JP6306634B2 - 食品用組成物 - Google Patents
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本発明は、筋肉の糖取り込み促進剤、高血糖改善剤、並びに、糖尿病および／または糖尿病合併症の予防または治療剤に関する。
血液中のグルコース濃度（血糖値）は、さまざまなホルモンの作用によって常に一定範囲内に調節されている。食事などにより血糖値が上昇すると、インスリンが膵臓から血中に分泌され、筋肉細胞や脂肪細胞に作用して血液中の糖を取り込ませることで血糖値が低下する。このような血糖降下作用を有するホルモンはインスリンだけである。そのため、インスリンの分泌や感受性に異常がある場合には、血糖値が常に高値を示す高血糖状態となり、糖尿病へと進展する。
血液中から細胞への糖取り込みは、ＧＬＵＴ（グルコーストランスポーター（glucose transporter）：糖輸送体）が担っており、筋肉細胞や脂肪細胞は、インスリン応答性のＧＬＵＴ ｔｙｅｐ４（ＧＬＵＴ４）を発現している。ＧＬＵＴ４はインスリン非存在下ではほとんどが細胞内に局在し、糖取り込みには関与していないが、インスリン刺激が加わると、細胞内から細胞膜上に移動（トランスロケーション（translocation））し、糖取り込み活性を発揮する。筋肉や脂肪組織におけるインスリンによる糖取り込み活性の顕著な増加は、主としてＧＬＵＴ４の細胞膜移行によるものと考えられている。
メタボリックシンドロームは肥満者が高血糖、高脂血症もしくは高血圧を併発した状態であり、動脈硬化発症の危険要因として知られる。また、高血糖状態より進展した糖尿病は、網膜症や神経障害、腎症などの合併症が生じ、重篤になると意識障害を来すことがある。肥満者の内臓脂肪では、インスリン感受性を低下させるＴＮＦ−αの産生が増加しており、これが筋肉細胞のインスリン感受性を低下させる（インスリン抵抗性）。インスリン抵抗性となった筋肉細胞は、インスリン刺激によるＧＬＵＴ４の細胞膜移行が阻害されており、糖取り込み活性が上昇しない。その結果、血糖が筋肉細胞にうまく取り込まれず、食後に上昇した血糖値が下がりにくい状態に陥る。
糖尿病患者では、筋肉、特に骨格筋における糖の取り込み量が減少していることが明らかにされており（非特許文献１〜３）、筋肉細胞の糖取り込み促進作用を指標とした糖尿病治療薬やポリフェノールのスクリーニングも行われ（非特許文献４〜５）、筋肉細胞の糖取り込み促進作用を有する組成物が提案されている（特許文献１〜２）。
The Journal of clinical investigation，1985年，76巻，149-155頁
Diabetologia，2000年，43巻，821-835頁
Biochemical Society transactions，2005年，33巻，354-357頁
J. Med. Chem.，1998年11月5日，41巻，23号，4556-4566頁
Mol. Nutr. Food. Res.，2011年，55巻，3号，467-475頁
J. Agric. Food Chem., 2013年年，61巻，14号，3351-3363頁
J. Ethnopharmacol.，2012年，140巻，2号，325-332頁
Phytomedicine，2012年，19巻，3-4号，239-244頁
Am. J. Chin. Med.，2009年，37巻，3号，597-608頁
Food Chem. Toxicol.，2010年，48巻，6号，1461-1465頁
Int. J. Bio. Macromol.，2011年，49巻，3号，255-259頁
本発明は、筋肉、特に、骨格筋および心筋の糖取り込み促進剤、およびこれを含有する高血糖改善剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、特定のトリテルペン類（トリテルペノイド）に、筋肉細胞の糖取り込みを促進する活性を見出した。また、これらトリテルペノイドによる糖取り込み促進作用はＧＬＵＴ４活性化に由来することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、上述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の形態として実現することが可能である。
［形態１］
オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する筋肉の糖取り込み促進剤を含有する、食品用組成物。この形態の食品用組成物によれば、骨格筋あるいは心筋などの筋肉細胞の糖取り込みを促進することができる。
［形態２］
上記形態の食品用組成物において、前記化合物が、植物抽出物由来であることとしてもよい。このような構成とすれば、毒性が低く安全性に優れた筋肉の糖取り込み促進剤を含有する食品組成物を、より容易に得ることができる。
［形態３］
上記形態の食品組成物において、前記化合物が、ナツメ抽出物由来であることとしてもよい。このような構成とすれば、より高い抽出効率にて、筋肉の糖取り込み促進剤を得て、食品組成物を得ることが可能になる。
［形態４］
本発明の他の形態によれば、ＧＬＵＴ４活性化食品組成物が提供される。このＧＬＵＴ４活性化食品組成物は、オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも1種の化合物を有効成分として含有する。この形態のＧＬＵＴ４活性化食品組成物によれば、骨格筋あるいは心筋などの筋肉細胞において、ＧＬＵＴ４を活性化することにより、筋肉細胞への糖取り込みを促進することができる。
その他、本発明は、以下のような形態として実現することも可能である。
［形態１］
オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する筋肉の糖取り込み促進剤を含有する、食品用組成物。この形態の食品用組成物によれば、骨格筋あるいは心筋などの筋肉細胞の糖取り込みを促進することができる。
［形態２］
上記形態の食品用組成物において、前記化合物が、植物抽出物由来であることとしてもよい。このような構成とすれば、毒性が低く安全性に優れた筋肉の糖取り込み促進剤を含有する食品組成物を、より容易に得ることができる。
［形態３］
上記形態の食品組成物において、前記化合物が、ナツメ抽出物由来であることとしてもよい。このような構成とすれば、より高い抽出効率にて、筋肉の糖取り込み促進剤を得て、食品組成物を得ることが可能になる。
［形態４］
本発明の他の形態によれば、ＧＬＵＴ４活性化食品組成物が提供される。このＧＬＵＴ４活性化食品組成物は、オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも1種の化合物を有効成分として含有する。この形態のＧＬＵＴ４活性化食品組成物によれば、骨格筋あるいは心筋などの筋肉細胞において、ＧＬＵＴ４を活性化することにより、筋肉細胞への糖取り込みを促進することができる。
その他、本発明は、以下のような形態として実現することも可能である。
（１）本発明の一形態によれば、筋肉の糖取り込み促進剤が提供される。この筋肉の糖取り込み促進剤は、オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する。この形態の筋肉の糖取り込み促進剤によれば、骨格筋あるいは心筋などの筋肉細胞の糖取り込みを促進することができる。このような筋肉細胞の糖取り込み促進作用は、上記筋肉の糖取り込み促進剤が、少なくとも、筋肉細胞内に存在するＧＬＵＴ４の細胞膜上へのトランスロケーションを促進することにより得られる。
（２）上記形態の筋肉の糖取り込み促進剤において、前記化合物が、植物抽出物由来であることとしてもよい。このような構成とすれば、毒性が低く安全性に優れた筋肉の糖取り込み促進剤を、より容易に得ることができる。
（３）上記形態の筋肉の糖取り込み促進剤において、前記化合物が、ナツメ抽出物由来であることとしてもよい。このような構成とすれば、より高い抽出効率にて、筋肉の糖取り込み促進剤を得ることが可能になる。
（４）本発明の他の形態によれば、ＧＬＵＴ４活性化剤が提供される。このＧＬＵＴ４活性化剤は、オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも1種の化合物を有効成分として含有する。この形態のＧＬＵＴ４活性化剤によれば、骨格筋あるいは心筋などの筋肉細胞において、ＧＬＵＴ４を活性化することにより、筋肉細胞への糖取り込みを促進することができる。
本発明は、上記以外の種々の形態で実現可能である。例えば、筋肉の糖取り込み促進剤を含有する高血糖改善剤の形態、あるいは、筋肉の糖取り込み促進剤を含有する、糖尿病および／または糖尿病合併症の予防または治療剤などの形態で実現することが可能である。また、糖尿病および／または糖尿病合併症の予防または治療用医薬製造のための、オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の使用の形態で実現することが可能である。また、筋肉の糖取り込み促進剤を含有する高血糖改善食品用組成物の態様、あるいは、筋肉の糖取り込み促進剤を含有する、メタボリックシンドローム、動脈硬化、糖尿病、および糖尿病合併症から選択される疾病の予防または改善のための飲食品の形態で実現することが可能である。また、筋肉の糖取り込み促進剤を患者に投与することにより、高血糖症、糖尿病、および糖尿病合併症から選択される疾病を治療する方法の形態で実現可能である。
本発明の糖取り込み促進剤および高血糖改善剤は、骨格筋および心筋の筋肉細胞において糖取り込みを促進することができる。本発明によれば、優れた糖取り込み促進作用により、高血糖症、メタボリックシンドローム、動脈硬化、糖尿病、および糖尿病合併症から選択される疾病の予防または治療剤を提供することができる。また、ＧＬＵＴ４活性化剤を提供することができる。
（糖取り込み促進剤）
本発明の実施形態における筋肉の糖取り込み促進剤は、３位にケトン基を有するトリテルペノイド(C-3 ketone)であるオレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含む。
本発明の実施形態における筋肉の糖取り込み促進剤は、３位にケトン基を有するトリテルペノイド(C-3 ketone)であるオレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含む。
オレアノン酸（Oleanonic acid）は、オレアナン型トリテルペノイドの一種で、３−オキソオレアナ−１２−エン−２８−酸（3-oxoolean-12-en-28-oic acid）であり、下記の式（Ｉ）で表される。
ベツロン酸（Betulonic acid）は、ルパン型トリテルペノイドの一種で、３−オキソルパ−２０（２９）−エン−２８−酸（3-oxolupa-20(29)-en-28-oic acid）であり、下記の式（ＩＩ）で表される。
ウルソン酸（Ursonic acid）は、ウルサン型トリテルペノイドの一種で、３−オキソウルサ−１２−エン−２８−酸（3-oxours-12-en-28-oic acid）であり、下記の式（ＩＩＩ）で表される。
本発明の実施形態で用いられるオレアノン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸から選択される化合物は、天然物由来であっても、化学合成あるいは半合成（天然物由来の化合物からの合成）により得られたものであっても良い。人体に対する毒性や安全性を考慮して、天然の植物から抽出して得られたものであることが好ましい。
本発明の実施形態において、オレアノン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸から選択される化合物を植物から抽出する場合に、抽出に用いる植物材料としては、ナツメ（果実）を好適に用いることができる。また、オレアノン酸においてはカキ（果実）およびＰｉｓｔａｃｉａ属植物（ナッツ、マスティックガム、樹液、樹脂、虫こぶ）、ウルソン酸においてはＭｙｒｉｃａ属植物（樹皮）も好ましく用いることができる。特に、糖取り込み促進剤の有効成分としてオレアノン酸あるいはウルソン酸を用いる場合には、抽出効率の観点から、植物材料としてナツメを用いることが望ましい。オレアノン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸から選択される化合物は、植物から公知の方法にしたがって抽出することができる。例えば、植物またはその乾燥物もしくは粉砕物に、エタノールやメタノールなどの極性有機溶媒またはこれらと水との混合物を加え、例えば約４℃〜１００℃の温度で攪拌または静置することにより抽出される。得られた抽出物は、濃縮または乾燥して用いることができる。
また、トリテルペノイドは植物中で配糖体としても存在することから、配糖体を用いてもよい。オレアノン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸から選択される化合物の配糖体は、生体内で代謝されて糖が脱離することにより、オレアノン酸、ベツロン酸、あるいはウルソン酸としての作用を示すことが可能になる。配糖体とは、上記の化合物のカルボキシル基と、任意の糖（例えば、グルコース、フコース、ガラクトース、６−デオキシグルコース、ラムノース）の水酸基との縮合体である。
本発明の実施形態において、糖取り込み促進剤の有効成分であるオレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体から選択される化合物を、ナツメなどの植物材料から得る場合には、植物材料からの抽出物をそのまま用いても良く、抽出物からの精製物を用いても良い。精製方法としては、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、限外ろ過、および電気泳動や高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。また、必要に応じてこれらの方法を組み合わせて精製を行ってもよい。
オレアノン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸から選択される化合物を合成する方法としては、例えば、オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸を、それぞれ、３位に水酸基を有するトリテルペノイド(C-3 alcohol)であるオレアノール酸、ベツリン酸、ウルソール酸から合成する方法を挙げることができる。
オレアノール酸（Oleanolic acid）は、オレアナン型トリテルペノイドの一種で、３β−ヒドロキシオレアナ−１２−エン−２８−酸（3β-hydroxyolean-12-en-28-oic acid）であり、下記の式（ＩＶ）で表される。
ベツリン酸（Betulinic acid）は、ルパン型トリテルペノイドの一種で、３β−ヒドロキシルパ−２０（２９）−エン−２８−酸（3β-hydroxylupa-20(29)-en-28-oic acid）であり、下記の式（Ｖ）で表される。
ウルソール酸（Ursolic acid）は、ウルサン型トリテルペノイドの一種で、３β−ヒドロキシウルサ−１２−エン−２８−酸（3β-hydroxyurs-12-en-28-oic acid）であり、下記の式（ＶＩ）で表される。
オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸を合成する具体的な方法としては、例えば、上記した３位に水酸基を有するトリテルペノイドの３位水酸基を酸化する方法が挙げられる。上記３位水酸基を酸化する方法としては、例えばジョーンズ酸化が挙げられる。ジョーンズ酸化とは、無水クロム酸（酸化クロム(VI)）の濃硫酸溶液であるジョーンズ試薬を酸化剤として用いて、アルコールをケトン等に酸化する周知の酸化方法である。上記酸化反応に用いる３位に水酸基を有するトリテルペノイドは、植物などの天然物から抽出したものであってもよく、化学合成したものでもよい。
本発明の実施形態における筋肉の糖取り込み促進剤は、上記したオレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含むことにより、骨格筋あるいは心筋などの筋肉細胞の糖取り込みを促進する。本願発明の実施形態の糖取り込み促進剤による糖取り込み促進作用は、少なくとも、筋肉細胞内に存在するＧＬＵＴ４の細胞膜上へのトランスロケーションを上記化合物が促進することにより発現される。よって、本発明の実施形態における筋肉の糖取り込み促進剤は、オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含むＧＬＵＴ４活性化剤であるということができる。
本発明の実施形態における筋肉の糖取り込み促進剤は、オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物からなる有効成分のみによって構成されていてもよく、また、さらにその他の成分を含有していてもよい。その他の成分について特に制限はなく、本願発明の効果を損なわない範囲で適宜選択可能である。
（高血糖改善剤）
本発明の実施形態の高血糖改善剤は、上記した本発明の実施形態の糖取り込み促進剤を含有し、この糖取り込み促進剤の優れた糖取り込み促進作用によって、血糖値を低下させる。したがって、高血糖症、糖尿病、糖尿病関連疾患（例えば、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、脂質代謝異常、高血圧症、脂肪肝、メタボリックシンドローム、浮腫、心不全、狭心症、心筋梗塞、動脈硬化症、高尿酸血症、痛風）、または糖尿病合併症（例えば、網膜症、腎症、神経障害、白内障、足壊疽、感染症、ケトーシス）の予防または治療剤として用いることができる。すなわち、上記各疾患の患者に投与することにより、上記各疾患の患者を治療することができる。
本発明の実施形態の高血糖改善剤は、上記した本発明の実施形態の糖取り込み促進剤を含有し、この糖取り込み促進剤の優れた糖取り込み促進作用によって、血糖値を低下させる。したがって、高血糖症、糖尿病、糖尿病関連疾患（例えば、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、脂質代謝異常、高血圧症、脂肪肝、メタボリックシンドローム、浮腫、心不全、狭心症、心筋梗塞、動脈硬化症、高尿酸血症、痛風）、または糖尿病合併症（例えば、網膜症、腎症、神経障害、白内障、足壊疽、感染症、ケトーシス）の予防または治療剤として用いることができる。すなわち、上記各疾患の患者に投与することにより、上記各疾患の患者を治療することができる。
本発明の実施形態の高血糖改善剤の投与経路は、経口投与または非経口投与のいずれであってもよい。その剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤などが挙げられる。これは、症状に応じてそれぞれ単独でまたは組み合わせて用いることができる。これらの製剤には、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤が用いられる。
本発明の実施形態の高血糖改善剤の投与量は、投与の目的や投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）に応じて異なる。通常、成人に対して、オレアノン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸の合計量として、経口投与の場合、１日あたり０．０１ｍｇ以上とすることができ、０．１ｍｇ以上が好ましく、１ｍｇ以上がさらに好ましい。また、経口投与の場合、一日あたり５０００ｍｇ以下とすることができ、１０００ｍｇ以下が好ましく、２００ｍｇ以下がさらに好ましい。一方、非経口投与の場合、１日あたり０．００１ｍｇ以上とすることができ、０．０１ｍｇ以上が好ましく、０．１ｍｇ以上がさらに好ましい。また、非経口投与の場合、一日あたり２５００ｍｇ以下とすることができ、５００ｍｇ以下が好ましく、１００ｍｇ以下がさらに好ましい。なお、高血糖改善剤中の有効成分として、オレアノン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸から選択される化合物の配糖体を含む場合には、これらの配糖体を、オレアノン酸、ベツロン酸、あるいはウルソン酸に換算したときの合計値として、上記した好ましい投与量を採用することができる。
本発明の実施形態の高血糖改善剤は、上記のような医薬品としてだけでなく、医薬部外品、化粧品などとして用いることができる。医薬部外品または化粧品として用いる場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに用いられ得る。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる有効成分の割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。
（高血糖改善食品用組成物および飲食品）
本発明の実施形態の高血糖改善食品用組成物は、上記した本発明の実施形態の糖取り込み促進剤を含有し、上記薬理効果を備えた健康食品・健康飲料・特定保健用食品・機能性食品・栄養補助剤、その他ヒト以外の動物に対する薬剤や飼料などに用いることができる。中でも、糖類を多く含んだ飲食物素材に本発明の実施形態の高血糖改善食品組成物を添加した場合には、筋肉細胞の糖取り込み促進作用による効率的なエネルギー供給効果を奏し、また、それに伴う筋肉組織の活性化・増強・増大や肉体疲労軽減、運動能力の向上などの効果を奏することから、優れたエネルギー補助食品を提供することができる。
本発明の実施形態の高血糖改善食品用組成物は、上記した本発明の実施形態の糖取り込み促進剤を含有し、上記薬理効果を備えた健康食品・健康飲料・特定保健用食品・機能性食品・栄養補助剤、その他ヒト以外の動物に対する薬剤や飼料などに用いることができる。中でも、糖類を多く含んだ飲食物素材に本発明の実施形態の高血糖改善食品組成物を添加した場合には、筋肉細胞の糖取り込み促進作用による効率的なエネルギー供給効果を奏し、また、それに伴う筋肉組織の活性化・増強・増大や肉体疲労軽減、運動能力の向上などの効果を奏することから、優れたエネルギー補助食品を提供することができる。
本発明の実施形態の高血糖改善食品用組成物を飲食品に用いる場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。
本発明の実施形態の高血糖改善食品用組成物へのオレアノン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸から選択される化合物の配合量は、例えば、組成物を飲料などとして用いる場合は、飲料中の上記特定の化合物の合計量は、０．００００１質量％以上とすることができ、０．００１質量％以上とすることが好ましい。また、飲料中の上記特定の化合物の合計量は、１０質量％以下とすることができ、１質量％以下とすることが好ましい。また、組成物が食品や食品素材などとして、固形状、粉末状、顆粒状、ペースト状等の形態で経口投与用として用いられる場合は、上記化合物の合計量は、０．０１質量％以上とすることができ、０．１質量％以上とすることが好ましい。また、固形状等の形態で経口投与する場合の上記化合物の合計量は、８０質量％以下とすることができ、２０質量％以下とすることが好ましい。また、組成物を非経口投与用として用いる場合は、上記特定の化合物の合計量は、０．００００１質量％以上とすることができ、０．０００１質量％以上とすることが好ましい。また、非経口投与の場合の上記特定の化合物の合計量は、１０質量％以下とすることができ、１質量％以下とすることが好ましい。なお、高血糖改善食品用組成物中の有効成分として、オレアノン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸から選択される化合物の配糖体を含む場合には、これらの配糖体を、オレアノン酸、ベツロン酸、あるいはウルソン酸に換算したときの合計値として、上記した好ましい投与量を採用することができる。
以下に実施例および製造例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（調製例１：ナツメ抽出物の作製および活性成分の単離）
図１は、ナツメ抽出物の作製および活性成分の単離に係る精製スキームを示す説明図である。ナツメ乾燥果実６ｋｇをメタノールに２週間漬けこみ、得られた抽出液を綿ろ過後、ロータリーエバポレーターで濃縮してメタノール抽出物を得た。さらに、この抽出物を酢酸エチルと水で再溶解して分液漏斗で分配し、得られた酢酸エチル可溶画分をロータリーエバポレーターで濃縮した。酢酸エチル可溶画分は、オープンカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏ−ｇｅｌ Ｃ−１００、トルエン／酢酸エチル、ステップワイズ法）により分画した。溶出溶媒の酢酸エチル濃度を０、１０、２０、３０、４０、５０、７５、および１００％(v/v)として溶出したのち、メタノールで溶出した。分画物はロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、糖取り込み試験（実施例１）および細胞毒性試験（実施例２）に用いた。糖取り込み促進活性を示した酢酸エチル１０％および２０％画分について、中圧カラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏ−ｇｅｌ Ｂ−０、ヘキサン／酢酸エチル、ステップワイズ法）により分画した。溶出溶媒の酢酸エチル濃度を０、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、および４０％(v/v)として溶出したのち、メタノールで溶出した。分画物はロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、糖取り込み試験（実施例３）に用いた。酢酸エチル１５％画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＰＤＡ:Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、Ｃ１８カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＳ、移動相：９０％(v/v)メタノール）で分取し、フラクション９−２において単一の活性化合物を得た。各種機器分析（ＦＴ−ＩＲ：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ２０００、ＫＢｒ法、ＭＳ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ、１Ｈおよび１３Ｃ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋａｒ ＡＲＸ−５００、ＣＤＣｌ３）により、活性化合物はオレアノン酸であると同定した。
図１は、ナツメ抽出物の作製および活性成分の単離に係る精製スキームを示す説明図である。ナツメ乾燥果実６ｋｇをメタノールに２週間漬けこみ、得られた抽出液を綿ろ過後、ロータリーエバポレーターで濃縮してメタノール抽出物を得た。さらに、この抽出物を酢酸エチルと水で再溶解して分液漏斗で分配し、得られた酢酸エチル可溶画分をロータリーエバポレーターで濃縮した。酢酸エチル可溶画分は、オープンカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏ−ｇｅｌ Ｃ−１００、トルエン／酢酸エチル、ステップワイズ法）により分画した。溶出溶媒の酢酸エチル濃度を０、１０、２０、３０、４０、５０、７５、および１００％(v/v)として溶出したのち、メタノールで溶出した。分画物はロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、糖取り込み試験（実施例１）および細胞毒性試験（実施例２）に用いた。糖取り込み促進活性を示した酢酸エチル１０％および２０％画分について、中圧カラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏ−ｇｅｌ Ｂ−０、ヘキサン／酢酸エチル、ステップワイズ法）により分画した。溶出溶媒の酢酸エチル濃度を０、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、および４０％(v/v)として溶出したのち、メタノールで溶出した。分画物はロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、糖取り込み試験（実施例３）に用いた。酢酸エチル１５％画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＰＤＡ:Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、Ｃ１８カラム：ＳＵＰＥＬＣＯ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＳ、移動相：９０％(v/v)メタノール）で分取し、フラクション９−２において単一の活性化合物を得た。各種機器分析（ＦＴ−ＩＲ：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ ２０００、ＫＢｒ法、ＭＳ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ、１Ｈおよび１３Ｃ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋａｒ ＡＲＸ−５００、ＣＤＣｌ３）により、活性化合物はオレアノン酸であると同定した。
（調製例２：Ｌ６骨格筋細胞の作製）
Ｌ６筋芽細胞（理研バイオリソースセンター製）を２×１０４／ｍＬの細胞密度になるようにＭＥＭ培地（１０％(v/v)牛胎児血清含有）で調製し、９６穴組織培養プレートに移し（１穴当たり２００μＬ）、３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２日間培養した。細胞がコンフルエントになった時点で、培地をＭＥＭ培地（２％(v/v)牛胎児血清含有）に置換し、さらに細胞を３７℃の５％炭酸ガス培養器にて５日間培養した（Ｌ６骨格筋細胞の作製）。次いで、培地をＭＥＭ培地（０．２％(w/v)牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有）に置換し、さらに細胞を３７℃の５％炭酸ガス培養器にて１８時間培養した。このように培養したＬ６骨格筋細胞を、糖取り込み試験（実施例１、３、および４）、細胞毒性試験（実施例２、および５）、およびＧＬＵＴ４阻害剤による糖取り込み阻害試験（実施例６）に用いた。
Ｌ６筋芽細胞（理研バイオリソースセンター製）を２×１０４／ｍＬの細胞密度になるようにＭＥＭ培地（１０％(v/v)牛胎児血清含有）で調製し、９６穴組織培養プレートに移し（１穴当たり２００μＬ）、３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２日間培養した。細胞がコンフルエントになった時点で、培地をＭＥＭ培地（２％(v/v)牛胎児血清含有）に置換し、さらに細胞を３７℃の５％炭酸ガス培養器にて５日間培養した（Ｌ６骨格筋細胞の作製）。次いで、培地をＭＥＭ培地（０．２％(w/v)牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有）に置換し、さらに細胞を３７℃の５％炭酸ガス培養器にて１８時間培養した。このように培養したＬ６骨格筋細胞を、糖取り込み試験（実施例１、３、および４）、細胞毒性試験（実施例２、および５）、およびＧＬＵＴ４阻害剤による糖取り込み阻害試験（実施例６）に用いた。
（調製例３：オレアノン酸、ベツロン酸およびウルソン酸の合成）
オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸は、それぞれ、オレアノール酸（Ｗａｋｏ社製）、ベツリン酸（Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ社製）、ウルソール酸（Ｗａｋｏ社製）の３位水酸基をジョーンズ酸化により酸化することで調製した。オレアノール酸、ベツリン酸またはウルソール酸２００ｍｇをアセトン２００ｍLに溶解し、氷冷しながらジョーンズ試薬を反応液が緑色から赤色に変わるまで滴下した。反応液に水を加え、ジエチルエーテルで分配したのち、ジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターで濃縮した。得られた濃縮物は簿層クロマトグラフィーで精製し、オレアノン酸（収率７８％）、ベツロン酸（収率７７％）、およびウルソン酸（収率８６％）を得た。
オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸は、それぞれ、オレアノール酸（Ｗａｋｏ社製）、ベツリン酸（Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ社製）、ウルソール酸（Ｗａｋｏ社製）の３位水酸基をジョーンズ酸化により酸化することで調製した。オレアノール酸、ベツリン酸またはウルソール酸２００ｍｇをアセトン２００ｍLに溶解し、氷冷しながらジョーンズ試薬を反応液が緑色から赤色に変わるまで滴下した。反応液に水を加え、ジエチルエーテルで分配したのち、ジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターで濃縮した。得られた濃縮物は簿層クロマトグラフィーで精製し、オレアノン酸（収率７８％）、ベツロン酸（収率７７％）、およびウルソン酸（収率８６％）を得た。
（２−デオキシグルコースの測定方法）
上記Ｌ６骨格筋細胞を用いて糖取り込みを行なわせ、Ｌ６骨格筋細胞が取り込んだ糖の量として、Ｌ６骨格筋細胞中の２−デオキシグルコース（以下、２ＤＧと記載する）の量を測定した。２ＤＧの測定は、次のように行った。まず、各試料（糖取り込み試験に供した後のＬ６骨格筋細胞を溶解させて得た混合物）を９６穴プレートに１穴当たり１０μＬ添加し、アッセイカクテル（５０ｍＭ トリエタノールアミン（ＴＥＡ）溶液（ｐＨ８．１）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０２％(w/v)ＢＳＡ、０．１ｍＭ ＮＡＤＰ、２μＭ レザズリン、２ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ジアホラーゼ、１５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）を１穴当たり１００μＬ添加した。このプレートをマイクロプレートミキサーで撹拌し、３７℃の５％炭酸ガス培養器にて５０分間静置した。プレートの各穴について、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）にて蛍光値（励起波長：５３０ｎｍ、測定波長：５７０ｎｍ）を測定した。２ＤＧ−６−リン酸（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を標準物質として検量線を作成し、プレートの各穴について、２ＤＧ取り込み量を算出した。
上記Ｌ６骨格筋細胞を用いて糖取り込みを行なわせ、Ｌ６骨格筋細胞が取り込んだ糖の量として、Ｌ６骨格筋細胞中の２−デオキシグルコース（以下、２ＤＧと記載する）の量を測定した。２ＤＧの測定は、次のように行った。まず、各試料（糖取り込み試験に供した後のＬ６骨格筋細胞を溶解させて得た混合物）を９６穴プレートに１穴当たり１０μＬ添加し、アッセイカクテル（５０ｍＭ トリエタノールアミン（ＴＥＡ）溶液（ｐＨ８．１）、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．０２％(w/v)ＢＳＡ、０．１ｍＭ ＮＡＤＰ、２μＭ レザズリン、２ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ジアホラーゼ、１５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）を１穴当たり１００μＬ添加した。このプレートをマイクロプレートミキサーで撹拌し、３７℃の５％炭酸ガス培養器にて５０分間静置した。プレートの各穴について、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）にて蛍光値（励起波長：５３０ｎｍ、測定波長：５７０ｎｍ）を測定した。２ＤＧ−６−リン酸（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を標準物質として検量線を作成し、プレートの各穴について、２ＤＧ取り込み量を算出した。
（実施例１：ナツメ抽出物（酢酸エチル可溶画分）を分画して得られた画分のＬ６骨格筋細胞における糖取り込み試験）
ナツメ抽出物（酢酸エチル可溶画分）の分画物の存在下におけるＬ６骨格筋細胞の糖取り込みを調べた。
ナツメ抽出物（酢酸エチル可溶画分）の分画物の存在下におけるＬ６骨格筋細胞の糖取り込みを調べた。
調製例１のオープンカラムクロマトグラフィーにより得られた酢酸エチル０〜４０％画分の各々の乾固物は、１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。酢酸エチル５０〜１００％画分の各々の乾固物およびメタノール画分の乾固物は、１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにメタノールに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。これにより、各々の乾固物について、各々の乾固物を５０μｇ／ｍＬの濃度で含有するＭＥＭ培地を調製した。０．５％(v/v)ＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地と、０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地とを陰性対照として用い、インスリンを１００ｎＭ含有するＭＥＭ培地を陽性対照として用いた。
調製例２のＬ６骨格筋細胞の培養プレートの培地を、これらの培地に置換し（１穴当たり１００μＬ）、さらにプレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて４時間静置した。次いで、０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１．８５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ４）を１穴当たり１００μＬ用いて各穴を２回洗浄した後、１ｍＭ ２ＤＧおよび０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を１穴当たり１００μＬ添加し、プレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２０分間静置した。次いで、０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を１穴当たり１００μＬ用いて各穴を２回洗浄した後、０．１Ｍ ＮａＯＨを１穴当たり５０μＬ添加し、プレートを６０℃の乾熱滅菌器にて１０分間静置した。プレートをマイクロプレートミキサーで撹拌して、細胞を溶解させた後、プレートを８５℃の乾熱滅菌器にて５０分間静置して乾燥させた。０．１Ｍ ＨＣｌを１穴当たり５０μＬ添加し、次いで２００ｍＭ ＴＥＡ溶液（ｐＨ８．１）を１穴当たり５０μＬ添加し、プレートをマイクロプレートミキサーで撹拌した。プレートの各穴中の混合物について２ＤＧ量を測定し、陰性および陽性対照区の測定値と比較することにより、糖取り込み促進作用を評価した。
２ＤＧの測定は、上記の各々の混合物を用いて、既述した２ＤＧの測定方法に基づいて測定した。各穴の２ＤＧ取り込み量を算出した後、各穴の２ＤＧ取り込み量の陰性対照区（酢酸エチル０〜４０％画分はＤＭＳＯ処理区、酢酸エチル５０〜１００％画分およびメタノール画分はメタノール処理区）の２ＤＧ取り込み量に対する比を算出した。結果を図２に示す。図２および以後の説明で参照する各図において、陰性対照は用いた溶媒に応じて「ＤＭＳＯ」または「メタノール」と示しており、陽性対照は「インスリン」と示している。図２および以後の説明で参照する各図では、各画分あるいは各化合物について、ｎ＝６〜９として測定を行なった結果としての平均値および標準偏差を示している。図２において、「＊」は、有意水準５％で陰性対照と有意差があったことを示す。
図２からわかるように、オープンカラムクロマトグラフィー分画物のうち、酢酸エチル０、１０、２０、３０、および４０％画分が高い糖取り込み促進作用を示し、酢酸エチル２０％画分の糖取り込み促進作用はインスリンより強力であった。
（実施例２：ナツメ抽出物（酢酸エチル可溶画分）を分画して得られた画分の細胞毒性試験）
調製例１のオープンカラムクロマトグラフィーにより得られた酢酸エチル０〜４０％画分の各々の乾固物は、１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させた。また、酢酸エチル５０〜１００％画分の各々の乾固物およびメタノール画分の乾固物は、１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにメタノールに溶解させた。その後、各々の溶液をＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈し、各々の乾固物について、各々の乾固物を５０μｇ／ｍＬの濃度で含有するＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、０．５％(v/v)ＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地と、０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地とを用いた。調製例１のＬ６骨格筋細胞の培養プレートに、これらの培地を１穴当たり１００μＬ添加し、プレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２４時間静置した。次いで、細胞をクリスタルバイオレット染色し、吸光度（測定波長５７０ｎｍ）をプレートリーダーにて測定し、陰性対照区（酢酸エチル０〜４０％画分はＤＭＳＯ処理区、酢酸エチル５０〜１００％画分およびメタノール画分はメタノール処理区）の吸光度に対する比より細胞生存率を算出した。結果を図３に示す。
調製例１のオープンカラムクロマトグラフィーにより得られた酢酸エチル０〜４０％画分の各々の乾固物は、１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させた。また、酢酸エチル５０〜１００％画分の各々の乾固物およびメタノール画分の乾固物は、１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにメタノールに溶解させた。その後、各々の溶液をＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈し、各々の乾固物について、各々の乾固物を５０μｇ／ｍＬの濃度で含有するＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、０．５％(v/v)ＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地と、０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地とを用いた。調製例１のＬ６骨格筋細胞の培養プレートに、これらの培地を１穴当たり１００μＬ添加し、プレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２４時間静置した。次いで、細胞をクリスタルバイオレット染色し、吸光度（測定波長５７０ｎｍ）をプレートリーダーにて測定し、陰性対照区（酢酸エチル０〜４０％画分はＤＭＳＯ処理区、酢酸エチル５０〜１００％画分およびメタノール画分はメタノール処理区）の吸光度に対する比より細胞生存率を算出した。結果を図３に示す。
図３からわかるように、いずれの分画物も、陰性対照と同等の細胞生存率を示した。すなわち、いずれの分画物も、実施例１で糖取り込み促進作用の評価に用いた濃度（５０μｇ／ｍＬ）において細胞毒性を示さなかった。
（実施例３：ナツメ抽出物（酢酸エチル１０％および２０％画分）を分画して得られた画分のＬ６骨格筋細胞における糖取り込み試験）
実施例１において高い糖取り込み促進作用を示した酢酸エチル１０％および２０％画分（調製例１のオープンカラムクロマトグラフィーにより得られた酢酸エチル１０％および２０％画分）について、調製例１のとおり中圧カラムクロマトグラフィーにより分画した（図１参照）。得られた酢酸エチル０〜１１％、１５％、３０％、および４０％画分の各々の乾固物は、１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させた。また、酢酸エチル１２％、２０％、２５％、およびメタノール画分の各々の乾固物は、１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにメタノールに溶解させた。その後、各々の溶液をＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈し、各々の乾固物について、各々の乾固物を７５μｇ／ｍＬの濃度で含有するＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、０．５％(v/v)ＤＭＳＯもしくは０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地を用いた。陽性対照として、インスリンを１００ｎＭ含有するＭＥＭ培地を用いた。
実施例１において高い糖取り込み促進作用を示した酢酸エチル１０％および２０％画分（調製例１のオープンカラムクロマトグラフィーにより得られた酢酸エチル１０％および２０％画分）について、調製例１のとおり中圧カラムクロマトグラフィーにより分画した（図１参照）。得られた酢酸エチル０〜１１％、１５％、３０％、および４０％画分の各々の乾固物は、１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させた。また、酢酸エチル１２％、２０％、２５％、およびメタノール画分の各々の乾固物は、１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにメタノールに溶解させた。その後、各々の溶液をＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈し、各々の乾固物について、各々の乾固物を７５μｇ／ｍＬの濃度で含有するＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、０．５％(v/v)ＤＭＳＯもしくは０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地を用いた。陽性対照として、インスリンを１００ｎＭ含有するＭＥＭ培地を用いた。
調製例２のＬ６骨格筋細胞の培養プレートの培地を、これらの培地に置換し（１穴当たり１００μＬ）、さらにプレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて４時間静置した。次いで、０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１．８５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ４）を１穴当たり１００μＬ用いて各穴を２回洗浄した後、１ｍＭ ２ＤＧおよび０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を１穴当たり１００μＬ添加し、プレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２０分間静置した。次いで、０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を１穴当たり１００μＬ用いて各穴を２回洗浄した後、０．１Ｍ ＮａＯＨを１穴当たり５０μＬ添加し、プレートを６０℃の乾熱滅菌器にて１０分間静置した。プレートをマイクロプレートミキサーで撹拌して、細胞を溶解させた後、プレートを８５℃の乾熱滅菌器にて５０分間静置して乾燥させた。０．１Ｍ ＨＣｌを１穴当たり５０μＬ添加し、次いで２００ｍＭ ＴＥＡ溶液（ｐＨ８．１）を１穴当たり５０μＬ添加し、プレートをマイクロプレートミキサーで撹拌した。プレートの各穴中の混合物について２ＤＧ量を測定し、陰性および陽性対照区の測定値と比較することにより、糖取り込み促進作用を評価した。
２ＤＧの測定は、上記の各々の混合物を用いて、既述した２ＤＧの測定方法に基づいて測定した。各穴の２ＤＧ取り込み量を算出した後、各穴の２ＤＧ取り込み量の陰性対照区（酢酸エチル０〜１１％、１５％、３０％、および４０％画分はＤＭＳＯ処理区、酢酸エチル１２％、２０％、２５％、およびメタノール画分はメタノール処理区）の２ＤＧ取り込み量に対する比を算出した。結果を図４に示す。図４において、＊は、有意水準５％で陰性対照（溶媒）と有意差があったことを示す。
図４からわかるように、中圧カラムクロマトグラフィー分画物のうち、酢酸エチル１０、１１、１２、１５、２０、および２５％画分が高い糖取り込み促進作用を示した。
（実施例４：トリテルペノイドのＬ６骨格筋細胞における糖取り込み試験）
調製例３で調製したオレアノン酸、ベツロン酸およびウルソン酸と、調製例３で用いたものと同様のオレアノール酸、ベツリン酸、およびウルソール酸を用いて、Ｌ６骨格筋細胞における糖取り込み試験を行なった。オレアノール酸、ベツリン酸、ベツロン酸、ウルソール酸、およびウルソン酸の各々を、０．４ｍＭ、２ｍＭ、および１０ｍＭの３段階の濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。また、オレアノン酸も同様の３段階の濃度となるようにメタノールに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。これにより、各々のトリテルペノイドについて、濃度が２μＭ、１０μＭ、および５０μＭであるＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、０．５％(v/v)ＤＭＳＯもしくは０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地を用い、陽性対照として、インスリンを１００ｎＭ含有するＭＥＭ培地を用いた。
調製例３で調製したオレアノン酸、ベツロン酸およびウルソン酸と、調製例３で用いたものと同様のオレアノール酸、ベツリン酸、およびウルソール酸を用いて、Ｌ６骨格筋細胞における糖取り込み試験を行なった。オレアノール酸、ベツリン酸、ベツロン酸、ウルソール酸、およびウルソン酸の各々を、０．４ｍＭ、２ｍＭ、および１０ｍＭの３段階の濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。また、オレアノン酸も同様の３段階の濃度となるようにメタノールに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。これにより、各々のトリテルペノイドについて、濃度が２μＭ、１０μＭ、および５０μＭであるＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、０．５％(v/v)ＤＭＳＯもしくは０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地を用い、陽性対照として、インスリンを１００ｎＭ含有するＭＥＭ培地を用いた。
調製例１のＬ６骨格筋細胞の培養プレートの培地を、これらの培地に置換し（１穴当たり１００μＬ）、さらにプレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて４時間静置した。次いで、０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１．８５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ４）を１穴当たり１００μＬ用いて各穴を２回洗浄した後、１ｍＭ ２ＤＧおよび０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を１穴当たり１００μＬ添加し、プレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２０分間静置した。次いで、０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を１穴当たり１００μＬ用いて各穴を２回洗浄した後、０．１Ｍ ＮａＯＨを１穴当たり５０μＬ添加し、プレートを６０℃の乾熱滅菌器にて１０分間静置した。プレートをマイクロプレートミキサーで撹拌して、細胞を溶解させた後、プレートを８５℃の乾熱滅菌器にて５０分間静置して乾燥させた。０．１Ｍ ＨＣｌを１穴当たり５０μＬ添加し、次いで２００ｍＭ ＴＥＡ溶液（ｐＨ８．１）を１穴当たり５０μＬ添加し、プレートをマイクロプレートミキサーで撹拌した。プレートの各穴中の混合物について２ＤＧ量を測定し、陰性および陽性対照区の測定値と比較することにより、糖取り込み促進作用を評価した。
２ＤＧの測定は、上記の各々の混合物を用いて、既述した２ＤＧの測定方法に基づいて測定した。各穴の２ＤＧ取り込み量を算出した後、各穴の２ＤＧ取り込み量の陰性対照区（オレアノール酸、ベツリン酸、ベツロン酸、ウルソール酸、およびウルソン酸はＤＭＳＯ処理区、オレアノン酸はメタノール処理区）の２ＤＧ取り込み量に対する比を算出した。結果を図５に示す。図５において、＊は、有意水準５％で陰性対照（溶媒）と有意差があったことを示す。
図５からわかるように、３位にケトン基を有するトリテルペノイドであるオレアノン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸は、２μＭ〜５０μＭの濃度範囲にわたって濃度依存的な糖取り込み活性化作用を示した。これに対して、３位に水酸基を有するトリテルペノイドのうちのオレアノール酸およびウルソール酸の糖取り込み活性化作用は、明確な濃度依存性を示さなかった。また、オレアノン酸およびベツロン酸は１０μＭ以上、ウルソン酸は５０μＭでインスリンと同等もしくはそれ以上の強い活性を示した。また、３位にケトン基を有するオレアノン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸は、３位に水酸基を有するオレアノール酸、ベツリン酸、およびウルソール酸よりも顕著な糖取り込み活性化作用を示した。具体的には、オレアノン酸およびベツロン酸はそれぞれ、２μＭから５０μＭの範囲のいずれの濃度においても、オレアノール酸あるいはベツリン酸よりも高い糖取り込み活性化作用を示した。また、ウルソン酸は、１０μＭ〜５０μＭのいずれの濃度においても、ウルソール酸よりも高い糖取り込み活性化作用を示した。
（実施例５：トリテルペノイドの細胞毒性試験）
調製例３で調製したオレアノン酸、ベツロン酸およびウルソン酸と、調製例３で用いたものと同様のオレアノール酸、ベツリン酸、およびウルソール酸を用いて、細胞毒性試験を行なった。オレアノール酸、ベツリン酸、ベツロン酸、ウルソール酸、およびウルソン酸の各々を、１０ｍＭの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。また、オレアノン酸を、１０ｍＭの濃度となるようにメタノールに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。これにより、各々のトリテルペノイドについて、濃度が５０μＭであるＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、０．５％(v/v)ＤＭＳＯもしくは０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地を用いた。調製例１のＬ６骨格筋細胞の培養プレートに、これらの培地を１穴当たり１００μＬ添加し、プレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２４時間静置した。次いで、細胞をクリスタルバイオレット染色し、吸光度（測定波長５７０ｎｍ）をプレートリーダーにて測定し、陰性対照区（オレアノール酸、ベツリン酸、ベツロン酸、ウルソール酸、およびウルソン酸はＤＭＳＯ処理区、オレアノン酸はメタノール処理区）の吸光度に対する比より細胞生存率を算出した。結果を図６に示す。
調製例３で調製したオレアノン酸、ベツロン酸およびウルソン酸と、調製例３で用いたものと同様のオレアノール酸、ベツリン酸、およびウルソール酸を用いて、細胞毒性試験を行なった。オレアノール酸、ベツリン酸、ベツロン酸、ウルソール酸、およびウルソン酸の各々を、１０ｍＭの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。また、オレアノン酸を、１０ｍＭの濃度となるようにメタノールに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。これにより、各々のトリテルペノイドについて、濃度が５０μＭであるＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、０．５％(v/v)ＤＭＳＯもしくは０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地を用いた。調製例１のＬ６骨格筋細胞の培養プレートに、これらの培地を１穴当たり１００μＬ添加し、プレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２４時間静置した。次いで、細胞をクリスタルバイオレット染色し、吸光度（測定波長５７０ｎｍ）をプレートリーダーにて測定し、陰性対照区（オレアノール酸、ベツリン酸、ベツロン酸、ウルソール酸、およびウルソン酸はＤＭＳＯ処理区、オレアノン酸はメタノール処理区）の吸光度に対する比より細胞生存率を算出した。結果を図６に示す。
図６からわかるように、オレアノン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸のいずれも、実施例４で糖取り込み促進作用の評価に用いた最高濃度（５０μｇ／ｍＬ）において細胞毒性を示さなかった。なお、オレアノール酸およびウルソール酸は、陰性対照に比べて有為に細胞生存率が低く、５０μｇ／ｍＬの濃度において細胞毒性が認められた。すなわち、３位にケトン基を有するオレアノン酸およびウルソン酸は、３位に水酸基を有するオレアノール酸およびウルソール酸よりも高い安全性を示した。
（実施例６：オレアノール酸、オレアノン酸およびフラクション９−２のＬ６骨格筋細胞における糖取り込み試験）
実施例３において高い糖取り込み促進作用を示した酢酸エチル１５％画分（調製例１の中圧カラムクロマトグラフィーにより得られた酢酸エチル１５％画分）について、調製例１のとおり高速液体クロマトグラフィーにより分画した。分画して得られたフラクション９−２（オレアノン酸）と、調製例３で用いたものと同様のオレアノール酸と、調製例３で得られたオレアノン酸とを用いて、Ｌ６骨格筋細胞における糖取り込み試験を行なった。オレアノール酸は、５ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させ、調製例３で得られたオレアノン酸および調製例１で得られたフラクション９−２の乾固物は、５ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにメタノールに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。これにより、各々の試料について、各々の試料を２５μｇ／ｍＬ（５５μＭ）の濃度で含有するＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、０．５％(v/v)ＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地と、０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地とを用いた。陽性対照として、インスリンを１００ｎＭ含有するＭＥＭ培地を用いた。
実施例３において高い糖取り込み促進作用を示した酢酸エチル１５％画分（調製例１の中圧カラムクロマトグラフィーにより得られた酢酸エチル１５％画分）について、調製例１のとおり高速液体クロマトグラフィーにより分画した。分画して得られたフラクション９−２（オレアノン酸）と、調製例３で用いたものと同様のオレアノール酸と、調製例３で得られたオレアノン酸とを用いて、Ｌ６骨格筋細胞における糖取り込み試験を行なった。オレアノール酸は、５ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させ、調製例３で得られたオレアノン酸および調製例１で得られたフラクション９−２の乾固物は、５ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにメタノールに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。これにより、各々の試料について、各々の試料を２５μｇ／ｍＬ（５５μＭ）の濃度で含有するＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、０．５％(v/v)ＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地と、０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地とを用いた。陽性対照として、インスリンを１００ｎＭ含有するＭＥＭ培地を用いた。
調製例２のＬ６骨格筋細胞の培養プレートの培地を、これらの培地に置換し（１穴当たり１００μＬ）、さらにプレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて４時間静置した。次いで、０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１．８５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ４）を１穴当たり１００μＬ用いて各穴を２回洗浄した後、１ｍＭ ２ＤＧおよび０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を１穴当たり１００μＬ添加し、プレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２０分間静置した。次いで、０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を１穴当たり１００μＬ用いて各穴を２回洗浄した後、０．１Ｍ ＮａＯＨを１穴当たり５０μＬ添加し、プレートを６０℃の乾熱滅菌器にて１０分間静置した。プレートをマイクロプレートミキサーで撹拌して、細胞を溶解させた後、プレートを８５℃の乾熱滅菌器にて５０分間静置して乾燥させた。０．１Ｍ ＨＣｌを１穴当たり５０μＬ添加し、次いで２００ｍＭ ＴＥＡ溶液（ｐＨ８．１）を１穴当たり５０μＬ添加し、プレートをマイクロプレートミキサーで撹拌した。プレートの各穴中の混合物について２ＤＧ量を測定し、陰性および陽性対照区の測定値と比較することにより、糖取り込み促進作用を評価した。
２ＤＧの測定は、上記の各々の混合物を用いて、既述した２ＤＧの測定方法に基づいて測定した。各穴の２ＤＧ取り込み量を算出した後、各穴の２ＤＧ取り込み量の陰性対照区（オレアノール酸はＤＭＳＯ処理区、オレアノン酸およびフラクション９−２はメタノール処理区）の２ＤＧ取り込み量に対する比を算出した。結果を図７に示す。図７において、＊は、有意水準５％で陰性対照（溶媒）と有意差があったことを示す。
図７からわかるように、調製例３で合成したオレアノン酸と調製例１で得たフラクション９−２とは、同等の筋肉糖取り込み誘導活性を示した。したがって、合成物および天然物のいずれにおいても活性に差異は無いことが明らかとなった。
（実施例７：ＧＬＵＴ４阻害剤Ｉｎｄｉｎａｖｉｒによるトリテルペノイドの糖取り込み促進作用の抑制）
調製例３で調製したオレアノン酸、ベツロン酸およびウルソン酸と、調製例３で用いたものと同様のオレアノール酸、ベツリン酸、およびウルソール酸を用いて、これらのトリテルペノイドの糖取り込み促進作用に対するＧＬＵＴ４阻害剤の影響を調べた。ＧＬＵＴ４阻害剤としては、Ｉｎｄｉｎａｖｉｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。Ｉｎｄｉｎａｖｉｒは１００ｍＭの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させ、１ｍＭ ２ＤＧを含有するＫＲＨ緩衝液にて１０００倍希釈した。オレアノール酸、ベツリン酸、ベツロン酸、ウルソール酸、およびウルソン酸の各々を、１０ｍＭの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。オレアノン酸を、１０ｍＭの濃度となるようにメタノールに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。これにより、各々のトリテルペノイドについて、濃度が５０μＭであるＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、０．５％(v/v)ＤＭＳＯもしくは０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地を用い、陽性対照としてインスリンを１００ｎＭ含有するＭＥＭ培地を用いた。
調製例３で調製したオレアノン酸、ベツロン酸およびウルソン酸と、調製例３で用いたものと同様のオレアノール酸、ベツリン酸、およびウルソール酸を用いて、これらのトリテルペノイドの糖取り込み促進作用に対するＧＬＵＴ４阻害剤の影響を調べた。ＧＬＵＴ４阻害剤としては、Ｉｎｄｉｎａｖｉｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。Ｉｎｄｉｎａｖｉｒは１００ｍＭの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させ、１ｍＭ ２ＤＧを含有するＫＲＨ緩衝液にて１０００倍希釈した。オレアノール酸、ベツリン酸、ベツロン酸、ウルソール酸、およびウルソン酸の各々を、１０ｍＭの濃度となるようにＤＭＳＯに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。オレアノン酸を、１０ｍＭの濃度となるようにメタノールに溶解させ、さらにＭＥＭ培地（０．２％(w/v)ＢＳＡ含有）にて２００倍希釈した。これにより、各々のトリテルペノイドについて、濃度が５０μＭであるＭＥＭ培地を調製した。陰性対照として、０．５％(v/v)ＤＭＳＯもしくは０．５％(v/v)メタノールを含有するＭＥＭ培地を用い、陽性対照としてインスリンを１００ｎＭ含有するＭＥＭ培地を用いた。
調製例１のＬ６骨格筋細胞の培養プレートの培地を、これらの培地に置換し（１穴当たり１００μＬ）、さらにプレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて４時間静置した。次いで、０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１．８５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ４）を１穴当たり１００μＬ用いて各穴を２回洗浄した後、１ｍＭ ２ＤＧ、０．１％(v/v)ＤＭＳＯ、および０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液、もしくは、１ｍＭ ２ＤＧ、１００μＭ Ｉｎｄｉｎａｖｉｒ、および０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を１穴当たり１００μＬ添加し、プレートを３７℃の５％炭酸ガス培養器にて２０分間静置した。次いで、０．１％(w/v)ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を１穴当たり１００μＬ用いて各穴を２回洗浄した後、０．１Ｍ ＮａＯＨを１穴当たり５０μＬ添加し、プレートを６０℃の乾熱滅菌器にて１０分間静置した。プレートをマイクロプレートミキサーで撹拌して、細胞を溶解させた後、プレートを８５℃の乾熱滅菌器にて５０分間静置して乾燥させた。その後、０．１Ｍ ＨＣｌを１穴当たり５０μＬ添加し、次いで２００ｍＭ ＴＥＡ溶液（ｐＨ８．１）を１穴当たり５０μＬ添加し、プレートをマイクロプレートミキサーで撹拌した。プレートの各穴中の混合物について２ＤＧ量を測定し、陰性および陽性対照区の測定値と比較することにより、糖取り込み促進作用を評価した。
２ＤＧの測定は、上記の各々の混合物を用いて、既述した２ＤＧの測定方法に基づいて測定した。なお、ここでは、陰性対照区であってＩｎｄｉｎａｖｉｒを加えないサンプルの２ＤＧ取り込み量に対する比を算出した。各穴の２ＤＧ取り込み量を算出した後、各穴の２ＤＧ取り込み量の陰性対照区（オレアノール酸、ベツリン酸、ベツロン酸、ウルソール酸、およびウルソン酸はＤＭＳＯ処理区、オレアノン酸はメタノール処理区）の２ＤＧ取り込み量に対する比を算出した。結果を図８に示す。図８において、＊は、有意水準５％で有意差があったことを示す。
図８からわかるように、オレアノン酸、ベツリン酸、ベツロン酸、およびウルソン酸によって促進された糖取り込み活性は、Ｉｎｄｉｎａｖｉｒによって顕著に阻害された。したがって、これらトリテルペノイドによる糖取り込み促進作用は、ＧＬＵＴ４活性化に由来することが示された。
本発明の糖取り込み促進剤および高血糖改善剤は、骨格筋および心筋の筋肉細胞において優れた糖取り込み促進作用を有する。したがって、本発明の糖取り込み促進剤および高血糖改善剤を用いることによって、高血糖症、糖尿病、および糖尿病合併症から選択される疾病の予防または治療剤、並びに、高血糖、糖尿病、および糖尿病合併症から選択される疾病を予防または改善する飲食品を提供することができる。
Claims (7)
- オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する筋肉の糖取り込み促進剤を含有する、食品用組成物。
- 前記化合物が、植物抽出物由来である、請求項１に記載の食品用組成物。
- 前記化合物が、ナツメ抽出物由来である、請求項２に記載の食品用組成物。
- 請求項１から３のいずれか１項に記載の、高血糖改善食品用組成物。
- 請求項１から３のいずれか１項に記載の食品用組成物であって、糖尿病および／または糖尿病合併症の予防または治療のための食品用組成物。
- 糖尿病または糖尿病合併症の予防または治療用食品用組成物製造のための、オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物の使用。
- オレアノン酸、ベツロン酸、ウルソン酸、およびそれらの配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する、ＧＬＵＴ４活性化食品用組成物。
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