WO2018159705A1 - 脂肪細胞分化抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物及び脂肪細胞分化抑制剤の製造方法 - Google Patents

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菜央子 大湖
耕平 阿閉
綾香 中島
修 岩田
鈴木　健吾
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Definitions

  • the present invention relates to an adipocyte differentiation inhibitor, a PPAR ⁇ expression inhibitor, a C / EBP ⁇ expression inhibitor, a food composition for inhibiting adipocyte differentiation, a cosmetic composition for inhibiting adipocyte differentiation, and a method for producing an adipocyte differentiation inhibitor. .
  • lifestyle-related diseases examples include obesity, hypertension, diabetes, hyperlipidemia, myocardial infarction, and stroke. In recent years, it has been found that these diseases do not develop due to individual causes, but are caused by various causes affecting each other, and such complex lifestyle-related diseases are also called metabolic syndrome.
  • Metabolic syndrome represents a state in which a series of pathological conditions such as type 2 diabetes based on insulin resistance, hyperlipidemia, hypertension, visceral fat obesity, and fatty liver are combined. Metabolic syndrome is a state in which the action of insulin is reduced due to the accumulation of fat cells, especially fat cells (built-in fat) in the viscera, and risk factors for arteriosclerosis such as hyperglycemia, abnormal lipid metabolism, and hypertension are accumulated. It is.
  • fat cell accumulation can lead to obesity, hypertension, diabetes, hyperlipidemia, myocardial infarction, stroke, etc. Prevention is very important.
  • “obesity” refers to a condition requiring weight loss treatment when there is an associated health disorder due to obesity or excessive accumulation of visceral fat expected to cause the health disorder. .
  • adipocyte differentiation inhibitors include hop tissue water extract (Patent Document 1), acidic mucopolysaccharide (Patent Document 2), plant extract (Patent Document 3), and the like. Among them, Patent Document 1 discloses that the water extract of hop tissue suppresses the expression of PPAR ⁇ and suppresses the differentiation of adipocytes through this.
  • Euglena (genus name: Euglena, Japanese name: Euglena) attracts attention as a biological resource that is expected to be used as food, feed, fuel, and the like.
  • Euglena has 59 kinds of nutrients that correspond to most of the nutrients necessary for humans to live, such as vitamins, minerals, amino acids, and unsaturated fatty acids, and as a supplement to take a variety of nutrients in a balanced manner.
  • the possibility of use as a food supply source in poverty areas where the necessary nutrients cannot be ingested has been proposed.
  • Euglena is located in the primary producer of the food chain and is cultivated in large quantities because it is preyed by predators and the culture conditions such as light, temperature conditions, and stirring speed are difficult compared to other microorganisms.
  • a large-scale culture technique has been established, which has opened the way for mass supply of Euglena-derived substances such as Euglena and paramylon extracted from Euglena.
  • Euglena is a unique organism that possesses the animal nature of flagellar movement and at the same time has chloroplasts as a plant and performs photosynthesis, and Euglena itself and substances derived from Euglena are expected to have many functions. ing. Therefore, it is desired to develop a method for using Euglena and Euglena-derived substances that can be supplied in large quantities.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and the object of the present invention is a novel adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, and food composition for inhibiting adipocyte differentiation.
  • An object of the present invention is to provide a cosmetic composition for inhibiting adipocyte differentiation.
  • Another object of the present invention is to provide an adipocyte differentiation inhibitor, a PPAR ⁇ expression inhibitor, a C / EBP ⁇ expression inhibitor, a food composition for inhibiting adipocyte differentiation, an adipocyte differentiation, which is a novel method of using an Euglena aqueous solvent extract. It is providing the cosmetic composition for suppression.
  • an Euglena aqueous solvent extract has an action of suppressing differentiation from preadipocytes to adipocytes. More specifically, in the process of differentiation of preadipocytes into mature adipocytes, the expression of PPAR ⁇ and C / EBP ⁇ among the key transcription factor groups is suppressed, and the differentiation from preadipocytes to adipocytes is suppressed. It has been clarified that the present invention has been made.
  • the above object is to provide an adipocyte differentiation inhibitor, a PPAR ⁇ expression inhibitor, a C / EBP ⁇ expression inhibitor, and an adipocyte differentiation inhibitor comprising an Euglena aqueous solvent extract as an active ingredient.
  • a food composition for food use and a cosmetic composition for inhibiting adipocyte differentiation.
  • the Euglena aqueous solvent extract may be a Euglena water extract or a Euglena hot water extract.
  • the present invention uses an aqueous solvent extract of Euglena that has no reports of side effects so far and has a safety level consistent with the Food Sanitation Law, it can be continuously administered and ingested over a long period of time. is there.
  • the object is to provide a dispersion preparation step in which an aqueous solvent is added to Euglena and shaken to obtain a dispersion, and the dispersion is centrifuged to obtain a supernatant, which is an aqueous solvent extract of Euglena.
  • a method for producing an adipocyte differentiation inhibitor, a PPAR ⁇ expression inhibitor, and a C / EBP ⁇ expression inhibitor is also provided.
  • a heating step of heating the dispersion may be performed after the dispersion preparation step and before the extraction step.
  • a novel adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, a food composition for inhibiting adipocyte differentiation, and a cosmetic composition for inhibiting adipocyte differentiation can be provided. It can. Since the present invention uses an aqueous solvent extract of Euglena that has no reports of side effects so far and has a safety level consistent with the Food Sanitation Law, it can be continuously administered and ingested over a long period of time. is there.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of a fat differentiation inhibition test of Euglena water extract or hot water extract of Examples 2 to 6 of the present invention, which was verified in Test Example 2.
  • FIG. FIG. 5 is a photograph showing the results of lipid droplet staining after a fat differentiation inhibition test of Euglena water extract or hot water extract of Examples 2 to 6 of the present invention verified in Test Example 2.
  • FIG. It is a graph which shows the result of the fat differentiation suppression test of the Euglena hot water extract of Example 1 of this invention and the EPA of Comparative Example 1 which was verified in Test Example 3.
  • This embodiment relates to the invention of an adipocyte differentiation inhibitor, a PPAR ⁇ expression inhibitor, a C / EBP ⁇ expression inhibitor, an anti-obesity agent, and an anti-metabolic syndrome agent comprising Euglena aqueous solvent extract as an active ingredient.
  • “obesity” is a state in which the body weight is higher than that in a normal state, or a body fat is excessively accumulated.
  • BMI Body Mass Index, body mass index
  • WHO World Health Organization
  • BMI 30 or more is obesity
  • Japan BMI 25 or more is obesity.
  • the criteria for Japanese judgment are standards defined by the Japanese Society of Obesity and are based on the fact that Japanese people have increased the frequency of complications such as impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and hypertension from around BMI 25.
  • “obesity” refers to a condition requiring weight loss treatment when there is an associated health disorder due to obesity or excessive accumulation of visceral fat predicted to cause the health disorder. It is. Obesity is caused by an increase in the number of fat cells and enlargement of fat cells, and the life cycle of fat cells such as proliferation and differentiation of preadipocytes, enlargement, or fat cell death and elimination from the living body. Involved. In the present specification, “anti-obesity” means prevention or treatment of the above obesity.
  • metabolic syndrome represents a state in which a series of pathological groups such as type 2 diabetes based on insulin resistance, hyperlipidemia, hypertension, visceral fat type obesity, fatty liver and the like are combined, It is also known by names such as syndrome X, insulin resistance syndrome, visceral fat syndrome, and multiple risk factor syndrome.
  • antimetabolic syndrome means prevention or treatment of at least one disease state selected from the above-mentioned disease state group.
  • An adipocyte is a cell having lipid droplets in the cytoplasm, and is classified into a monocystic adipocyte (white adipocyte) and a multivesicular adipocyte (brown adipocyte).
  • White adipocytes are consumed in excess and convert excess energy that is not consumed into neutral fat and accumulate as an energy source.
  • White adipose cells are widely present in the human body, but are particularly abundant in the lower abdomen, buttocks, thighs, back, upper arm, and viscera, and accumulate as subcutaneous fat and visceral fat.
  • the number of white adipocytes in adults around the age of 20 is about 40 billion, but the number of white adipocytes in obese people can be as high as 40 to 60 billion.
  • White fat cells break down the accumulated fat when energy is needed and supply it to the whole body as free fatty acids and glycerol. At that time, the white fat cells that have released the fat return to the preadipocytes, and when the energy becomes excessive again, they become mature fat cells and take in the fat.
  • brown adipocytes have a function of generating heat by decomposing excess fat, and are present in specific parts of the human body such as the back of the neck, around the shoulder blades, under the arms, around the heart and kidneys.
  • the number of brown adipocytes is greatest immediately after birth, decreases with age as an adult, and particularly decreases after age 40 years. This reduction in the number of brown adipocytes has been reported to be a major cause of middle-age fatness.
  • the life cycle of adipocytes is (1) a process in which mesenchymal stem cells are determined to differentiate into preadipocytes, and (2) proliferation of preadipocytes and differentiation into mature adipocytes. (3) Apoptosis of enlarged fat cells and a process of being excluded from the living body can be considered. Transcription factors closely related to the adipocyte differentiation process have been clarified by a system using cultured cells or genetically modified individuals.
  • PPAR Peroxisome Proliferator-Activated Receptor, peroxisome proliferator-responsive receptor
  • C / EBP CCAAT / Enhancer-Binding Protein, CCAAT / Enhancer Binding Protein
  • PPAR ⁇ A family of PPARs such as PPAR ⁇ , PPAR ⁇ , and PPAR ⁇ is known. Among them, PPAR ⁇ is particularly important for adipocyte differentiation. When PPAR ⁇ is forcibly expressed in lipoblasts and preadipocytes, it differentiates into adipocytes.
  • C / EBP is known to be a family of C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , and C / EBP ⁇ is the same as PPAR ⁇ in adipocyte differentiation. It functions as a master regulator.
  • C / EBP ⁇ and C / EBP ⁇ are expressed at the early stage of differentiation and control the expression of C / EBP ⁇ and PPAR ⁇ .
  • SREBP1 / ADD1 is known to promote adipocyte differentiation, while being involved in PPAR ⁇ ligand generation in the adipocyte differentiation process.
  • Euglena includes taxonomically classified microorganisms classified as Euglena, variants thereof, variants thereof, and closely related species of Euglenaaceae.
  • the Euglena genus is a group of organisms belonging to the Excavator, Euglenozoa, Euglena algae, Euglena, Euglena family among eukaryotes.
  • Euglena chadefaudii Euglena deses, Euglena gracilis, Euglena granulata, Euglena mutabilis, Euglena proxima, Euglena spirogyra, Euglena viridis, and the like.
  • Euglena Euglena gracilis (E. gracilis), particularly E. gracilis Z strain, can be used. (Chloroplast-deficient strains) and variants of E. gracilis var. Bacillaris, genetic mutants such as chloroplast mutants of these species, other Euglenas such as Astaia longa, and ⁇ -1 derived therefrom A substance such as 3-glucanase may be used.
  • Euglena is widely distributed in fresh water such as ponds and swamps, brackish water, and seawater, and may be used separately from these, or any Euglena that has already been isolated may be used. Good. Euglena includes all its mutants. These mutant strains also include those obtained by genetic methods such as recombination, transduction, transformation and the like.
  • examples of the culture solution include a culture solution to which nutrient salts such as a nitrogen source, a phosphorus source, and a mineral are added, such as a modified Cramer-Myers medium ((NH 4 ) 2 HPO 4 1.0 g / L.
  • KH 2 PO 4 1.0 g / L, MgSO 4 .7H 2 O 0.2 g / L, CaCl 2 .2H 2 O 0.02 g / L, Fe 2 (SO 2 ) 3 7H 2 O 3 mg / L, MnCl 2 ⁇ 4H 2 O 1.8 mg / L, CoSO 4 ⁇ 7H 2 O 1.5 mg / L, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.4 mg / L, Na 2 MoO 4 ⁇ 2H 2 O 0.2 mg / L, CuSO 4 .5H 2 O 0.02 g / L, thiamine hydrochloride (vitamin B 1 ) 0.1 mg / L, cyanocobalamin (vitamin B 12 , (pH 3.5)) can be used.
  • (NH 4 ) 2 HPO 4 can also be converted to (NH 4 ) 2 SO 4 or NH 3 aq.
  • a known Hunter medium or Koren-Hunter medium prepared based on the description of Euglena Physiology and Biochemistry (Edited by Shozaburo Kitaoka, Society Publishing Center, Inc.) may be used.
  • the pH of the culture solution is preferably 2 or more, and the upper limit thereof is preferably 6 or less, more preferably 4.5 or less.
  • the photosynthetic microorganisms can grow more dominantly than other microorganisms, so that contamination can be suppressed.
  • Euglena cells may be cultured by an open pond method using sunlight directly, a light collecting method in which sunlight condensed by a light concentrator is sent through an optical fiber, etc., and irradiated in a culture tank and used for photosynthesis.
  • Euglena cells can be cultured using, for example, a fed-batch method, but flask culture, fermentation using a fermentor, batch culture, semi-batch culture (fed-batch culture), continuous culture (perfusion) Any liquid culture method such as a culture method may be used.
  • the culture can be performed using a known culture apparatus such as an open pond type, a raceway type, or a tube type, or an experimental culture vessel such as a Sakaguchi flask, an Erlenmeyer flask, or a reagent bottle. Since Euglena assimilate CO 2 , it is preferable to pass air containing 1 to 5% CO 2 through the medium when culturing using Cramer-Myers medium, which is an autotrophic medium. Furthermore, in order to sufficiently develop the chloroplast, about 1 to 5 g of ammonium phosphate may be added per liter of the medium.
  • the culture temperature is usually 20 to 34 ° C., particularly preferably 28 to 30 ° C.
  • Euglena Depending on the culture conditions, Euglena usually enters a logarithmic growth phase 2 to 3 days after the start of culture, and reaches a stationary phase about 4 to 5 days. Euglena may be cultured under light irradiation (light culture) or non-irradiated (dark culture).
  • Euglena cells are separated by, for example, centrifugation or simple sedimentation of a culture solution, membrane filtration, or the like.
  • the dried Euglena alga body is prepared by washing the separated Euglena cells and then freeze-drying them in a known manner. However, adjustment of the dried alga body may be performed by spray drying, heating vacuum drying, or the like.
  • the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, anti-obesity agent, and anti-metabolic syndrome agent of this embodiment were separated from the culture solution as Euglena by centrifugation, sedimentation, membrane filtration, etc.
  • Euglena alga bodies may be used, or dried alga bodies may be used. Moreover, you may use the dry powder of Euglena which grind
  • Euglena aqueous solvent extract means an extract extracted from Euglena using an aqueous solvent, and in particular, water is used as an aqueous solvent at 5 ° C. to 600 ° C. for several seconds to several It is preferable to use an Euglena water extract or hot water extract extracted for 10 hours.
  • the water used for extraction does not necessarily need to be distilled water, pure water, or ultrapure water. For example, it may contain tap water or impurities, but it contains components that hinder the extraction of active ingredients. No water is preferred.
  • the “water extract” means an extract with water at 0 to 50 ° C. (excluding 0 ° C.).
  • water means water at 0 to 50 ° C. (excluding 0 ° C.).
  • the temperature of the water is not particularly limited as long as it is within a range in which the active ingredient can be sufficiently extracted without affecting the active ingredient, but preferably 1 to 40 ° C, more preferably 5 to 35 ° C, Particularly preferred is 10 to 30 ° C.
  • the “hot water extract” means an extract with water having a temperature higher than 50 ° C., and can also be referred to as a “hot water extract”.
  • hot water means water having a temperature higher than 50 ° C., and is a concept including “hot water”, and includes water in a boiling state. Moreover, it is not limited to hot water in a liquid state, and includes hot water in a gas state and a supercritical state.
  • the temperature of the hot water is not particularly limited as long as it is within a range in which the active ingredient can be sufficiently extracted without affecting the active ingredient, but is preferably higher than 50 ° C. and 120 ° C. or lower, more preferably 50 It is higher than 100 ° C. and lower than 100 ° C.
  • the pH of water used for extraction is not particularly limited as long as the active ingredient can be sufficiently extracted without affecting the active ingredient, but is preferably 4 to 10, more preferably 5 to 9. Particularly preferably, the pH is 6 to 8.
  • water is used alone as the aqueous solvent, but the active ingredient can be sufficiently extracted without affecting the active ingredient, and usually one kind of solvent that can be used for extraction is used. Or you may select and use 2 or more types.
  • solvents include ethanol, methanol, n-propanol, and isopropanol.
  • glycols include butylene glycol and propylene glycol.
  • Other aqueous solvents include acetone. These solvents may be used alone or as an aqueous solution, and may be used as any two or three or more mixed solvents.
  • the temperature of the aqueous solvent used for extraction is, for example, 0 ° C. or higher, and is not particularly limited as long as it does not affect the active ingredient.
  • an aqueous solvent in a boiling state or a supercritical state can be used, an aqueous solvent at 5 ° C. to 600 ° C. is preferable, and an aqueous solvent at 10 ° C. to 200 ° C. is more preferable. Therefore, the aqueous solvent for extraction includes an aqueous solvent in a boiling state or a supercritical state.
  • the amount of the aqueous solvent used for the extraction is preferably an amount that can sufficiently dissolve the water-soluble active ingredient contained in Euglena.
  • the extraction method is also not particularly limited.
  • extraction can be performed by the following method, but the extraction method is not limited to this, and a normal extraction method can be freely selected and used.
  • a method of centrifuging or filtering Euglena alga body dry powder in an aqueous solvent for a predetermined time and then centrifuging or filtering; Euglena alga body dry powder added to an aqueous solvent and shaken to uniformly disperse, and then centrifuged or filtered. Method, etc. It is also possible to heat the aqueous solvent after the addition of Euglena to facilitate extraction.
  • Euglena water extraction can be carried out by a conventional method as shown below, but is not limited thereto.
  • the Euglena tissue and water are placed in a container and allowed to stand for a predetermined time with appropriate stirring or shaking, and the resulting extract can be used as a water extract as it is.
  • a supernatant obtained by centrifuging such an extract can be used as a water extract.
  • such an extract or supernatant can be concentrated and dried to remove water, and this can be used as a water extract.
  • Water extraction may be performed by adding a small amount of alcohol, for example, 10% by mass or less, preferably ethanol, to water in order to increase extraction efficiency and shorten extraction time.
  • the extraction time in the case of performing water extraction is not particularly limited as long as the active ingredient is extracted, and can be appropriately set in the range of several seconds to several tens of hours according to the extraction temperature.
  • Extraction with hot water can be performed by a commonly used method as shown below, but is not limited thereto.
  • Euglena is extracted by introducing it with water into a commonly used extractor and then heating.
  • the pressure at the time of extraction can be set to 1 to 5000 atmospheres, and preferably 60 to 400 atmospheres.
  • the extraction time is preferably short, for example, within 3 minutes, more preferably within 1 minute, and particularly preferably within 30 seconds.
  • the extracted Euglena extract can be used as an active ingredient of the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, anti-obesity agent, and metabolic syndrome preventive or therapeutic agent according to this embodiment as it is.
  • the extract can be further separated into a fraction having a high activity by an appropriate separation means (for example, partition extraction, gel filtration, silica gel chromatography, reverse phase or normal phase high performance liquid chromatography, etc.). It is also possible to use it.
  • the Euglena extract or a fraction thereof can be concentrated and dried to remove the aqueous solvent, and this can be used as the aqueous solvent extract.
  • the adipocyte differentiation inhibitor, the PPAR ⁇ expression inhibitor, and the C / EBP ⁇ expression inhibitor according to the present embodiment include a Euglena aqueous solvent extract as an active ingredient.
  • the adipocyte differentiation inhibitor according to this embodiment suppresses the expression of PPAR ⁇ and C / EBP ⁇ , which are master regulators of adipocyte differentiation, and suppresses differentiation from preadipocytes to adipocytes in the adipocyte differentiation process. It is.
  • the anti-obesity agent and anti-metabolic syndrome agent contain Euglena aqueous solvent extract as an active ingredient.
  • Euglena aqueous solvent extract suppresses the expression of PPAR ⁇ and C / EBP ⁇ , which are master regulators of adipocyte differentiation, and suppresses the differentiation of preadipocytes into adipocytes, thereby suppressing the accumulation of adipocytes, As a result, it exerts preventive or therapeutic effects on anti-obesity and metabolic syndrome.
  • An adipocyte differentiation inhibitor, a PPAR ⁇ expression inhibitor, a C / EBP ⁇ expression inhibitor, an anti-obesity agent, and an anti-metabolic syndrome agent comprising the Euglena aqueous solvent extract according to the embodiment as an active ingredient are obesity and / or metabolic syndrome It is administered to patients who have received a definite diagnosis.
  • the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, anti-obesity agent, and anti-metabolic syndrome agent of the present embodiment are configured as a pharmaceutical composition, health food, etc. Or those who have developed symptoms of metabolic syndrome, those who have a tendency to increase BMI, those who are likely to suffer from obesity and / or metabolic syndrome genetically or in consideration of the living environment, etc. And prophylactic administration to those with metabolic syndrome.
  • Euglena aqueous solvent extract can be ingested as a food and has no side effects, so it can be administered even before a definitive diagnosis of obesity and / or metabolic syndrome.
  • any time after receiving a definitive diagnosis for example, when the BMI value decreases to less than 25, when the differentiation of adipocytes seems to become inactive, or other anti-obesity Administration can be continued until the time of switching to the agent.
  • the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor of this embodiment may be symptomatic for patients with obesity and / or metabolic syndrome patients who have a BMI value below 25 after treatment.
  • it can be continuously administered as a preventive or inhibitory agent for obesity and / or metabolic syndrome.
  • the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, anti-obesity agent, and anti-metabolic syndrome agent of the present embodiment are those who are susceptible to psychological and social stress, For example, it can be administered for a long period of time to a person who is prone to psychogenic stress, a person in a living environment, or a person preparing for a test.
  • the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, anti-obesity agent, and anti-metabolic syndrome agent of the present embodiment may be obesity and / or metabolic depending on diet and genetic factors. Long term for people in environments that are likely to suffer from syndromes, such as those in households with disturbed eating habits, family members such as parents who have obesity and / or metabolic syndrome Can be administered continuously for a period of time.
  • an adipocyte differentiation inhibitor, a PPAR ⁇ expression inhibitor, a C / EBP ⁇ expression inhibitor, an antiobesity agent, and an antimetabolic syndrome agent containing the Euglena aqueous solvent extract according to the present embodiment as an active ingredient is It is not limited to persons with the above symptoms or conditions or animals other than humans.
  • a C / EBP ⁇ expression inhibitor, an anti-obesity agent, and an anti-metabolic syndrome agent can be administered or ingested.
  • white adipocytes are provided by the adipocyte differentiation inhibitory effect, PPAR ⁇ expression inhibitory effect, and C / EBP ⁇ expression inhibitory effect of Euglena aqueous solvent extract. Can be suppressed.
  • infanthood is a period of less than one year from the age of birth
  • infanthood is a period of one to six years of age.
  • the term “puberty” refers to the period from when secondary sexual characteristics begin, to maturity, until height development finally stops.
  • the period is between 12 and 17 years old, but for women, according to the definition of the Japan Obstetrics and Gynecology Association, “beginning with the development of sexual function (breast development, pubic growth, etc.) The period until the completion of the secondary sexual characteristics and the menstrual cycle are almost smooth.
  • the average is between 8 and 9 years old and 17 and 18 years old.
  • WHO World Health Organization
  • an adipocyte differentiation inhibitor, a PPAR ⁇ expression inhibitor, a C / EBP ⁇ expression inhibitor, an anti-obesity agent, and an anti-metabolic syndrome agent containing Euglena aqueous solvent extract as an active ingredient are administered to humans after the age of 40 can do.
  • Humans over the age of 40 are losing their ability to generate heat by breaking down excess fat, making it easier to accumulate fat and make middle-aged fat, but the Euglena aqueous solvent extract contains fat. Accumulation of fat cells and middle-aged fat can be suppressed by a cell differentiation inhibitory effect, a PPAR ⁇ expression inhibitory effect, and a C / EBP ⁇ expression inhibitory effect.
  • an adipocyte differentiation inhibitor, a PPAR ⁇ expression inhibitor, a C / EBP ⁇ expression inhibitor, an anti-obesity agent, and an anti-metabolic syndrome agent containing the Euglena aqueous solvent extract according to this embodiment as an active ingredient are pharmacologically It can be used as a composition such as a pharmaceutical composition, a cosmetic composition, and a food composition by adding an acceptable additive.
  • the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, anti-obesity agent, and anti-metabolic syndrome agent comprising the Euglena aqueous solvent extract according to this embodiment as an active ingredient are excellent adipocyte differentiation.
  • the inhibitory effect, the PPAR ⁇ expression inhibitory effect, the C / EBP ⁇ expression inhibitory effect, the anti-obesity effect and the anti-metabolic syndrome effect can be used suitably for the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition can be applied to drugs of all dosage forms or quasi drugs.
  • powders, fine granules, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, extracts, pills, and other oral preparations external liquids, external gels, creams, ointments, It can be applied to external preparations such as sprays, nasal drops, liniments, lotions, haps, plasters, sprays, aerosols, or injections.
  • one or more pharmaceutically acceptable additives can be freely selected and contained.
  • an oral preparation for example, an excipient, a binder, a disintegrant, a surfactant, a preservative, a coloring agent, a corrigent, a fragrance, a stabilizer, an antiseptic, for example.
  • All additives that can be usually used in the field of pharmaceutical preparations, such as agents and antioxidants, can be contained.
  • a sustained-release preparation can be obtained using a drug delivery system (DDS).
  • DDS drug delivery system
  • a base when applying the pharmaceutical composition according to the present embodiment to an external preparation, a base, a surfactant, a preservative, an emulsifier, a colorant, a flavoring agent, a fragrance, a stabilizer, an antiseptic, an antioxidant, an abundance All additives that can be usually used in the field of pharmaceutical preparations, such as an agent, a solubilizing agent, and a suspending agent can be contained.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment when applied to an injection, for example, a solvent, a stabilizer, a solubilizing agent, a suspending agent, a preservative, an isotonic agent, an antiseptic, an antioxidant, etc.
  • a solvent for example, a solvent, a stabilizer, a solubilizing agent, a suspending agent, a preservative, an isotonic agent, an antiseptic, an antioxidant, etc.
  • all additives which can be usually used in the field of pharmaceutical preparations can be contained.
  • the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, anti-obesity agent, and anti-metabolic syndrome agent according to this embodiment are administered orally, transdermally, intradermally, subcutaneously, intramuscularly
  • the effect is exerted systemically or locally by administration, intravenous administration, or the like, or the effect is exhibited locally at the administration site.
  • the contents of the adipocyte differentiation inhibitor, the PPAR ⁇ expression inhibitor, the C / EBP ⁇ expression inhibitor, the antiobesity agent, and the antimetabolic syndrome agent are not particularly limited, depending on the purpose. It is possible to set freely.
  • the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, anti-obesity agent, and anti-metabolic syndrome agent comprising the Euglena aqueous solvent extract according to this embodiment as an active ingredient are excellent adipocyte differentiation. It is possible to provide a food composition having such an action by blending it into various foods by utilizing the inhibitory effect, the PPAR ⁇ expression inhibitory effect, the C / EBP ⁇ expression inhibitory effect, the anti-obesity effect and the metabolic syndrome prevention or treatment effect. it can.
  • beverages soft drinks, alcoholic beverages, carbonated beverages, milk beverages, fruit juice beverages, tea, coffee, nutrition drinks, etc.
  • seasonings such as soy sauce, soups, creams, various dairy products, processed meat products, agricultural products
  • frozen desserts such as ice cream
  • various powdered foods including beverages
  • concentrated beverages foods for preservation, frozen foods, breads, cereals, confectionery (candy), cookies, biscuits, gum, gummi , Chocolate, etc.
  • food for specified health use is a food containing health functional ingredients that affect physiological functions, etc., and can be used to indicate that it is suitable for specific health use with the permission of the Commissioner of the Consumer Affairs Agency. is there.
  • a specific health use it is a food that is sold with the label “Make it hard to get fat”, prevention and improvement of fat accumulation, suppression of adipocyte proliferation, prevention and improvement of obesity, etc.
  • the nutritional functional food is a food used for supplementing nutritional components (vitamins and minerals) and displays the function of the nutritional components.
  • the amount of nutrients contained in the daily intake standard amount must be within the specified upper and lower limits. You also need to.
  • the functional labeling food is a food that displays the functionality based on the scientific basis at the responsibility of the operator. Information on safety and functionality grounds was reported to the Commissioner of the Consumer Affairs Agency before sales.
  • the present embodiment includes a Euglena aqueous solvent extract as an active ingredient, a specific health food for preventing fat accumulation / a specific health food for inhibiting adipocyte differentiation, and a nutrition for preventing fat accumulation for obese patients. It can be used as a functional food / nutrient functional food for inhibiting adipocyte differentiation, a functional display food for preventing fat accumulation / a functional display food for inhibiting fat cell differentiation.
  • the present embodiment includes a Euglena aqueous solvent extract as an active ingredient, for fat accumulation prevention intended for living bodies, for example, humans before fat accumulation, humans of the metabolic syndrome reserve arm caused by fat accumulation Food for specified health use / Food for specified health use for prevention of fat cell differentiation, Food for nutrition function for preventing fat accumulation / Function food for nutrition function for preventing fat cell differentiation, Function food for preventing fat accumulation / Function display for preventing fat cell differentiation It can be used as food.
  • the food composition according to this embodiment is usually a food composition. It is possible to freely select one or more components that can be used in the preparation. For example, all additives that can be usually used in the food field, such as various seasonings, preservatives, emulsifiers, stabilizers, fragrances, colorants, preservatives, and pH adjusters can be contained.
  • the content of the adipocyte differentiation inhibitor, the PPAR ⁇ expression inhibitor, the C / EBP ⁇ expression inhibitor, the anti-obesity agent, and the anti-metabolic syndrome agent in the food composition is not particularly limited and can be freely set according to the purpose. Is possible.
  • the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, anti-obesity agent, and anti-metabolic syndrome agent comprising the Euglena aqueous solvent extract according to this embodiment as an active ingredient are excellent adipocyte differentiation.
  • the inhibitory effect, the PPAR ⁇ expression inhibitory effect, the C / EBP ⁇ expression inhibitory effect, the anti-obesity effect and the metabolic syndrome prevention or improvement effect can be preferably used for the cosmetic composition.
  • the cosmetic composition can be applied to any form of cosmetic.
  • cosmetics such as lotions, milky lotions, creams, and cosmetics, foundations, concealers, makeup bases, makeup cosmetics such as lipsticks, blushers, eye shadows, and eyeliners, sunscreen cosmetics, etc. .
  • the cosmetic composition according to this embodiment is usually a cosmetic.
  • One or two or more components that can be used in the composition can be freely selected and blended.
  • the contents of the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, anti-obesity agent, and anti-metabolic syndrome agent are not particularly limited, depending on the purpose Can be set freely.
  • the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, anti-obesity agent, and anti-metabolic syndrome agent of this embodiment are produced by the following method.
  • a dispersion preparation step is performed in which an aqueous solvent is added to Euglena and stirred and / or shaken to obtain a dispersion.
  • Euglena powder may be used as Euglena.
  • the dispersion liquid is centrifuged, and an extraction step is performed to obtain a supernatant as an aqueous solvent extract of Euglena.
  • the heating step may be performed by heating the dispersion using heating means such as a high-pressure steam sterilizer.
  • a dispersion preparation step is performed in which an aqueous solvent is added to Euglena and stirred and / or shaken to obtain a dispersion.
  • a heating step is performed in which the dispersion is heated using a heating means and is heated and extracted.
  • the dispersion liquid is centrifuged, and an extraction step is performed in which the supernatant is obtained as an aqueous solvent extract of Euglena.
  • the set temperature of the heating means is room temperature or higher, for example, 20 ° C or higher and 50 ° C or lower, 50 ° C or higher and 80 ° C or lower, 80 ° C or higher and 100 ° C or lower, 100 ° C or higher and 120 ° C or lower, 120 ° C or higher and 150 ° C or lower, It can be set to 150 ° C. or higher and 200 ° C. or lower.
  • the heating step when the Euglena aqueous solvent dispersion is placed in a sealed container, the set temperature of the heating means matches the temperature of the Euglena aqueous solvent dispersion.
  • the temperature of the Euglena aqueous solvent dispersion is determined according to the atmospheric pressure around the open container. It becomes about 100 ° C.
  • the heating step when the Euglena aqueous solvent dispersion is placed in an open container, the heating step and the Euglena aqueous solvent extract concentration step are performed simultaneously.
  • an aqueous solvent extract of Euglena may be obtained by a general separation method.
  • an aqueous solvent extract of Euglena may be obtained from the filtrate obtained by filtering the dispersion.
  • a dispersion obtained by adding an aqueous solvent and shaking without performing centrifugation or filtration can be directly used as an Euglena aqueous solvent extract.
  • the obtained Euglena aqueous solvent extract is further fractionated to a highly active fraction by an appropriate separation means (for example, partition extraction, gel filtration, silica gel chromatography, reversed phase or normal phase high performance liquid chromatography, etc.).
  • a fractionation step obtained in this manner may be performed.
  • a concentration step of concentrating the obtained Euglena aqueous solvent extract or fraction and / or a drying step of evaporating and drying the aqueous solvent may be performed.
  • the aqueous solvent extract of Euglena obtained as described above is used as the adipocyte differentiation inhibitor, PPAR ⁇ expression inhibitor, C / EBP ⁇ expression inhibitor, anti-obesity agent, and anti-metabolic syndrome agent of this embodiment.
  • Example 1 Euglena powder (Euglena Gracilis, EU-1593, Euglena Co., Ltd.) 0.5 g was added with 20 ml of ultrapure water, shaken and dispersed uniformly, and then heated and extracted using a dry heat sterilizer (95 ° C. 2 hours). The supernatant obtained by centrifugation (4000 rpm, 3 minutes, 25 ° C.) is collected and filtered through a 0.45 ⁇ m sterilizing filter to prepare a Euglena hot water extract (Euglena hot water extract, stock solution). did. The extract was used as an adipocyte differentiation inhibitor.
  • Example 2 20 g of ultrapure water was added to 0.5 g of Euglena powder (Euglena Gracilis, EU-1593, manufactured by Euglena Co., Ltd.), shaken and dispersed uniformly, and then extracted at room temperature (25 ° C.) for 2 hours. The supernatant obtained by centrifugation (4000 rpm, 3 minutes, 25 ° C.) was collected and filtered through a 0.45 ⁇ m sterilizing filter to prepare a Euglena water extract (Euglena water extract, stock solution). The extract was used as an adipocyte differentiation inhibitor.
  • Euglena powder Euglena Gracilis, EU-1593, manufactured by Euglena Co., Ltd.
  • Examples 3 to 5 Euglena powder (Euglena Gracilis, EU-1593, manufactured by Euglena Co., Ltd.) 0.5 g was added with 20 ml of ultrapure water, shaken and dispersed uniformly, and then each temperature (implemented using a dry heat sterilizer) Example 3: 50 ° C, Example 4: 75 ° C, Example 5: 95 ° C) for 2 hours. The supernatant obtained by centrifugation (4000 rpm, 3 minutes, 25 ° C.) is collected and filtered through a 0.45 ⁇ m sterilizing filter to prepare a Euglena hot water extract (Euglena hot water extract, stock solution). did. The extract was used as an adipocyte differentiation inhibitor.
  • Example 6 Euglena powder (Euglena Gracilis, EU-1593, manufactured by Euglena Co., Ltd.) 0.5 g was added with 20 ml of ultrapure water, shaken and dispersed uniformly, and then heated and extracted using a high-pressure steam sterilizer (120 ° C. 20 minutes). The supernatant obtained by centrifugation (4000 rpm, 3 minutes, 25 ° C.) is collected and filtered through a 0.45 ⁇ m sterilizing filter to prepare a Euglena hot water extract (Euglena hot water extract, stock solution). did. The extract was used as an adipocyte differentiation inhibitor.
  • ⁇ Experimental example 1 Euglena hot water extract using adipose-derived stem cells> (Culture medium)
  • a fat-derived stem cell growth medium growth medium
  • a medium containing DMEM, ⁇ MEM, 1% FBS, ITS-X, 10 ng / mLb-FGF, and hydrocortisone was used.
  • a medium containing DMEM, 10% FBS, 1 ⁇ M dexamethasone 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 0.2 mM indomethacin, 10 ⁇ g / mL insulin, 33 ⁇ M biotin was used.
  • adipocyte differentiation maintenance medium a medium containing DMEM, 10% FBS, 10 ⁇ g / mL insulin, 33 ⁇ M biotin was used.
  • the Euglena extract-added medium solution containing a predetermined concentration of Euglena extract was prepared by adding the Euglena extract of each Example to the adipocyte differentiation induction medium. 2) The culture supernatant was removed with an aspirator, and 500 ⁇ l of Euglena extract added medium solution prepared in 1) was added. 3) Adipocyte differentiation induction medium was added to the control. 4) Cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5 vol% CO 2 ) for 7 days. 5) The medium was changed once every 2 to 3 days.
  • the fixing solution in the plate was removed.
  • Example 2 Euglena water extract extracted at different temperatures> Instead of the Euglena hot water extract of Example 1, the water extract or hot water extract of Examples 2 to 6 (Example 2: 25 ° C., Example 3: 50 ° C., Example 4: 75 ° C. (Example 5: 95 ° C., Example 6: 120 ° C.)
  • Example 3 Euglena Hot Water Extract and EPA Fat Differentiation Inhibition Test>
  • a test similar to Test Example 1 was performed using Euglena hot water extract of Example 1 and eicosapentaneenoic acid (EPA), which is known to have a fat differentiation inhibitory effect as Comparative Example 1.
  • EPA eicosapentaneenoic acid
  • Example 4 Fat Differentiation Inhibition Test with Different Addition Period of Euglena Hot Water Extract>
  • a test similar to Test Example 1 was conducted except that the Euglena hot water extract of Example 1 was used and the period during which the Euglena hot water extract was added to the medium was changed. Specifically, when 0 to 7 days of culture using an adipocyte differentiation induction medium are the first half, and 7 to 14 days of culture using an adipocyte differentiation maintenance medium are the second half ( i) When Euglena hot water extract is added in the first half and second half, (ii) Euglena hot water extract is added only in the first half, and (iii) Euglena hot water extract is added only in the second half. The fat accumulation rate was compared.
  • FIG. 9 shows a graph comparing the fat accumulation rate when the result of Test Example 4 was analyzed and the period for adding the Euglena hot water extract was changed. It was found that the fat accumulation rate was comparable in the case where the period of addition of the Euglena hot water extract was (i) the first half and the second half and (ii) only the first half. On the other hand, it was found that (iii) the fat accumulation rate was high when the addition period was only the latter half. This result has shown that the fat differentiation inhibitory effect of a Euglena hot water extract is exhibiting the effect in the first half of fat differentiation induction.
  • Example 5 Gene Expression Analysis by Real-Time PCR>
  • the same test as in Test Example 1 was performed using the Euglena hot water extract of Example 1. Specifically, Euglena hot water extract was added on day 0 and cultured using a differentiation-inducing medium. On day 1, day 2, day 3, day 6, day 13 of culture. The total RNA was extracted from the cells, and the expression levels of the PPAR ⁇ gene and the C / EBP ⁇ gene were measured using real-time PCR using cDNA obtained by the reverse transcription reaction.
  • RNA isolation and extraction of RNA 1) The medium was removed and the plate was washed twice with PBS ( ⁇ ). 2) After removing PBS ( ⁇ ), 0.5 ml of total RNA extraction reagent (RNAiso Plus, manufactured by Takara Bio Inc.) was added and transferred to a 1.5 ml microtube (can be stored at ⁇ 80 ° C.). 3) 100 ⁇ l of chloroform (0.2 times the amount of total RNA extraction reagent) was added, and the mixture was stirred with a vortex mixer for 15 seconds and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. 4) Centrifugation was performed at 12000 g and 4 ° C. for 15 minutes.
  • CDNA synthesis 1) The concentration was measured with a spectrophotometer (NanoDrop ND-2000C, manufactured by Thermo). 2) 5 ⁇ PrimeScript RT Master Mix and 2 ⁇ l of Total RNA were added to the microtube, and sterilized water was added to 10 ⁇ l and mixed. 3) A sample was placed in a thermal cycler (TP600, manufactured by TaKaRa), held at 37 ° C for 15 minutes, held at 85 ° C for 5 seconds, and cooled to 25 ° C to perform a reverse transcription reaction. 4) Diluted 10-fold by adding 90 ⁇ l of sterilized water and stored at ⁇ 20 ° C.
  • Primer SYBR mix having a capacity of +1 number of wells to be used was prepared by mixing reagents in the following ratio. PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems): 5 ⁇ l ⁇ well number Primer: 0.6 ⁇ l ⁇ well number Sterile water: 1.4 ⁇ l ⁇ well number 2) 3 ⁇ l of each sample was added to a 96-well plate. Sterile water was added to the negative control (NC). 3) 7 ⁇ l each of the primer SYBR mix was added, and the plate was spun down with a plate centrifuge (PS-020, manufactured by TOMY).
  • PS-020 plate centrifuge
  • GAPDH-F 5'-TGCACCACCACCAACTGCTTAGC-3 '(SEQ ID NO: 5) used for expression analysis of House Keeping Gene (GAPDH) gene
  • GAPDH-R 5′-TCTTCTGGGTGGCAGTGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
  • FIG. 11 shows the results of comparing the expression levels of the PPAR ⁇ genes on the first day, the second day, the third day, the sixth day, and the thirteenth day when the expression level of the PPAR ⁇ gene on the 0th day of culture is 1. .
  • the expression level of the PPAR ⁇ gene on the first day, the second day, the third day, the sixth day, and the thirteenth day is as follows. When the Euglena hot water extract was added at 10 vol% and 20 vol%, the PPAR ⁇ gene expression level It was found that the gene expression level was significantly reduced. It was also found that the expression of the PPAR ⁇ gene is suppressed as the concentration of Euglena hot water extract increases.
  • the C / EBP ⁇ gene expression level is the same as the C / EBP ⁇ gene expression level compared to the control cultured in a medium that induces adipocyte differentiation. It was found that there was a significant decrease. It was also found that the expression of the C / EBP ⁇ gene is suppressed as the concentration of Euglena hot water extract increases.

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Abstract

ユーグレナ抽出物の新規な利用方法となる新規な脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、及び脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物を提供する。　ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有する新規な脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、及び脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物である。例えば、ユーグレナ水性溶媒抽出物は、ユーグレナの水抽出物又は熱水抽出物である。

Description

脂肪細胞分化抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物及び脂肪細胞分化抑制剤の製造方法
　本発明は、脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物及び脂肪細胞分化抑制剤の製造方法に関する。
　生活習慣病と呼ばれる疾患には、例えば、肥満症、高血圧症、糖尿病、高脂血症、心筋梗塞、脳卒中などが挙げられる。近年、これらの疾患は、個々の原因で発症するのではなく、種々の原因が影響し合って発症することが分かっており、このような複合生活習慣病は、メタボリックシンドロームとも呼ばれている。
　「メタボリックシンドローム」とは、インスリン抵抗性を基盤とする２型糖尿病、高脂血症、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝などの一連の病態群を合併した状態を表す。
　メタボリックシンドロームは、脂肪細胞、特に、内臓における脂肪細胞（内蔵脂肪）の蓄積によりインスリンの働きの低下が起こり、高血糖、脂質代謝異常、高血圧などの動脈硬化のリスクファクターが、集積している状態である。
　脂肪細胞の蓄積は、肥満症、高血圧症、糖尿病、高脂血症、心筋梗塞、脳卒中などにつながることが解明されており、これらの疾病の予防および治療をするために、脂肪細胞の蓄積を防止することが、極めて重要視されている。
　ここで、「肥満症」とは、肥満に起因、関連する健康障害を有するか、該健康障害が予測される内臓脂肪が過剰に蓄積した場合で、減量治療を必要とする状態のことである。
　また、最近の健康や美容への関心の高まりから、老若男女を問わず、健康的でスリムな身体を維持したいと願う人も増加しており、肥満症でない人の間でも、局所の脂肪蓄積に関して非常に高い関心が持たれている。
　従来、肥満症を治療又は予防する抗肥満剤としては、蓄積した脂肪を分解することにより脂肪蓄積抑制効果を示すものが多かった。
　肥満症は、前駆脂肪細胞が脂肪細胞（成熟脂肪細胞）へと分化し、その数及びサイズが増大することによるものである。また、脂肪細胞の分化過程における、脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとして、ＰＰＡＲγやＣ／ＥＢＰα等の転写因子が知られている。肥満症を予防及び治療するには、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を抑制するのが効果的である。
　脂肪細胞分化抑制剤としては、ホップ組織の水抽出物（特許文献１）、酸性ムコ多糖類（特許文献２）、植物抽出物（特許文献３）等が知られている。その中でも、特許文献１には、ホップ組織の水抽出物が、ＰＰＡＲγの発現を抑制し、これを介して脂肪細胞の分化を抑制することが開示されている。
　一方で、食糧、飼料、燃料等としての利用が有望視されている生物資源として、ユーグレナ（属名：Euglena、和名：ミドリムシ）が注目されている。
　ユーグレナは、ビタミン，ミネラル，アミノ酸，不飽和脂肪酸など、人間が生きていくために必要な栄養素の大半に該当する５９種類もの栄養素を備え、多種類の栄養素をバランスよく摂取するためのサプリメントとしての利用や、必要な栄養素を摂取できない貧困地域での食糧供給源としての利用の可能性が提案されている。
　ユーグレナは、食物連鎖の第一次生産者に位置し、捕食者により捕食されることや、光、温度条件、撹拌速度などの培養条件が他の微生物に比べて難しいなどの理由から、大量培養が難しいとされてきたが、近年、本発明者らの鋭意研究によって、大量培養技術が確立され、ユーグレナ及びユーグレナから抽出されるパラミロン等、ユーグレナ由来物質の大量供給の途が開かれた。
　ユーグレナは、鞭毛運動をする動物的性質をもちながら、同時に植物として葉緑体を持ち光合成を行うユニークな生物であり、ユーグレナ自体やユーグレナ由来の物質に、多くの機能性があることが期待されている。
　そのため、大量供給可能となったユーグレナ及びユーグレナ由来物質の利用法の開発が望まれている。
特開２０１０－１７３９４２号公報 特開２０１４－９１６１号公報 特開２０１１－６３４７号公報
　本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、新規な脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物を提供することにある。
　本発明の他の目的は、ユーグレナ水性溶媒抽出物の新規な利用方法となる脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物を提供することにある。
　本発明者らは、鋭意研究した結果、ユーグレナ水性溶媒抽出物が、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制する作用を有することを見出した。
　より詳細には、前駆脂肪細胞が成熟脂肪細胞へと分化する過程において、鍵となる転写因子群のうち、ＰＰＡＲγおよびＣ／ＥＢＰαの発現を抑制し、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制することを明らかにして、本発明をするに至った。
　従って、前記課題は、本発明によれば、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物により解決される。
　このとき、前記ユーグレナ水性溶媒抽出物は、ユーグレナ水抽出物又はユーグレナ熱水抽出物であるとよい。
　本発明は、これまでに副作用の報告がなく、食品衛生法に合致する水準の安全性を備えたユーグレナの水性溶媒抽出物を有効成分としているため、長期間の継続投与および継続摂取が可能である。
　前記課題は、本発明によれば、ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調整工程と、前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤の製造方法により解決される。
　このとき、前記分散液調製工程の後、前記抽出工程の前に、前記分散液を加熱する加熱工程を行ってもよい。
　本発明によれば、新規な脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、脂肪細胞分化抑制用食品組成物、及び脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物を提供することができる。
　本発明は、これまでに副作用の報告がなく、食品衛生法に合致する水準の安全性を備えたユーグレナの水性溶媒抽出物を有効成分としているため、長期間の継続投与および継続摂取が可能である。
脂肪細胞のライフサイクル及び転写因子である蛋白質発現量を示す概略説明図である。 本発明の一実施例に係る、実施例１及び実施例２～６のユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物の脂肪分化抑制効果を検証した脂肪分化抑制試験の手順を示す説明図である。 試験例１において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物の脂肪分化抑制試験の結果を示すグラフである。 試験例１において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物の脂肪分化抑制試験後の脂肪滴染色の結果を示す写真である。 試験例２において検証を行った、本発明の実施例２～６のユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物の脂肪分化抑制試験の結果を示すグラフである。 試験例２において検証を行った、本発明の実施例２～６のユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物の脂肪分化抑制試験後の脂肪滴染色の結果を示す写真である。 試験例３において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物および比較例１のＥＰＡの脂肪分化抑制試験の結果を示すグラフである。 試験例３において検証を行った、比較例１のＥＰＡの脂肪分化抑制試験後の脂肪滴染色の結果を示す写真である。 試験例４において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物を添加する期間を変えた場合の脂肪分化抑制試験の手順を示す説明図及び、脂肪分化抑制試験の結果を示すグラフである。 試験例４において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物を添加する期間を変えた場合の脂肪分化抑制試験後の脂肪滴染色の結果を示す写真である。 試験例５において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物を添加したときのＰＰＡＲγ遺伝子発現量を比較した結果を示すグラフである。 試験例５において検証を行った、本発明の実施例１のユーグレナ熱水抽出物を添加したときのＣ／ＥＢＰα遺伝子発現量を比較した結果を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について、図１～図１２を参照しながら説明する。
　本実施形態は、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分とする、脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤の発明に関するものである。
　本明細書において、「肥満」とは、正常な状態と比較して体重が多い状態、又は体脂肪が過剰に蓄積した状態である。肥満の判定基準として、ＢＭＩ（Ｂｏｄｙ　Ｍａｓｓ　Ｉｎｄｅｘ、ボディマス指数）が用いられている。ＷＨＯ（Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、世界保健機関）による肥満の判定基準では、ＢＭＩ　３０以上を肥満とし、一方、日本ではＢＭＩ　２５以上を肥満としている。日本の判定基準は、日本肥満学会が定義した基準で、日本人はＢＭＩ　２５を超えたあたりから、耐糖能障害、脂質異常症、高血圧といった合併症の発症頻度が高まることに基づいている。
　本明細書において、「肥満症」とは、肥満に起因、関連する健康障害を有するか、該健康障害が予測される内臓脂肪が過剰に蓄積した場合で、減量治療を必要とする状態のことである。肥満症は、脂肪細胞数の増加及び脂肪細胞の肥大化に起因するものであり、前駆脂肪細胞の増殖や分化、肥大化、あるいは脂肪細胞の死および生体からの排除といった脂肪細胞のライフサイクルと関係している。
　本明細書において、「抗肥満」とは、上記肥満症を予防又は治療することを意味する。
　本明細書において、「メタボリックシンドローム」とは、インスリン抵抗性を基盤とする２型糖尿病、高脂血症、高血圧、内臓脂肪型肥満、脂肪肝などの一連の病態群を合併した状態を表し、シンドロームＸ、インスリン抵抗性症候群、内臓脂肪症候群、マルチプルリスクファクター症候群などの呼称でも知られている。
　本明細書において、「抗メタボリックシンドローム」とは、上記の病態群より選ばれる少なくとも１つ以上の病態を予防又は治療することを意味する。
＜脂肪細胞の概要＞
　脂肪細胞とは、細胞質内に脂肪滴を有する細胞のことであり、単胞性脂肪細胞（白色脂肪細胞）と、多胞性脂肪細胞（褐色脂肪細胞）とに分類される。
　白色脂肪細胞は、過剰に摂取されて、消費されなかった過剰なエネルギーを中性脂肪へと変換し、エネルギー源として蓄積する。白色脂肪細胞は、人体に広く存在しているが、特に下腹部、臀部、大腿部、背中、上腕部、内臓の周囲などに多く、皮下脂肪や内臓脂肪として蓄積される。
　白色脂肪細胞の数は、乳幼児や思春期など、限られた時期にのみ増加し、その時期に生涯の白色脂肪細胞の数が決定すると考えられていた。しかし、最近の研究では、過剰なエネルギー摂取や運動不足などにより、既に存在している白色脂肪細胞が中性脂肪で満たされると、思春期を過ぎてからでも脂肪細胞の数が増え、さらに脂肪を取り込むということがわかった。脂肪細胞の大きさが上限に達し、これ以上脂肪を溜め込めない状態になると、周囲の前駆脂肪細胞がＰＰＡＲγなどによって刺激されることで成熟脂肪細胞となり、順次肥大化し、さらに、成熟脂肪細胞も細胞分裂し、脂肪細胞の数も増加する。
　２０歳前後の成人における白色脂肪細胞の数は約４００億個であるが、肥満の人における白色脂肪細胞の数は、４００～６００億個にもなる。
　白色脂肪細胞は、エネルギーが必要となった時に、蓄積している脂肪を分解し、遊離脂肪酸とグリセロールとして全身に供給する。その際に、脂肪を放出した白色脂肪細胞は、前駆脂肪細胞に戻り、再びエネルギーが過剰な状態になると、成熟脂肪細胞となり、脂肪を取り込む。
　一方、褐色脂肪細胞は、余分な脂肪を分解することによって熱を生み出す働きがあり、首の後や肩甲骨周囲、脇の下、心臓や腎臓の周囲など、人体の特定の部分に存在している。褐色脂肪細胞の数は、生後すぐのときに最も多く、成人になると加齢に従い減少し、特に４０歳以降で顕著に減少する。この褐色脂肪細胞の数の減少が、中年太りの大きな原因になることが報告されている。
＜脂肪細胞のライフサイクルと転写因子カスケード、及び脂肪細胞分化抑制作用＞
　図１に示すように、脂肪細胞のライフサイクルは、（１）間葉系幹細胞が前駆脂肪細胞へ分化することが決定される過程、（２）前駆脂肪細胞の増殖と成熟脂肪細胞へと分化する過程、（３）肥大化した脂肪細胞のアポトーシスと生体から排除される過程に分けて考えることができる。
　培養細胞や遺伝子改変個体を用いた系などにより脂肪細胞分化過程に密接に関与する転写因子が、明らかになっている。
　ＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体）、Ｃ／ＥＢＰ（ＣＣＡＡＴ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ－Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質）、及びＳＲＥＢＰ－１／ＡＤＤ１（Ｓｔｅｒｏｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｅｌｅｍｅｎｔ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１　または　Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｆａｃｔｏｒ　１）は脂肪細胞の分化に最も重要な転写因子として知られている。
　ＰＰＡＲは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲδなどのファミリーが知られており、その中でもＰＰＡＲγは脂肪細胞分化に特に重要である。脂肪芽細胞や前駆脂肪細胞において、ＰＰＡＲγを強制的に発現させると脂肪細胞に分化する。
　Ｃ／ＥＢＰは、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃ／ＥＢＰε、Ｃ／ＥＢＰζなどのファミリーが知られており、Ｃ／ＥＢＰαがＰＰＡＲγと同じように脂肪細胞分化のマスターレギュレーターとして機能している。また、Ｃ／ＥＢＰβとＣ／ＥＢＰδは分化の初期に発現し、Ｃ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγの発現を制御している。
　ＳＲＥＢＰ１／ＡＤＤ１は、脂肪細胞の分化を促進することが知られている一方、脂肪細胞の分化過程においてＰＰＡＲγのリガンド生成に関わっている。
　これら３種類の転写因子群（ＰＰＡＲ、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＲＥＢＰ１／ＡＤＤ１）が、クロストークすることにより脂肪細胞の分化過程が進行する。
＜ユーグレナ＞
　本実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Euglena）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Euglenaceae）の近縁種を含む。
　ここで、ユーグレナ属（Euglena）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。
　ユーグレナ属に含まれる種として、具体的には、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena mutabilis、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridisなどが挙げられる。
　ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis），特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ－ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のE. gracilis var. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Astaia longa等のその他のユーグレナ類、及びそれらに由来するβ－１，３－グルカナーゼ等の物質であってもよい。
　ユーグレナ類は、池や沼などの淡水及び汽水、海水中に広く分布しており、これらから分離して使用しても良く、また、既に単離されている任意のユーグレナ類を使用してもよい。
　ユーグレナ類は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え，形質導入，形質転換等により得られたものも含有される。
　ユーグレナ細胞の培養において、培養液としては、例えば、窒素源，リン源，ミネラルなどの栄養塩類を添加した培養液、例えば、改変Ｃｒａｍｅｒ－Ｍｙｅｒｓ培地（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４　１．０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４　１．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．２ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　０．０２ｇ／Ｌ，Ｆｅ２（ＳＯ２）３・７Ｈ２Ｏ　３ｍｇ／Ｌ，ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ　１．８ｍｇ／Ｌ，ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１．５ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．４ｍｇ／Ｌ，Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ　０．２ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　０．０２ｇ／Ｌ，チアミン塩酸塩（ビタミンＢ１）　０．１ｍｇ／Ｌ，シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、（ｐＨ３．５））を用いることができる。なお、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４は、（ＮＨ４）２ＳＯ４やＮＨ３ａｑに変換することも可能である。また、そのほか、ユーグレナ生理と生化学（北岡正三郎編、株式会社学会出版センター）の記載に基づき調製される公知のＨｕｎｔｅｒ培地、Ｋｏｒｅｎ－Ｈｕｎｔｅｒ培地を用いてもよい。
　培養液のｐＨは好ましくは２以上、また、その上限は、好ましくは６以下、より好ましくは４．５以下である。ｐＨを酸性側にすることにより、光合成微生物は他の微生物よりも優勢に生育することができるため、コンタミネーションを抑制することができる。
　ユーグレナ細胞の培養は、太陽光を直接利用するオープンポンド方式、集光装置で集光した太陽光を光ファイバー等で送り、培養槽で照射させ光合成に利用する集光方式等により行ってもよい。
　また、ユーグレナ細胞の培養は、例えば供給バッチ法を用いて行われ得るが、フラスコ培養や発酵槽を用いた培養、回分培養法、半回分培養法（流加培養法）、連続培養法（灌流培養法）等、いずれの液体培養法により行ってもよい。
　培養は、オープンポンド型、レースウェイ型、チューブ型等の公知の培養装置や、坂口フラスコ、三角フラスコ、試薬ビンなどの実験用の培養容器を用いて行うことができる。ユーグレナはＣＯ２を資化するため、独立栄養培地であるＣｒａｍｅｒ－Ｍｙｅｒｓ培地を用いて培養する場合は１～５％ＣＯ２を含む空気を培地中に通過させることが好ましい。また、さらに、葉緑体を十分に発達させるために、培地１リットルあたり１～５ｇ程度のリン酸アンモニウムを加えるとよい。培養温度は、通常２０～３４℃で、特に２８～３０℃が好適である。また、培養条件にもよるが、ユーグレナは通常、培養開始後２～３日で対数増殖期となり、４～５日程度で定常期に到達する。
　ユーグレナは、光照射下で培養（明培養）されてもよく、無照射で培養（暗培養）されてもよい。
　ユーグレナ細胞の分離は、例えば、培養液の遠心分離または単純な沈降，膜濾過等によって行われる。
　ユーグレナの藻体乾燥物は、分離されたユーグレナ細胞を洗浄後、公知の方法で真空凍結乾燥することにより調製される。但し、藻体乾燥物の調整は、噴霧乾燥、加熱真空乾燥等により行ってもよい。
　本実施形態の脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、ユーグレナとして、遠心分離、沈降、膜濾過等により培養液から分離したユーグレナの藻体を用いてもよいし、藻体乾燥物を用いてもよい。また、藻体乾燥物を、公知の粉砕機で粉砕したユーグレナの乾燥粉末を用いてもよい。
＜ユーグレナ水性溶媒抽出物＞
　本実施形態において、「ユーグレナ水性溶媒抽出物」とは、水性溶媒を用いてユーグレナから抽出される抽出物を意味し、特に、水性溶媒として水を用い、５℃～６００℃で、数秒～数十時間抽出したユーグレナの水抽出物又は熱水抽出物を用いることが好ましい。
　抽出に使用する水は、必ずしも蒸留水や、純水、又は超純水である必要はなく、例えば、水道水や不純物を含むものであってもよいが、活性成分の抽出を妨げる成分を含まない水が好ましい。
　本実施形態において、「水抽出物」とは、０～５０℃（０℃を除く。）の水による抽出物を意味する。
　ここで、「水」とは、０～５０℃（０℃を除く。）の水を意味する。
　水の温度は、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分に抽出できる範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくは１～４０℃、より好ましくは５～３５℃、特に好ましくは１０～３０℃である。
　本実施形態において、「熱水抽出物」とは、５０℃よりも高い温度の水による抽出物を意味し、「温水抽出物」とも呼ぶことができる。
　ここで、「熱水」とは、５０℃よりも高温の水を意味し、「熱湯」も含む概念であり、沸騰状態にある水も含まれる。また、液体状態の熱水に限定されることなく、気体状態及び超臨界状態の熱水も含まれる。
　熱水の温度は、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分に抽出できる範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５０℃より高く１２０℃以下、より好ましくは５０℃より高く１００℃以下である。
　抽出に使用する水のｐＨは、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分抽出できる範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくはｐＨ４～１０、より好ましくはｐＨ５～９、特に好ましくはｐＨ６～８であるとよい。
　なお、本実施形態では、水性溶媒として、水を単独で用いるが、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分抽出できるものであって、通常、抽出に用いることができる溶媒を１種または２種以上選択して用いてもよい。例えば、水、アルコール類、グリコール類などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。アルコール類としては、エタノール、メタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール等が挙げられる。グリコール類としては、ブチレングリコール及びプロピレングリコール等が挙げられる。その他の水性溶媒としては、アセトン等が挙げられる。これらの溶媒は単独或いは水溶液として用いても良く、任意の２種または３種以上の混合溶媒として用いてもよい。
　抽出に用いる水性溶媒の温度は、例えば、０℃以上であり、活性成分に影響を与えないのであれば特に限定されることはない。沸騰状態又は超臨界状態にある水性溶媒を使用することもできるが、５℃～６００℃の水性溶媒を使用するのが好ましく、１０℃～２００℃の水性溶媒を使用するのがより好ましい。
　したがって、抽出用の水性溶媒とは、沸騰状態や超臨界状態にある水性溶媒も含むものである。抽出に使用する水性溶媒の量は、ユーグレナ中に含まれる水溶性活性成分を十分に溶解することができる量であることが好ましい。
　抽出方法も特に限定されず、例えば、以下に示す方法により抽出を行うことができるが、これに限定されることなく、通常の抽出方法を自由に選択して用いることができる。例えば、ユーグレナの藻体乾燥粉末を水性溶媒に所定時間浸漬した後に遠心分離又は濾過する方法、ユーグレナの藻体乾燥粉末を水性溶媒に加えて震盪して均一に分散させた後に遠心分離又は濾過する方法、などが挙げられる。
　また、抽出を促進するために、ユーグレナを添加後の水性溶媒を加熱することも可能である。
　ユーグレナの水抽出は、以下に示すような通常の方法で行うことができるが、これに限定されるものではない。例えば、ユーグレナ組織及び水を容器に入れ、適宜攪拌又は震盪しながら所定時間静置し、得られた抽出液は、そのまま水抽出物として使用可能である。また、例えば、そのような抽出液を遠心して得られる上清を水抽出物として使用することもできる。また、そのような抽出液又は上清を濃縮、乾燥して水分を除去し、これを水抽出物として使用することもできる。水抽出は、抽出効率を上げて抽出時間を短縮するために、水に、少量、例えば、１０質量％以下のアルコール、好ましくはエタノールを添加して行ってもよい。
　水抽出を行う場合の抽出時間は、活性成分が抽出される時間であれば特に限定されず、数秒～数十時間の範囲で、抽出の温度に応じて適宜設定することができる。
　熱水による抽出は、以下に示すような、通常用いられている方法で行なうことができるが、これに限定されるものではない。ユーグレナを、通常用いられる抽出器に水とともに導入した後に、加熱することで抽出を行う。沸騰水または超臨界状態にある水を使用して抽出する場合には、水の蒸気圧に耐え得る抽出器を使用する必要がある。抽出時の圧力は１～５０００気圧に設定することができ、６０～４００気圧に設定するのが好ましい。
　高温高圧下で抽出を行なう場合には、抽出時間が長す過ぎると活性成分が分解したり、化学反応を起こすことがある。従って、高温高圧下で抽出を行なうときには、抽出時間を短時間、例えば、３分以内とするのが好ましく、１分以内とするのがより好ましく、３０秒以内とすることが特に好ましい。
　抽出したユーグレナ抽出物は、そのままでも本実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、およびメタボリックシンドローム予防または治療剤の有効成分として用いることができるが、当該抽出物を更に、適当な分離手段（例えば、分配抽出、ゲル濾過法、シリカゲルクロマトグラフィー、逆相若しくは順相の高速液体クロマトグラフィーなど）により活性の高い画分を分画して用いることも可能である。
　また、ユーグレナ抽出物やその画分を、濃縮、乾燥して水性溶媒を除去し、これを水性溶媒抽出物として使用することもできる。
＜脂肪細胞分化抑制剤・ＰＰＡＲγ発現抑制剤・Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤＞
　本実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤は、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分とする。
　本実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤は、脂肪細胞分化過程において、脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるＰＰＡＲγ及びＣ／ＥＢＰαの発現を抑制し、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制するものである。
＜抗肥満剤・抗メタボリックシンドローム剤＞
　本実施形態に係る抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分とする。
　ユーグレナ水性溶媒抽出物は、脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるＰＰＡＲγやＣ／ＥＢＰαの発現を抑制し、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制することにより、脂肪細胞の蓄積を抑制し、その結果、抗肥満やメタボリックシンドロームの予防または治療効果を発揮する。
＜用途＞
　実施形態に係るユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームの確定診断を受けた患者に投与される。
　また、本実施形態の脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、医薬組成物、健康食品等として構成され、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームの自覚症状を発現した者や、ＢＭＩが増加傾向にある者や、遺伝的に又は生活環境から考慮して肥満症及び／又はメタボリックシンドロームに罹患する可能性の高い者等、肥満症やメタボリックシンドローム予備軍の者に、予防的に投与される。
　ユーグレナ水性溶媒抽出物は、食品としても摂取可能で副作用がないため、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームの確定診断を受ける前であっても、投与可能である。また、確定診断を受ける前から、確定診断を受けた後の任意の時点、例えば、ＢＭＩ値が２５未満まで低下した時点、脂肪細胞の分化が活発でなくなったと思われる時点や、他の抗肥満剤に切り替える時点などまで、継続して投与可能である。
　また、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームの治療を完了した人は、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームを再発しやすいため、本実施形態の脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤を、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームの患者が治療によりＢＭＩ値が２５未満まで低下した後、ＢＭＩ値が２５未満まで低下した患者に対して、症状の再発を抑制することを目的に、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームの再発予防、抑制薬として、継続投与することができる。
　一般的に、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームは、ストレス、食生活、遺伝的要因など、様々な要因によって引き起こされることが知られている。
　よって、本実施形態の脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤を、心理的ストレス・社会的ストレスのかかり易い環境にある人、例えば、心因性ストレスのかかりやすい職場、住環境にある人や試験等の準備中の人に対して、長期間継続投与できる。
　また、本実施形態の脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤を、食生活や、遺伝的要因により、肥満症及び／又はメタボリックシンドロームに罹患する可能性の高い環境にある人、例えば、食生活の乱れた家庭の人、親などの家族に肥満症及び／又はメタボリックシンドロームに罹患した者がいる家庭の人に対して、長期間継続投与できる。
　さらに、本実施形態に係るユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤を投与する対象は、上記症状又は状態の者や、ヒト以外の動物に限定されるものではない。
　例えば、白色脂肪細胞が特に増加する、乳幼児期や思春期のヒトのうち、ＢＭＩ　２５以上の肥満状態のヒトに、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤および抗メタボリックシンドローム剤を投与し、又は摂取させることができる。
　乳幼児期や思春期の年齢のヒトは、白色脂肪細胞が増加し易いが、ユーグレナ水性溶媒抽出物が備える、脂肪細胞分化抑制効果、ＰＰＡＲγ発現抑制効果、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制効果により、白色脂肪細胞の増加を抑制することができる。
　ここで、「乳児期」とは、生後から１歳未満の期間であり、「幼児期」とは、１歳以上から６歳未満の期間である。
　また、「思春期」とは、二次性徴が始まり、成熟して、身長発育が最終的に停止するまでの期間である。男性に関しては、概ね１２歳～１７歳の期間であるが、女性に関し、日本産科婦人科学会の定義によれば、「性機能の発育（乳房発育・恥毛発育など）に始まり、初経を経て第二次性徴の完成と月経周期がほぼ順調になるまでの期間で、現在の日本人の場合、平均的には８、９歳から１７、１８歳の間とする」と定義される。ＷＨＯ（世界保健機関）によれば１０～１９歳と定義されるように、性別や個人差によって、幅を有する概念であるが、８～１９歳の期間である。
　また、４０歳以降の年齢のヒトに、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤を投与することができる。
　４０歳以上のヒトは、余分な脂肪を分解することによって熱を生み出す働きが衰えており、脂肪が蓄積し易く、中年太りになり易くなっているが、ユーグレナ水性溶媒抽出物が備える、脂肪細胞分化抑制効果、ＰＰＡＲγ発現抑制効果、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制効果により、脂肪細胞の蓄積や中年太りを抑制することができる。
　また、本実施形態に係るユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、薬理学的に許容され得る添加剤を加え、医薬組成物、化粧料組成物、食品組成物等の組成物等として用いることができる。
　　（医薬組成物）
　本実施形態に係るユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、その優れた脂肪細胞分化抑制効果、ＰＰＡＲγ発現抑制効果、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制効果、抗肥満効果および抗メタボリックシンドローム効果を利用して、医薬組成物に好適に用いることができる。
　該医薬組成物は、あらゆる剤型の医薬品又は医薬部外品に適用することができる。例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、丸剤、などの経口剤、外用液剤、外用ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、スプレー剤、点鼻液剤、リニメント剤、ローション剤、ハップ剤、硬膏剤、噴霧剤、エアゾール剤、などの外用剤、または注射剤に適用することができる。
　本実施形態に係る医薬組成物には、薬学的に許容される添加剤を１種または２種以上自由に選択して含有させることができる。
　例えば、本実施形態に係る医薬組成物を経口剤に適用させる場合、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、保存剤、着色剤、矯味剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。また、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用して、徐放性製剤等にすることもできる。
　また、本実施形態に係る医薬組成物を外用剤に適用させる場合、基剤、界面活性剤、保存剤、乳化剤、着色剤、矯臭剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤、潤沢剤、溶解補助剤、懸濁化剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
　また、本実施形態に係る医薬組成物を注射剤に適用させる場合、例えば、溶剤、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、保存剤、等張化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
　本実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、経口投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、などにより全身又は局所においてその効果を発揮したり、あるいは投与部位において、局所的に効果を発揮したりする。
　本実施形態に係る医薬組成物において、脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤の含有量は特に限定されず、目的に応じて自由に設定することが可能である。
　　（食品組成物）
　本実施形態に係るユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、その優れた脂肪細胞分化抑制効果、ＰＰＡＲγ発現抑制効果、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制効果、抗肥満効果およびメタボリックシンドローム予防または治療効果を利用して、各種食品に配合することにより、当該作用を有する食品組成物を提供することができる。
　例えば、飲料（清涼飲料、アルコール飲料、炭酸飲料、乳飲料、果汁飲料、茶、コーヒー、栄養ドリンク等）、醤油などの調味料、スープ類、クリーム類、各種乳製品類、畜肉加工品、農産加工品、アイスクリームなどの冷菓、各種粉末食品（飲料を含む）、濃縮飲料、保存用食品、冷凍食品、パン類、シリアル類、菓子類（キャンディ（のど飴）、クッキー、ビスケット、ガム、グミ、チョコレート等）など、あらゆる食品組成物に用いることができる。
　あるいは、保健機能食品（特定保健機能食品、栄養機能食品、機能性表示食品）や、いわゆる健康食品（飲料を含む）、濃厚栄養剤、流動食、乳児・幼児食にも用いることができる。
　ここで特定保健用食品とは、生理学的機能等に影響を与える保健機能成分を含む食品であって、消費者庁長官の許可を得て特定の保健の用途に適する旨を表示可能なものである。本実施形態においては、特定の保健用途として、「体脂肪をつきにくくする」、脂肪蓄積の予防、改善、脂肪細胞増殖の抑制、肥満の予防、改善などと表示して販売される食品となる。
　また栄養機能食品とは、栄養成分（ビタミン、ミネラル）の補給のために利用される食品であって、栄養成分の機能を表示するものである。栄養機能食品として販売するためには、一日当たりの摂取目安量に含まれる栄養成分量が定められた上限値、下限値の範囲内にある必要があり、栄養機能表示だけでなく注意喚起表示等もする必要がある。
　また機能性表示食品とは、事業者の責任において、科学的根拠に基づいた機能性を表示した食品である。販売前に安全性及び機能性の根拠に関する情報などが消費者庁長官へ届け出られたものである。
　上記において本実施形態は、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含み、肥満病患者を対象とした脂肪蓄積予防用特定保健用食品／脂肪細胞分化抑制用特定保健用食品や、脂肪蓄積予防用栄養機能食品／脂肪細胞分化抑制用栄養機能食品、脂肪蓄積予防用機能性表示食品／脂肪細胞分化抑制用機能性表示食品として用いることができる。
　また本実施形態は、ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含み、生体、例えば脂肪が蓄積する前のヒト、脂肪が蓄積することによって引き起こされるメタボリックシンドローム予備軍のヒトを対象とした脂肪蓄積予防用特定保健用食品／脂肪細胞分化予防用特定保健用食品や、脂肪蓄積予防用栄養機能食品／脂肪細胞分化予防用栄養機能食品、脂肪蓄積予防用機能性表示食品／脂肪細胞分化予防用機能性表示食品として用いることができる。
　本実施形態に係る食品組成物には、本実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤に加え、通常食品組成物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。例えば、各種調味料、保存剤、乳化剤、安定剤、香料、着色剤、防腐剤、ｐＨ調整剤などの、食品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
　食品組成物における肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤の含有量は特に限定されず、目的に応じて自由に設定することが可能である。
　　（化粧料組成物）
　本実施形態に係るユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含む脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、その優れた脂肪細胞分化抑制効果、ＰＰＡＲγ発現抑制効果、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制効果、抗肥満効果およびメタボリックシンドローム予防または改善効果を利用して、化粧料組成物に好適に用いることができる。
　該化粧料組成物は、あらゆる形態の化粧料に適用することができる。例えば、ローション、乳液、クリーム、美容液などのスキンケア化粧料、ファンデーション、コンシーラー、化粧下地、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナーなどのメイクアップ化粧料、日焼け止め化粧料などに適用することができる。
　本実施形態に係る化粧料組成物には、本実施形態に係る脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤に加え、通常化粧料組成物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。
　例えば、基材、保存剤、乳化剤、着色剤、防腐剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、紫外線吸収剤、香料、防腐防黴剤、体質顔料、着色顔料、アルコール、水などの、化粧品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
　本実施形態に係る化粧料組成物において、脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤の含有量は特に限定されず、目的に応じて自由に設定することが可能である。
＜脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤の製造方法＞
　本実施形態の脂肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤は、以下の方法で製造される。
　まず、ユーグレナに、水性溶媒を加えて撹拌及び／又は振盪して分散液を得る分散液調製工程を行う。この分散液調製工程においてユーグレナとして、ユーグレナ粉末を用いるとよい。
　次いで、分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水性溶媒抽出物として得る抽出工程を行う。
　また、分散液調製工程の後、抽出工程の前に、高圧蒸気滅菌器等の加熱手段を用いて分散液を加熱して、加熱工程を行ってもよい。
　具体的には、まず、ユーグレナに、水性溶媒を加えて撹拌及び／又は振盪して分散液を得る分散液調製工程を行う。
　次いで、加熱手段を用いて分散液を加熱して、加熱抽出する加熱工程を行う。
　さらに、分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水性溶媒抽出物として得る抽出工程を行う。
　加熱工程において、加熱手段の設定温度を、室温以上、例えば２０℃以上５０℃以下、５０℃以上８０℃以下、８０℃以上１００℃以下、１００℃以上１２０℃以下、１２０℃以上１５０℃以下、１５０℃以上２００℃以下とすることができる。
　加熱工程において、ユーグレナ水性溶媒分散液が密閉容器に入れられている場合、加熱手段の設定温度が、ユーグレナ水性溶媒分散液の温度に一致する。
　また、加熱工程において、ユーグレナ水性溶媒分散液を開放容器に入れられている場合、開放容器周囲の雰囲気の気圧に応じて、ユーグレナ水性溶媒分散液の温度が決まるが、大気圧の場合、最高で約１００℃となる。
　加熱工程において、ユーグレナ水性溶媒分散液が開放容器に入れられている場合には、加熱工程と、ユーグレナ水性溶媒抽出物の濃縮工程が同時に行われることになる。
　なお、分散液を遠心分離する代わりに、一般的な分離方法によって、ユーグレナの水性溶媒抽出物を得てもよい。例えば、分散液を濾過することで得られる濾液をユーグレナの水性溶媒抽出物を得てもよい。
　さらに、遠心分離や濾過等を行うことなく、水性溶媒を加えて振盪して得られる分散液をそのままユーグレナ水性溶媒抽出物とすることも可能である。
　得られたユーグレナ水性溶媒抽出物を更に、適当な分離手段（例えば、分配抽出、ゲル濾過法、シリカゲルクロマトグラフィー、逆相若しくは順相の高速液体クロマトグラフィーなど）により活性の高い画分を分画して得る分画工程を行ってもよい。
　また、得られたユーグレナ水性溶媒抽出物又は画分を濃縮する濃縮工程及び／又は、水性溶媒を蒸発させ乾燥する乾燥工程を行ってもよい。
　以上により得られたユーグレナの水性溶媒抽出物を、本実施形態の肪細胞分化抑制剤、ＰＰＡＲγ発現抑制剤、Ｃ／ＥＢＰα発現抑制剤、抗肥満剤、および抗メタボリックシンドローム剤として用いる。
　以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　以下の試験例では、ユーグレナの熱水抽出物（実施例１）、室温および異なる温度（２５℃、５０℃、７５℃、９５℃、１２０℃）で抽出を行ったユーグレナの水抽出物又は熱水抽出物（実施例２～６）のヒト皮下脂肪由来幹細胞を用いた脂肪細胞への分化に対する影響を確認することにより、脂肪細胞への分化抑制効果が高くなるユーグレナの抽出方法の検討を行った。
　また、ユーグレナ熱水抽出物が、脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるＰＰＡＲγ遺伝子及びＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現量に対して与える影響を確認することにより、脂肪細胞分化抑制のメカニズムを検討した。
　　＜実施例１＞
　ユーグレナ粉末（ユーグレナ・グラシリス、ＥＵ－１５９３、（株）ユーグレナ製）０．５ｇに、超純水２０ｍｌを加え震盪し、均一に分散された後、乾熱滅菌器を用いて加熱抽出（９５℃、２時間）した。遠心分離（４０００ｒｐｍ、３分、２５℃）により得られた上清を分取し、０．４５μｍ滅菌フィルターにて濾過することで、ユーグレナ熱水抽出物（ユーグレナ熱水抽出液、原液）を調製した。当該抽出液を脂肪細胞分化抑制剤として用いた。
　　＜実施例２＞
　ユーグレナ粉末（ユーグレナ・グラシリス、ＥＵ－１５９３、（株）ユーグレナ製）０．５ｇに、超純水２０ｍｌを加え震盪し、均一に分散された後、室温（２５℃）で２時間抽出した。遠心分離（４０００ｒｐｍ、３分、２５℃）により得られた上清を分取し、０．４５μｍ滅菌フィルターにて濾過することで、ユーグレナ水抽出物（ユーグレナ水抽出液、原液）を調製した。当該抽出液を脂肪細胞分化抑制剤として用いた。
　　＜実施例３～５＞
　ユーグレナ粉末（ユーグレナ・グラシリス、ＥＵ－１５９３、（株）ユーグレナ製）０．５ｇに、超純水２０ｍｌを加え震盪し、均一に分散された後、乾熱滅菌器を用いて、各温度（実施例３：５０℃、実施例４:７５℃、実施例５:９５℃）で２時間熱水抽出した。遠心分離（４０００ｒｐｍ、３分、２５℃）により得られた上清を分取し、０．４５μｍ滅菌フィルターにて濾過することで、ユーグレナ熱水抽出物（ユーグレナ熱水抽出液、原液）を調製した。当該抽出液を脂肪細胞分化抑制剤として用いた。
　　＜実施例６＞
　ユーグレナ粉末（ユーグレナ・グラシリス、ＥＵ－１５９３、（株）ユーグレナ製）０．５ｇに、超純水２０ｍｌを加え震盪し、均一に分散された後、高圧蒸気滅菌器を用いて加熱抽出（１２０℃、２０分）した。遠心分離（４０００ｒｐｍ、３分、２５℃）により得られた上清を分取し、０．４５μｍ滅菌フィルターにて濾過することで、ユーグレナ熱水抽出物（ユーグレナ熱水抽出液、原液）を調製した。当該抽出液を脂肪細胞分化抑制剤として用いた。
＜試験例１　脂肪由来幹細胞を用いたユーグレナ熱水抽出物の脂肪分化抑制試験＞
　（培地）
　脂肪由来幹細胞増殖培地（増殖培地）として、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ、１％ＦＢＳ、ＩＴＳ－Ｘ、１０ｎｇ／ｍＬｂ－ＦＧＦ、ハイドロコルチゾンを含む培地を用いた。
　脂肪細胞分化誘導培地として、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１μＭデキサメタゾン、０．５ｍＭ３－イソブチル－１－メチルキサンチン、０．２ｍＭインドメタシン、１０μｇ／ｍＬインスリン、３３μＭビオチンを含む培地を用いた。
　脂肪細胞分化維持培地として、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍＬインスリン、３３μＭビオチンを含む培地を用いた。
　（細胞の準備）
１）　１５ｍｌチューブに９ｍｌの増殖培地を入れた。
２）　ヒト皮下脂肪由来幹細胞（Ｌｏｎｚａ社、ＰＴ－５００６；以下、ＡＳＣ）の凍結バイアルを液体窒素から取り出した。
３）　３７℃の温浴に１～２分入れ、氷片が指先程度の大きさになるまで溶かした。
４）　アルコールでふき取り、クリーンベンチ内に入れた。
５）　１）内の培地で氷片を溶解し、１）の１５ｍｌチューブに全て回収した。
６）　１２００ｒｐｍで３分間遠心した。
７）　アスピレーターで上清を除き、増殖培地を５００μｌ～１ｍｌ入れて細胞を懸濁した。
８）　トリパンブルーと細胞懸濁液を１０μｌずつ混合し、ワンセルカウンターに入れた。
９）　顕微鏡を用いて、細胞数を計測した。
１０)　培養用ｄｉｓｈに３～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで細胞を播種した。
１１）　ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２）で３日間培養した。
　上記手順で準備したヒト皮下脂肪由来幹細胞を用い、ユーグレナ熱水抽出物の脂肪分化抑制試験を図２に示す手順で行った。試験の手順を以下に具体的に示す。
　（３日前：細胞播種）
１）　細胞を顕微鏡で確認した。
２）　アスピレーターで細胞上清を除き、ＰＢＳ（－）５ｍｌを添加した。
３）　ＰＢＳ（－）をアスピレーターで除去し、トリプシン溶液（０．２５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐｓｉｎ－１ｍＭ　ＥＤＴＡ（和光純薬株式会社製）を１ｍｌ滴下した。
４）　ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２）で２分間静置した。
５）　顕微鏡で細胞を観察し、細胞が丸く、バラバラになってくることを確認した。
６）　１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭを２ｍｌ添加し、１５ｍｌチューブに細胞を回収した。
７）　１２００ｒｐｍで３分間、遠心分離を行った。
８）　上清を除いて、増殖培地で再懸濁し、細胞数を血球計算盤でセルカウントした。
９）　２５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように増殖培地で調整し、２４ｗｅｌｌプレートに５００μｌずつ播種した。
１０）　ＣＯ２インキュベーターで静置した。
１１）　ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２）で３日間培養した。
　（０日目：脂肪分化誘導／ユーグレナ抽出物添加）
１）　脂肪細胞分化誘導培地に、各実施例のユーグレナ抽出物を添加し、ユーグレナ抽出物を所定濃度含む、ユーグレナ抽出物添加培地溶液を作製した。
２）　アスピレーターで培養上清を除き、１）で調整したユーグレナ抽出物添加培地溶液を５００μｌずつ添加した。
３）　コントロールに脂肪細胞分化誘導培地を添加した。
４）　ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２）で７日間培養した。
５）　２～３日に１回、培地交換を行った。
　（７日目：脂肪分化誘導／ユーグレナ抽出物添加）
１）　脂肪細胞分化維持培地に、各実施例のユーグレナ抽出物を添加し、ユーグレナ抽出物を所定濃度含む、ユーグレナ抽出物添加培地溶液を作製した。
２）　アスピレーターで培養上清を除き、１）で調整したユーグレナ抽出物添加培地溶液を５００μｌずつ添加した。
３）　コントロールに脂肪細胞分化維持培地を添加した。
４）　ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２）で７日間培養した。
５）　２～３日に１回、培地交換を行った。
　（１４日目：細胞測定および細胞固定）
１）　顕微鏡で細胞を確認した。
２）　ＤＭＥＭ、Ｐ／Ｓ培地：Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８＝２４：１の比でＣＣＫ－８溶液を必要量調製した。ここで、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８は、水溶性テトラゾリウム塩ＷＳＴ－８を発色試薬として用いた生細胞数測定キット（株式会社同仁化学研究所製）である。
３）　アスピレーターで培養上清を除き、２）で調整したＣＣＫ－８溶液を５００μｌずつ添加した。
４）　ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２）で１時間静置した。
５）　９６ｗｅｌｌプレートにそれぞれ上清を１００μ×２ｗｅｌｌずつ移した。
６）　マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ及び６５０ｎｍのそれぞれの波長における吸光度を測定した。
７）　５）で余った上清をアスピレーターで除き、ＰＢＳ（－）を５００μｌずつ添加した。
８）　７）を計２回実施した。 
９）　ＰＢＳ（－）を除き、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を５００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、細胞を固定した。
１０）　アルミホイルで遮光をし、４℃で２４時間以上保存した。
１１）　以下に示す方法でオイルレッドＯ染色を行い、脂肪蓄積率を定量化した。
　（染色及び脂肪分化の定量）
　Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏストック溶液を、Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ：イソプロパノール＝１２０ｍｇ：４０ｍｌの比で５０ｍｌチューブに作成し、室温で保存した。
　Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ染色液は、Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏストック溶液：超純水＝３：２の比で混合し、濾過をし、直ちに以下の細胞染色に用いた。
１）　プレート内の固定液を除いた。
２）　ＰＢＳ（－）５００μｌ／ｗｅｌｌで２回洗浄した。
３）　６０％イソプロパノール水溶液を５００μｌ／ｗｅｌｌ加え、室温で２分程度なじませた。
４）　６０％イソプロパノール水溶液を除き、Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ染色液を２５０μｌ／ｗｅｌｌ添加した。
５）　室温で１５分静置した。
６）　Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ染色液を除き、６０％イソプロパノール水溶液を５００μｌ／ｗｅｌｌ加え、軽く撹拌し洗浄した。
７）　６０％イソプロパノール水溶液を除き、ＰＢＳ（－）を５００μｌ／ｗｅｌｌ加え、写真を撮影した。
８）　ＰＢＳ（－）を除き、１００％イソプロパノールを５００μｌ／ｗｅｌｌ加え、Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏを抽出した。
９）　全て抽出が完了したら、９６ｗｅｌｌプレートに２００μｌ／ｗｅｌｌずつ移した。
１０）　マイクロプレートリーダーを用い、５２０ｎｍで吸光度を測定した。
１１）　吸光度の値を脂肪蓄積量とした。単位細胞あたりの脂肪蓄積量は、脂肪蓄積量（Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ）／細胞の数（ＣＣＫ－８）で換算した値を用いた。
１２）　脂肪細胞分化誘導培地を用いて培養を行ったコントロールにおける脂肪蓄積率を１００％として、脂肪蓄積率を算出した。
　（試験例１の結果）
　実施例１のユーグレナ熱水抽出物を用いて、上記試験を行った結果を解析して、ユーグレナ熱水抽出物による各濃度（５ｖｏｌ％、１０ｖｏｌ％、２０ｖｏｌ％）の脂肪蓄積率を比較したグラフを図３に示す。
　コントロールにおける脂肪蓄積率を１００％としたときの、各濃度における脂肪蓄積率は、順に５６．４％、３２．５％、７．０５％であった。
　脂肪蓄積率は、ユーグレナ熱水抽出物の濃度が高くなるにつれて減少した。
　なお、これら試験は複数回行い、同様の再現性が得られた。
　図４に示す通り、ユーグレナ熱水抽出物の濃度が高くなるにつれて脂肪滴（Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏで染色された部分）が少なくなっていることがわかった。
＜試験例２　異なる温度で抽出したユーグレナ水抽出物の脂肪分化抑制試験＞
　実施例１のユーグレナ熱水抽出物の代わりに、実施例２～６の水抽出物又は熱水抽出物（実施例２：２５℃、実施例３：５０℃、実施例４:７５℃、実施例５:９５℃、実施例６:１２０℃）を用いたこと以外は、試験例１と同様の試験を行った。
　（試験例２の結果）
　実施例２～６のユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物を用いた試験の結果を解析して、異なる温度で抽出したユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物による各濃度（５ｖｏｌ％、１０ｖｏｌ％、２０ｖｏｌ％）の脂肪蓄積率を比較したグラフを図５に示す。
　各温度のユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物における脂肪蓄積率は、ユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物の濃度が高くなるにつれて減少した。
　なお、これら試験は複数回行い、同様の再現性が得られた。
　一方、抽出温度が高くなっても、脂肪蓄積率が大きく下がることはなかった。以上の結果から、抽出の温度よりも、抽出物の濃度が、脂肪蓄積率の減少に影響を与えることがわかった。このことは、５０℃程度という比較的低い温度の熱水抽出物であっても、脂肪蓄積率の減少に効果があることを示している。
　図６に示す通り、各温度の水抽出物又は熱水抽出物において、ユーグレナ水抽出物又は熱水抽出物の濃度が高くなるにつれて脂肪滴が少なくなっていることがわかった。
＜試験例３　ユーグレナ熱水抽出物とＥＰＡの脂肪分化抑制試験＞
　実施例１のユーグレナ熱水抽出物と、比較例１として脂肪分化抑制作用を有することが知られているエイコサペンタンエン酸（ＥＰＡ）を用いて、試験例１と同様の試験を行った。
　（試験例３の結果）
　実施例１のユーグレナ熱水抽出物を用いた試験の結果と、比較例１のＥＰＡを用いた試験の結果を解析して、ユーグレナ熱水抽出物（１０ｖｏｌ％濃度、２０ｖｏｌ％濃度）と、ＥＰＡ（１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ）の脂肪蓄積率を比較したグラフを図７に示す。
　なお、本試験のＥＰＡの添加量は、ユーグレナ熱水抽出に含有されるＥＰＡの量よりも６倍以上多くなるように設定した。
　比較例１における脂肪蓄積率は、８０％以上であり、実施例１のユーグレナ熱水抽出物の脂肪蓄積率と比較して高かった。
　また、図８に示す通り、コントロールと比べて脂肪滴（Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏで染色された部分）が僅かに少なくなっていることがわかった。
　この結果から、ユーグレナ熱水抽出物に含まれる成分のうち、ＥＰＡ以外の有効成分、特に未同定の有効成分が、脂肪細胞の分化を抑制する作用をもたらすことが分かった。
＜試験例４　ユーグレナ熱水抽出物の添加期間を変えた脂肪分化抑制試験＞
　実施例１のユーグレナ熱水抽出物を用い、ユーグレナの熱水抽出物を培地に添加する期間を変更した以外は、試験例１と同様の試験を行った。
　具体的には、脂肪細胞分化誘導培地を用いて培養を行う０～７日目までを前半、脂肪細胞分化維持培地を用いて培養を行う７～１４日目までを後半としたときに、（ｉ）前半および後半にユーグレナ熱水抽出物を添加した場合と、（ｉｉ）前半のみにユーグレナ熱水抽出物を添加した場合と、（ｉｉｉ）後半のみにユーグレナ熱水抽出物を添加した場合とで、脂肪蓄積率を比較した。
　（試験例４の結果）
　試験例４の結果を解析して、ユーグレナ熱水抽出物を添加する期間を変えた場合の脂肪蓄積率を比較したグラフを図９に示す。
　ユーグレナ熱水抽出物の添加期間が（ｉ）前半および後半の場合と、（ｉｉ）前半のみの場合で、同程度の脂肪蓄積率であることがわかった。一方、（ｉｉｉ）添加期間が後半のみの場合では、脂肪蓄積率が高くなっていることがわかった。この結果は、ユーグレナ熱水抽出物の脂肪分化抑制効果は、脂肪分化誘導の前半に、その効果を発揮していることを示している。
　図１０に示す通り、ユーグレナ熱水抽出物の添加期間が（ｉ）前半および後半の場合と、（ｉｉ）前半のみの場合に、（ｉｉｉ）添加期間が後半のみの場合と比べて、添加脂肪滴が少なくなっていることがわかった。
＜試験例５　リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析＞
　脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるＰＰＡＲγ遺伝子及びＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現を調べるために、実施例１のユーグレナ熱水抽出物を用いて試験例１と同様の試験を行った。具体的には、０日目にユーグレナ熱水抽出物を添加して、分化誘導培地を用いて培養を行い、培養１日目、２日目、３日目、６日目、１３日目に、細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応で得られたｃＤＮＡを使用してリアルタイムＰＣＲを用い、ＰＰＡＲγ遺伝子及びＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現量を測定した。
　（ＲＮＡの回収および抽出）
１）　培地を除き、ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。
２）　ＰＢＳ（－）を除いた後、全ＲＮＡ抽出試薬（ＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ、タカラバイオ株式会社製）０．５ｍｌを入れ、１．５ｍｌのマイクロチューブに移した（－８０℃で保存可能）。
３）　クロロホルムを１００μｌ（全ＲＮＡ抽出試薬の０．２倍量）加え、１５秒間ボルテックスミキサーで撹拌後、５分間、室温で静置した。
４）　１２０００ｇ、４℃で、１５分間遠心分離した。
５）　遠心分離の間に、新しい１．５ｍｌのマイクロチューブに、イソプロパノール５００μｌを用意した。
６）　遠心分離後、透明の層を１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、１０秒間ボルテックスミキサーで撹拌後、１０分間、室温で静置した。
７）　１２０００ｇ、４℃で、１５分間遠心分離した。
８）　遠心分離の間、７５％エタノール水溶液を作製し、氷上に置いた。
９）　遠心分離後、上清を抜き、７５％エタノールを５００μｌずつ入れて、ボルテックスミキサーで少し撹拌した。
１０）　７５００ｇ、４℃で、５分間で遠心分離した。
１１）　ペレットを吸わないようにし、可能な限り上清を抜いた。
１２）　室温で、１０分～３０分間乾燥させた。
１３）　滅菌水２０μｌを加え、数回ピペッティングをしてペレットを溶かし、－２０℃で保存した。
　（ｃＤＮＡ合成）
１）　分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ　ＮＤ－２０００Ｃ、Ｔｈｅｒｍｏ社製）で濃度を測定した。
２）　５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘと、２μｌ分のＴｏｔａｌ　ＲＮＡをマイクロチューブに添加し、１０μｌになるように滅菌水を加え、混合した。
３）　サーマルサイクラー（ＴＰ６００、ＴａＫａＲａ社製）に試料を設置し、３７℃で１５分間保持、８５℃で５秒間保持、２５℃に降温することで、逆転写反応を行った。
４）　９０μｌの滅菌水を加えて１０倍希釈し、－２０℃で保存した。
　（リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析）
１）　使用するｗｅｌｌ数＋１ｗｅｌｌの容量のプライマーＳＹＢＲ　ｍｉｘを、以下の比で、試薬を混合することで作製した。
　ＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）：５μｌ×ｗｅｌｌ数
　プライマー：０．６μｌ×ｗｅｌｌ数
　滅菌水：１．４μｌ×ｗｅｌｌ数
２）　各試料を９６ｗｅｌｌプレートに３μｌずつ添加した。ネガティブコントロール（ＮＣ）には滅菌水を添加した。
３）　プライマーＳＹＢＲ　ｍｉｘを各７μｌずつ添加し、プレート遠心機（ＰＳ―０２０、ＴＯＭＹ社製）にてスピンダウンした。
４）　リアルタイムＰＣＲ装置（Ｓｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｐｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、リアルタイムＰＣＲを実行した。
　プライマーとして、以下のプライマーを用いた。
・ＰＰＡＲγ遺伝子の発現解析に用いたプライマー
　ＰＰＡＲＧ－Ｆ：5'-GAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAAT-3'（配列番号１）
　ＰＰＡＲＧ－Ｒ：5'-TCTTTATTCATCAAGGAGGCCAGCATT-3'（配列番号２）
・Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現解析に用いたプライマー
　ＣＥＢＰＡ－Ｆ：5'-GGGTCTGAGACTCCCTTTCCTT-3'（配列番号３）
　ＣＥＢＰＡ－Ｒ：5'-CTCATTGGTCCCCCAGGAT-3'（配列番号４）
　内部標準として、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを同様に増幅した。
・Ｈｏｕｓｅ　Ｋｅｅｐｉｎｇ　Ｇｅｎｅ(ＧＡＰＤＨ)遺伝子の発現解析に用いたプライマー
　ＧＡＰＤＨ－Ｆ：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'（配列番号５）
　ＧＡＰＤＨ－Ｒ：5'-TCTTCTGGGTGGCAGTGATG-3'（配列番号６）
　（試験例５の結果）
　培養０日目のＰＰＡＲγ遺伝子発現量を１とした場合の、１日目、２日目、３日目、６日目、１３日目のＰＰＡＲγ遺伝子の発現量を比較した結果を図１１に示す。
　１日目、２日目、３日目、６日目、１３日目のＰＰＡＲγ遺伝子発現量は、ユーグレナ熱水抽出物を１０ｖｏｌ％及び２０ｖｏｌ％添加した場合、各日数のコントロールに対して、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現量が、有意に減少していることがわかった。
　また、ユーグレナ熱水抽出物の濃度が高くなるに従い、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
　培養０日目のＣ／ＥＢＰα遺伝子発現量を１とした場合の、１日目、２日目、３日目、６日目、１３日目のＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現量を比較した結果を図１２に示す。
　熱水抽出物添加量が１０ｖｏｌ％及び２０ｖｏｌ％である場合のＣ／ＥＢＰα遺伝子発現量は、脂肪細胞の分化を誘導する培地で培養を行ったコントロールに対してＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現量が、有意に減少していることがわかった。
　また、ユーグレナ熱水抽出物の濃度が高くなるに従い、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
　試験例５の結果から、ＰＰＡＲγ遺伝子及びＣ／ＥＢＰα遺伝子の発現が抑制されることで、脂肪細胞への分化が抑制され、脂肪蓄積量の減少につながったことが示された。

Claims (9)

  1. 　ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とする脂肪細胞分化抑制剤。
  2. 　前記ユーグレナ水性溶媒抽出物は、ユーグレナ水抽出物であることを特徴とする請求項１に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
  3. 　前記ユーグレナ水抽出物は、ユーグレナ熱水抽出物であることを特徴とする請求項２に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
  4. 　ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＰＰＡＲγ発現抑制剤。
  5. 　ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＣ／ＥＢＰα発現抑制剤。
  6. 　ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有し、
    　脂肪細胞の分化抑制に用いられることを特徴とする脂肪細胞分化抑制用食品組成物。
  7. 　ユーグレナ水性溶媒抽出物を有効成分として含有し、
    　脂肪細胞の分化抑制に用いられることを特徴とする脂肪細胞分化抑制用化粧料組成物。
  8. 　ユーグレナに、水性溶媒を加えて振盪して分散液を得る分散液調製工程と、
    　前記分散液を遠心分離して、上澄を、ユーグレナの水性溶媒抽出物として得る抽出工程と、を含むことを特徴とする脂肪細胞分化抑制剤の製造方法。
  9. 　前記分散液調製工程の後、前記抽出工程の前に、前記分散液を加熱する加熱工程を行うことを特徴とする請求項８記載の脂肪細胞分化抑制剤の製造方法。
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