WO2015041235A1 - 生活習慣病治療のための食品素材の使用 - Google Patents

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WO2015041235A1
WO2015041235A1 PCT/JP2014/074513 JP2014074513W WO2015041235A1 WO 2015041235 A1 WO2015041235 A1 WO 2015041235A1 JP 2014074513 W JP2014074513 W JP 2014074513W WO 2015041235 A1 WO2015041235 A1 WO 2015041235A1
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mung bean
globulin
bean protein
lifestyle
blood
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PCT/JP2014/074513
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河野　光登
さゆり 北川
伸彦 橘
貴康 本山
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不二製油株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin

Definitions

  • the present invention relates to the use of food materials for the treatment of lifestyle-related diseases.
  • metabolic syndrome In order to prevent the onset of lifestyle diseases such as diabetes, dyslipidemia, hypertension and obesity that cause arteriosclerosis, the concept of metabolic syndrome was devised. Many researchers currently have obesity at the forefront, and insulin resistance caused by obesity leads to abnormal glucose metabolism, abnormal lipid metabolism, and high blood pressure. This condition is considered to be metabolic syndrome.
  • Insulin is a hormone that plays an important role in maintaining normal sugar and lipid levels in the blood. Insulin promotes absorption of excess sugar and fat in the blood to its target organs, skeletal muscle, liver, and adipose tissue, so that these blood concentrations are kept normal. A combination of various levels of reduced insulin sensitivity (induction of insulin resistance) in the skeletal muscle, liver, and adipose tissues that are the target organs of insulin causes a decrease in insulin action, resulting in conditions such as hyperglycemia and abnormal lipids. . This is the metabolic syndrome.
  • Pancreatic ⁇ cells increase insulin secretion and become hyperinsulinemia to compensate for this insulin resistance. Therefore, it is possible to maintain a state such as hyperglycemia and abnormal lipid in the boundary region for a certain period. This period is called the compensation period. However, if this state continues, pancreatic ⁇ -cells become exhausted and dysfunctional and enter into a failure stage, insulin secretion decreases and progresses to lifestyle-related diseases such as dyslipidemia and diabetes (Non-patent Document 1). . Furthermore, there is a risk of leading to a risk factor reaching 30% of Japanese causes of death such as arteriosclerosis and accompanying cardiovascular disease and cerebrovascular disease.
  • SREBP sterol-responsive element-binding protein
  • SREBP-1a, -1c, -2 three isoforms are known.
  • SREBP-1c regulates the transcription of fatty acid and triglyceride synthesis enzymes, and is associated with fatty liver, dyslipidemia, and diabetes through these lipid metabolism disorders.
  • SREBP-1c When SREBP-1c is activated chronically, it is considered that the increase in fat synthesis leads to impaired insulin action in cells, that is, to induce insulin resistance (Non-patent Document 3).
  • thiazolidine drugs as insulin resistance improvers.
  • PRO active study is a large-scale clinical trial using pioglitazone. In this trial, the number of patients who started insulin treatment was significantly reduced to 53% in the pioglitazone group compared to the placebo group.
  • Non-Patent Document 4 This pioglitazone has been reported to increase the incidence of bladder cancer in France, and the US FDA has contraindicated the administration of pioglitazone to bladder cancer patients.
  • the same thiazolidine drug rosiglitazone has also been discontinued in Europe as it may increase cardiovascular events. Thus, it can be said that the development of an insulin resistance improving agent excellent in safety is an urgent issue.
  • Non-patent Document 5 Non-patent Document 5
  • adipose tissue expression gene analysis process carried out as part of the Human Genome Project, it was found that human adipose tissue encodes various secreted protein genes. In particular, about 30% of the genes of visceral fat encode secretory proteins, and it has been revealed that adipose tissue is a huge secretory organ.
  • the physiologically active substances secreted from the adipose tissue are collectively referred to as adipocytokines.
  • adipocytokinin is the only adipocytokin that is inversely correlated with the degree of obesity.
  • Adiponectin is a hormone produced only from adipocytes, and its blood concentration is 1,000 to 2,000 times higher (2 to 20 ⁇ g / ml) compared to insulin and thyroid hormone, which are common hormones. Has been used as a marker of obesity in visceral fat obesity (Non-patent Document 6).
  • Adiponectin is not just a marker of obesity, but has been reported to be associated with many pathological conditions, and the concept of hypoadiponectinemia has been proposed. It goes without saying that diabetes is a typical example of hypoadiponectinemia, but other than that, hypoadiponectinemia causes heart, liver, and kidney tissue damage and fibrosis, which can lead to heart failure and chronic It leads to diseases such as kidney disease (CKD) and nonalcoholic steatohepatitis (NASH).
  • CKD kidney disease
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • Non-patent Document 7 when a hormone related to blood pressure (angiotensin II) is administered to induce muscle fibrosis, there is a report that adiponectin accumulates in the damaged part and tissue repair is performed.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • adiponectin is not only involved in pathologies ranging from insulin resistance to diabetes, dyslipidemia, hypertension and arteriosclerosis, but also heart failure, chronic kidney disease (CKD), nonalcoholic steatohepatitis ( NASH), adipone cytokine involved in diseases such as cirrhosis, osteoporosis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and pathological conditions such as cancer.
  • CKD chronic kidney disease
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • a thiazolidinedione derivative that is a PPAR ⁇ agonist is known as a pharmaceutical that increases the concentration of adiponectin in blood (Non-patent Document 13).
  • thiazolidinedione derivatives have been reported to cause edema that appears to be due to an increase in circulating plasma volume in a short period of time, and that heart failure may worsen or develop as a side effect.
  • congestive heart failure may be induced, and attention should be paid to whether or not symptoms of heart failure such as sudden excessive weight gain, dyspnea, and edema appear during taking.
  • the development of an adiponectin secretion promoter with excellent safety is an urgent issue.
  • 8S ⁇ globulin is a main component of the protein of mung bean, which is the seed of Yaenari (scientific name: Vigna radiate), an annual plant of the legume family.
  • Yaenari is native to India and is currently cultivated mainly in East Asia, South Asia, Africa, South America and Australia, and is used as a raw material for bean sprout and vermicelli, as well as cooking ingredients such as salmon and persimmon, mainly in Asia. Is eaten all over the world.
  • An object of the present invention is to provide a safe and efficient food material that is used for the treatment of lifestyle-related diseases, is derived from natural products, and can be expected to have an effect by ingestion in daily life. .
  • the first of the present invention is the use of mung bean protein for the treatment of lifestyle-related diseases
  • the second of the present invention is the use of 8S ⁇ globulin for the treatment of lifestyle-related diseases.
  • the third aspect of the present invention is the gist of using mung bean protein or 8S ⁇ globulin for improving insulin resistance
  • the fourth aspect of the present invention is mung bean protein or 8S ⁇ globulin for promoting adiponectin secretion.
  • the fifth aspect of the present invention is the use of mung bean protein or 8S ⁇ globulin for reducing blood neutral fat
  • the sixth aspect of the present invention is to improve blood glucose level. For the purpose of use of mung bean protein or 8S ⁇ globulin.
  • the seventh aspect of the present invention is to use mung bean protein or 8S ⁇ globulin for the treatment of lifestyle-related diseases in which 1 to 10 g per day is administered as 8S ⁇ globulin.
  • the eighth aspect of the present invention is the use of mung bean protein or 8S ⁇ globulin for improving insulin resistance, in which 1-10 g per day is administered as 8S ⁇ globulin, and the ninth aspect of the present invention is 8S ⁇ globulin.
  • the gist is the use of mung bean protein or 8S ⁇ globulin for promoting adiponectin secretion by administering 1 to 10 g per day as globulin.
  • the tenth aspect of the present invention is the use of mung bean protein or 8S ⁇ globulin for reducing blood neutral fat, which is administered at 1 to 10 g per day as 8S ⁇ globulin.
  • the gist is the use of soy protein or 8S ⁇ globulin for improving blood glucose level, in which 1 to 10 g per day is administered as 8S ⁇ globulin.
  • the twelfth aspect of the present invention is based on mung bean protein for the treatment of lifestyle-related diseases
  • the thirteenth aspect of the present invention is based on 8S ⁇ globulin for the treatment of lifestyle-related diseases. is there.
  • the fourteenth aspect of the present invention is a summary of the use of mung bean protein or 8S ⁇ globulin for improving insulin resistance, and the fifteenth aspect of the present invention is mung bean protein or 8S ⁇ for promoting adiponectin secretion.
  • the gist is the use of globulin.
  • the sixteenth aspect of the present invention is based on the use of mung bean protein or 8S ⁇ globulin for reducing blood neutral fat, and the seventeenth aspect of the present invention is a mung bean protein for improving blood glucose level.
  • the gist is to use 8S ⁇ globulin.
  • adiponectin secretion promoter that is derived from a natural product and can be expected to have an effect by ingestion in daily life.
  • Various pathologies caused by hypoadiponectinemia heart failure, chronic kidney disease (CKD), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), osteoporosis, pulmonary edema lesions, etc.
  • CKD chronic kidney disease
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • osteoporosis osteoporosis
  • pulmonary edema lesions etc.
  • metabolic syndrome It becomes extremely useful for the improvement of lifestyle-related diseases such as diabetes and dyslipidemia.
  • a, b, and c mean presence of a significant difference (p ⁇ 0.05, Tukey HSD) between different symbols. It is a figure which shows the increase in the adiponectin secretion amount by 8S (alpha) globulin addition in the fat cell by macrophage stimulation. In addition, a and b mean existence of a significant difference (p ⁇ 0.05, Turkey HSD) with different symbols.
  • the mung bean protein used in the lifestyle-related disease improving agent of the present invention is a protein contained in mung bean, which is a seed of Yaenari.
  • the storage protein accumulated in the vacuole of the seed tissue, which is mainly used as a nutrient source during germination, is preferable.
  • 8S ⁇ globulin which is the main component of these mung bean storage proteins, shows this effect strongly and is most preferable as a target.
  • the protein extraction method and the content in the material are not particularly limited. In order to reduce the amount of intake as a material, it is preferable to extract protein with high purity from mung beans, and it is preferable that 8S ⁇ globulin is present with high purity in the obtained protein.
  • mung beans taken out from the pods of Yaenari can be used as they are.
  • Mung bean protein containing 8S ⁇ globulin is extracted by standing or stirring for 2 to 18 hours at 20 to 60 ° C and pH 6 to 9 by adding 3 to 10 times the amount of water to the raw mung bean. . Furthermore, a protein solution can be obtained by grinding the raw material and further removing the precipitated starch.
  • a mung bean protein containing 8S ⁇ globulin By sterilizing and drying this protein solution as it is, a mung bean protein containing 8S ⁇ globulin can be obtained.
  • a mung bean protein containing high-purity 8S ⁇ globulin can be obtained by collecting the precipitate, adjusting the pH as necessary, sterilizing and drying.
  • the lifestyle-related disease improving agent of the present invention is characterized by using mung bean protein as an active ingredient.
  • lifestyle-related diseases in the present invention include hyperglycemia, dyslipidemia, diabetes, hypertension, arteriosclerosis, heart failure, chronic kidney disease, nonalcoholic steatohepatitis, cirrhosis, osteoporosis, pulmonary edema lesions, etc.
  • lifestyle-related disease improving agents include insulin resistance improving agents, blood neutral fat reducing agents, blood sugar level improving agents, adiponectin secretion promoters, and the like.
  • the insulin resistance improving agent, blood neutral fat reducing agent, and blood sugar level improving agent of the present invention may contain an effective amount of the above-mentioned 8S ⁇ globulin, and the content is determined in consideration of the intake amount described later. It can be set appropriately.
  • the insulin resistance improving agent, blood neutral fat reducing agent, and blood sugar level improving agent of the present invention can be used in the form of powder, granule, solid, semi-fluid, fluid, or liquid.
  • the administration method is preferably an oral medicine.
  • oral medicine include powders, granules, capsules, pills, solid preparations such as tablets, suspensions, liquids such as emulsions, and the like.
  • orally administered agents include excipients, disintegrants, binders, lubricants, surfactants, alcohols, water, water-soluble polymers, sweeteners, flavoring agents, etc. that are generally used depending on the form. It can add and can manufacture according to a conventional method.
  • the compounding amount in these orally administered agents is generally 0.1 to 100% by weight, particularly preferably 5 to 80% by weight.
  • the dosage is preferably 1 to 10 g per day as the 8S ⁇ globulin divided into 2 to several times.
  • Examples of foods include so-called health foods, functional foods, foods for specified health use, and the like. Such food can be produced according to a conventional method by adding commonly used food materials according to the type of food.
  • the amount of 8S ⁇ globulin blended in the food varies depending on the type of food, but is generally 0.1 to 100%, particularly preferably 5 to 80%.
  • the adiponectin secretion promoter according to the present invention only needs to contain an effective amount of the above-described 8S ⁇ globulin, and the content can be appropriately set in consideration of the intake amount described later.
  • the adiponectin secretion promoter of the present invention can be used as a pharmaceutical or food in the form of powder, granule, solid, semi-fluid, fluid or liquid.
  • the administration method is preferably a drug for oral administration.
  • a drug for oral administration include powders, granules, capsules, pills, solid preparations such as tablets, suspensions, liquids such as emulsions, and the like.
  • These orally administered agents include excipients, disintegrants, binders, lubricants, surfactants, alcohols, water, water-soluble polymers, sweeteners, flavoring agents, etc. that are generally used depending on the form. It can add and can manufacture according to a conventional method.
  • the compounding amount of mung bean protein in these orally administered agents is generally 0.1 to 100% by weight, particularly preferably 5 to 80% by weight.
  • the dosage is preferably 1 to 10 g per day as the 8S ⁇ globulin divided into 2 to several times.
  • Examples of foods include so-called health foods, functional foods, foods for specified health use, and the like. Such food can be produced according to a conventional method by adding commonly used food materials according to the type of food.
  • the blending amount of mung bean protein in the food varies depending on the type of food, but is generally 0.1 to 100% by weight, particularly preferably 5 to 80% by weight.
  • Example 1 The mung beans were pulverized with a pulverizer. Ten times the amount of warm water at 50 ° C. was added to the pulverized mung bean powder, and the mixture was stirred for 1 hour while adjusting the pH to 7.0 as needed. Centrifuge (3,000 rpm, 10 minutes at room temperature), adjust the resulting supernatant to pH 5.0, and centrifuge again (3,000 rpm, 10 minutes at room temperature). After recovery and water addition, the product was neutralized to pH 7.0, sterilized, and spray-dried to obtain 8S ⁇ globulin. The 8S ⁇ globulin thus obtained was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and then the protein was stained.
  • the total amount of all the stained areas was 8S ⁇ globulin-derived protein with a molecular weight of 48 kDa as the main protein. From the measurement of the staining degree of the 60, 26 kDa protein band, the purity was 84.9%, and it was confirmed that the purity was sufficient to withstand the following examination.
  • the experimental animals were 5 weeks old male Wistar male rats purchased from CLEA Japan, and pre-bred for 5 days with the commercial solid feed “CRF-1” (produced by Oriental Yeast Co., Ltd.). Each group was divided into two groups of 5 animals so that their body weights were uniform, and were reared on the test feed for 4 weeks. The animals were housed individually in individual cages at a temperature of 23 ⁇ 1 ° C. and a humidity of 55 ⁇ 5% under a 12-hour light / dark cycle (lighting from 7:00 to 19:00). During the breeding period, water and feed were freely consumed.
  • Test Example 2 As in Test Example 1, a test for confirming the effect of improving insulin resistance by rats was conducted. Based on the composition of AIN-93G as a feed composition, 8S ⁇ globulin obtained in Production Example 1 as a test feed and casein (vitamin free casein, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) as a comparative control are each 20% by weight as a dietary protein. The included one was used. Specific formulations are shown in Table 4 below.
  • the experimental animal was a 5-week-old male GK rat (Gotoh-Kakizaki rats), a diabetic model with reduced glucose metabolism function, purchased from CLEA Japan.
  • the commercial solid feed “CRF-1” produced by Oriental Yeast Co., Ltd.
  • each test food group was divided into 2 groups with 5 animals per group so that the weight of each test food group was matched, and the test diet was raised for 3 weeks.
  • the animals were housed individually in individual cages at a temperature of 23 ⁇ 1 ° C. and a humidity of 55 ⁇ 5% under a 12-hour light / dark cycle (lighting from 7:00 to 19:00). During the breeding period, water and feed were freely consumed.
  • the Taqman (R) primer used used sterol regulatory element binding protein 1 (sterol regulatory element binding transcription factor 1, Rn01495769) as a target and ⁇ -actin (Actb, Rn00667869) as a housekeeping gene. Table 7 shows the measurement results.
  • SREBP-1c which is a factor related to the induction of insulin resistance in the liver, has a significantly decreased gene expression in the 8S ⁇ globulin group, and insulin resistance is suppressed in the 8S ⁇ globulin group. It was supported.
  • Glucose uptake tests were performed with skeletal muscle cells.
  • 8S ⁇ globulin it was used as digested 8S ⁇ globulin which was previously degraded with pepsin (pH 2.0), trypsin and chymotrypsin (both pH 7.0) as digestive enzymes.
  • Rat skeletal muscle L6 cells were used.
  • a 96-well microplate was seeded at 2 ⁇ 104 cells / ml, and precultured in DMEM medium containing 10 wt% FBS containing 100 Units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin. After confirming that the cells reached 80-100% confluence, differentiation induction was started.
  • DMEM medium containing 2 wt% HS containing 100 Units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin was used. The medium was changed every 24 or 48 hours. All the cultures were performed under the conditions of 37 ° C. and 5% by volume CO 2. After confirmation of differentiation induction, the amount of sugar uptake was measured.
  • Differentiated L6 cells were desensitized by acting on serum-free DMEM containing 0.2% BSA. Then, digested 8S ⁇ globulin or insulin as a control was allowed to act at 37 ° C. for 4 hours, washed twice with 0.1% BSA-containing KRH, and 1 mM 2-Deoxy-D-glucose was allowed to act at 37 ° C. for 20 minutes. . The cells were washed twice with 0.1 wt% BSA-containing KRH, added with 50 ⁇ l of 0.1N NaOH and incubated at 60 ° C. for 10 minutes to solubilize the cells, and dried at 85 ° C. for 1 hour.
  • the uptake of blood sugar in skeletal muscle was significantly increased by the addition of 8S ⁇ globulin, similar to the addition of insulin. This result confirmed that 8S ⁇ globulin promotes migration (translocation) to the plasma membrane of GLUT4 related to sugar uptake in skeletal muscle. This result leads to a decrease in blood glucose level.
  • Example 4 An adiponectin secretion promoting effect confirmation test was conducted by rats. Based on the composition of AIN-93G as a feed composition, 8S ⁇ globulin obtained in Production Example 1 as the test feed and casein (vitamin free casein, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) as a comparative control were each 20% by weight as a dietary protein. The included one was used. Specific formulations are shown in Table 8.
  • the experimental animals were 5 weeks old male Wistar male rats purchased from CLEA Japan, and pre-bred for 5 days with the commercial solid feed “CRF-1” (produced by Oriental Yeast Co., Ltd.). Each group was divided into two groups of 5 animals so that their body weights were uniform, and were reared on the test feed for 4 weeks. The animals were housed in individual cages at a temperature of 23 ⁇ 1 ° C. and a humidity of 55 ⁇ 5% under a 12-hour light / dark cycle (lighting from 7:00 to 19:00). During the breeding period, water and feed were freely consumed.
  • liver and kidney organ weights were significantly reduced. It is said that these organs are generally enlarged with disease and increase in weight. The weights of these organs were significantly low, indicating that these organs were not diseased or even if they were diseased.
  • the amount of adiponectin in the blood was significantly higher in the 8S ⁇ globulin group, confirming the decrease in fat mass and body weight associated with optimization of adipose tissue.
  • Test Example 5 As in Test Example 4, a test for confirming the effect of promoting adiponectin secretion by rats was performed. Based on the composition of AIN-93G as a feed composition, 8S ⁇ globulin obtained in Production Example 1 as the test feed and casein (vitamin free casein, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) as a comparative control were each 20% by weight as a dietary protein. The included one was used. Furthermore, in order to induce lifestyle-related diseases, 13% by weight of beef tallow was added as an oil and fat to obtain a high-fat diet with an oil content of 20% by weight. The specific formulation is shown in Table 11.
  • the experimental animal was a 5-week-old male GK rat (Goto-Kakizaki rats), a diabetic model with reduced glucose metabolism function, purchased from CLEA Japan, and the commercial solid feed “CRF-1” (produced by Oriental Yeast Co., Ltd.)
  • GK rat Goto-Kakizaki rats
  • CRF-1 commercial solid feed “produced by Oriental Yeast Co., Ltd.
  • each test food group was divided into 2 groups with 5 animals per group so that the weight of each test food group was matched, and the test diet was raised for 3 weeks.
  • the animals were housed in individual cages at a temperature of 23 ⁇ 1 ° C. and a humidity of 55 ⁇ 5% under a 12-hour light / dark cycle (lighting from 7:00 to 19:00).
  • water and feed were freely consumed.
  • the liver weight significantly decreased. Even if the liver is not diseased or diseased, it has been shown to be less severe. The amount of adiponectin in the blood was significantly higher in the 8S ⁇ globulin group, confirming the optimization of adipose tissue.
  • Example 6 An adiponectin secretion test using adipocytes was performed. As for 8S ⁇ globulin, it was used as digested 8S ⁇ globulin which was previously degraded with pepsin (pH 2.0), trypsin and chymotrypsin (both pH 7.0) as digestive enzymes. Mouse preadipocytes 3T3-L1 were used as the cells. The cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 cells / ml on a microplate and cultured at 37 ° C. under 5% by volume CO 2 until reaching confluence.
  • the cells When differentiation was induced, the cells were cultured in DMEM medium containing 10 ⁇ g / 1 ml insulin, 0.25 ⁇ M dexamethasone and 0.5 mM IBMX (isobutylmethylxanthine) for 48 hours.
  • DMEM medium containing 10 ⁇ g / 1 ml insulin, 0.25 ⁇ M dexamethasone and 0.5 mM IBMX (isobutylmethylxanthine) for 48 hours.
  • the amount of adiponectin in a certain amount of culture supernatant was measured using an adiponectin ELISA kit manufactured by Otsuka Pharmaceutical. The measurement results are shown in FIG.
  • Adipocytes were stimulated with cytokines (TNF- ⁇ ), and the effect on the secretion ability of adiponectin was observed. As a result, the decrease in the secretion amount was suppressed by 8S ⁇ globulin, and 8S ⁇ globulin inhibited adiponectin secretion from adipocytes. It was shown to be promoting.

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Abstract

　【課題】生活習慣病治療のために使用される、天然物由来であって、日常生活における摂取により効果が期待できる、安全かつ効率的な食品素材を提供する。　【解決手段】アディポネクチン分泌促進やインスリン抵抗性改善などの生活習慣治療のため、食品素材である緑豆蛋白質が提供される。緑豆蛋白質は８Ｓαグロブリンであることが好ましい。　

Description

生活習慣病治療のための食品素材の使用
　本発明は、生活習慣病治療のための食品素材の使用に関するものである。
　動脈硬化症の原因となる、糖尿病、脂質異常症、高血圧症、肥満症といった生活習慣病については、その発症を未然に防ぐため、メタボリックシンドロームという概念が打ち出された。現在多くの研究者は、肥満がその最上流に位置し、肥満によって生じたインスリン抵抗性により、糖代謝異常、脂質代謝異常、血圧高値の状態となり、この状態がメタボリックシンドロームと考えられている。
　血中の糖や脂質の濃度を正常に保つに重要な役割を果たすホルモンがインスリンである。インスリンは、その標的臓器である骨格筋、肝臓、脂肪組織に対して、血中の過剰な糖や脂肪の吸収を促すことで、これらの血中濃度が正常に保たれるのである。インスリン標的臓器である骨格筋、肝臓、脂肪組織でのインスリン感受性の低下（インスリン抵抗性の惹起）が様々な程度合わさることでインスリンの作用の低下が起こり、高血糖、脂質異常などの状態となる。これがメタボリックシンドロームである。
　膵β細胞はこのインスリン抵抗性を代償するべく、インスリン分泌を増強し高インスリン血症となる。従って一定期間は、境界域での高血糖、脂質異常などの状態を保つことができる。この期間を代償期という。しかしこの状態が続くと、膵β細胞の疲弊・機能不全を来し不全期に陥り、インスリン分泌が低下し脂質異常症、糖尿病などの生活習慣病にまで進行してしまう（非特許文献１）。さらには動脈硬化およびそれに伴って発症する心血管病、脳血管病などの日本人の死因の３割にも達するリスクファクターに繋がる危険がある。
　各臓器におけるインスリン作用の程度を表す指標が明らかとなっている。骨格筋では、細胞内に４型糖輸送担体（glucose transporter 4 : GLUT4）が発現しており、インスリンの骨格筋での糖の取り込みの増加は、インスリン刺激による細胞内プールからのGLUT4の形質膜に移動（トランスロケーション）を促されることによって生じる。よって、骨格筋でのGLUT4の膜移行の程度を見ることは、インスリン作用を知るうえで重要な指標となる（非特許文献２）。
　肝臓におけるインスリン作用の見極めであるが、ステロール応答配列結合タンパク質(sterol regulatory element-binding protein : SREBP)が、その指標となりうる。SREBPはコレステロール代謝関連遺伝子や脂肪酸合成酵素遺伝子を制御する、細胞内の脂質合成の調節因子であり、３つのアイソフォームが知られている（SREBP-1a, -1c, -2）。このうち、SREBP-1cは脂肪酸やトリグリセリド合成系の酵素群の転写制御を行い、脂肪肝、脂質異常症さらには、これら脂質代謝異常を介して糖尿病と関連している。SREBP-1cが慢性的に活性化されると、脂肪合成の増加とともに細胞内でのインスリン作用の障害、つまりインスリン抵抗性の惹起につながると考えられている（非特許文献３）。
　インスリン抵抗性改善剤として、チアゾリジン系薬剤がある。このチアゾリジン系薬剤のうち、ピオグリタゾンを用いた大規模臨床試験としてPRO active studyがあり、この試験ではプラセボ群に対して、ピオグリタゾン群では、インスリン治療を開始した症例は53%へと有意に減少したことが示されている（非特許文献４）。しかしながら、このピオグリタゾンについては、フランスにおいて膀胱がんの発症率を増加させたとの報告があり、米国FDAも膀胱がん患者へのピオグリタゾン投与は禁忌としている。また、同じチアゾリジン系薬剤のロシグリタゾンは、心血管イベントを増加させる可能性があるとして、欧州での販売は中止されている。このように、安全性に優れたインスリン抵抗性改善剤の開発は急務な課題と言える。
　さらに、メタボリックシンドロームについての最近の研究では、肥満が最上流に位置することは変わりないが、この肥満がインスリン抵抗性を介さずに、糖代謝異常、脂質代謝異常、血圧高値さらには動脈硬化症の発症、進展に直接関与していることが明らかになってきた（非特許文献５）。
　ヒトゲノムプロジェクトの一環として行われた脂肪組織発現遺伝子解析過程において、ヒト脂肪組織が種々の分泌タンパク質遺伝子をコードしていることが判明した。特に、内臓脂肪の遺伝子の約30％が分泌タンパク質をコードしており、脂肪組織が巨大な分泌臓器であることが明らかとなった。この脂肪組織から分泌される生理活性物質が、アディポサイトカインと総称されている。
　脂肪の過剰蓄積、すなわち肥満により、ほとんどすべてのアディポサイトカインは、その血中濃度が上昇するのに対して、唯一肥満度と逆相関するアディポサイトカインが、アディポネクチンである。
　アディポネクチンは、脂肪細胞からのみ作られるホルモンで、血中濃度が一般的なホルモンであるインスリンや甲状腺ホルモンに比べ、1,000倍から2,000倍もの高濃度（2～20μg/ml）であり、血中濃度を精度よく定量測定できることから、内臓脂肪肥満における肥満度のマーカーとして利用されている（非特許文献６）。
　アディポネクチンは単なる肥満度のマーカーに止まらず、病態との関連が数多く報告されており、現在低アディポネクチン血症という概念が提唱されている。低アディポネクチン血症の代表例が、糖尿病であることは言うまでもないが、それ以外にも低アディポネクチン血症により、心臓、肝臓、腎臓の組織障害、線維化が引き起こされ、これが原因となり心不全や、慢性腎臓病（CKD）、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）などの疾患につながる。
　心臓については、血圧に関与するホルモン（アンジオテンシンII）を投与し、筋肉の線維化を誘発したところ、その障害部分にアディポネクチンが集積し、組織修復を行ったとの報告がある（非特許文献７）。腎臓では、６分の５腎摘されたアディポネクチン欠損マウスにおいて、その腎臓での強い線維化の誘発や（非特許文献８）、肝臓でも非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）や肝硬変に至る組織の線維化とアディポネクチンの関係が報告されている（非特許文献９）。さらにアディポネクチンとガン、骨粗鬆症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）といった疾患の関係についても報告されている（非特許文献１０－１２）。
　このように、アディポネクチンはインスリン抵抗性から糖尿病、脂質異常症、高血圧症、さらには動脈硬化に至る病態に関与するだけでなく、心不全や、慢性腎臓病（CKD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬変、骨粗鬆症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）といった疾患、またガンといった病態に関与するアディポネサイトカインである。
　血中アディポネクチン濃度を上昇させる医薬品として、PPARγアゴニストであるチアゾリジンジオン誘導体が知られている（非特許文献１３）。しかしながら、チアゾリジンジオン誘導体は、副作用として、循環血漿量の増加によると考えられる浮腫が短期間に発現し、また、心不全が増悪、あるいは、発症することがあるとされている。また、うっ血性心不全を誘発するおそれがあるとの報告があり、服用中は、急激な過度の体重増加、呼吸困難、浮腫など、心不全の症状が現れないか、注意が必要とされている。このように、安全性に優れたアディポネクチン分泌促進剤の開発は急務な課題と言える。
　他方、８Ｓαグロブリンは、マメ科の一年生植物であるヤエナリ（学名：Vigna radiate）の種子である緑豆のタンパク質の主要構成成分である。ヤエナリはインドが原産地で、現在は主に東アジアから南アジア、アフリカ、南アメリカ、オースラリアで栽培されており、もやしや春雨の原料となるほか、餡、粥といった料理の材料として、アジアを中心に全世界で食されている。また、漢方薬のひとつとして、解熱、解毒、消炎作用があるとされているが、インスリン抵抗性、さらにそれに起因する脂質代謝や糖代謝の改善効果や、アディポネクチン分泌促進作用については、これまでに全く知られていない。
春日雅人(2012)：糖尿病の成員と病態、春日雅人編「糖尿病学イラストレイテッド」、pp24-20, 羊水社、東京 Kono T et al, J.Biol.Chem., 257, 10942-10947 (1982) Shimano H et al, Prog.Lipid Res., 40, 439-452 (2001) Dormandy J A et al, Lancet, 366, 1279-1289 (2005) 春日雅人(2006)：メタボリックシンドローム：解明が進むその分子メカニズム、春日雅人編「生活習慣病がわかる」、pp12-19, 羊土社、東京 Ryo M et al, Circ J., 68, 975-981 (2004) Fujita K et al, Arteioscler Thromb Vasc Bio., 28, 863-870, 2008 Ohashi K et al, Arteioscler Thromb Vasc Bio., 27, 1910-1917, 2007 Kamada Y et al, J Hepatol., 47(4), 556-564, 2007 Miyoshi Y et al, Clin Cancer Res., 9, 5699-5704, 2003 Tanabe K et al, J Oral Tissue Engin., 7(2), 99-106, 2009 Nakanishi K et al, Am J Respir Crit Care Med., 183(9), 1164-1175, 2011 Maeda N et al, Diabetes, 50, 2094-2099, 2001
　本発明は、生活習慣病治療のために使用される、天然物由来であって、日常生活における摂取により効果が期待できる、安全かつ効率的な食品素材を提供することを目的とするものである。
　本発明者は、日常生活で摂取する食品素材を用いて、食品素材が、生活習慣病に関わる因子である血中インスリン濃度や血中アディポネクチン濃度に及ぼす関係について検討した結果、緑豆の貯蔵タンパク質である８Ｓαグロブリンが、良好なインスリン抵抗性改善効果、血中中性脂肪低減効果、血糖値改善効果及び良好なアディポネクチン分泌促進効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第一は、生活習慣病治療のための緑豆タンパク質の使用であり、本発明の第二は、生活習慣病治療のための８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものである。また、本発明の第三は、インスリン抵抗性改善のための緑豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものであり、本発明の第四は、アディポネクチン分泌促進のための緑豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものであり、本発明の第五は、血中中性脂肪低減のための緑豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものであり、本発明の第六は血糖値改善のための緑豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものである。また、本発明の第七は、８Ｓαグロブリンとして１日当たり１～１０ｇを投与する生活習慣病治療のための緑豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものである。また、本発明の第八は、８Ｓαグロブリンとして１日当たり１～１０ｇを投与するインスリン抵抗性改善のための緑豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものであり、本発明の第九は、８Ｓαグロブリンとして１日当たり１～１０ｇを投与するアディポネクチン分泌促進のための緑豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものである。また、本発明の第十は、８Ｓαグロブリンとして１日当たり１～１０ｇを投与する血中中性脂肪低減のための緑豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものであり、本発明の第十一は、８Ｓαグロブリンとして１日当たり１～１０ｇを投与する血糖値改善のための豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものである。また、本発明の第十二は、生活習慣病治療のための緑豆タンパク質を要旨とするものであり、本発明の第十三は、生活習慣病治療のための８Ｓαグロブリンを要旨とするものである。また、本発明の第十四は、インスリン抵抗性改善のための緑豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものであり、本発明の第十五は、アディポネクチン分泌促進のための緑豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものである。また、本発明の第十六は、血中中性脂肪低減のための緑豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものであり、本発明の第十七は、血糖値改善のための緑豆タンパク質または８Ｓαグロブリンの使用を要旨とするものである。
　本発明により、天然物由来であって、日常生活における摂取により効果が期待できる、安全かつ効率的なアディポネクチン分泌促進剤を提供することができ、その摂取により、近年問題となっているメタボリックシンドロームや低アディポネクチン血症によって引き起こされるとされる様々な病態（心不全、慢性腎臓病（CKD）、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）、骨粗鬆症、肺浮腫病変など）、また、メタボリックシンドロームやそれが進行することによって発症に至る、糖尿病や脂質異常症といった生活習慣病の改善に極めて有用なものとなる。
８Ｓαグロブリン添加による糖取り込み活性の図である、尚、a,b,cは、異なる記号間で有意差（p＜0.05, Tukey HSD）の存在を意味する。 マクロファージ刺激による脂肪細胞での８Ｓαグロブリン添加によるアディポネクチン分泌量の増加を示す図である。なお、a、ｂは、異なる記号で有意差（p＜0.05, Turkey HSD）の存在を意味する。
（緑豆タンパク質）
　本発明の生活習慣病改善剤に用いられる緑豆タンパク質とは、ヤエナリの種子である緑豆に含有されるタンパク質である。これらの中でも、主に発芽時の栄養源として利用される、種子組織の液胞中に蓄積された貯蔵タンパク質が好ましい。中でも、これら緑豆貯蔵タンパク質の主成分である８Ｓαグロブリンは、本効果を強く示すものであり、対象として最も好ましい。タンパク質の抽出方法や素材中における含量は、特に限定されるものではない。素材としての摂取量を抑える意味では、緑豆よりタンパク質を高純度で抽出することが好ましく、得られたタンパク質中に８Sαグロブリンが高純度で存在することが好ましい。
　８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質の抽出するに当たり、ヤエナリのさやから取り出した緑豆をそのまま使用することができる。
　８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質は、原料である緑豆に対して水を３～10倍量投入し、20～60℃、pH６～９の条件で２～１８時間、静置あるいは撹拌処理により抽出する。さらに原料を磨砕し、さらに沈殿するデンプンを除くことでタンパク質溶液を得ることができる。
　このタンパク質溶液をそのまま殺菌・乾燥することにより、８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質を得ることができる。
　また、高純度の８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質を抽出するため、さらに、得られたタンパク質溶液のｐＨを４～５に調整してタンパク質を等電点沈殿させることが好ましい。この沈殿物を回収して、必要に応じてpHを調整し、殺菌・乾燥することで、高純度の８Ｓαグロブリンを含有する緑豆タンパク質を得ることができる。
（生活習慣病改善剤）
　本発明の生活習慣病改善剤は、緑豆タンパク質を有効成分とすることを特徴とする。
　本発明における生活習慣病として、高血糖、脂質異常症、糖尿病、高血圧症、動脈硬化症、心不全、慢性腎臓病、非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変、骨粗鬆症、肺浮腫病変等が挙げられ、これらの生活習慣病改善剤として、例えば、インスリン抵抗性改善剤、血中中性脂肪低減剤、血糖値改善剤、アディポネクチン分泌促進剤等が挙げられる。
（インスリン抵抗性改善剤、血中中性脂肪低減剤、血糖値改善剤）
本発明のインスリン抵抗性改善剤、血中中性脂肪低減剤および血糖値改善剤は、上記した８Ｓαグロブリンが有効量含有していればよく、その含有量は、後述した摂取量を考慮して適宜設定することができる。
　本発明のインスリン抵抗性改善剤、血中中性脂肪低減剤および血糖値改善剤としては、粉末、顆粒、固形物、半流動物、流動物、液状物の形態で用いることができる。
　医薬として用いる場合、投与方法としては経口投与用医薬が好ましい。具体的には散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。これら経口投与剤は、その形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤等を添加し、常法に従って製造することができる。これら経口投与剤への配合量は、一般に0.1～100重量%、特に５～80重量%が好ましい。また、投与量は、上記８Ｓαグロブリンとして、１日当たり１～１０ｇを、２～数回に分けて投与するのが好ましい。
　食品としては、いわゆる健康食品、機能性食品、特定保健用食品等が挙げられる。かかる食品は、食品の種類に応じて一般に用いられる食品原料を添加し、常法に従って製造することができる。上記８Ｓαグロブリンの食品への配合量は、食品の種類によっても異なるが、一般に０．１～１００％、特に５～８０％が好ましい。
（アディポネクチン分泌促進剤）
　本発明のアディポネクチン分泌促進剤は、上記した８Ｓαグロブリンが有効量含有していればよく、その含有量は、後述した摂取量を考慮して適宜設定することができる。
　本発明のアディポネクチン分泌促進剤としては、粉末、顆粒、固形物、半流動物、流動物、液状物の形態で医薬品または食品等として用いることができる。
　医薬品として用いる場合、投与方法としては経口投与用医薬が好ましい。具体的には散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。これら経口投与剤は、その形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤等を添加し、常法に従って製造することができる。これら経口投与剤への緑豆タンパク質の配合量は、一般に０．１～１００重量％、特に５～８０重量％が好ましい。また、投与量は、上記８Ｓαグロブリンとして、１日当たり１～１０ｇを、２～数回に分けて投与するのが好ましい。
　食品としては、いわゆる健康食品、機能性食品、特定保健用食品等が挙げられる。かかる食品は、食品の種類に応じて一般に用いられる食品原料を添加し、常法に従って製造することができる。緑豆タンパク質の食品への配合量は、食品の種類によっても異なるが、一般に０．１～１００重量％、特に５～８０重量％が好ましい。
　以下に、本発明の有効性を実施例とともに示すが、これら例示によって本発明の技術思想が限定されるものではない。
○製造例１
　緑豆を粉砕機にて粉状に粉砕した。粉砕緑豆粉に対して１０倍量の５０℃の温水を加え、随時pHを7.0に調整しながら１時間撹拌した。遠心分離（3,000 r.p.m., 室温にて10分間）し、得られた上澄液をpH5.0に調整して、再度遠心分離（3,000 r.p.m., 室温にて10分間）して得られた沈殿物を回収、加水後、pH7.0に中和して殺菌し、噴霧乾燥したものを８Ｓαグロブリンとした。このようにして得られた８ＳαグロブリンをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、その後タンパク質を染色し、全染色域の合計に対して、８Ｓαグロブリン由来のタンパク質として分子量48 kDaをメインに、72, 60, 26 kDaのタンパク質のバンドの染色度の測定から、純度として84.9％あり、以下の検討に十分耐えうる純度であることを確認した。
○製造例２
　緑豆の表面を水洗浄後、１０倍量の水に一晩浸漬した。浸漬物を80メッシュの裏漉し器のついた磨砕装置に供し、皮と粗繊維を分離後、通過懸濁液を得る。懸濁液を遠心分離（3,000 r.p.m., 室温にて10分間）し、得られた上澄液をpH5.0に調整して、再度遠心分離（3,000 r.p.m., 室温にて10分間）して得られた沈殿物を回収、加水後、pH7.0に中和して殺菌し、噴霧乾燥したものを８Ｓαグロブリンとした。このようにして得られた８Ｓαグロブリンを上記同様にSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、その後染色されたタンパク質のバンドの染色度の測定から、純度として82.6％あり、以下の検討に十分耐えうる純度であることを確認した。
（インスリン抵抗性改善）
○試験例１
　ラットによるインスリン抵抗性改善効果確認試験を行った。飼料組成としてAIN-93G組成に基づき、その試験飼料として上記製造例１にて得られた８Ｓαグロブリンと比較対照としてカゼイン（ビタミンフリーカゼイン、オリエンタル酵母（株）製）をそれぞれ食餌タンパク質として20重量%含んだものを用いた。具体的配合を下記表１に記す。
（表１）各試験群の飼料組成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　実験動物は、５週齢雄のウィスター系雄ラットを日本クレアより購入し、市販固形飼料「CRF-1」（オリエンタル酵母（株）製）にて５日間の予備飼育後、各試験食群の体重が揃うように１群５匹で２群に分け、試験飼料で４週間飼育した。飼育は個別ケージに１匹ずつ入れ、温度23±１℃、湿度55±５%で12時間明暗サイクル（7:00から19:00まで照明）の下で行った。飼育期間中は水および飼料を自由摂取させた。
　４週間の試験期間内の飼料摂取量と体重の増加量を毎日測定した。下表２に結果を示す。
（表２）飼料摂取量と体重の推移
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　食餌摂取量は８Ｓαグロブリン群が少ないものの、有意差は認められなかったが、試験終了時の体重および体重増加量は、８Ｓαグロブリン群で有意に低値であった。
　試験期間終了後、朝8:00より６時間絶食し、ネンブタール麻酔下で開腹後、ヘパリン処理した注射器で腹部大動脈より採血した。血液から遠心分離（3,000 r.p.m., ５℃にて10分間）にて血漿を分離し、血糖値、インスリンおよび中性脂肪を測定した。得られた血糖値とインスリン値よりインスリン抵抗性指数（HOMA-IR：Homeostasis model assessment-Insulin Resistance）を算出した。その結果を表３に示す。
（表３）血糖値とインスリン値およびインスリン抵抗性指数の比較
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　血糖値には差が認められなかったが、インスリンが有意に低下し、その結果、HOMA-IRも有意に低値であった。さらに血中中性脂肪値も有意に低下していた。
○試験例２
　試験例１同様、ラットによるインスリン抵抗性改善効果確認試験を行った。飼料組成としてAIN-93G組成に基づき、その試験飼料として上記製造例１にて得られた８Ｓαグロブリンと比較対照としてカゼイン（ビタミンフリーカゼイン、オリエンタル酵母（株）製）をそれぞれ食餌タンパク質として20重量%含んだものを用いた。具体的配合を下記表４に記す。
（表４）各試験群の飼料組成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　実験動物は、糖代謝機能の低下した糖尿病モデルである５週齢雄のGKラット（Gotoh-Kakizaki rats）を日本クレアより購入し、市販固形飼料「CRF-1」（オリエンタル酵母（株）製）にて５日間の予備飼育後、各試験食群の体重が揃うように１群５匹で２群に分け、試験飼料で３週間飼育した。飼育は個別ケージに１匹ずつ入れ、温度23±１℃、湿度55±５%で12時間明暗サイクル（7:00から19:00まで照明）の下で行った。飼育期間中は水および飼料を自由摂取させた。
　３週間の試験期間内の飼料の摂取量と体重の増加量を毎日測定した。下表５に結果を示す。群間に有意な差は認められなかった。
（表５）飼料摂取量と体重の推移
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
試験期間終了後、朝8:00より６時間絶食し、ネンブタール麻酔下で開腹後、ヘパリン処理した注射器で腹部大動脈より採血した。血液から遠心分離（3,000 r.p.m., ５℃にて10分間）にて血漿を分離し、血糖値およびインスリンを測定した。得られた血糖値とインスリン値よりインスリン抵抗性指数（HOMA-IR：Homeostasis model assessment-Insulin Resistance）を算出した。各臓器については臓器重量測定後、ドライアイスにて凍結し、-80℃に保管、適宜分析に供した。血液分析の結果を表６に示す。
（表６）血糖値とインスリン値およびインスリン抵抗性指数の比較
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　上記試験にて得られた肝臓について、mRNA発現量の測定は以下のように行った。
　肝臓から一定量のサンプルについて、ISOGEN（日本ジーン（株）製）を用いてRNAを抽出した。RNA量測定後、PrimeScriptTM RT reagent kit（タカラバイオ製）を用いて逆転写を行った。得られたcDNAを用いて相対定量RT-PCRを行った。RT-PCRは、Taqman(R)プライマー（アプライドバイオシステムズ製）およびABI PRISM 7700（アプライドバイオシステムズ製）を用いて行った。増幅サイクルは、95℃/10分のdenaturationを行った後、95℃/30秒→60度/30秒→72度/20秒のサイクルを40サイクル行った。用いたTaqman（R)プライマーは、ターゲットとして、ステロール調節領域結合タンパク質1（sterol regulatory element binding transcription factor 1，Rn01495769）を、housekeeping geneとしてβアクチン（Actb，Rn00667869）を用いた。測定結果を表７に示す。
（表７）肝臓におけるSREBP-1cの遺伝子発現の比較
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　肝臓におけるインスリン抵抗性惹起に関係あるとされる因子であるSREBP-1cが、８Ｓαグロブリン群で、その遺伝子発現が有意に低下しており、インスリン抵抗性が８Ｓαグロブリン群で押えられていることが裏付けられた。
○試験例３
　骨格筋細胞による、糖取り込み試験を行った。８Ｓαグロブリンについては、消化酵素であるペプシン（pH2.0）、トリプシン、キモトリプシン（ともにpH7.0）にてあらかじめ分解した消化８Ｓαグロブリンとして用いた。細胞はラット骨格筋L6細胞を用いた。２×104 cells/mlで96穴マイクロプレートに播種し、100 Units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン含有の10重量%FBSを含むDMEM培地にて前培養を行った。80～100%コンフルエントに達したことを確認して分化誘導を開始した。分化誘導時は100 Units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン含有の２重量%HSを含むDMEM培地を使用した。培地交換は24時間または48時間ごとに行った。なお培養は、すべて37℃、５容量%CO2条件下で行った。分化誘導確認後、糖取り込み量の測定を行った。
　分化したL6細胞を0.2％BSA含有無血清DMEMに作用させ脱感作した。その後、消化８Ｓαグロブリンあるいはコントロールとしてインスリンを37℃にて４時間作用させ、0.1重量%BSA含有KRHで二度洗浄し、1mMの2-Deoxy-D-glucoseを37℃にて20分間作用させた。再度0.1重量%BSA含有KRHで二度洗浄し、0.1N NaOH 50μlを入れて60℃にて10分間インキュベートして細胞を可溶化し、85℃で１時間乾燥させた。その後、0.1N HCl 50μlおよび200mM TEA buffer (pH8.1) 50μlをそれぞれ添加し細胞磨砕液とした。磨砕液のうち10μlを測定用プレートに入れ、測定用カクテル（200mM TEA buffer containing 200mM KCl (pH8.1), 0.4重量% BSA, 10mM NADP, Diaphorase 2units, Lmesenteriodes G6PDH 150units, 2mM Resazurin sodium salt）を100μlずつ添加して、37℃にて60～80分間インキュベートした後、励起波長530nm、測定波長570nmにて蛍光測定した。測定結果を図１に示す。
　骨格筋における血中の糖の取り込みが、インスリン添加同様、８Ｓαグロブリン添加により有意に上昇していた。この結果より、骨格筋において糖の取り込みに関係するGLUT4の形質膜に移動（トランスロケーション）が、８Ｓαグロブリンにより促されていることが裏付けられた。この結果は血糖値の低下を導くものである。
（アディポネクチン分泌促進効果）
○試験例４
　ラットによるアディポネクチン分泌促進効果確認試験を行った。飼料組成としてAIN-93G組成に基づき、その試験飼料として上記製造例１にて得られた８Ｓαグロブリンと比較対照としてカゼイン（ビタミンフリーカゼイン、オリエンタル酵母（株）製）をそれぞれ食餌タンパク質として２０重量％含んだものを用いた。具体的な配合を表８に示した。
（表８）各試験群の飼料組成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　実験動物は、５週齢雄のウィスター系雄ラットを日本クレアより購入し、市販固形飼料「CRF-1」（オリエンタル酵母（株）製）にて５日間の予備飼育後、各試験食群の体重が揃うように１群５匹で２群に分け、試験飼料で４週間飼育した。飼育は個別ケージに１匹ずつ入れ、温度23±１℃、湿度55±５％で12時間明暗サイクル（7:00から19:00まで照明）の下で行った。飼育期間中は水および飼料を自由摂取させた。
　４週間の試験期間内の飼料摂取量と体重の増加量を毎日測定した。表９に結果を示した。
（表９）飼料摂取量と体重の推移（平均値 ± 標準誤差）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　食餌摂取量には有意差は認められなかったが、試験終了時の体重および体重増加量は、８Ｓαグロブリン群で有意に低値であり、内臓脂肪低下によるアディポネクチン分泌促進を裏付けるものであった。
　試験期間終了後、朝8:00より６時間絶食し、ネンブタール麻酔下で開腹後、ヘパリン処理した注射器で腹部大動脈より採血した。各臓器（肝臓、腎臓）については、個々の臓器重量を測定した。血液については、遠心分離（3,000 r.p.m., ５℃にて10分間）にて血漿を分離し、アディポネクチン量を測定した。その結果を表１０に示した。
（表１０）臓器重量およびアディポネクチン量の比較（平均値 ± 標準誤差）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　８Ｓαグロブリン群で肝臓や腎臓の臓器重量が有意な低下を示した。これらの臓器は一般に疾患に伴い肥大化し、重量が増加すると言われている。これらの臓器重量が有意に低かったことから、これらの臓器が疾患状態ではない、あるいは疾患状態であっても、その程度が低いことが示された。また、血中のアディポネクチン量が、８Ｓαグロブリン群で有意に高く、脂肪組織の最適化に伴う脂肪量、体重の減少を裏付けるものであった。
○試験例５
　試験例４同様、ラットによるアディポネクチン分泌促進効果確認試験を行った。飼料組成としてAIN-93G組成に基づき、その試験飼料として上記製造例１にて得られた８Ｓαグロブリンと比較対照としてカゼイン（ビタミンフリーカゼイン、オリエンタル酵母（株）製）をそれぞれ食餌タンパク質として２０重量％含んだものを用いた。さらに生活習慣病を誘発するため、油脂として牛脂を13重量％添加し、油分20重量％の高脂肪食とした。具体的な配合を表１１に示した。
（表１１）各試験群の飼料組成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
　実験動物は、糖代謝機能の低下した糖尿病モデルである５週齢雄のGKラット（Goto-Kakizaki rats）を日本クレアより購入し、市販固形飼料「CRF-1」（オリエンタル酵母（株）製）にて５日間の予備飼育後、各試験食群の体重が揃うように１群５匹で２群に分け、試験飼料で３週間飼育した。飼育は個別ケージに１匹ずつ入れ、温度23±１℃、湿度55±５％で12時間明暗サイクル（7:00から19:00まで照明）の下で行った。飼育期間中は水および飼料を自由摂取させた。
　３週間の試験期間内の飼料の摂取量と体重の増加量を毎日測定した。表１２に結果を示した。群間に有意な差は認められなかった。
（表１２）飼料摂取量と体重の推移（平均値 ± 標準誤差）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　試験期間終了後、朝8:00より６時間絶食し、ネンブタール麻酔下で開腹後、ヘパリン処理した注射器で腹部大動脈より採血した。各臓器については、個々の臓器重量を測定した。血液については、遠心分離（3,000 r.p.m., ５℃にて10分間）にて血漿を分離し、アディポネクチン量を測定した。その結果を表１３に示した。
（表１３）臓器重量およびアディポネクチン量の比較（平均値 ± 標準誤差）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　生活習慣病を促進させる系においても、試験例１同様、肝臓重量が有意な低下を示した。肝臓が疾患状態ではない、あるいは疾患状態であっても、その程度が低いことが示された。血中のアディポネクチン量が、８Ｓαグロブリン群で有意に高く、脂肪組織の最適化を裏付けるものであった。
○試験例６
　脂肪細胞による、アディポネクチン分泌試験を行った。８Ｓαグロブリンについては、消化酵素であるペプシン（pH2.0）、トリプシン、キモトリプシン（ともにpH7.0）にてあらかじめ分解した消化８Ｓαグロブリンとして用いた。細胞はマウス前駆脂肪細胞3T3-L1を用いた。１×104 cells/mlでマイクロプレートに播種し、37℃、５容量%CO2条件下でコンフルエントに達するまで培養した。分化誘導時は10μg/1mlインスリン、0.25μMデキサメタゾンおよび0.5mMIBMX（イソブチルメチルキサンチン）含有のDMEM培地にて48時間培養した。
　分化した3T3-L1細胞に5μg/1mlインスリンのみ添加し、分化誘導後10日間培養した。その後、消化８Ｓαグロブリンを37℃にて９時間作用させ、それから5 ng/ml TNF-αにて刺激し、37℃にて15時間培養した。
　なお、一定量の培養上澄み液中のアディポネクチン量を、大塚製薬製のアディポネクチンELISAキットを用いて測定した。測定結果を図２に示した。
　脂肪細胞をサイトカイン(TNF-α)にて刺激し、アディポネクチンの分泌能への影響を見たところ、８Ｓαグロブリンによりその分泌量の低下が抑えられており、８Ｓαグロブリンが脂肪細胞からのアディポネクチン分泌を促進していることが示された。

Claims (17)

  1. 生活習慣病治療のための緑豆タンパク質の使用。
  2. 請求項１記載の緑豆タンパク質が、緑豆タンパク質に由来する８Ｓαグロブリンである、請求項１記載の生活習慣病治療のための緑豆タンパク質の使用。
  3. 生活習慣病治療が、インスリン抵抗性改善である請求項１または２記載の緑豆タンパク質の使用。
  4. 生活習慣病治療が、アディポネクチン分泌促進である請求項１または２記載の緑豆タンパク質の使用。
  5. 生活習慣病治療が、血中中性脂肪低減である請求項１または２記載の緑豆タンパク質の使用。
  6. 生活習慣病治療が、血糖値改善である請求項１または２記載の緑豆タンパク質の使用。
  7. 緑豆タンパク質中の８Ｓαグロブリンとして、１日当たり１～１０ｇを投与する、請求項１または２記載の緑豆タンパク質の使用。
  8. 緑豆タンパク質中の８Ｓαグロブリンとして、１日当たり１～１０ｇを投与する、請求項３記載の緑豆タンパク質の使用。
  9. 緑豆タンパク質中の８Ｓαグロブリンとして、１日当たり１～１０ｇを投与する、請求項４記載の緑豆タンパク質の使用。
  10. 緑豆タンパク質中の８Ｓαグロブリンとして、１日当たり１～１０ｇを投与する、請求項５記載の緑豆タンパク質の使用。
  11. 緑豆タンパク質中の８Ｓαグロブリンとして、１日当たり１～１０ｇを投与する、請求項６記載の緑豆タンパク質の使用。
  12. 生活習慣病治療のための緑豆タンパク質。
  13. 緑豆タンパク質が、緑豆タンパク質に由来する８Ｓαグロブリンである、請求項１２記載の生活習慣病治療のための緑豆タンパク質。
  14. 生活習慣病治療が、インスリン抵抗性改善である請求項１２または１３記載の緑豆タンパク質。
  15. 生活習慣病治療が、アディポネクチン分泌促進である請求項１２または１３記載の緑豆タンパク質。
  16. 生活習慣病治療が、血中中性脂肪低減である請求項１２または１３記載の緑豆タンパク質。
  17. 生活習慣病治療が、血糖値改善である請求項１２または１３記載の緑豆タンパク質。
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