CN110710682A - 苦荞麦种皮萃取物提升粒线体活性、促进抗老化基因表现、及抑制蛋白质醣化的用途 - Google Patents

Abstract

本发明是关于一种植物萃取物的保健用途，特别是关于一种苦荞麦种皮萃取物提升粒线体活性、促进抗老化基因表现、及抑制蛋白质醣化的用途。该苦荞麦种皮萃取物较佳为以水为溶剂对苦荞麦种皮进行萃取而制得，其能提高细胞的能量产生，减少醣化蛋白质生成，并且促进CCT、PINK1、SIRT1、及FOXO3等多种抗老化基因的表现，因此预防个体机能衰退与维持健康。

Description

苦荞麦种皮萃取物提升粒线体活性、促进抗老化基因表现、及 抑制蛋白质醣化的用途

技术领域

本发明是关于一种植物萃取物的保健用途，特别是关于一种苦荞麦种皮萃取物用于制备提升粒线体活性、促进抗老化基因表现、及抑制蛋白质醣化的组合物的用途。

背景技术

随着人口平均年龄的延长，拥有健康而高质量的老年生活成为大众关注的焦点之一，关于老化的科学研究也越发受重视。老化可大致定义为生理机能随时间而衰退，其与许多流行疾病相关，例如心血管疾病、癌症、代谢疾病、神经退化疾病等。老化的过程复杂而受到诸多因素影响，包括饮食、运动、心理状态、及遗传因子。在分子或细胞层次，可能的内部机制包括染色体末端的端粒(telomere)缩短、基因突变、基因表现失调、蛋白质恒定丧失、粒线体功能下降等。此外，细胞周围环境中由物理或化学因素产生的自由基(如活性氧物质)会损害细胞的染色体脱氧核醣核酸(DNA)、蛋白质、及脂质生物膜，因而破坏细胞的机能。

鉴于上述造成老化的因素，抗老化可以从多方面着手，包括改变饮食与运动习惯、保持心情愉快、减少暴露于诱导自由基形成的环境因子(如紫外光)、及促进细胞保护机制的运作(例如促进长寿基因的表现)。其中，促进细胞保护机制的方法正处于发展阶段，虽然初步研究成果显示其颇具抗老潜力，但其确切效力尚待进一步证实。因此，开发一种能促进细胞保护机制的新颖组合物，为减缓细胞机能衰退与维持细胞健康状态提供新方向，实有其必要。

发明内容

缘此，本发明之一目的在提供一种苦荞麦(Fagopyrum tataricum)种皮萃取物用于制备提升粒线体活性、促进抗老化基因表现、及抑制蛋白质醣化的组合物的用途，其中该苦荞麦种皮萃取物是以一溶剂萃取一苦荞麦种皮而获得。

在本发明的一实施例中，该溶剂与该苦荞麦种皮的重量比范围为20∶1 至1∶1，且该萃取是在50℃至100℃进行。

在本发明的一实施例中，该溶剂为水，且该苦荞麦种皮萃取物的浓度为 0.125mg/mL至0.25mg/mL，较佳为0.125mg/mL。

在本发明的一实施例中，该抗老化基因编码一伴随蛋白T复合体 (chaperonincontaining TCP1 complex，CCT)的蛋白次单元，其是选自于由 CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、及其任意组合所组成的群组。

在本发明的一实施例中，该抗老化基因编码一磷酸酶及张力蛋白同源物诱导激酶1(phosphatase and tensin homolog(PTEN)-induced putative kinase 1， PINK1)。

在本发明的一实施例中，该抗老化基因编码一受蓝光照射细胞内的一沉默信息调节因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1 或sirtuin 1，SIRT1)或一叉头框蛋白O3(forkhead box class O 3，FOXO3)。

本发明苦荞麦种皮萃取物能提升粒线体活性及促进数种人类细胞中与抗老化相关的多种基因表现，例如活化血管内皮细胞的粒腺体活性，及提升脐带静脉内皮细胞、人类视网膜细胞、人类纤维母细胞与人类外围血液单核球的抗老化相关基因群的基因表现量，并且能减少醣化蛋白质生成，最终达到预防个体机能衰退与维持健康的功效。因此，本发明提供苦荞麦种皮萃取物用于制备提升粒线体活性、促进抗老化基因表现、及抑制蛋白质醣化的组合物的用途。该组合物可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体，且可制成食品、饮品、医药品、或营养补充剂，藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明的发明特点及应用，而非以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1显示人类脐带静脉内皮细胞在有或无苦荞麦种皮萃取物处理24小时后，具有正常值粒线体膜电位的细胞百分比；

图2显示经蓝光照射的人类视网膜色素上皮细胞在有或无苦荞麦种皮萃取物处理48小时后，相对于控制组细胞的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、 CCT8、PINK1、ATG8、SIRT1及FOXO3基因的相对表现量；

图3显示人类皮肤纤维母细胞在有或无苦荞麦种皮萃取物处理48小时后，相对于控制组细胞的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、及PINK1基因的相对表现量；

图4显示人类外周血单核细胞在有或无苦荞麦种皮萃取物处理48小时后，相对于控制组细胞的CCT2及CCT5基因的相对表现量；

图5显示人类脐带静脉内皮细胞在有或无苦荞麦种皮萃取物处理48小时后，相对于控制组细胞的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、及PINK1基因的相对表现量；

图6显示不同浓度苦荞麦种皮萃取物对胶原蛋白醣化的抑制作用。

具体实施方式

本发明提供一种苦荞麦种皮萃取物用于制备提升粒线体活性、促进抗老化基因表现、及抑制蛋白质醣化的组合物的用途。本发明的苦荞麦种皮萃取物是以一溶剂萃取一苦荞麦种皮而获得，其中，该溶剂较佳为水，该溶剂与该苦荞麦种皮的重量比为20∶1至1∶1，且该萃取是在50℃至100℃进行。该苦荞麦种皮萃取物处理经下列实施例证实能提升人类细胞的粒线体活性及减少胶原蛋白醣化终产物生成。此外，基于基因表现定量分析结果，该苦荞麦种皮萃取物促进脐带静脉内皮细胞、人类视网膜细胞、人类纤维母细胞与人类外围血液单核球的抗老化相关基因群的基因表现量。该些抗老化基因编码的蛋白质包括伴随蛋白T复合体(CCT)的蛋白次单元、磷酸酶及张力蛋白同源物诱导激酶 1(PINK1)、沉默信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)及叉头框蛋白O3(FOXO3)。

定义

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

本文中所谓「抗老化基因」泛指其存在与生物体长寿相关或其蛋白质产物的作用可维持细胞正常功能的基因。该抗老化基因所编码蛋白质的作用包括协助其他蛋白质折迭，使粒线体正常运作，及调控参与养分代谢或细胞压力反应的蛋白的基因表现等。

材料与方法

细胞培养

以下实施例使用购自美国典型培养物保存中心(American Type CultureCollection，ATCC)或食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心 (BioresourceCollection and Research Center，BCRC)的人类脐带静脉内皮细胞 (human umbilicalvein endothelial cells，HUVEC，BCRC H-UV001或ATCC CRL-1730)、人类视网膜色素上皮细胞ARPE-19(ATCC CRL-2302)、及人类皮肤纤维母细胞(human skin fibroblast)CCD-966SK(BCRC 60153)。人类外周血单核细胞(peripheral mononuclear mononuclear cell，PBMC)是分离自捐赠者血液。所有细胞皆培养于37℃、5％二氧化碳的条件。HUVEC细胞培养于添加 10％低血清生长添加剂(low serum growth supplement，LSGS；Thermo FischerScientific)的M200培养基(Medium 200；Thermo Fischer Scientific)，以下称M200 细胞培养基。ARPE-19细胞培养于DMEM培养基(Dulbecco′s modified Eagle’s medium；ThermoFischer Scientific)与汉氏F12培养基(Ham’s F12 medium； Thermo FischerScientific)依1∶1体积比混和的DMEM/F12培养基，其中添加 0.5mM丙酮酸钠、15mM HEPES缓冲溶液、及10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，以下称DMEM/F12细胞培养基。CCD-966SK细胞培养于添加 10％FBS及1％青霉素-链霉素的最低基础培养基(MinimumEssential Medium (MEM)；Thermo Fischer Scientific)，以下称MEM细胞培养基。PBMC细胞培养于添加10％FBS及1％青霉素-链霉素的RPMI培养基(RPMI medium 1640； ThermoFischer Scientific)，以下称RPMI细胞培养基。

粒线体活性分析

为评估细胞的粒线体活性，利用流式细胞仪(flow cytometer；BD Accuri) 及粒线体膜电位检测套组(BD^TM MitoScreen)测定粒线体膜电位改变的细胞群体占比，其步骤简述如下。依据厂商使用说明，以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS；ThermoFischer Scientific)润洗待测细胞，再将细胞收集至1.5mL微量离心管及进行离心(400xg，5分钟)。经移除上清液，以PBS溶液再悬浮细胞并且再次离心(400xg，5分钟)。将沉淀的细胞与100μL JC-1操作溶液在暗处均匀混合15分钟以进行荧光标记，再以清洗溶液及离心步骤(400 xg，5分钟)清洗细胞2次。最终，将细胞再悬浮于含2％FBS的PBS溶液，使用流式细胞仪计数粒线体膜电位为正常值的细胞百分比。

基因表现量分析

基于定量聚合酶链锁反应(quantitative polymerase chain reaction，简称qPCR)测定细胞中抗老化基因的表现量，其步骤简述如下。依据厂商使用说明，利用RNA萃取套组(RNA Extraction Kit；Geneaid)自细胞分离出RNA，于37℃下以反转录酶III Reverse Transcriptase(Invitrogen)将2000ng RNA反转录为cDNA。其后，藉由目标基因与作为内部对照的甘油醛3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因的引物对(表 1)，利用qPCR套组(KAPA CYBR FAST qPCR Kit(2X)；KAPA Biosystems)在 PCR反应仪(Step One Plus Real-Time PCR system；AppliedBiosystems)对前述 cDNA进行qPCR，以取得解链曲线(melting curve)。

表1

最终，使用2^-ΔΔCT方法测定目标基因的相对表现量。该方法以GAPDH基因的循环阈值(C_T)作为内部对照的参考基因的循环阈值，按照以下公式计算相对倍数变化：

ΔC_T＝实验组或控制组的目标基因的C_T-内部对照的C_T

ΔΔC_T＝实验组的ΔC_T-控制组的ΔC_T

倍数变化＝2^{-ΔΔCt平均值}

统计分析是使用Excel软件中的STDEV函数计算各基因相对表现量的标准偏差，并以单尾学生T检验(TTEST)计算统计上差异。

实施例1

苦荞麦种皮萃取物的制备

首先，洗净及干燥苦荞麦全谷的外壳，即苦荞麦种皮，及使用粉碎机将其粉碎。苦荞麦种皮粉碎物可选择性以10目(mesh)筛网过滤。其次，以水为溶剂对苦荞麦种皮粉碎物进行萃取。该溶剂与该苦荞麦种皮粉碎物混合的重量比范围为20∶1至1∶1。萃取温度为介于50℃至100℃，较佳为80℃至90℃。以下实施例2-4中苦荞麦种皮萃取物皆为以水萃取，萃取时间为0.5至3小时。

经上述萃取步骤所得苦荞麦种皮萃取物冷却至室温后，可于5000rpm的转速离心10分钟，再以400目的滤网过滤，以移除残余固体物。该过滤后的苦荞麦种皮萃取物可进一步在45℃至70℃进行减压浓缩而获得一浓缩产物。为获得固态的苦荞麦种皮萃取物，可将前述经浓缩的苦荞麦种皮萃取物以例如冷冻干燥、喷雾干燥的干燥方式去除溶剂，因此获得苦荞麦种皮萃取物的干燥产物。

实施例2

苦荞麦种皮萃取物提升粒线体活性

粒线体是供给细胞能量的胞器，其正常运作对维持细胞的活力与增殖能力至关重要。为探讨苦荞麦种皮萃取物对粒线体功能的影响，本实施例以流式细胞仪评估人类脐带静脉内皮细胞(HUVEC)经苦荞麦种皮萃取物处理后，其粒线体活性的变化。首先，将HUVEC细胞依1×10⁵个细胞/孔接种于含有2mL M200 细胞培养基的6孔盘的各孔，在37℃下培养24小时。其后，以1mL含0.25 mg/mL或0.125mg/mL苦荞麦种皮萃取物的M200培养基处理细胞(实验组)，或者仅用M200培养基处理细胞以作为控制组。各组细胞于37℃培养24小时后用于粒线体活性分析。

图1显示前述各组HUVEC细胞中粒线体膜电位为正常值者的百分比，其值越高表示具有正常功能粒线体的细胞数目越多；^*表示相比控制组为p＜0.05，^***表示相比控制组为p＜0.001。依据图1，相比控制组细胞，施予0.125mg/mL 苦荞麦种皮萃取物使具有正常功能粒线体的细胞显著增加，施予0.25mg/mL 苦荞麦种皮萃取物则造成较小幅细胞数增加，此结果说明苦荞麦种皮萃取物能提高细胞的平均能量产生，使细胞有能力执行特定生理功能或增殖以汰换老旧细胞，因此有益于维持动物或人类个体的健康状况。

实施例3

苦荞麦种皮萃取物抗老化基因的表现

3.1视网膜色素上皮细胞

为探讨苦荞麦种皮萃取物对抗老化相关基因表现的影响，以qPCR测定人类视网膜色素上皮细胞ARPE-19经苦荞麦种皮萃取物处理后，其伴随蛋白T 复合体(CCT)次单元、磷酸酶及张力蛋白同源物诱导激酶1(PINK1)、自嗜相关蛋白8(autophagy-related protein8，ATG8)、沉默信息调节因子2同源蛋白 1(SIRT1)及叉头框蛋白O3(FOXO3)的基因表现变化。简言之，将细胞依1×10⁵个细胞/孔接种于含有2mL细胞培养基的6孔盘的各孔，在37℃下培养24小时后，移除该细胞培养基并以PBS溶液清洗细胞。其后，以1mL含0.5％(w/v) 苦荞麦种皮萃取物的DMEM/F12细胞培养基处理细胞48小时，再将6孔培养盘置于蓝光箱中，于室温下接受蓝光(波长约为425-475nm)照射15分钟。作为蓝光照射组的细胞是以不合苦荞麦种皮萃取物的DMEM/F12培养基处理并且经蓝光照射15分钟；作为控制组的细胞是以不含苦荞麦种皮萃取物的 DMEM/F12培养基处理但未经蓝光照射。最终，收集各组细胞用于qPCR分析。

图2显示前述三组ARPE-19细胞相对于控制组细胞的CCT2、CCT5、 CCT6A、CCT7、CCT8、PINK1、ATG8、SIRT1、及FOXO3基因的相对表现量；^*及^**分别表示相比蓝光照射组为p＜0.05及p＜0.01。依据图2，相比控制组，蓝光照射会降低多数抗老化基因的表现。然而，相比蓝光照射组，苦荞麦种皮萃取物的处理显著提升ARPE-19细胞中协助蛋白质折迭的伴随蛋白T 复合体的CCT2、CCT5、及CCT6A次单元的基因表现，同时显著增加与长寿相关的SIRT1及FOXO3的基因表现，以及略为增加与粒线体活性相关的PINK 与ATG8的基因表现。此结果说明苦荞麦种皮萃取物能促进多种抗老化基因于蓝光照射下的视网膜细胞内合成，因此具有减少该细胞因蓝光照射而损伤或死亡的潜力。

3.2皮肤纤维母细胞

利用qPCR测定人类皮肤纤维母细胞CCD-966SK经苦荞麦种皮萃取物处理后，其CCT的蛋白次单元及PINK1的基因表现变化。简言之，将细胞依1×10⁵个细胞/孔接种于含有2mL细胞培养基的6孔盘的各孔，在37℃下培养24小时后，移除该细胞培养基并以PBS溶液清洗细胞。其后，以1mL含0.125mg/mL 苦荞麦种皮萃取物的MEM培养基处理细胞(实验组)，或者仅以MEM培养基处理细胞以作为控制组。前述二组细胞于37℃培养48小时后用于qPCR分析。

图3显示前述二组CCD-966SK细胞相对于控制组细胞的CCT2、CCT5、 CCT6A、CCT7、CCT8、及PINK1基因的相对表现量；^***表示相比控制组为p ＜0.001。依据图3，苦荞麦种皮萃取物的处理显著提升CCD-966SK细胞中伴随蛋白T复合体的CCT2、CCT6A、CCT7、及CCT8次单元的基因表现，同时略为增加CCT5与PINK1基因的表现。此结果说明苦荞麦种皮萃取物有益于维持皮肤细胞的活力，因此具有推迟肌肤老化的潜力。

3.3外周血单核细胞

利用qPCR测定人类外周血单核细胞(PBMC)经苦荞麦种皮萃取物处理后，其CCT的蛋白次单元的基因表现变化。简言之，将细胞依1×10⁵个细胞/孔接种于含有2mL细胞培养基的6孔盘的各孔，在37℃下培养24小时后，移除该细胞培养基并以PBS溶液清洗细胞。其后，以1mL含0.125mg/mL苦荞麦种皮萃取物的RPMI培养基处理细胞(实验组)，或者仅以RPMI培养基处理细胞以作为控制组。前述二组细胞于37℃培养48小时后用于qPCR分析。

图4显示前述二组PBMC细胞相对于控制组细胞的CCT2及CCT5基因的相对表现量；^*及^***分别表示相比控制组为p＜0.05及p＜0.001。依据图4，苦荞麦种皮萃取物的处理显著提升CCD-966SK细胞中伴随蛋白T复合体的 CCT2与CCT5次单元的基因表现。此结果指示荞麦种皮萃取物有助于血液中单核细胞(例如T细胞、B细胞、及单核球)的正常功能。

3.4血管内皮细胞

利用qPCR测定人类脐带静脉内皮细胞(HUVEC)经苦荞麦种皮萃取物处理后，其CCT的蛋白次单元及PINK1的基因表现变化。简言之，将细胞依1×10⁵个细胞/孔接种于含有2mL细胞培养基的6孔盘的各孔，在37℃下培养24小时后，移除该细胞培养基并以PBS溶液清洗细胞。其后，以1mL含0.125mg/mL 苦荞麦种皮萃取物的M200培养基处理细胞(实验组)，或者仅以M200培养基处理细胞以作为控制组。前述二组细胞于37℃培养48小时后用于qPCR分析。

图5显示前述二组HUVEC细胞相对于控制组细胞的CCT2、CCT5、 CCT6A、CCT7、CCT8、及PINK1基因的相对表现量；^*及^**分别表示相比控制组为p＜0.05及p＜0.01。依据图5，苦荞麦种皮萃取物的处理显著提升 HUVEC细胞中伴随蛋白T复合体的CCT2与CCT5次单元的基因表现，亦显著增加PINK1基因的表现。此结果说明苦荞麦种皮萃取物有益于维持血管内皮细胞的活力，因此具有降低血管相关疾病发生率的潜力。

实施例4

苦荞麦种皮萃取物抑制蛋白质醣化

身体内蛋白质的醣化反应会导致蛋白质功能缺失，进而促进老化与相关疾病发生。为探讨苦荞麦种皮萃取物是否能抑制蛋白质醣化，以抗醣化分析测定0.1、0.5、1、或5mg/mL苦荞麦种皮萃取物对猪胶原蛋白醣化反应的抑制作用。简言之，利用200mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)配制60mg/mL胶原蛋白溶液(含0.06％迭氮化钠)及1.5M果糖溶液。为进行胶原蛋白醣化反应，将0.2mL 胶原蛋白溶液与0.2mL果糖溶液的混合物与0.2mL各浓度的苦荞麦种皮萃取物样品或去离子水(控制组)均匀混合，于50℃反应24小时，再添加胺基胍(aminoguanidine，AG，购自Sigma)以中止醣化反应。使用分光荧光计(spectrofluorometer，FLx 800，BioTek)测量前述反应液(0.1mL)在0小时与24 小时的荧光强度(激发波长360nm，放射波长460nm)，并依下列公式计算蛋白质醣化终产物生成率：[(样品荧光强度_24小时-样品荧光强度_0小时)/(控制组荧光强度_24小时-控制组荧光强度_0小时)]×100％。

图6显示不同浓度苦荞麦种皮萃取物对胶原蛋白醣化的抑制作用。依据图 6，0.1、0.5、1、及5mg/mL苦荞麦种皮萃取物分别减少胶原蛋白醣化终产物生成达约8％、52％、69％、81％，显示苦荞麦种皮萃取物可降低体内蛋白质的醣化反应，进而推迟老化的进展，例如肌肤老化。

综上所述，苦荞麦种皮萃取物能提升粒线体活性及促进数种人类细胞中与抗老化相关的多种基因表现，例如活化血管内皮细胞的粒腺体活性，及提升脐带静脉内皮细胞、人类视网膜细胞、人类纤维母细胞与人类外围血液单核球的抗老化相关基因群的基因表现量，并且能减少醣化蛋白质生成，最终达到预防个体机能衰退与维持健康的功效。因此，本发明提供苦荞麦种皮萃取物用于制备提升粒线体活性、促进抗老化基因表现、及抑制蛋白质醣化的组合物的用途。该组合物可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体，且可制成食品、饮品、医药品、或营养补充剂，藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。

Claims (10)

1.一种苦荞麦种皮萃取物用于制备提升粒线体活性、促进抗老化基因表现、及抑制蛋白质醣化的组合物的用途，其中该苦荞麦种皮萃取物是以一溶剂萃取一苦荞麦种皮而获得。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述溶剂与所述苦荞麦种皮的重量比范围为20∶1至1∶1。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述萃取是在50℃至100℃进行。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述溶剂为水。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述苦荞麦种皮萃取物的浓度为0.125mg/mL至0.25mg/mL。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗老化基因编码一伴随蛋白T复合体(CCT)的蛋白次单元，其是选自于由CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、及其任意组合所组成的群组。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗老化基因是编码一磷酸酶及张力蛋白同源物诱导激酶1(PINK1)。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗老化基因是编码一受蓝光照射细胞内的一沉默信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)或一叉头框蛋白O3(FOXO3)。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物是一食品、一饮品、一营养补充剂、或一医药品。

10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物具有粉末、颗粒、溶液、胶体、或膏体的剂型。

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