必要に応じて、さらに脱臭、脱色等の精製を行ってもよい。このような精製方法は、通常の手段を任意に選択して行えばよく、例えば、ろ過;イオン交換樹脂、合成吸着樹脂、活性炭等の担体を用いるカラムクロマト等の各種クロマトグラフィー等を用いる方法が挙げられる。クロマトグラフィーに使用する担体の一例として、例えば、ダイヤイオンHP-20 15L(製品名、三菱化学(株)製)、Sephadex LH-20(製品名、GEヘルスケア社製)等が挙げられる。
本発明における植物の抽出物は、上記のような抽出方法で得られた各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮物又はその乾燥粉末、これらの精製物を含む。
また、上記植物の抽出物として、市販品を使用することもできる。
上述したように皮膚由来のタンパク質に紫外線を照射すると、異性化タンパク質が増加する。一方、加齢、紫外線等の要因で皮膚におけるPIMT発現量が低下する。これらの知見から、加齢、紫外線等の要因により、皮膚中の異性化タンパク質の蓄積が促進されると推定される。アミノ酸の異性化による皮膚タンパク質の変性は、皮膚の老化とも関連すると考えられる。
皮膚に存在するPIMTの活性化は、皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復を促進することから、例えば、老化した皮膚(皮膚状態又は皮膚機能)の回復促進、皮膚老化の予防又は改善等に有効であると考えられる。老化は、加齢による老化(加齢に伴う生理的老化)及び紫外線による老化(紫外線曝露による光老化)の何れか又は両方を包含する。予防は、症状の発症の防止、遅延を包含する。改善は、症状の軽快、症状の進行抑制及び完快を包含する。
上記植物抽出物を含む本発明のPIMT活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、皮膚に存在するPIMTの活性化、皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復促進に有効である。上記植物抽出物は、例えば、皮膚の老化が気になる人や、皮膚老化症状の予防又は改善を希望する人等に適用して、皮膚の回復促進、皮膚老化の予防又は改善等のために好適に使用することができる。
上記目的のための上記植物の抽出物の使用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念である。
本発明のPIMT活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、一例として、剤の形態で提供することができるが、本形態に限定されるものではない。当該剤をそのまま組成物として、又は、当該剤を含む組成物として提供することもできる。
本発明のPIMT活性化用組成物、異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物は、皮膚外用剤以外の医薬品又は医薬部外品として使用することもできる。
別の実施態様においては、PIMT活性化用組成物及び異性化タンパク質の復元又は修復促進用組成物を飲食品とすることも好ましい。上記植物の抽出物を含む飲食品は、例えば、皮膚におけるPIMT活性化のため、又は、皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復促進のために好適に使用される。上記植物の抽出物を含む飲食品は、皮膚に存在するPIMT活性化用の飲食品、皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復促進用の飲食品として使用され得る。
ヒト皮膚に存在するPIMTを活性化することにより、皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復を促進する方法も、本発明に包含される。
異性化タンパク質が復元又は修復されると、異性化により損なわれたタンパク質の機能を回復させることができる。従って本発明の方法は、例えば、老化した皮膚(皮膚状態又は皮膚機能)の回復促進、皮膚老化の予防又は改善等に有効である。
ヒト皮膚に存在するPIMTを活性化する方法として、ヒトに上記の植物抽出物を適用する方法が挙げられる。より具体的には、例えば、上記植物抽出物をヒト皮膚に適用する方法、上記植物抽出物をヒトに投与又は摂取させて適用する方法等が挙げられる。好ましくは植物抽出物をヒト皮膚に適用する。植物抽出物は、上記のPIMT活性化用組成物に記載した通りである。植物抽出物は、上述した皮膚外用剤、医薬品、医薬部外品、飲食品等の形態で適用することができる。皮膚に存在するPIMTを活性化することにより、皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復を促進することができる。
動物は、上述したヒト又は非ヒト哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。
上記PIMTの活性化方法は、好ましくは、皮膚に存在するPIMTの活性化方法である。異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進方法は、好ましくは皮膚における異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進方法である。皮膚におけるPIMTの活性化及び異性化タンパク質の復元又は修復促進においては、上記植物抽出物を、皮膚に接触させることが好ましい。本発明の好ましい態様においては、上記植物の抽出物を動物の皮膚に適用する。例えば、上記植物抽出物を含む皮膚外用剤をヒト等の動物の皮膚に適用することにより、上記植物の抽出物をその皮膚細胞に接触させることができる。植物の抽出物及びその好ましい態様、好ましい使用量等は上述した通りである。皮膚外用剤も上述した通りである。一態様において、上記方法は非治療的な方法(医療行為を含まない方法)であることが好ましい。
皮膚に存在するPIMTの発現量又は活性を指標として、皮膚の復元又は修復活性、皮膚の抗老化活性を評価することができる。
本発明の皮膚の復元又は修復活性の評価方法は、皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性を指標とする。本発明の皮膚の抗老化活性の評価方法は、皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性を指標とする。
本明細書中、本発明の皮膚の復元又は修復活性の評価方法、及び、本発明の皮膚の抗老化活性の評価方法を、本発明の評価方法ともいう。
また、上述したように、アミノ酸の異性化による皮膚タンパク質の変性は、皮膚の老化とも関連すると考えられる。皮膚中の異性化タンパク質が復元又は修復されることにより、例えば、老化した皮膚の機能等が回復すると考えられる。従って皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性は、皮膚の抗老化活性の指標としても有用である。本発明における抗老化は、老化、好ましくは皮膚の老化の予防又は改善である。老化は、加齢による老化及び紫外線による老化の何れか又は両方を包含する。
また、例えば、皮膚細胞におけるPIMTの発現は、紫外線及び/又は加齢により低下するが、紫外線及び/又は加齢によるPIMTの発現低下が少ない皮膚では、紫外線及び/又は加齢による皮膚のタンパク質の異性化を復元又は修復する活性が高い。皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性を指標とすると、このような紫外線及び/又は加齢による皮膚の復元又は修復活性の低下を抑制する、紫外線及び/又は加齢による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性を評価することもできる。
本発明の皮膚の復元又は修復活性の評価方法は、紫外線及び/又は加齢による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性の評価方法として使用され得る。本発明の皮膚の抗老化活性の評価方法は、紫外線及び/又は加齢による皮膚の老化に対する抗老化活性の評価方法として使用され得る。
例えば、皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性が高いと、タンパク質中の異性化AspをL-Aspに変換する活性が高い。つまり、異性化タンパク質を復元又は修復する活性が高い。また、皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性が高いと、アミノ酸の異性化による皮膚の諸機能の低下等を抑制する活性が高い。このため皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性が高いと、皮膚を復元又は修復する活性(作用)が高く、皮膚の老化を予防又は改善する活性(作用)が高いといえる。
従って、皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性を指標として用いることにより、皮膚の復元又は修復活性、及び、皮膚の抗老化活性を客観的に評価することができる。また、皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性は、皮膚の老化の進行度の評価の指標としても使用できる。
PIMTの発現量は、皮膚細胞のPIMT量(タンパク質量)又はPIMTをコードするmRNA量を測定することにより測定することができる。操作が簡便であることから、PIMTの発現量として、PIMT量を測定することが好ましい。
PIMT量を測定する場合は、採取した皮膚細胞からタンパク質を抽出してサンプルを調製し、該サンプル中のPIMT量を測定すればよい。タンパク質の抽出方法及びPIMT量の測定方法は特に限定されない。例えば、市販のタンパク質抽出溶媒(例えば、Thermo社製のM-PER(登録商標) Mammalian Protein Extraction ReagentやGE Healthcare社製の製品名Mammalian Cell Lysis Buffer等)を用いて、皮膚細胞から抽出溶媒に可溶性のタンパク質を抽出し、PIMT測定用のサンプルとすることができる。また、皮膚細胞からのタンパク質の抽出には、浸透圧ショック法、凍結融解法、超音波処理法、ホモジナイズ等の方法を採用することもできる。
PIMT量は、PIMTに特異的な抗体を利用する免疫測定方法(例えば、酵素反応を利用したELISA法、ウェスタンブロット法)等の公知の方法により測定することができる。ELISA法は、例えば、市販のキット(ELISA Kit for Homo sapiens(Human) Protein L-Isoaspartate-O-Methyltransferase(PCMT1)、CLOUD-CLONE社製)を使用することができる。
mRNAの抽出、その量の測定方法は、公知の方法により行えばよい。mRNAの測定は、例えば、PCR法等の方法により実施することができる。ヒトPIMTのDNA配列は知られている(NCBI Accession No.NM_005389)。当業者であれば、PIMTをコードするmRNA量を測定するためのプライマーの設計や合成、DNAの増幅等を容易に行うことができる。また、ヒトPIMT遺伝子の定量に使用可能なプライマーは市販されている(OriGene社、製品番号HK25454、HK205453など)。このような市販のプライマーを入手してPIMTをコードするmRNA量を測定することもできる。
PIMTの発現量及びPIMTの活性の測定値は、測定法に応じて使用しやすい値を用いればよい。例えば、PIMTの発現量としてPIMT量(タンパク質量)を使用する場合、PIMT発現量の測定値は、タンパク質量あたりのPIMT量に換算したものを使用することができる。
PIMTの発現量又はPIMTの活性の測定値を用いて、皮膚の復元又は修復活性の程度、皮膚の抗老化活性の程度、該活性の変化を評価することができる。
例えば、実施態様の一例として、被験者の皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性を測定する工程、該被験者の皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性を、あらかじめ測定しておいた集団(例えば、同世代の集団)の皮膚細胞における発現量又は活性の分布と比較する工程を行うことができる。例えば、被験者の皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性が、あらかじめ測定しておいた集団の皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性の分布と比較して高い場合は、その被験者は皮膚の復元又は修復活性、及び、皮膚の抗老化活性が高いと評価(判定)される。
紫外線照射前後におけるPIMT発現量又は活性を比較することは、紫外線による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性の評価、及び、紫外線による皮膚の老化に対する抗老化活性を評価する際に適している。紫外線照射前と比較して、照射後のPIMT発現量又は活性の低下が小さいほど、紫外線による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復活性、及び、紫外線による皮膚の老化に対する抗老化活性が高いと評価される。
本発明のスクリーニング方法は、皮膚に存在するPIMTの活性化、皮膚の復元若しくは修復促進、又は、皮膚の抗老化のための有効成分をスクリーニングする方法である。本発明のスクリーニング方法では、皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性を指標とする。
皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性を指標として、皮膚に存在するPIMTの活性化、皮膚の復元若しくは修復促進、又は、皮膚の抗老化のための有効成分、換言すると、皮膚に存在するPIMTの活性化作用を有する物質、皮膚の復元若しくは修復促進作用を有する物質、又は、皮膚の抗老化作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
本発明のスクリーニング方法は、通常、インビトロ(in vitro)で行われる方法(インビトロでのスクリーニング方法)である。
皮膚細胞に被験物質を接触させる方法は、被験物質が該細胞に接触することができればよく、特に限定されない。例えば培養皮膚細胞であれば、被験物質を、該皮膚細胞を培養するための培地に添加すればよい。この際には、被験物質を添加した培地中で皮膚細胞を所定時間培養後、該細胞におけるPIMTの発現量又は活性を測定することが好ましい。培地、培養条件等は、細胞の種類等に応じて適宜設定することができる。培養時間は特に限定されず、培養条件等により適宜設定すればよい。例えば、被験物質を添加した培地中で、皮膚細胞を好ましくは5~72時間、より好ましくは12~48時間培養すればよい。例えば培地の一例として、α-MEM培地が挙げられる。培地には、血清(例えば、牛胎児血清)を添加してもよい。培地は、市販品を使用してもよい。
皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性の測定は、上述した方法により行うことができる。
また、上述したように、皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性は紫外線により減少することから、例えば、皮膚細胞に被験物質を接触させる前又は後に、該皮膚細胞に紫外線を照射してもよい。紫外線を照射した場合に、被験物質を接触させた皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性が、上記被験物質を接触させなかった皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性と比較して大きいと、該被験物質は、皮膚に存在するPIMT活性化作用が高いといえる。また、該被験物質は、紫外線による皮膚における異性化タンパク質の復元又は修復活性の低下を抑制する作用、つまり紫外線による皮膚の老化に対する皮膚の復元又は修復作用が高いと考えられる。また、該被験物質は、紫外線による皮膚の老化に対する抗老化作用が高いと考えられる。
プロテインL-イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ(PIMT)を活性化するための、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される1種以上の植物の抽出物の使用。
異性化したアミノ酸を含むタンパク質を復元又は修復促進するための、カバノキ科カバノキ属植物、ブドウ科ブドウ属植物、マメ科ダイズ属植物、アサ科カラハナソウ属植物、シソ科植物、ミカン科ミカン属植物、ショウブ科ショウブ属植物、キク科アルニカ属植物及びバラ科モモ属植物からなる群より選択される1種以上の植物の抽出物の使用。
上記の使用は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物における使用である。使用は、治療的使用であってもよく、非治療的使用であってもよい。上記使用は、非治療的な美容目的のための使用であり得る。植物抽出物の好ましい態様等は、上述した通りである。植物抽出物は、そのまま使用してもよく、植物抽出物を含有する組成物として使用してもよい。植物抽出物は上述した皮膚外用剤、飲食品等の形態で使用することができる。
本発明は、PIMT活性化用組成物を製造するための、上記植物抽出物の使用;異性化したアミノ酸を含むタンパク質の復元又は修復促進用組成物を製造するための、上記植物抽出物の使用も包含する。植物抽出物の好ましい態様等は、上述した通りである。
皮膚細胞におけるPIMT発現量の測定
成人由来正常ヒト表皮角化細胞(NHEK-AD:クラボウ株式会社より購入)、成人由来正常ヒト真皮線維芽細胞(NHDF-AD:クラボウ株式会社より購入及びNHDF-Ad:Lonza社より購入)及び新生児由来ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF-NB:クラボウ株式会社より購入及びNHDF-Neo:Lonza社より購入)を用いて、ヒト皮膚におけるプロテインL-イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ(PIMT)のタンパク質発現量について評価した。各細胞を懸濁した培地を100mmの培養ディッシュに播種し、37℃、二酸化炭素濃度5vol%中にてコンフルエントになるまで培養した。タンパク質抽出試薬を用いてコンフルエントに達した細胞から該抽出試薬に可溶性のタンパク質を回収し、タンパク質量あたりのPIMT量を測定した。このタンパク質量あたりのPIMT量を、PIMT発現量とした。PIMT量はELISA Kit for Homo sapiens(Human) Protein L-Isoaspartate-O-Methyltransferase(PCMT1)(CLOUD-CLONE社製)を用い、添付された説明書に従って測定を行った。また、発現量の指標としてPIMTが発現していることが既に報告されている胎児由来ヒト腎臓由来細胞(HEK293)の細胞溶解液(Santa Cruz社製)を陽性対照に用いた。
皮膚由来のNHEK細胞及びNHDF細胞全てにおいて、HEK293細胞に比較すると低いものの、PIMTが発現していることが示された。
紫外線B波(UVB)照射により生成される皮膚タンパク質中の異性化アスパラギン酸のPIMTによる修復作用の検討
UVB照射によりアスパラギン酸の異性化を誘導した新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF-NB)のタンパク質を用いて、PIMTが皮膚タンパク質中の異性化アスパラギン酸に対しても修復作用を有するかについて検証した。具体的には、NHDF-NB細胞を懸濁した培地を培養ディッシュに播種し、37℃、二酸化炭素濃度5vol%中にてコンフルエントになるまで培養した。タンパク質抽出試薬を用いてコンフルエントに達した細胞からタンパク質を回収後、該タンパク質にUVBを一定時間照射し、異性化アスパラギン酸としてL-β-Asp量をISOQUANT(登録商標) Isoaspartate Detection Kit(Promega社製)を用いて添付された説明書に従って定量した。本キットは、タンパク質又はペプチド中のイソアスパラギン酸にPIMTが作用するときに、補酵素S-adenosyl-L-methionine(SAM)のメチル基をイソアスパラギン酸のα-カルボキシル基に転移し、SAMの脱メチル化物S-adenosyl homocystein(SAH)が生成することを利用し、SAHを定量することでイソアスパラギン酸残基を間接的に定量する方法である。また、1分子中に1箇所イソアスパラギン酸を含むことがわかっているデルタ睡眠誘発ペプチド(DSIP)を陽性対照として用いた。陽性対照の結果から、上記反応が起こり、生成したSAHが検出できていることが確認された。なお、定量結果は各試験サンプルのタンパク質量あたりのSAH量として算出した。
UVB未照射のNHDF-NB細胞由来タンパク質からも一定量のSAHが検出されたが、UVB照射時間(40分、60分)に依存してSAH量が増加した。NHDF-NBは真皮線維芽細胞である。この結果から、真皮線維芽細胞由来のタンパク質において、UVBの照射によりアスパラギン酸の異性化が誘導されることが示された、また、異性化した皮膚タンパク質中のアスパラギン酸に対してPIMTが作用することが示された。
継代数の異なる真皮線維芽細胞におけるPIMT発現量の評価
細胞を繰り返し継代して培養すると、細胞は老化が進み、最終的には分裂機能を失うことが知られている。このため継代培養を繰り返した新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞(真皮線維芽細胞)を、老化モデルとして使用した。
PIMTの発現量が老化によりどのように変動するかを検証するため、継代を繰り返した新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF-NB、クラボウ株式会社より購入)を用いてPIMTのタンパク質発現量の変化を検証した。継代培養を繰り返したNHDF-NB細胞(継代数(P):3、6、10、12、15及び17)を播種し、37℃、二酸化炭素濃度5vol%中にてコンフルエントになるまで培養した。コンフルエントに達した細胞からタンパク質抽出試薬を用いて、該抽出試薬に可溶性のタンパク質を回収し、タンパク質量あたりのPIMT量を測定した。PIMT量の測定は、試験例1と同じ方法で行った。
種々のストレス負荷におけるPIMT発現量の変化
PIMTの発現量が外的環境に影響されるかを調べるため、新生児由来正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF-NB)にUVB照射や炎症惹起、栄養の枯渇、活性酸素などの刺激を与え、PIMTのタンパク質発現量の変化を検証した。100mmの培養ディッシュに細胞を播種し、37℃、二酸化炭素濃度5vol%中にて培養した。培養には10%ウシ血清(FBS)含有α-MEM培地(SIGMA社製)を用いた。コンフルエントに達した細胞に以下の通り各種刺激を負荷した。
(1)活性酸素種(過酸化水素(H2O2))曝露によるPIMT発現量への影響検証
培養上清を除去し、過酸化水素水(ナカライテスク社製)を最終濃度10μMとなるように添加した新鮮なFBS含有α-MEM培地へ交換した。
(2)UVB曝露によるPIMT発現量への影響検証
培養上清を除去し、ハンクス平衡塩溶液(ナカライテスク社製)へ交換後、UVB(積算光量約5.7mJ/cm2)を照射した。照射後、新鮮なFBS含有α-MEM培地へ交換した。
(3)低栄養状態におけるPIMT発現量への影響検証
10%FBS含有α-MEM培地を、FBS無添加α-MEM培地へ交換した。
図4のデータは、平均値±標準偏差(n=3)で示した。*は、コントロールに対する有意差である(*:p<0.05)。過酸化水素(H2O2)曝露、UVB曝露、低栄養下いずれにおいてもコントロールの細胞に比べPIMT発現量が顕著に低下した。これらのことから、紫外線に曝露している皮膚や、活性酸素種などに曝露している皮膚、加齢に伴い栄養状態が低下している皮膚ではPIMTの発現が低下することで、異性化アスパラギン酸の蓄積が増加すると想定される。
抽出に用いた植物及びその部位は以下の通りである。
(1)エンメイソウ(Isodon japonicus):茎及び葉
(2)シソ(Perilla frutescens var. Crispa):葉
(3)シラカバ(Betula pendula):樹皮
(4)ユズ(Citrus junos):果実
(5)セージ(Salvia officinalis):葉
(6)ダイズ(Glycine max):胚芽(ダイズ芽)
(7)アルニカ(Arnica montana):花
(8)アンズ(Prunus armeniaca):種子
(9)ショウブ(Acorus calamus):根
(10)ラベンダー(Lavandula angustifolia):花
(11)モモ(Amygdalus persica):種子
(12)ホップ(Humulus lupulus):雌花穂
(13)ブドウ(Vitis spp.)(カベルネ・ソーヴィニヨン):果皮及び種子
植物抽出物添加による皮膚細胞におけるPIMT発現量の変化
新生児由来ヒト真皮線維芽細胞(NHDF-NB:クラボウ株式会社より購入)を用いて、調製例1で調製した植物抽出物を添加したときのヒト皮膚におけるPIMTのタンパク質発現量について評価した。
100mmの培養ディッシュに細胞を播種し、37℃、二酸化炭素濃度5vol%中にてコンフルエントになるまで培養した。その後、得られた細胞に表1又は表2に記載の各植物抽出物を10μg/mLの濃度で添加し24時間培養した。尚、培地は、FBS無添加のα-MEM培地を用い、植物抽出物はジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、培地中のDMSOの最終濃度が0.1質量%となるように添加した。またコントロールには0.1質量%DMSOを含む培地を用いた。
本実験では、上記手順で各植物抽出物につきn=3でサンプルを調製した。上記PIMT量の測定は、各サンプルにつき2回ずつ行い、その平均値を測定値とした。各植物抽出物について、この各サンプルの測定値(n=3)の平均値をPIMT量の定量結果とした。
表1及び表2中、「コントロール」は、UVBを照射していないコントロールであり、「コントロール(+UV)」は、UVBを照射したコントロールである。表1及び表2において、UV照射の「-」は、UVBを照射しなかったことを意味し、「+」はUV照射したことを意味する。表中、「*」及び「**」は、「コントロール(+UV)」に対する有意差を示す(*:p<0.05、**:p<0.01)。
回復率(%)=100×((S)-(C1))/((C0)-(C1))
植物抽出物添加による皮膚細胞におけるPIMT発現量の変化
調製例1で調製したシラカバ抽出物、セージ抽出物、ダイズ抽出物、エンメイソウ抽出物、ラベンダー抽出物を用いて、以下の評価を行った。
試験例5と同じ方法で、新生児由来ヒト真皮線維芽細胞(NHDF-NB:クラボウ株式会社より購入)をコンフルエントになるまで培養した。
その後、得られた細胞に各植物抽出物を10μg/mLの濃度で添加し、24時間培養した。尚、培地は、FBS無添加のα-MEM培地を用い、植物抽出物はDMSOに溶解し、培地中のDMSOの最終濃度が0.1質量%となるように添加した。コントロールには0.1質量%DMSOを含む培地を用いた。
植物抽出物添加24時間後、培養上清を除去し、上記植物抽出物のDMSO溶液を添加した新鮮な10%FBS含有α-MEM培地(植物抽出物の最終濃度は10μg/mL、DMSOの最終濃度は0.1質量%)へ交換し、さらに24時間培養した。この培養後、細胞からタンパク質抽出試薬に可溶性のタンパク質を回収したものをサンプルとし、試験例5と同じ方法で、タンパク質量あたりのPIMT量(PIMT質量/タンパク質の質量)を測定した。
本実験では、上記手順で各植物抽出物につきn=3又はn=4でサンプルを調製した。PIMT量の測定は、各サンプルにつき2回ずつ行い、その平均値を各サンプルの測定値とした。各植物抽出物について、この各サンプルの測定値(n=3又はn=4)の平均値をPIMT量の定量結果とした。
植物抽出物添加による皮膚細胞におけるPIMT発現量の変化
新生児由来ヒト真皮線維芽細胞(NHDF-NB:クラボウ株式会社より購入)に調製例1で調製したブドウ抽出物を添加したときの、ヒト皮膚におけるPIMTのタンパク質発現量について評価した。
本実験では、上記手順で各植物抽出物につきn=4でサンプルを調製した。PIMT量の測定は、各サンプルにつき2回ずつ行い、その平均値を各サンプルの測定値とした。各植物抽出物について、この各サンプルの測定値(n=4)の平均値をPIMT量の定量結果とした。
試験例5と同じ方法で、新生児由来ヒト真皮線維芽細胞(NHDF-NB:クラボウ株式会社より購入)をコンフルエントになるまで培養した。
その後、得られた細胞に調製例1で調製したブドウ抽出物を2.5μg/mL又は5μg/mLの濃度で添加し、24時間培養した。尚、培地は、FBS無添加のα-MEM培地を用い、ブドウ抽出物はDMSOに溶解し、培地中のDMSOの最終濃度が0.1質量%となるように添加した。コントロールには0.1質量%DMSOを含む培地を用いた。
ブドウ抽出物添加24時間後、培養上清を除去し、ブドウ抽出物のDMSO溶液を添加した新鮮な10%FBS含有α-MEM培地(ブドウ抽出物の最終濃度は2.5μg/mL又は5μg/mL、DMSOの最終濃度は0.1質量%)へ交換し、さらに24時間培養した。この培養後、細胞からタンパク質抽出試薬に可溶性のタンパク質を回収したものをサンプルとし、試験例5と同じ方法で、タンパク質量あたりのPIMT量(PIMT質量/タンパク質の質量)を測定した。
本実験では、上記手順で各濃度のブドウ抽出物につきn=5でサンプルを調製した。PIMT量の測定は、各サンプルにつき2回ずつ行い、その平均値を各サンプルの測定値とした。この各サンプルの測定値(n=5)の平均値をPIMT量の定量結果とした。
化粧水
表6に記載の原料を均一に撹拌して、PIMT活性化用化粧水を調製した。
乳液
表7に記載の原料を均一に撹拌して、PIMT活性化用乳液を調製した。
クリーム
表8に記載の原料を均一に撹拌して、PIMT活性化用クリームを調製した。
用時溶解用粉末
表9に記載の原料を均一に撹拌して、PIMT活性化用粉末を調製した。用時溶解用粉末は、例えば、水、コーヒー、紅茶、ジュース等の飲料に溶解させて、又は、ヨーグルト等の食品に混ぜて使用することができる。
皮膚細胞におけるPIMTの発現量又は活性を指標として、皮膚に存在するPIMTの活性化作用を有する物質、皮膚の復元若しくは修復促進作用を有する物質、又は、皮膚の抗老化作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
試験例5~8のいずれかに記載の評価方法において、植物抽出物の代わりに任意の被験物質を使用して、該被験物質を添加したときの皮膚細胞におけるPIMT発現量について評価する。
被験物質を添加して培養した細胞のPIMT発現量(タンパク質量あたりのPIMT量)が、被験物質を添加せずに培養した細胞(コントロール)のPIMT発現量と比較して多い場合に、該被験物質を有効成分として選択する。有効成分として選択された被験物質は、皮膚に存在するPIMTの活性化、皮膚の復元若しくは修復促進、又は、皮膚の抗老化のための有効成分として使用することができる。
Claims (6)
- シソ科植物の抽出物を含み、
シソ科植物の抽出物は、シソ科植物の花、茎及び葉からなる群より選択される少なくとも1種の30~90vol%エタノール水溶液抽出物又は1,3-ブチレングリコール水溶液抽出物である、ヒトの正常な皮膚に存在するプロテインL-イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ(PIMT)活性化用組成物。 - 前記シソ科植物の抽出物が、ラベンダーの花、セージの葉、エンメイソウの茎及び葉並びにシソの葉からなる群より選択される少なくとも1種の30~90vol%エタノール水溶液抽出物又は1,3-ブチレングリコール水溶液抽出物である、請求項1に記載のPIMT活性化用組成物。
- 前記シソ科植物の抽出物が、ラベンダーの花、セージの葉並びにエンメイソウの茎及び葉からなる群より選択される1種以上の植物の30~90vol%エタノール水溶液抽出物である請求項1又は2に記載のPIMT活性化用組成物。
- 皮膚外用剤である請求項1~3のいずれかに記載のPIMT活性化用組成物。
- 化粧料である請求項1~4のいずれかに記載のPIMT活性化用組成物。
- 飲食品である請求項1~3のいずれかに記載のPIMT活性化用組成物。
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LI, X. et al.,PIMT Prevents the Apoptosis of Endothelial Cells in Response to Glycated Low Density Lipoproteins an,PLOS ONE,2013年07月26日,Vol. 8, No. 7,p. 1-14,e69979 |
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