WO2022158368A1 - Ｇｌｓ１遺伝子阻害用化粧料組成物、ｇｌｓ１遺伝子阻害剤、老化細胞除去用化粧料組成物及び老化細胞除去剤 - Google Patents

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gls1
cells
water
extract
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健吾 鈴木
綾香 中島
光祐 安田
由布子 三輪
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株式会社ユーグレナ
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    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the present invention relates to a GLS1 gene-inhibiting cosmetic composition, a GLS1 gene inhibitor, a senescent cell-removing cosmetic composition, and a senescent cell-removing agent.
  • Patent Document 1 describes a senescent cell-removing agent containing a glutaminase inhibitor as an active ingredient, which is a drug for removing senescent cells in vivo.
  • a glutaminase inhibitor may at least inhibit the activity of KGA (kidney-type glutaminase), and a nucleic acid such as siRNA or miRNA for knocking out the gene (GLS1) encoding KGA. It is also disclosed that it may be used as a glutaminase inhibitor.
  • An object of the present invention is to provide a GLS1 gene-inhibiting cosmetic composition, a GLS1 gene inhibitor, a senescent cell-removing cosmetic composition, and a senescent cell-removing agent.
  • the object is to contain a Euglena-derived substance as an active ingredient, which is used to inhibit the expression of the GLS1 gene in the skin, and wherein the Euglena-derived substance is an aqueous solvent extract of Euglena or an algae cell belonging to the genus Euglena as a protein enzyme.
  • a cosmetic composition for inhibiting the GLS1 gene which is a water-soluble component that is decomposed and extracted and is applied transdermally.
  • the object is to contain a Euglena-derived substance as an active ingredient, which is used to inhibit the expression of the GLS1 gene in the skin, and wherein the Euglena-derived substance is an aqueous solvent extract of Euglena or an algae cell belonging to the genus Euglena as a protein enzyme. It is resolved by inhibiting the GLS1 gene, which is characterized by being a water-soluble component that is decomposed and extracted, and is applied percutaneously.
  • the above-mentioned subject contains an Euglena-derived substance as an active ingredient, is used to remove aging cells of the skin, and the Euglena-derived substance is an aqueous solvent extract of Euglena or algae cells belonging to the genus Euglena that are proteolytically degraded.
  • the problem is solved by a cosmetic composition for removing senescent cells, which is a water-soluble component that is extracted through the skin and is applied transdermally.
  • the above-mentioned subject contains an Euglena-derived substance as an active ingredient, is used to remove aging cells of the skin, and the Euglena-derived substance is an aqueous solvent extract of Euglena or algae cells belonging to the genus Euglena that are proteolytically degraded. It is a water-soluble component that is extracted through the skin, and is solved by a senescent cell removing agent that is characterized by being applied transdermally.
  • the Euglena-derived substance is preferably an Euglena extract.
  • the Euglena-derived substance is preferably an aqueous solvent extract of Euglena or a water-soluble component extracted by proteolytic decomposition of algal cells belonging to the genus Euglena.
  • the present invention it is possible to provide a GLS1 gene-inhibiting cosmetic composition and a GLS1 gene inhibitor capable of inhibiting the expression of the GLS1 gene. Further, according to the present invention, it is possible to provide a senescent cell-removing cosmetic composition and a senescent cell-removing agent capable of removing senescent cells.
  • 1 is a graph showing the results of examining the effects of Euglena-derived substances on the GSL1 gene in human epidermal keratinocytes. 1 is a graph showing the results of examining the removal of senescent cells by Euglena-derived substances.
  • FIG. 1 includes a GLS1 gene-inhibiting cosmetic composition, a GLS1 gene-inhibiting food composition, a GLS1 gene inhibitor, a senescent cell-removing cosmetic composition, and a senescent cell-removing food containing an Euglena-derived substance as an active ingredient. It relates to a composition and a senescent cell removing agent.
  • “cell senescence” means changes in cells that progress toward this division limit.
  • “senescent cells” refer to cells whose cell proliferation or cell cycle has irreversibly stopped. Whether or not a cell is a senescent cell can be determined based on the characteristics of cellular senescence. Specifically, senescent cells show increased expression levels of senescent markers compared to normal cells. Senescence markers include, but are not limited to, senescence-associated acid ⁇ -galactosidase, P53, P16INK4a, P21CIP1, and the like.
  • the GLS1 gene inhibitor according to this embodiment contains an Euglena-derived substance as an active ingredient and is used to inhibit the expression of the GLS1 gene. “Inhibiting the expression of the GLS1 gene” includes not only expression at the transcription level (expression as mRNA) but also expression at the translation level (expression as protein).
  • the “GLS1 gene” is a gene related to glutamine metabolism, and is known to be a gene necessary for the survival of senescent cells.
  • GLS1 glutaminase 1
  • GLS1 is a type of amidohydrolase enzyme that produces glutamic acid and ammonia from glutamine. Due to abnormalities in intracellular organelles, the inside of senescent cells tends to be acidic, and GLS1 works excessively to neutralize them to maintain the cells.
  • Glutaminolysis is composed of several reaction steps, among which senescent cell-specific cell death is efficiently induced by inhibiting the reaction step that produces glutamic acid from glutamine.
  • the senescent cell removing agent contains an Euglena-derived substance as an active ingredient, and is used to remove senescent cells in vivo.
  • senescent cell removal means removing senescent cells from a tissue or organ or the like, or killing senescent cells. to selectively remove senescent cells from a cell population containing senescent cells.
  • senescent cells In various organs and tissues, the number of senescent cells increases with aging. Accumulation of senescent cells in aged tissue can lead to a variety of dysfunctions, diseases, and diminished regenerative capacity. Cells are induced to become senescent cells by being stressed. Senescent tissue, with an accumulation of senescent cells, is incapable of responding to the stresses that require proliferation, resulting in reduced health.
  • the Euglena-derived substance which is the active ingredient of the senolytic agent according to the present embodiment, has the effect of inhibiting the expression of the GLS1 gene, so it is possible to selectively kill senescent cells. Therefore, according to the agent for removing senescent cells according to the present embodiment, it is possible to suppress the accumulation of senescent cells and to suppress the deterioration of health.
  • Senescent cells to be targeted are not particularly limited, but eukaryotic cells are exemplified.
  • Examples of senescent cells include skin-related cells such as keratinocytes (keratinocytes), epithelial cells, fibroblasts, and dermal papilla cells. It may be a cell.
  • the term "euglena” includes taxonomically classified microorganisms classified into the genus Euglena, variants thereof, variants thereof, and closely related species of the family Euglenaceae.
  • the genus Euglena is a group of eukaryotic organisms belonging to Excoverta, Euglenozoa, Euglenomycetes, Euglenoides, and Euglenaceae.
  • Euglena chadefaudii Euglena deses, Euglena gracilis, Euglena granulata, Euglena mutabilis, Euglena proxima, Euglena spirogyra, and Euglena viridis.
  • Euglena gracilis Euglena gracilis
  • Euglena gracilis Euglena gracilis
  • Euglena gracilis Z strain can be used, but in addition, Euglena gracilis (E. gracilis) Z strain mutant strain SM-ZK strain (chloroplast-deficient strain), variants of E. gracilis var.
  • the genus Euglena is widely distributed in freshwater such as ponds and marshes, and it may be used by separating it from these, or any already isolated Euglena genus may be used.
  • the genus Euglena includes all its variants. These mutant strains also include those obtained by genetic methods such as recombination, transduction, and transformation.
  • Euglenoid algae can be used as Euglena.
  • Euglenoid cells separated by centrifugation, filtration, sedimentation, or the like can be used as they are as Euglenoid alga bodies.
  • Euglena living cells can be used as they are after being harvested from the culture vessel, but they are preferably washed with water or physiological saline.
  • the Euglenoid alga body may be used in the form of a dispersion in a liquid such as water.
  • a mechanically processed product of algal bodies obtained by subjecting living Euglena cells to ultrasonic irradiation treatment or mechanical treatment such as homogenization may be used as Euglena algal bodies.
  • a dried mechanically processed product obtained by subjecting a mechanically processed product to a drying treatment may be used as the Euglenoid algal body.
  • Euglena extract In the present embodiment, it is possible to use an Euglena extract (Euglena extract) as Euglena, and it is particularly preferable to use an Euglena aqueous solvent extract.
  • Euglena aqueous solvent extract means an extract extracted from Euglena using an aqueous solvent. It is preferable to use a water extract, a hot water extract, an alcohol extract, or a glycol extract of Euglena extracted for several seconds to several tens of hours at °C.
  • the water used for extraction does not necessarily have to be distilled, pure, or ultrapure water, and may, for example, be tap water or contain impurities, but may contain ingredients that interfere with the extraction of the active ingredient. no water is preferred.
  • water extract means an extract with water at 0 to 50°C (excluding 0°C).
  • water means water at 0 to 50°C (excluding 0°C).
  • the temperature of the water is not particularly limited as long as the active ingredient can be sufficiently extracted without affecting the active ingredient. Especially preferred is 10 to 30°C.
  • the "hot water extract” means an extract with water at a temperature higher than 50°C, and can also be called a “hot water extract”.
  • hot water means water having a temperature higher than 50° C., and is a concept that includes “hot water”, including water in a boiling state. Moreover, it is not limited to hot water in a liquid state, but also includes hot water in a gaseous state and a supercritical state.
  • the temperature of the hot water is not particularly limited as long as the active ingredient can be extracted sufficiently without affecting the active ingredient. °C and 100°C or less.
  • the pH of the water used for extraction is not particularly limited as long as the active ingredient can be sufficiently extracted without affecting the active ingredient, preferably pH 4 to 10, more preferably pH 5 to 9. , particularly preferably pH 6-8.
  • aqueous solvent one or more solvents that can sufficiently extract the active ingredient without affecting the active ingredient and that can be used for extraction are usually selected.
  • examples include, but are not limited to, water, alcohols, glycols, and the like.
  • Alcohols include ethanol, methanol, n-propanol, isopropanol and the like.
  • Glycols include 1,3-butylene glycol (BG) and propylene glycol.
  • Other aqueous solvents include acetone and the like. These solvents may be used alone or as an aqueous solution, or may be used as a mixed solvent of any two or three or more.
  • the temperature of the aqueous solvent used for extraction is, for example, 0°C or higher, and is not particularly limited as long as it does not affect the active ingredients.
  • Aqueous solvents in a boiling or supercritical state can also be used, but it is preferred to use aqueous solvents at 5°C to 600°C, more preferably 10°C to 200°C. Therefore, the aqueous solvent for extraction includes an aqueous solvent in a boiling state or a supercritical state.
  • the amount of the aqueous solvent used for extraction is preferably an amount that can sufficiently dissolve the water-soluble active ingredient contained in Euglena.
  • the extraction method is also not particularly limited.
  • extraction can be performed by the method shown below, but it is not limited to this, and a normal extraction method can be freely selected and used.
  • a dry powder of Euglena algae is immersed in an aqueous solvent for a predetermined time and then centrifuged or filtered, or a dry powder of Euglena algae is added to an aqueous solvent and shaken to uniformly disperse, followed by centrifugation or filtration. method, etc.
  • Euglena can be extracted with water by the usual method shown below, but it is not limited to this.
  • the Euglena tissue and water are placed in a container and allowed to stand for a predetermined period of time with appropriate stirring or shaking, and the obtained extract can be used as a water extract as it is.
  • the supernatant obtained by centrifuging such an extract can also be used as an aqueous extract.
  • such an extract or supernatant can be concentrated and dried to remove water and used as an aqueous extract.
  • the water extraction may be carried out by adding a small amount of alcohol, preferably ethanol, to water in an amount of, for example, 10% by mass or less, in order to increase the extraction efficiency and shorten the extraction time.
  • the extraction time for water extraction is not particularly limited as long as the active ingredient is extracted, and can be appropriately set in the range of several seconds to several tens of hours depending on the extraction temperature.
  • the extraction with hot water can be performed by a commonly used method as shown below, but it is not limited to this.
  • Euglena is introduced into a commonly used extractor together with water, it is extracted by heating.
  • the pressure during extraction can be set to 1 to 5000 atmospheres, preferably 60 to 400 atmospheres.
  • the extraction time is short, for example, preferably within 3 minutes, more preferably within 1 minute, and particularly preferably within 30 seconds.
  • the extracted Euglena extract can be used as it is as an active ingredient of the GLS1 gene inhibitor and the senescent cell-removing agent according to the present embodiment. Filtration, silica gel chromatography, reverse-phase or normal-phase high-performance liquid chromatography, etc.) can be used to fractionate and use highly active fractions. Alternatively, the Euglena extract or a fraction thereof can be concentrated and dried to remove the aqueous solvent, and this can be used as an aqueous solvent extract.
  • an extract extracted using BG may be used as the Euglena extract.
  • the Euglena extract may be in the form of a complex with other cosmetic raw materials, such as permeation type collagen, permeation type elastin, permeation type hyaluronic acid, and hexapeptide-33 in a multi-layered capsule.
  • Euglena extract a water-soluble component extracted by enzymatically decomposing algal cells belonging to the genus Euglena, specifically, a hydrolyzed Euglena extract obtained by enzymatically hydrolyzing and extracting Euglena powder (Euglena algae body) is used.
  • can be Hydrolyzed Euglena extract can be prepared according to the method described in JP-A-2010-90065.
  • Purified water is preferably added in an amount (weight) 100 times the amount (weight) of the dried Euglena, and pressure and heat treatment is performed. After that, a proteolytic enzyme is added to treat the algal body. After completion of the treatment, it is deactivated, for example, at 90° C., and the residue and water-soluble components are separated by centrifugation or filtration.
  • the pressure and heat treatment conditions are preferably 100 to 150 ° C. using an autoclave, atmospheric pressure to 0.255 MPa, and heat and pressure treatment for 1 minute to 30 minutes. It is preferable to heat and pressurize at 0.14 MPa and 121° C. for 10 minutes.
  • the proteolytic enzyme for example, pepsin, pancreatin, papain, and other commonly used enzymes having protease activity may be used alone or in combination. It is preferable to employ an endo-type peptidase to decompose into .
  • Pantidase MP and Alloase AP-10 manufactured by Yakult Pharmaceutical Co., Ltd. can also be used.
  • the concentration of the enzyme added, the pH and reaction temperature of the reaction solution, and other conditions may be selected optimally for each enzymatic agent.
  • the water-soluble component obtained in this way can be used as it is, but it can also be used after undergoing purification operations such as fractionation, deodorization, decolorization, and concentration within the range that does not lose the effect of the present invention.
  • Polystyrene resin is a porous macromolecule ( ⁇ -1,3-glucan) in which about 700 glucoses are polymerized by ⁇ -1,3-bonds, and is a storage polysaccharide contained in the genus Euglena. is. Paramylon particles are flattened spheroidal particles and are formed by helically intertwined ⁇ -1,3-glucan chains.
  • Paramylon exists as granules in the Euglena cells of all species and varieties, and the number, shape, and uniformity of the particles are characteristic for each species.
  • Paramylon is composed only of glucose, and the average degree of polymerization of paramylon obtained from E. gracilis Z wild strain and chloroplast-deficient strain SM-ZK is about 700 glucose units.
  • Paramylon is insoluble in water and hot water, but soluble in dilute alkali, strong acid, dimethyl sulfoxide, formaldehyde and formic acid.
  • the average density of paramylon is 1.53 for E. gracilis Z and 1.63 for E. gracilis var. bacillaris SM-L1.
  • paramylon has a gentle helical structure in which three straight-chain ⁇ -1,3-glucans are twisted like a right-handed rope. Several of these glucan molecules aggregate to form paramylon granules. Paramylon granules have a very large crystal structure portion, accounting for about 90%, and are compounds with the highest crystal structure rate among polysaccharides (Euglena, Physiology and Biochemistry, edited by Shozaburo Kitaoka, Gakkai Shuppan Center). The particle size distribution of paramylon (manufactured by Euglena Co., Ltd.) has a median diameter of 1.5 to 2.5 ⁇ m when measured with a laser diffraction/scattering particle size distribution analyzer.
  • Paramylon particles are isolated from cultured Euglena cells by any appropriate method and purified into fine particles, and are usually provided as powder.
  • paramylon particles can be (1) cultured Euglena cells in any appropriate medium, (2) separation of Euglena cells from the medium, (3) isolation of paramylon from the separated Euglena cells, ( 4) purification of the isolated paramylon, and optionally (5) cooling and subsequent lyophilization. Isolation of paramylon is performed, for example, using non-ionic or anionic detergents of the type that are largely biodegradable. Purification of paramylon occurs substantially simultaneously with isolation.
  • Processed products of paramylon include water-soluble paramylon obtained by chemically or physically treating paramylon by various known methods, sulfated paramylon, and paramylon derivatives.
  • Examples of processed products of paramylon include amorphous paramylon and emulsion paramylon.
  • Amorphous paramylon is a substance obtained by amorphizing crystalline paramylon derived from Euglena.
  • Amorphous paramylon has a relative crystallinity of 1 to 20% with respect to crystalline paramylon produced from Euglena by a known method. However, this relative crystallinity is obtained by the method described in JP-A-2011-184592.
  • amorphous paramylon and paramylon were respectively pulverized with a pulverizer (ball mill MM400 manufactured by Retsh) for 5 minutes at a frequency of 20 times/second, and then analyzed using an X-ray diffractometer (H'PertPRO manufactured by Spectris).
  • a pulverizer ball mill MM400 manufactured by Retsh
  • H'PertPRO X-ray diffractometer
  • Amorphous paramylon is prepared according to the method described in JP-A-2011-184592 by treating crystalline paramylon powder with an alkali, then neutralizing it with an acid, then washing, removing moisture, and drying.
  • Processed products of paramylon also include water-soluble paramylon obtained by chemically or physically treating paramylon by various known methods, sulfated paramylon, and paramylon derivatives.
  • Embodision paramylon is a substance that is also called emulsion paramylon because its processing method and physical properties are similar to emulsions, and is obtained by adding water to paramylon according to the method described in JP-A-2016-199650. It is processed paramylon that is swollen by bonding with water four times or more, obtained by performing a collision treatment in which the fluid is ejected from a fine nozzle at an ultrahigh pressure to collide with an object to be collided.
  • Emulsion paramylon is a known physical property modification device that ejects a slurry obtained by adding a water-soluble solvent to a solid such as powder at an ultrahigh pressure from a fine-pore nozzle to collide with an object to be collided (for example, JP-A-2011-88108 It can be obtained by performing collision treatment one or more times at a nozzle pressure of 245 MPa at the time of jetting using a device described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-47264.
  • Emulsion paramylon has a median diameter of 5 times or more that of paramylon and 7 ⁇ m or more when the particle size is measured with a laser diffraction/scattering particle size distribution analyzer, and the particles are separated from adjacent particles by an optical electron microscope. Adhesion was observed, and it swelled by binding with water four times or more that of paramylon.
  • Slurry which is a mixture of raw material paramylon and water, is a free-flowing fluid. It has excellent stickiness and elasticity, and has a paste-like feel.
  • the processed paramylon obtained is called emulsion paramylon in this specification because of its processing method and physical properties, but it is unknown whether or not it is emulsified. is.
  • the GLS1 gene inhibitor and the senescent cell removing agent according to the present embodiment are configured as cosmetic compositions, food compositions such as health foods, and pharmaceutical compositions, and are used and ingested preventively to remove senescent cells. • Administered. Euglena-derived substances such as Euglena, Euglena extracts, and paramylon can be ingested as food and have no side effects, so they can be used, ingested, and administered continuously.
  • the GLS1 gene inhibitor and senolytic agent according to the present embodiment can be suitably used in cosmetic compositions by utilizing the GLS1 gene inhibitory action and senolytic action.
  • the cosmetic composition can be applied to any form of cosmetics.
  • skin care cosmetics such as cleansing agents, facial cleansers, lotions, lotions, milky lotions, creams, serums, packs, and scrubs, and makeup such as foundations, concealers, makeup bases, lipsticks, blushers, eye shadows, and eyeliners. It can be applied to cosmetics, sunscreen cosmetics, and the like.
  • one or more components that can be used in ordinary cosmetic compositions are freely added. It is possible to select and blend.
  • the contents of the GLS1 gene inhibitor and the senescent cell removing agent are not particularly limited, and can be freely set according to the purpose.
  • the GLS1 gene inhibitor and senolytic agent of the present embodiment contain an effective amount of Euglena-derived substances that can effectively exhibit the GLS1 gene inhibitory action and the senescent cell removing action as a food material, and are blended in various foods. By doing so, it is possible to provide a food composition having the action. That is, the present invention can provide a food composition for foods labeled for removing senescent cells in the field of foods. Examples of the food composition include general foods, foods for specified health uses, foods with nutrient function claims, foods with function claims, foods for hospital patients, supplements, and the like. It can also be used as a food additive.
  • Examples of the food composition include seasonings, processed meat products, processed agricultural products, beverages (lactic acid beverages, soft drinks, alcoholic beverages, carbonated beverages, milk beverages, fruit juice beverages, tea, coffee, nutritional drinks, etc.), powders Beverages (powder juice, powder soup, etc.), concentrated drinks, confectionery (candies, cookies, biscuits, gums, gummies, chewables, tablets, chocolate, etc.), bread, cereals and the like.
  • beverages lactic acid beverages, soft drinks, alcoholic beverages, carbonated beverages, milk beverages, fruit juice beverages, tea, coffee, nutritional drinks, etc.
  • powders Beverages powder juice, powder soup, etc.
  • concentrated drinks confectionery (candies, cookies, biscuits, gums, gummies, chewables, tablets, chocolate, etc.), bread, cereals and the like.
  • the shape may be capsule, troche, syrup, granule, powder, or the like.
  • Foods for Specified Health Uses are foods that contain functional health ingredients that affect physiological functions, etc., and can be labeled as suitable for specific health uses with the permission of the Director-General of the Consumer Affairs Agency. be. In the present invention, it is a food that is marketed with a label indicating a specific health use related to removal of senescent cells.
  • a food with nutrient function claims is a food that is used to supplement nutritional ingredients (vitamins, minerals), and that displays the functions of the nutritional ingredients.
  • nutritional ingredients vitamins, minerals
  • the amount of nutrients contained in the recommended daily intake must be within the specified upper and lower limits. also need to
  • Foods with functional claims are foods labeled with functionalities based on scientific evidence under the responsibility of the business operator. Information on the grounds for safety and functionality was submitted to the Commissioner of the Consumer Affairs Agency before sales.
  • the food composition according to the present embodiment in addition to the Euglena-derived substance, it is possible to freely select and add one or more components that can be used in normal food compositions.
  • all additives that can be commonly used in the food field such as various seasonings, preservatives, emulsifiers, stabilizers, fragrances, coloring agents, preservatives, and pH adjusters, can be included.
  • the GLS1 gene inhibitor and senolytic agent of the present embodiment are used together with an amount of Euglena-derived substances that can effectively exhibit the GLS1 gene inhibitory action and senolytic action, together with a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • a pharmaceutical composition having the action is provided.
  • the pharmaceutical composition may be a drug or a quasi-drug.
  • the pharmaceutical composition may be applied internally or externally. Therefore, the pharmaceutical composition is used in the form of an oral preparation, an injection such as an intravenous injection, a subcutaneous injection, an intradermal injection, an intramuscular injection and/or an intraperitoneal injection, a transmucosal application, a transdermal application, and the like. be able to.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition can be appropriately set depending on the application form. Semi-solid formulations such as ointments or gels are included.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment can contain one or more pharmaceutically acceptable additives by freely selecting them.
  • pharmaceutically acceptable additives for example, excipients, binders, disintegrants, surfactants, preservatives, coloring agents, flavoring agents, fragrances, stabilizers, preservatives All additives that can be commonly used in the field of pharmaceutical formulations, such as agents, antioxidants, etc., can be contained.
  • a drug delivery system can be used to prepare a sustained-release preparation or the like.
  • Example 1 Hydrolyzed Euglena extract>
  • a hydrolyzed Euglena extract which is a water-soluble component extracted by proteolytic decomposition of Euglena gracilis cells.
  • the hydrolyzed Euglena extract is obtained by adding 100 times the amount of purified water to 1 g of Euglena gracilis powder (Euglena algae body, manufactured by Euglena Co., Ltd.), heating to a pressure of 0.1 MPa and a temperature of 12 ° C., and heating for 10 minutes. pressure treated.
  • Euglena extract was used as the Euglena-derived substance.
  • the Euglena extract was prepared using Euglena gracilis powder (Euglena algae, manufactured by Euglena Co., Ltd.) as a raw material and 1,3-butylene glycol (BG) as a solvent.
  • Euglena gracilis powder Euglena algae, manufactured by Euglena Co., Ltd.
  • BG 1,3-butylene glycol
  • Euglena powder Euglena gracilis, Lot. EU-16189, manufactured by Euglena Co., Ltd.
  • 1 ml of BG was added and shaken to uniformly disperse, followed by extraction at room temperature (25°C) for 10 minutes.
  • the supernatant obtained by centrifugation (3000 rpm, 3 minutes, 25° C.) was fractionated and filtered through a 0.45 ⁇ m sterile filter to prepare an Euglena extract.
  • Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an internal standard for real-time PCR.
  • FIG. 1 shows the results of examining the effects of Euglena-derived substances on the GSL1 gene in human epidermal keratinocytes.
  • the hydrolyzed Euglena extract Example 1
  • the expression level of the GLS1 gene was low.
  • the Euglena extract Example 2
  • the expression level of the GLS1 gene was significantly reduced.
  • Euglena-derived substances inhibit the expression of the GLS1 gene in human epidermal keratinocytes.
  • the use of the Euglena-derived substance as an active ingredient can inhibit the expression of the GLS1 gene and eliminate senescent cells in vivo.
  • Test 3 evaluated the effects of the Euglena extract (Example 2) on normal and senescent cells.

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Abstract

ＧＬＳ１遺伝子阻害用化粧料組成物、ＧＬＳ１遺伝子阻害剤、老化細胞除去用化粧料組成物及び老化細胞除去剤を提供する。　ユーグレナ由来物質を有効成分として含有し、皮膚におけるＧＬＳ１遺伝子の発現を阻害するために用いられ、前記ユーグレナ由来物質が、ユーグレナ水性溶媒抽出物又はユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分であり、経皮的に適用されることを特徴とするＧＬＳ１遺伝子阻害用化粧料組成物及びＧＬＳ１遺伝子阻害剤により解決される。　また、ユーグレナ由来物質を有効成分として含有し、皮膚の老化細胞を除去するために用いられ、前記ユーグレナ由来物質が、ユーグレナ水性溶媒抽出物又はユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分であり、経皮的に適用されることを特徴とする老化細胞除去用化粧料組成物及び老化細胞除去剤により解決される。

Description

ＧＬＳ１遺伝子阻害用化粧料組成物、ＧＬＳ１遺伝子阻害剤、老化細胞除去用化粧料組成物及び老化細胞除去剤
　本発明は、ＧＬＳ１遺伝子阻害用化粧料組成物、ＧＬＳ１遺伝子阻害剤、老化細胞除去用化粧料組成物及び老化細胞除去剤に関する。
　超高齢化社会におけるＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｆｅ）向上の観点から、健康寿命の延長やアンチエイジングに関する技術が注目を集めている。健康寿命の延長を目的として、細胞老化及び老化制御機構についての研究が盛んになされている。
　特許文献１には、生体内の老化細胞を除去するための薬剤であって、グルタミナーゼ阻害剤を有効成分として含有する老化細胞除去剤が記載されている。特許文献１には、グルタミナーゼ阻害剤として、少なくともＫＧＡ（ｋｉｄｎｅｙ－ｔｙｐｅ　ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）の活性を阻害するものであればよく、ＫＧＡをコードする遺伝子（ＧＬＳ１）をノックアウトするためのｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡなどの核酸をグルタミナーゼ阻害剤として使用してもよいことも開示されている。
国際公開第２０２０／０９５９７１号
　上述の背景技術があり、老化細胞を除去する技術が求められている。本発明の目的は、ＧＬＳ１遺伝子阻害用化粧料組成物、ＧＬＳ１遺伝子阻害剤、老化細胞除去用化粧料組成物及び老化細胞除去剤を提供することにある。
　前記課題は、ユーグレナ由来物質を有効成分として含有し、皮膚におけるＧＬＳ１遺伝子の発現を阻害するために用いられ、前記ユーグレナ由来物質が、ユーグレナ水性溶媒抽出物又はユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分であり、経皮的に適用されることを特徴とするＧＬＳ１遺伝子阻害用化粧料組成物により解決される。
　前記課題は、ユーグレナ由来物質を有効成分として含有し、皮膚におけるＧＬＳ１遺伝子の発現を阻害するために用いられ、前記ユーグレナ由来物質が、ユーグレナ水性溶媒抽出物又はユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分であり、経皮的に適用されることを特徴とするＧＬＳ１遺伝子阻害により解決される。
　前記課題は、ユーグレナ由来物質を有効成分として含有し、皮膚の老化細胞を除去するために用いられ、前記ユーグレナ由来物質が、ユーグレナ水性溶媒抽出物又はユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分であり、経皮的に適用されることを特徴とする老化細胞除去用化粧料組成物により解決される。
　前記課題は、ユーグレナ由来物質を有効成分として含有し、皮膚の老化細胞を除去するために用いられ、前記ユーグレナ由来物質が、ユーグレナ水性溶媒抽出物又はユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分であり、経皮的に適用されることを特徴とする老化細胞除去剤により解決される。
　このとき、前記ユーグレナ由来物質が、ユーグレナ抽出物であるとよい。
　このとき、前記ユーグレナ由来物質が、ユーグレナ水性溶媒抽出物又はユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分であるとよい。
　本発明によれば、ＧＬＳ１遺伝子の発現を阻害することが可能なＧＬＳ１遺伝子阻害用化粧料組成物及びＧＬＳ１遺伝子阻害剤を提供できる。また、本発明によれば、老化細胞を除去することが可能な老化細胞除去用化粧料組成物及び老化細胞除去剤を提供できる。
ヒト表皮角化細胞において、ユーグレナ由来物質によるＧＳＬ１遺伝子に対する影響を検討した結果を示すグラフである。 ユーグレナ由来物質による老化細胞除去を検討した結果を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について、図１及び図２を参照しながら説明する。本実施形態は、ユーグレナ由来物質を有効成分として含有するＧＬＳ１遺伝子阻害用化粧料組成物、ＧＬＳ１遺伝子阻害用食品組成物、ＧＬＳ１遺伝子阻害剤、老化細胞除去用化粧料組成物、老化細胞除去用食品組成物及び老化細胞除去剤に関するものである。
＜細胞老化と老化細胞＞
　ヒトの正常な体細胞には分裂可能回数に限界がある。本施形態において、「細胞老化」とは、この分裂限界に向かって進行する細胞の変化を意味する。また、「老化細胞」とは、細胞増殖または細胞周期が不可逆的に停止した細胞を意味する。細胞が老化細胞であるか否かは、細胞老化の特徴を基準として判断すればよい。具体的には、老化細胞では、正常な細胞と比べて老化マーカーの発現量の上昇を示す。老化マーカーとしては、老化関連酸性β－ガラクトシダーゼ、Ｐ５３、Ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｐ２１ＣＩＰ１などが例示されるが特に限定されるものではない。
＜ＧＬＳ１遺伝子阻害剤＞
　本実施形態に係るＧＬＳ１遺伝子阻害剤は、ユーグレナ由来物質を有効成分として含有し、ＧＬＳ１遺伝子の発現を阻害するために用いられるものである。「ＧＬＳ１遺伝子の発現を阻害する」とは、転写レベルでの発現（ｍＲＮＡとしての発現）のみならず、翻訳レベルでの発現（タンパク質としての発現）も含まれる。
（ＧＬＳ１遺伝子）
　「ＧＬＳ１遺伝子」は、グルタミン代謝に関する遺伝子であるが、老化細胞の生存に必要な遺伝子であることが知られている。ＧＬＳ１（グルタミナーゼ１）は、アミドヒドラーゼ酵素の一種で、グルタミンからグルタミン酸、およびアンモニアを産生する。細胞内小器官の異常に起因して、老化細胞内は酸性に傾いており、ＧＬＳ１が過剰に働いて中和することで、細胞を維持している。
　老化細胞では、ＧＬＳ１アイソフォームの１つであるＫＧＡの発現が顕著に増加しており、ヒトの皮膚でもＫＧＡの発現と年齢に正の相関がある。正常細胞および老化細胞におけるＧＬＳ１阻害の影響の検討結果から、ＧＬＳ１を阻害することで、老化細胞を選択的に死滅させることが報告されている（特許文献１）。
　具体的には、老化細胞のグルタミノリシス（グルタミン代謝）を阻害すると、老化細胞に選択的な細胞死が誘導される。グルタミノリシスは、いくつかの反応段階によって構成されるが、なかでも、グルタミンからグルタミン酸を生成する反応段階を阻害することで老化細胞特異的な細胞死が効率的に誘導される。
＜老化細胞除去剤＞
　本実施形態に係る老化細胞除去剤は、ユーグレナ由来物質を有効成分として含有し、生体内の老化細胞を除去するために用いられるものである。ここで、「老化細胞除去」とは、老化細胞を組織又は器官などから取り除くことを意味するか、又は老化細胞を死滅させることを意味し、例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて老化細胞に細胞死を誘導し、老化細胞を含む細胞集団から、老化細胞を選択的に除去することを意味する。
　様々な器官や組織において、加齢と共に老化細胞の数は増加する。老化した組織において老化細胞が蓄積すると、様々な機能障害や疾患、再生能力の減少につながり得る。細胞は、ストレスを受けることで老化細胞に誘導される。老化細胞が蓄積した老化組織は、増殖が必要とされるストレスに応答する能力が無いことから、健康性の低減が生じてしまう。
　本実施形態に係る老化細胞除去剤の有効成分であるユーグレナ由来物質は、ＧＬＳ１遺伝子の発現を阻害する作用を有していることから、老化細胞を選択的に死滅させることが可能である。したがって、本実施形態に係る老化細胞除去剤によれば、老化細胞が蓄積することを抑制し、健康性が低減してしまうことを抑制できる。
（対象となる老化細胞について）
　対象となる老化細胞は、特に限定されるものではないが、真核細胞が例示される。老化細胞の例としては、例えば、ケラチノサイト（角化細胞）、上皮細胞、線維芽細胞、毛乳頭細胞などの皮膚に関連する細胞が例示されるが、除去可能な老化細胞であれば、その他の細胞であってもよい。
＜ユーグレナ＞
　本実施形態において、「ユーグレナ」とは、分類学上、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）に分類される微生物、その変種、その変異種及びユーグレナ科（Ｅｕｇｌｅｎａｃｅａｅ）の近縁種を含む。ここで、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）とは、真核生物のうち、エクスカバータ、ユーグレノゾア門、ユーグレナ藻綱、ユーグレナ目、ユーグレナ科に属する生物の一群である。
　ユーグレナ属に含まれる種として、具体的には、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena mutabilis、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridisなどが挙げられる。ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis），特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株を用いることができるが、そのほか、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ－ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のE. gracilis var. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株、Astasia longa等のその他のユーグレナ類であってもよい。
　ユーグレナ属は、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離して使用しても良く、また、既に単離されている任意のユーグレナ属を使用してもよい。ユーグレナ属は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え、形質導入、形質転換等により得られたものも含有される。
（ユーグレナ藻体）
　本実施形態では、ユーグレナとしてユーグレナ藻体を用いることが可能である。ユーグレナ藻体として、遠心分離，濾過又は沈降等によって分離したユーグレナ生細胞をそのまま用いることができる。ユーグレナ生細胞は、培養槽から収穫後そのままの状態で使用することもできるが、水若しくは生理食塩水で洗浄するのが好ましい。また、ユーグレナ藻体が水などの液体に分散した分散液の状態で用いてもよい。本実施形態において、ユーグレナ生細胞を凍結乾燥処理やスプレー乾燥処理して得たユーグレナの乾燥藻体（ユーグレナ粉末）をユーグレナ藻体として用いると好適である。
　更に、ユーグレナ生細胞を超音波照射処理や、ホモゲナイズ等の機械処理を行うことにより得た藻体の機械的処理物をユーグレナ藻体として用いてもよい。また、機械的処理物に乾燥処理を施した機械的処理物乾燥物をユーグレナ藻体として用いてもよい。
（ユーグレナ抽出物）
　本実施形態では、ユーグレナとしてユーグレナ抽出物（ユーグレナエキス）を用いることも可能であり、特にユーグレナ水性溶媒抽出物を用いると好適である。本実施形態において、「ユーグレナ水性溶媒抽出物」とは、水性溶媒を用いてユーグレナから抽出される抽出物を意味し、特に、水性溶媒として水やアルコール類、グリコール類を用い、５℃～６００℃で、数秒～数十時間抽出したユーグレナの水抽出物、熱水抽出物、アルコール抽出物、グリコール抽出物を用いることが好ましい。抽出に使用する水は、必ずしも蒸留水や、純水、又は超純水である必要はなく、例えば、水道水や不純物を含むものであってもよいが、活性成分の抽出を妨げる成分を含まない水が好ましい。
　本実施形態において、「水抽出物」とは、０～５０℃（０℃を除く。）の水による抽出物を意味する。ここで、「水」とは、０～５０℃（０℃を除く。）の水を意味する。水の温度は、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分に抽出できる範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくは１～４０℃、より好ましくは５～３５℃、特に好ましくは１０～３０℃である。
　本実施形態において、「熱水抽出物」とは、５０℃よりも高い温度の水による抽出物を意味し、「温水抽出物」とも呼ぶことができる。ここで、「熱水」とは、５０℃よりも高温の水を意味し、「熱湯」も含む概念であり、沸騰状態にある水も含まれる。また、液体状態の熱水に限定されることなく、気体状態及び超臨界状態の熱水も含まれる。熱水の温度は、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分に抽出できる範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５０℃より高く１２０℃以下、より好ましくは５０℃より高く１００℃以下である。
　抽出に使用する水のｐＨは、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分抽出できる範囲内であれば特に限定されるものではないが、好ましくはｐＨ４～１０、より好ましくはｐＨ５～９、特に好ましくはｐＨ６～８であるとよい。
　なお、本実施形態では、水性溶媒として、活性成分に影響を与えずに、活性成分を十分抽出できるものであって、通常、抽出に用いることができる溶媒を１種または２種以上選択して用いてもよい。例えば、水、アルコール類、グリコール類などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。アルコール類としては、エタノール、メタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール等が挙げられる。グリコール類としては、１，３－ブチレングリコール（ＢＧ）及びプロピレングリコール等が挙げられる。その他の水性溶媒としては、アセトン等が挙げられる。これらの溶媒は単独或いは水溶液として用いても良く、任意の２種または３種以上の混合溶媒として用いてもよい。
　抽出に用いる水性溶媒の温度は、例えば、０℃以上であり、活性成分に影響を与えないのであれば特に限定されることはない。沸騰状態又は超臨界状態にある水性溶媒を使用することもできるが、５℃～６００℃の水性溶媒を使用するのが好ましく、１０℃～２００℃の水性溶媒を使用するのがより好ましい。したがって、抽出用の水性溶媒とは、沸騰状態や超臨界状態にある水性溶媒も含むものである。抽出に使用する水性溶媒の量は、ユーグレナ中に含まれる水溶性活性成分を十分に溶解することができる量であることが好ましい。
　抽出方法も特に限定されず、例えば、以下に示す方法により抽出を行うことができるが、これに限定されることなく、通常の抽出方法を自由に選択して用いることができる。例えば、ユーグレナの藻体乾燥粉末を水性溶媒に所定時間浸漬した後に遠心分離又は濾過する方法、ユーグレナの藻体乾燥粉末を水性溶媒に加えて震盪して均一に分散させた後に遠心分離又は濾過する方法、などが挙げられる。また、抽出を促進するために、ユーグレナを添加後の水性溶媒を加熱することも可能である。
　ユーグレナの水抽出は、以下に示すような通常の方法で行うことができるが、これに限定されるものではない。例えば、ユーグレナ組織及び水を容器に入れ、適宜攪拌又は震盪しながら所定時間静置し、得られた抽出液は、そのまま水抽出物として使用可能である。また、例えば、そのような抽出液を遠心して得られる上清を水抽出物として使用することもできる。また、そのような抽出液又は上清を濃縮、乾燥して水分を除去し、これを水抽出物として使用することもできる。水抽出は、抽出効率を上げて抽出時間を短縮するために、水に、少量、例えば、１０質量％以下のアルコール、好ましくはエタノールを添加して行ってもよい。水抽出を行う場合の抽出時間は、活性成分が抽出される時間であれば特に限定されず、数秒～数十時間の範囲で、抽出の温度に応じて適宜設定することができる。
　熱水による抽出は、以下に示すような、通常用いられている方法で行なうことができるが、これに限定されるものではない。ユーグレナを、通常用いられる抽出器に水とともに導入した後に、加熱することで抽出を行う。沸騰水または超臨界状態にある水を使用して抽出する場合には、水の蒸気圧に耐え得る抽出器を使用する必要がある。抽出時の圧力は１～５０００気圧に設定することができ、６０～４００気圧に設定するのが好ましい。
　高温高圧下で抽出を行なう場合には、抽出時間が長過ぎると活性成分が分解したり、化学反応を起こすことがある。従って、高温高圧下で抽出を行なうときには、抽出時間を短時間、例えば、３分以内とするのが好ましく、１分以内とするのがより好ましく、３０秒以内とすることが特に好ましい。
　抽出したユーグレナ抽出物は、そのままでも本実施形態に係るＧＬＳ１遺伝子阻害剤及び老化細胞除去剤の有効成分として用いることができるが、当該抽出物を更に、適当な分離手段（例えば、分配抽出、ゲル濾過法、シリカゲルクロマトグラフィー、逆相若しくは順相の高速液体クロマトグラフィーなど）により活性の高い画分を分画して用いることも可能である。また、ユーグレナ抽出物やその画分を、濃縮、乾燥して水性溶媒を除去し、これを水性溶媒抽出物として使用することもできる。
　また、ユーグレナ抽出物として、ＢＧを用いて抽出したエキスを用いてもよい。ユーグレナ抽出物は、浸透型コラーゲン、浸透型エラスチン、浸透型ヒアルロン酸、ヘキサペプチド－３３を多層構造のカプセルにするなど、他の化粧品原料と複合化した形態としても良い。
（加水分解ユーグレナエキス）
　ユーグレナ抽出物として、ユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分、具体的には、ユーグレナ粉末（ユーグレナ藻体）を酵素で加水分解抽出した加水分解ユーグレナエキスを用いても良い。加水分解ユーグレナエキスは、特開２０１０－９００６５号記載の方法に従い、調製することが可能である。
　以下、加水分解ユーグレナエキスの調製方法について説明をする。ユーグレナの乾燥体（重量）に対し、好ましくは１００倍量（重量）の精製水を加え、加圧加熱処理を行う。その後、蛋白質分解酵素を添加し藻体を処理する。処理終了後、例えば９０℃で失活し、遠心分離または濾過することにより、残渣と水溶性成分を分離する。
　具体的には、加圧加熱処理条件は、オートクレーブを用いて１００～１５０℃、大気圧～０．２５５ＭＰａ、1分～３０分の加熱加圧処理であることが好ましく、例えば、０．１～０．１４ＭＰａ、１２１℃で１０分間の加熱加圧処理をするとよい。蛋白質分解酵素としては、例えばペプシン、パンクレアチン、パパインなど一般的に用いられるプロテアーゼ活性を有する酵素を単独または併用すればよい特に、ポリペプチド鎖の途中のペプチド結合を加水分解し、幾つかのペプチドに分解するためにエンド型ペプチダーゼを採用することが好ましい。
　市販の蛋白質分解酵素としては、ヤクルト薬品工業社製のパンチダーゼＭＰ、アロアーゼＡＰ－１０なども採用できる。酵素の添加濃度、反応液のｐＨや反応温度、その他の条件等は、各酵素剤にとって最適な条件を選択すればよい。
　このようにして得られた水溶性成分は、そのまま用いることもできるが、本発明の効果を失わない範囲内で分画、脱臭，脱色，濃縮等の精製操作を加えて用いることもできる。
＜パラミロン＞
　「パラミロン（ｐａｒａｍｙｌｏｎ）」とは、約７００個のグルコースがβ－１，３－結合により重合した高分子体（β－１，３－グルカン）で多孔質であり、ユーグレナ属が含有する貯蔵多糖である。パラミロン粒子は、扁平な回転楕円体粒子であり、β－１，３－グルカン鎖がらせん状に絡まりあって形成されている。
　パラミロンは、すべての種，変種のユーグレナ細胞内に顆粒として存在し、その個数,形状，粒子の均一性は、種により特徴がある。パラミロンは、グルコースのみからなり、E. gracilis Zの野生株と葉緑体欠損株SM-ZKから得られたパラミロンの平均重合度は、グルコース単位で約７００である。パラミロンは、水，熱水には不溶性であるが、希アルカリ，濃い酸，ジメチルスルホキシド，ホルムアルデヒド，ギ酸に溶ける。パラミロンの平均密度は、E. gracilis Zでは１．５３、E. gracilis var. bacillaris SM-L1では１．６３である。
　パラミロンは、粉末図形法を用いたＸ線解析によれば、３本の直鎖状β－１，３－グルカンが右巻きの縄のようにねじれあったゆるやかならせん構造をとっている。このグルカン分子がいくつか集まってパラミロン顆粒を形成する。パラミロン顆粒は結晶構造部分が非常に多く約９０％を占め、多糖類の中で最も結晶構造率の高い化合物である（ユーグレナ 生理と生化学，北岡正三郎編，学会出版センター）。なお、パラミロン（（株）ユーグレナ製）の粒度分布は、レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置で測定したときのメジアン径が、１．５～２．５μｍである。
　パラミロン粒子は、培養されたユーグレナ細胞から任意の適切な方法で単離及び微粒子状に精製され、通常、粉末体として提供されている。例えば、パラミロン粒子は、（１）任意の適切な培地中でのユーグレナ細胞の培養、（２）当該培地からのユーグレナ細胞の分離、（３）分離されたユーグレナ細胞からのパラミロンの単離、（４）単離されたパラミロンの精製、および必要に応じて（５）冷却及びその後の凍結乾燥によって得ることができる。パラミロンの単離は、例えば、大部分が生物分解される種類の非イオン性又は陰イオン性の界面活性剤を用いて行われる。パラミロンの精製は、実質的には単離と同時に行われる。
（パラミロンの加工品）
　パラミロンの加工品としては、公知の種々の方法によりパラミロンを化学的又は物理的に処理して得た水溶性パラミロン、硫酸化パラミロン等や、パラミロン誘導体も含まれる。
　パラミロンの加工品としては、例えば、アモルファスパラミロンやエマルジョンパラミロンが挙げられる。アモルファスパラミロンとは、ユーグレナ由来の結晶性パラミロンをアモルファス化した物質である。アモルファスパラミロンは、ユーグレナから公知の方法で生成された結晶性のパラミロンに対する相対結晶度が、１～２０％である。但し、この相対結晶度は、特開２０１１－１８４５９２号記載の方法により求めたものである。
　つまり、アモルファスパラミロン及びパラミロンを、それぞれ、粉砕機（Ｒｅｔｓｈ社製ボールミルＭＭ４００）にて、振動数２０回／秒で５分間粉砕後、Ｘ線回折装置（スペクトリス社製Ｈ‘ＰｅｒｔＰＲＯ）を用い、管電圧４５ＫＶ、管電流４０ｍＡにて、２θが５°乃至３０°の範囲でスキャンを行い、パラミロンとアモルファスパラミロンの２θ＝２０°の付近の回折ピークＰｃ，Ｐａを得る。このＰｃ，Ｐａの値を用い、アモルファスパラミロンの相対結晶度を、アモルファスパラミロンの相対結晶度＝Ｐａ／Ｐｃ×１００（％）により算出する。
　アモルファスパラミロンは、特開２０１１－１８４５９２号記載の方法に従い、結晶性のパラミロン粉末を、アルカリ処理した後に酸で中和し、その後洗浄、水分除去工程を経て、乾燥を行うことにより調製される。パラミロンの加工品としては、そのほか、公知の種々の方法によりパラミロンを化学的又は物理的に処理して得た水溶性パラミロン、硫酸化パラミロン等や、パラミロン誘導体も含まれる。
　「エマルジョンパラミロン」とは、その加工方法及び物性が乳化物に類似していることから、エマルジョンパラミロンとも呼ばれる物質であって、特開２０１６－１９９６５０号記載の方法に従い、パラミロンに水を加えて得た流体を超高圧で細孔ノズルから噴出させて被衝突物に衝突させる衝突処理を行うことにより得られ、４倍以上の水と結合して膨潤した加工パラミロンである。
　エマルジョンパラミロンは、粉体等の固体に水溶性溶媒を加えたスラリーを、細孔ノズルから超高圧で噴出させて被衝突物に衝突させる公知の物性改質装置（例えば、特開２０１１－８８１０８号公報、特開平６－４７２６４号公報記載の装置）で、噴出時のノズル圧力２４５ＭＰａで、１回以上衝突処理を行うことにより得ることができる。
　エマルジョンパラミロンは、レーザ回折／散乱式粒度分布測定装置で粒度を測定したときのメジアン径が、パラミロンの５倍以上であり、７μｍ以上であって、光学電子顕微鏡により、粒子が、隣接する粒子と付着していることが観察され、パラミロンに対して４倍以上の水と結合して膨潤している。
　原料パラミロンと水を混合したスラリーは、さらさらした流体であるが、エマルジョンパラミロンは、パラミロンが水分子中に分散して、粘度が増加して粘性を有し、触ったときに手に付着するような粘着性と、弾力性を有し、糊のような触感を備えている。なお、その処理方法と物性から、得られた加工パラミロンを本明細書においてエマルジョンパラミロンと呼んでいるが、エマルジョン化しているか否かは不明であり、パラミロンが水と結合して膨潤している状態である。
＜用途＞
　本実施形態に係るＧＬＳ１遺伝子阻害剤及び老化細胞除去剤は、化粧料組成物、健康食品等の食品組成物、医薬組成物として構成され、老化細胞を除去するために、予防的に使用・摂取・投与される。ユーグレナ、ユーグレナ抽出物、パラミロンといったユーグレナ由来物質は、食品としても摂取可能で副作用がないため、継続的に使用・摂取・投与可能である。
（化粧料組成物）
　本実施形態に係るＧＬＳ１遺伝子阻害剤及び老化細胞除去剤は、ＧＬＳ１遺伝子阻害作用及び老化細胞除去作用を利用して、化粧料組成物に好適に用いることができる。該化粧料組成物は、あらゆる形態の化粧料に適用することができる。例えば、クレンジング剤、洗顔材、化粧水、ローション、乳液、クリーム、美容液、パック、スクラブ剤などのスキンケア化粧料、ファンデーション、コンシーラー、化粧下地、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナーなどのメイクアップ化粧料、日焼け止め化粧料などに適用することができる。
　本実施形態に係る化粧料組成物には、本実施形態に係るＧＬＳ１遺伝子阻害剤及び老化細胞除去剤に加え、通常化粧料組成物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。例えば、基材、保存剤、乳化剤、着色剤、防腐剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、紫外線吸収剤、香料、防腐防黴剤、体質顔料、着色顔料、アルコール、水などの、化粧品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
　本実施形態に係る化粧料組成物において、ＧＬＳ１遺伝子阻害剤及び老化細胞除去剤の含有量は特に限定されず、目的に応じて自由に設定することが可能である。
（食品組成物）
　本実施形態のＧＬＳ１遺伝子阻害剤及び老化細胞除去剤は、食品の分野では、ＧＬＳ１遺伝子阻害作用及び老化細胞除去作用を有効に発揮できる有効な量のユーグレナ由来物質を食品素材として、各種食品に配合することにより、当該作用を有する食品組成物を提供することができる。すなわち、本発明は、食品の分野において、老化細胞除去用等と表示された食品の食品組成物を提供することができる。当該食品組成物としては、一般の食品のほか、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、病院患者用食品、サプリメント等が挙げられる。また、食品添加物として用いることもできる。
　当該食品組成物としては、例えば、調味料、畜肉加工品、農産加工品、飲料（乳酸菌飲料、清涼飲料、アルコール飲料、炭酸飲料、乳飲料、果汁飲料、茶、コーヒー、栄養ドリンク等）、粉末飲料（粉末ジュース、粉末スープ等）、濃縮飲料、菓子類（キャンディ（のど飴）、クッキー、ビスケット、ガム、グミ、チュアブル、タブレット剤、チョコレート等）、パン、シリアル等が挙げられる。また、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の場合、カプセル、トローチ、シロップ、顆粒、粉末等の形状であっても良い。
　ここで特定保健用食品とは、生理学的機能等に影響を与える保健機能成分を含む食品であって、消費者庁長官の許可を得て特定の保健の用途に適する旨を表示可能なものである。本発明においては、老化細胞除去に関する特定の保健用途を表示して販売される食品となる。
　また栄養機能食品とは、栄養成分（ビタミン、ミネラル）の補給のために利用される食品であって、栄養成分の機能を表示するものである。栄養機能食品として販売するためには、一日当たりの摂取目安量に含まれる栄養成分量が定められた上限値、下限値の範囲内にある必要があり、栄養機能表示だけでなく注意喚起表示等もする必要がある。
　また機能性表示食品とは、事業者の責任において、科学的根拠に基づいた機能性を表示した食品である。販売前に安全性及び機能性の根拠に関する情報などが消費者庁長官へ届け出られたものである。
　本実施形態に係る食品組成物には、ユーグレナ由来物質に加え、通常食品組成物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。例えば、各種調味料、保存剤、乳化剤、安定剤、香料、着色剤、防腐剤、ｐＨ調整剤などの、食品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
（医薬組成物）
　本実施形態のＧＬＳ１遺伝子阻害剤及び老化細胞除去剤は、医薬の分野では、ＧＬＳ１遺伝子阻害作用及び老化細胞除去作用を有効に発揮できる量のユーグレナ由来物質と共に、薬学的に許容される担体や添加剤を配合することにより、当該作用を有する医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、医薬品であっても医薬部外品であってもよい。
　当該医薬組成物は、内用的に適用されても、また外用的に適用されても良い。従って、当該医薬組成物は、内服剤、静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射及び／又は腹腔内注射等の注射剤、経粘膜適用剤、経皮適用剤等の製剤形態で使用することができる。当該医薬組成物の剤型としては、適用の形態により、適当に設定できるが、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末剤、散剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤などの液状製剤、軟膏剤、またはゲル剤等の半固形剤が挙げられる。
　本実施形態に係る医薬組成物には、薬学的に許容される添加剤を１種または２種以上自由に選択して含有させることができる。例えば、本実施形態に係る医薬組成物を経口剤に適用させる場合、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、保存剤、着色剤、矯味剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。また、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用して、徐放性製剤等にすることもできる。
　以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜実施例１：加水分解ユーグレナエキス＞
　ユーグレナ由来物質として、ユーグレナ・グラシリスの細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分である加水分解ユーグレナエキスを用いた。加水分解ユーグレナエキスは、ユーグレナ・グラシリス粉末（ユーグレナ藻体、（株）ユーグレナ製）１ｇにその１００倍量の精製水を加え、圧力０．１ＭＰａ、温度１２℃に加熱して１０分間の加熱加圧処理をした。その後、エンド型プロテアーゼのタンパク質分解酵素（例えば、ヤクルト薬品工業社製:パンチダーゼＭＰ）を全量の５％添加し、３５℃、１６時間、攪拌反応させた。反応後、濾紙を用いて濾過することで水溶性成分を分取した。得られた水溶性成分を０．４５μｍフィルター滅菌したサンプルを、加水分解ユーグレナエキス原液１００％とした。
＜実施例２：ユーグレナ抽出物＞
　ユーグレナ由来物質として、ユーグレナ抽出物を用いた。ユーグレナ抽出物は、原料としてユーグレナ・グラシリス粉末（ユーグレナ藻体、（株）ユーグレナ製）を用い、溶媒として１，３－ブチレングリコール（ＢＧ）を用いて調製した。
　ユーグレナ粉末（ユーグレナ・グラシリス、Ｌｏｔ．ＥＵ－１６１８９、（株）ユーグレナ製）０．５ｇに、ＢＧ１ｍｌを加え震盪し、均一に分散した後、室温（２５℃）で１０分間抽出した。遠心分離（３０００ｒｐｍ、３分、２５℃）により得られた上清を分取し、０．４５μｍ滅菌フィルターにて濾過することで、ユーグレナ抽出物を調製した。
＜試験１＞
　試験１では、加水分解ユーグレナエキス（実施例１）による皮膚表皮細胞の遺伝子に与える影響を評価した。
（試験１の方法）
　正常ヒト表皮細胞（３．０×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地を用いて１２ウェルプレートに播種した。次に、加水分解ユーグレナエキスをＨｕＭｅｄｉａ－ＫＢ２培地（非増殖培地）に溶解させ、培地を交換した。培地を交換した後、２４時間培養して、培養上清を除去して細胞をＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓを用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを単離したあと、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡを用いて精製した。ＲＮＡライブラリーの構築およびシークエンスは、ＴｒｕＳｅｑ　Ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｍＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　ＫｉｔおよびＮｏｖａＳｅｑ　６０００　（Ｉｌｌｕｍｉｎａ　Ｉｎｃ，　ＵＳＡ）を用いて行った。本試験では（ｎ＝１）、ＦＰＫＭ値を算出して、｜ｌｏｇＦＣ｜＞０．５の遺伝子を変動遺伝子とした。
（試験１の結果）
　加水分解ユーグレナエキスによるヒト表皮角化細胞の遺伝子変化を、次世代シーケンサーを用いて網羅的に解析した結果、全５７，６４３遺伝子のうち、１４，５８６遺伝子で十分なリード数が確保できた。加水分解ユーグレナエキスを５％添加したとき、１，１４５遺伝子（４６．８％）が減少し、１，３０８遺伝子（５３．２％）が増加した。ＧＬＳ１遺伝子について、その発現量は、コントロールでは１９８．５１５であり、加水分解ユーグレナエキスを添加した場合１２７．００３であった。
＜試験２＞
　試験２では、加水分解ユーグレナエキス（実施例１）及びユーグレナ抽出物（実施例２）が長寿関連遺伝子（ＧＬＳ１）に与える影響を評価した。
（試験２の方法）
　正常ヒト表皮細胞（３．０×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２培地（増殖培地）を用いて１２ウェルプレートに播種した。次に、加水分解ユーグレナエキス（実施例１）、またはユーグレナ抽出物（実施例２）をＨｕＭｅｄｉａ－ＫＢ２培地（非増殖培地）に溶解させ、培地を交換した。培地を交換した後、２４時間培養して、培養上清を除去して細胞をＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓを用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲにより遺伝子発現量を評価した。リアルタイムＰＣＲの内部標準はグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を用いた。
（試験２の結果）
　図１に、ヒト表皮角化細胞において、ユーグレナ由来物質によるＧＳＬ１遺伝子に対する影響を検討した結果を示す。加水分解ユーグレナエキス（実施例１）を添加したとき、ＧＬＳ１遺伝子の発現量が低値であった。ユーグレナ抽出物（実施例２）を添加したとき、ＧＬＳ１遺伝子の発現量が有意に低下した。
　以上の結果から、ユーグレナ由来物質が、ヒト表皮角化細胞におけるＧＬＳ１遺伝子の発現を阻害することが示された。つまり、有効成分としてユーグレナ由来物質を用いることで、ＧＬＳ１遺伝子の発現を阻害したり、生体内の老化細胞を除去したりできることが示唆された。
＜試験３＞
　試験３では、ユーグレナ抽出物（実施例２）が正常細胞および老化細胞に与える影響を評価した。
（試験３の方法）
　過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）５０μＭを添加したＰＢＳで、ヒト表皮角化細胞を２時間処理して、細胞老化を引き起こした。その後、ユーグレナ抽出物（実施例２）を含む増殖培地に交換して、培養２日後にＣＣＫ－８を用いて細胞数を測定した。コントロールとして、増殖培地を用いた。
（試験３の結果）
　結果を図２に示す。過酸化水素処理により誘導した老化細胞に、ユーグレナ抽出物（実施例２）を添加すると、細胞数が４６．７％減少した。正常な角化細胞に、ユーグレナ抽出物（実施例２）を添加すると、細胞増殖を促進する傾向が見られた（Ｈ２Ｏ２　０μＭ）。したがって、ユーグレナ抽出物（実施例２）は、正常細胞に対しては増殖を促進し、老化細胞に対しては増殖を抑制することが示された。

Claims (4)

  1. 　ユーグレナ由来物質を有効成分として含有し、皮膚におけるＧＬＳ１遺伝子の発現を阻害するために用いられ、
    　前記ユーグレナ由来物質が、ユーグレナ水性溶媒抽出物又はユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分であり、
    　経皮的に適用されることを特徴とするＧＬＳ１遺伝子阻害用化粧料組成物。
  2. 　ユーグレナ由来物質を有効成分として含有し、皮膚におけるＧＬＳ１遺伝子の発現を阻害するために用いられ、
    　前記ユーグレナ由来物質が、ユーグレナ水性溶媒抽出物又はユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分であり、
    　経皮的に適用されることを特徴とするＧＬＳ１遺伝子阻害剤。
  3. 　ユーグレナ由来物質を有効成分として含有し、皮膚の老化細胞を除去するために用いられ、
    　前記ユーグレナ由来物質が、ユーグレナ水性溶媒抽出物又はユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分であり、
    　経皮的に適用されることを特徴とする老化細胞除去用化粧料組成物。
  4. 　ユーグレナ由来物質を有効成分として含有し、皮膚の老化細胞を除去するために用いられ、
    　前記ユーグレナ由来物質が、ユーグレナ水性溶媒抽出物又はユーグレナ属に属する藻類の細胞を蛋白質酵素分解して抽出される水溶性成分であり、
    　経皮的に適用されることを特徴とする老化細胞除去剤。
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