JP6156795B2 - 脂肪細胞分化の抑制用、脂肪細胞の脂肪蓄積量低減用および/または脂肪細胞のアディポネクチン分泌促進用組成物 - Google Patents
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Description
本実施例では、特開2008−167712号公報に記載の方法に準じて、Paenibacillus sp. KB0549株(寄託番号:FERM P-21057)を、ゴマ脱脂粕を含む培地中で培養することにより、ゴマ脱脂粕中に含まれるセサミノール配糖体から得られたセサミノールを用いた。具体的には、以下のようにして、セサミノールを調製した。
HPLC:HITACHI LaChrom
カラム:Wakosil-II 5C18HG(φ4.6*250 mm、和光純薬工業株式会社)
展開溶媒:A;10%アセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸、B;80%アセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸、Bを10%〜100%の直線勾配(40分間)で展開。
流速:0.8 ml/min
分析波長:280 nm
(1)トリアシルグリセロール(TG)蓄積量の検討
前駆脂肪細胞は、脂肪細胞に分化すると、TGなどを含む脂肪滴を細胞内に蓄積するようになる。本実施例では、分化誘導の過程でセサミノールを前駆脂肪細胞に添加し、誘導完了後の細胞内のTGを、アゾ色素の1種であるOil red Oで染色することにより、セサミノールによる脂肪細胞分化への影響を評価した。
マウス由来線維芽細胞株3T3-L1(財団法人ヒューマンサイエンス振興財団)を前駆脂肪細胞として用いた。3T3-L1細胞を1.0×105〜1.0×106 cells/mlの濃度で播種し、80〜90%コンフルエントになるまで37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した。なお、培養培地として、10%牛胎児血清(FBS:株式会社ニチレイバイオサイエンス)、ペニシリン(50 units/ml、明治製菓株式会社)およびストレプトマイシン(50 mg/ml、明治製菓株式会社)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM:日水製薬株式会社)を用いた。
細胞を80〜90%コンフルエントになるまで培養した後、培地を、分化誘導剤としてウシ由来インスリン(0.2μM、和光純薬工業株式会社)、デキサメタゾン(0.25μM、和光純薬工業株式会社)および3-イソブチル-1-メチルキサンチン(0.5 mM、和光純薬工業株式会社)を添加したDMEMに交換した(この日を「誘導開始0日目」とする)。その2日後に、培地を、インスリン(0.2μM)のみを添加したDMEMに交換した。以後、2日ごとに培地を新しいDMEM培地に交換して、誘導開始8日目に分化誘導を完了した。なお、セサミノール溶液の添加(セサミノールの終濃度0.5または1.0μg/ml)は、誘導開始0、2、4および6日目の培地交換の際に行った。また、対照として、セサミノール溶液を添加しないで分化させた細胞を用いた。
本実施例に用いたOil red O染色液は、Oil red O(和光純薬工業株式会社)をイソプロパノール(和光純薬工業株式会社)に溶解させて得た、Oil red O/イソプロパノール飽和溶液である。Oil red O染色液と超純水とを、体積比で6:4の割合で混合し、10分後、得られた混合液を0.45μmフィルターで濾過することによって得た。分化誘導させた細胞から培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄した。細胞を70%エタノールにより30秒間固定した後、Oil red O染色液(2ml)を添加し、室温で2時間放置して染色した。そして、染色した細胞を50%エタノールで10秒間洗浄し、さらに、脱イオン水を用いて、水の赤みが消えるまで洗浄した。洗浄後、細胞を顕微鏡(OLYMPUS IX-70:オリンパス株式会社)で観察し、写真を撮影した。なお、各検体の写真を図1に示す。
GPDHは、脂肪細胞におけるトリアシルグリセロール(TG;トリグリセリドとも呼ばれる)の合成の律速酵素である。また、GPDHの活性は、前駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化するときに急激に増強することから、GPDHは脂肪細胞分化のマーカーとしても知られている。そこで、分化誘導によって得た細胞のGPDH活性を、WiseおよびGreenの方法(Wise, L.S. and Green, H., (1979) Participation of one isozyme of cytosolic glycerophosphate dehydrogenase in the adipose conversion of 3T3 cells. The Journal of Biological Chemistry, 254, 273-275.)により測定した。なお、用いた細胞は、上記(1-1)および(1-2)と同様にして得た。また、対照として、セサミノール溶液を添加しないで分化させた細胞を用いた。
誘導開始8日目以降の3T3-L1由来の脂肪細胞をPBSで2回洗浄した。酵素抽出用バッファー(100 mM トリエタノールアミン、2.5 mM EDTA)(300μl)を細胞に添加し、セルスクレイパーで細胞を回収した。回収した細胞を超音波破砕(middle、2分30秒間、10秒間/20秒間)し、すみやかに遠心分離(13,000 rpm、5分、4℃)して上清を得た。得られた上清を測定用試料として用いた。
ウォーターバスにて予め28℃に保温しておいた、酵素抽出バッファー(2800μl)の入った試験管内に、6mM 2-メルカプトエタノール(終濃度0.1 mM)、7.2 mM NADH(終濃度0.12 mM)、12 mM ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP:SIGMA社)(終濃度0.2 mM)および測定用試料(50μl)を添加して、340 nmでの吸光度を3分間測定した。GPDHの活性を、NADHの吸光係数(6.22 mM-1cm-1)を用いて、1分間当たりの吸光度の変化(NADHの変化量)に基づいて算出した。結果を図2に示す。なお、図2では、各測定用試料の酵素活性は、対照の酵素活性を100%として、これに対する比率として示されている。また、図中の「**」は、対照に対してp値が0.01未満であることを示す。
(1)分化誘導による脂肪細胞の調製
実施例1の(1-1)と同様にして、前駆脂肪細胞の3T3-L1細胞を80〜90%コンフルエントになるまで培養した。そして、培地を、分化誘導剤としてウシ由来インスリン(0.2μM、和光純薬工業株式会社)、デキサメタゾン(0.25μM、和光純薬工業株式会社)および3-イソブチル-1-メチルキサンチン(0.5 mM、和光純薬工業株式会社)を添加したDMEMに交換した(この日を「誘導開始0日目」とする)。その2日後に、培地を、インスリン(0.2μM)のみを添加したDMEMに交換した。以後、2日ごとに培地を新しいDMEM培地に交換して、誘導開始8日目に分化誘導を完了して、脂肪細胞を得た。
得られた脂肪細胞に、セサミノール溶液を、セサミノールの終濃度が0.5または1.0μg/mlとなるように添加した。また、対照として、セサミノール溶液を添加しないで培養した細胞を用いた。3日後、実施例1の(1-3)と同様にして、細胞をOil red O染色液で染色し、洗浄した。細胞を顕微鏡(OLYMPUS IX-70:オリンパス株式会社)で観察し、写真を撮影した。なお、各検体の写真を図3に示す。観察後、細胞にイソプロパノール(3ml)を添加して、Oil red O染色液を抽出し、得られた抽出液の520 nmでの吸光度を測定した。そして、測定値に基づいて、各細胞のTG蓄積量を比較した。結果を図4に示す。なお、図4では、各検体のTG蓄積量は、対照の蓄積量を100%として、これに対する比率として示されている。また、図4中の「*」は、対照に対するp値が0.05未満であることを示す。
脂肪細胞からは種々の生理活性物質が分泌されるが、それらのうち、アディポネクチンはインスリン抵抗性の改善や動脈硬化を予防する作用を有することが知られている。本実施例では、脂肪細胞へのセサミノールの添加によるアディポネクチン分泌量の変化をSDS-PAGE法およびウェスタンブロット法により解析した。
実施例1の(1-1)と同様にして、前駆脂肪細胞の3T3-L1細胞を80〜90%コンフルエントになるまで培養した。そして、培地を、分化誘導剤としてウシ由来インスリン(0.2μM、和光純薬工業株式会社)、デキサメタゾン(0.25μM、和光純薬工業株式会社)および3-イソブチル-1-メチルキサンチン(0.5 mM、和光純薬工業株式会社)を添加したDMEMに交換した(この日を「誘導開始0日目」とする)。その2日後に、培地を、インスリン(0.2μM)のみを添加したDMEMに交換した。以後、2日ごとに培地を新しいDMEM培地に交換して、誘導開始8日目に分化誘導を完了して、脂肪細胞を得た。
得られた脂肪細胞に、セサミノール溶液を、セサミノールの終濃度が0.5または1.0μg/mlとなるように添加した。また、対照として、セサミノール溶液を添加しないで培養した細胞を用いた。3日後、細胞をPBSで1回洗浄した後、セルスクレイパーを用いてHEPESバッファーで1.5 mlチューブ中に回収した。そして、該チューブを遠心分離(10000 rpm、10秒間、4℃)に付して、上清を除き、沈殿(細胞)を回収した。回収した細胞に、可溶化バッファー(1%NP-40および1%Triton(登録商標)-X100、1mM PMSF、10μg/mlロイペプチンおよび10μg/mlアプロチニン)を適量添加して、ボルテックスミキサーにより混合した。そして、チューブを30分間氷冷した後、超音波処理(5分間の処理および30秒間のインターバルを2回繰り返す)で細胞を破砕した。チューブを遠心分離(15000 rpm、4℃、10分間)に付して、可溶性の細胞溶解物を含む上清を回収した。回収した上清の一部について、Serva Blue G(Serva Electrophoresis GmbH社)を用いて595 nmの吸収に基づいてタンパク質の定量を行い、電気泳動に付すサンプル量を算出した。
(1次抗体)
・ラビット抗アディポネクチン抗体(Theromo SCIENTIFIC社)
・マウス抗アクチン抗体(ACTN05(c4))(abcam社)
(2次抗体)
・ビオチンコンジュゲート抗ラビットIgG抗体(Dako A/S社)
・ビオチンコンジュゲート抗マウスIgG抗体(Dako A/S社)
Claims (4)
- セサミノールから実質的になる、脂肪細胞のアディポネクチン分泌促進用組成物。
- 糖尿病および/または動脈硬化症を予防、治療または改善するための組成物である請求項1に記載の組成物。
- 医薬部外品、医薬品または食品の形態にある請求項1または2に記載の組成物。
- 組成物が、1日あたりのセサミノール量として1〜100 mgの範囲で投与される請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
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