WO2014041703A1

WO2014041703A1 - コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法

Info

Publication number: WO2014041703A1
Application number: PCT/JP2012/074398
Authority: WO
Inventors: 二村　芳弘
Original assignee: 高野友梨
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2012-09-24
Publication date: 2014-03-20
Also published as: JP2014058459A

Abstract

　コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法は、モズク及び大豆を納豆菌で発酵させ、得られた発酵液に分岐シクロデキストリンを添加してプロテアーゼ処理し、次いでアルカリ還元処理をすることで調製された細胞保存液に、コラゲナーゼを配合してコラゲナーゼ含有細胞保存液を調製し、次いで該コラゲナーゼ含有細胞保存液に羊毛根肌組織を添加分散させて反応させ、反応後の肌細胞を細胞保存液に懸濁させて懸濁液とする、コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法である。また、羊毛根肌組織は細胞保存液で洗浄することが望ましい。

Description

コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法

　本発明は、新規なコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法に関し、詳細には、コラゲナーゼを含有する、モズクを発酵させた液（以下、「細胞保存液」と称す）と羊毛根肌組織を用いた、コラーゲン増加作用を呈する、コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法に関する。

　コラーゲンはタンパク質の１種であり、体内で合成されるものである。コラーゲンには種々のタイプが存在し、肌組織の維持に重要な働きを担っている。
　肌に含有されるコラーゲンはタイプＩであり、３本のコラーゲン線維が組み合わさっている。また、アミノ酸組成の特徴はヒドロキシプロリンとヒドロキシリジンであり、この水酸化反応にはビタミンＣが必要である。
　コラーゲンは肌の真皮組織に存在している他に、表皮の間質を埋める働きもあることから肌にとっては大切なタンパク質である。

　しかし加齢により、または、紫外線の照射や空気の乾燥、酸化等により、皮膚、特に真皮に含まれるコラーゲンが減少してくる。かかるコラーゲンの減少は、皮膚の保湿機能の減少、肌荒れ、しわ、たるみ、くすみやきめの細かさの消失等の老化現象を招く大きな要因となっている。

　また、コラーゲンは通常のタンパク質と比較してターンオーバーに要する時間が長く、加齢（老化）に伴いそのサイクルは遅くなると言われている。そのサイクルが遅くなるとコラーゲン自体の変性（老化）も進行し、皮膚の柔軟性や弾力性の低下につながる。コラーゲンが老化すると、構造支持体としての機能が低下するため、皮膚基底部に存在する繊維芽細胞の増殖、分化、移動が妨げられ、皮膚のターンオーバーサイクルはさらに遅くなるという悪循環に陥ると考えられている。

　かかるコラーゲンを増加させることができれば、皮膚の乾燥や肌荒れ、しわ、たるみ等の老化現象を予防、改善することができることが期待されている。

　この点に鑑み、従来より種々の研究が行われており、例えば、コラーゲンを増加させる化合物として、特許第４８２２７１８号公報（特許文献１）には、特定の式で表される新規なＣ－グリコシド化合物のみを有効成分として含有するコラーゲン促進剤が記載されている。
　また、特開２０１２－１６３５１４号公報（特許文献２）には、卵殻膜及びコラーゲンを含有するコラーゲン産生促進剤が、特開２０１２－１６７０２１号公報（特許文献３）には、ＴＧＦ－β及び／又はＴＧＦ－β分解物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤が、更には特開２０１２－３６１２８号公報（特許文献４）には、バラ科のイチゴ属の抽出物や、ライチの種子の抽出物、又はクルミ科クルミ属の抽出物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤が開示されている。

　しかし、化学合成により製造された物質には安全性に問題はある場合があり、これらの植物エキスや化学物質によるコラーゲン産生は軽度であり、より有効なコラーゲン産生促進作用を有する材料の開発が期待されていた。
　また、自然物であるモズクを用いて、コラーゲンの増加を有効に促進することができる、コラーゲン産生促進剤を製造する方法については、知られていない。

特許第４８２２７１８号公報特開２０１２－１６３５１４号公報特開２０１２－１６７０２１号公報特開２０１２－３６１２８号公報

　従って、本発明の目的は、優れたコラーゲン促進作用を有する新規なコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法を提供することである。
　特に自然物であるモズクを発酵させた懸濁液及び羊毛根肌組織を用いることで、安全性に問題がなく、コラーゲン促進作用を有効に発現することができる、新規なコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法を提供することである。

　本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、モズクを納豆菌で発酵させた発酵液を用いることで、フレッシュな状態で細胞を懸濁した懸濁液が、優れたコラーゲン産生促進作用を有することを見出し、本発明に到達した。
　即ち、本発明のコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法は、モズク及び大豆を納豆菌で発酵させ、得られた発酵液に分岐シクロデキストリンを添加してプロテアーゼを処理し、次いでアルカリ還元処理をすることで調製された細胞保存液に、コラゲナーゼを配合してコラゲナーゼ含有細胞保存液を調製し、次いで該コラゲナーゼ含有細胞保存液に羊毛根肌組織を添加分散させて反応させ、反応後に得られた肌細胞を細胞保存液に懸濁させることにより製造することを特徴とする、コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法である。

　好適には、上記本発明のコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法において、羊毛根肌組織をコラゲナーゼ含有細胞保存液に添加分散させて反応させる前に、該羊毛根肌組織を細胞保存液で洗浄することを特徴とする、コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法である。

　更に好適には、上記本発明のコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法において、反応後に得られた肌細胞を細胞保存液に懸濁させる前に、該肌細胞を細胞保存液で洗浄することを特徴とする、コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法である。
　また更に好適には、上記本発明のコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法において、反応後の肌細胞を細胞保存液に懸濁させた懸濁液を、超音波破砕処理又はホモジナイザー処理をすることにより肌細胞微細粒子懸濁液とすることを特徴とする、コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法である。

　本発明のコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法により製造されたコラーゲン産生促進懸濁液（肌細胞フレッシュエキスとも称す）は、コラーゲンの産生促進を有効に図ることができ、皮膚の乾燥や肌荒れ、しわ、たるみ等の老化現象を予防、改善することができることが可能となる。
　また、コラーゲンの増加により、皮膚の弾力性が高まり皮膚の乾燥を予防することができるため、美容上のみならず、皮膚の乾燥により悪化していたアトピー等の改善を図ることも可能となる。

　また、本発明のコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法は、自然物であるモズクを利用しているため、安全性に問題がない、コラーゲン産生促進懸濁液（肌細胞フレッシュエキスとも称す）を効率よく製造することができる。
　かかるコラーゲン産生促進懸濁液（肌細胞フレッシュエキスとも称す）を有効成分とすることで、化粧料、飲食物、薬品等に利用することができる。

本発明の製法方法を用いて製造したコラーゲン産生促進懸濁液の濃度と、細胞生存率１００％あたりのコラーゲン濃度との関係を示す一例の図である。

　本発明を以下の好適な形態により説明するが、これらに限定されることはない。
　本発明のコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法は、モズク及び大豆を納豆菌で発酵させ、得られた発酵液に分岐シクロデキストリンを添加してプロテアーゼを処理し、次いでアルカリ還元処理をすることで調製された細胞保存液に、コラゲナーゼを配合してコラゲナーゼ含有細胞保存液を調製し、次いで該コラゲナーゼ含有細胞保存液に羊毛根肌組織を添加分散させて反応させ、反応後に得られた肌細胞を細胞保存液に懸濁させることにより製造する、コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法である。

　このようにして得られたコラーゲン産生促進懸濁液（肌細胞フレッシュエキスとも称す）には、糖質、脂質、糖脂質、ビタミン、ミネラルを含有するものであり、羊由来のコラーゲンは含有されてない。
　また、本発明のコラーゲン産生促進懸濁液の製法方法は、フレッシュな状態で細胞を懸濁液とするもので、微細粒子を維持することが可能となる。

　まず、本発明のコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法に用いる細胞保存液について説明する。
　細胞保存液は、モズク及び大豆を納豆菌で発酵させ、得られた発酵液に分岐シクロデキストリンを添加してプロテアーゼを処理し、次いでアルカリ還元処理をすることにより製造することができる、モズクを発酵させた液である。

　原材料としてのモズクは、褐藻綱・ナガマツモ目のうち、モズク科やナガマツモ科に属する海藻の総称であり、枝分かれのある糸状藻類であり、市場で入手し得る任意のモズクを用いことができる。
　特に、日本国内で食用として流通しているものは、ナガマツモ科に属するモズク、学名Cladosiphon　Okamuranusとイシモズク学名Sphaerotrichia Divaricataであり、これらを好適に利用することができる。
　モズクの産地は問われず、日本のみでなく、トンガ、アメリカ、台湾、アジア産の汎用のものを用いることができ、かかるモズクの葉又は塊根の部分が食用として利用されることから、葉又は塊根を水洗後、裁断機により細切して粉砕物を得、この粉砕物を乾燥させて得られたモズクの粉末を使用する。

　かかるモズクの粉末には、炭水化物、脂質、たんぱく質やペプチド成分の他、ウロン酸や桂皮酸などのウロン酸が含有されている。特に、葉の部分にはウロン酸が多量に含有されていることから、葉を利用することが望ましい。
　モズクの粉末は清浄な水を添加して懸濁され、例えば、モズクの粉末１０ｇに対して水を１０～２０リットルを添加し、攪拌することでモズク懸濁液を得る。

　細胞保存液の製造に用いる他の原材料としての大豆は、日本産、アメリカ産、中国産等の市場で入手し得る任意の大豆が用いられ、遺伝子組み換え型大豆を用いることもできるが、好ましくは、ｎｏｎＧＭＰタイプの大豆を使用する。

　前記モズク懸濁液と大豆を煮沸滅菌し、発酵タンクに添加する。
　例えば、モズク１０ｇに対して大豆を８～１８ｇ添加配合することで、発酵を効率良く行わせることが可能となる。

　発酵には、納豆菌（Bacillus subtilis var. natto）を用いて、発酵させる。
　納豆菌は、市販の納豆の生産に供されるものであれば、特に限定されず、市場で入手し得る任意の納豆菌を利用することができる。
　納豆菌としては、バチルス・ズブチリスに分類される菌株が用いられ、例えば、宮城野菌、高橋菌、成瀬菌や、例えばＩＦＯ３００９、ＩＦＯ３０１３、ＩＦＯ３３３５、ＩＦＯ３３３６、ＩＦＯ３９３６、ＩＦＯ１３１６９、ＡＴＣＣ７０５８、ＡＴＣＣ７０５９、ＡＴＣＣ１５２４５のような、Bacillus subtilis var. nattoとして登録されている、任意の分譲菌株を例示することができる。

　発酵は、静置法または撹拌法のいずれの方法を用いても良いが、発酵を短時間で実施できる点から撹拌法が好ましい。
　かかる発酵は３９～４９℃、１２～３６時間で行われることが好ましい。
　温度が低く、時間が短い場合には発酵が進行せず、一方、温度が高く、時間が長い場合には、コラーゲン促進作用を有効に発揮できる細胞保存液を製造することができなくなるおそれがあり好ましくない。

　次いで、以下の工程を容易に行なうため、上記発酵後の発酵液を、例えば濾過布等により濾過することが望ましい。
　得られた発酵液を濾過した濾液に分岐シクロデキストリンを添加配合する。この発酵液と分岐シクロデキストリンとの懸濁液は攪拌されることが好ましい。
　本発明において使用する分岐シクロデキストリンとしては、特に限定されず、市場で入手し得る任意の分岐シクロデキストリンを用いることができるが、例えば塩水港精糖社製の分岐シクロデキストリンを例示することができる。

　添加配合される分岐シクロデキストリンは、モズク１ｇに対して０．５～５ｇが好ましい。
　分岐シクロデキストリンは内腔に疎水性部分を有することから疎水性の高い物質を吸着しやすい性質を有し、かかる分岐シクロデキストリンによりモズク中のペプチドとウロン酸の結合体が包みこまれる。
　分岐シクロデキストリンは環状ブドウ糖の一種であり、ブドウ糖が環状に結合し、食品や化粧料に利用されているものである。

　次いで、上記発酵液と分岐シクロデキストリンとの懸濁液にプロテアーゼが添加される。
　使用されるプロテアーゼは、特に限定されず、市場で入手し得る任意のプロテアーゼを用いることができる。特に、天野エンザイム社製の食品加工用プロテアーゼであるプロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤやプロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤは、品質が安定し、使用実績が豊富なことから好ましく使用することができる。

　添加配合されるプロテアーゼの量は、モズク１ｇに対して０．０２～０．１ｇが好ましい。このプロテアーゼは、好ましくは精製水に懸濁して添加されることで、より反応が進むこととなる。
　かかる懸濁液は反応を促進するために加温され、攪拌されることが好ましい。
　加温としては３０～４５℃が、また、攪拌は１分間当り約１０～３０回程度が好ましい。

　かかる反応後のプロテアーゼ反応液を、好ましくは濾過する。濾過には、濾紙やメンブランフィルター等の公知の任意の手段を用いることにより効率良く濾過することができる。
　濾過して濾液を得ることにより、反応していない成分や原材料を排除することができる。

　次いで、得られた濾液に含まれる反応物を、アルカリ還元処理する。
　アルカリ還元処理手段は、公知の任意のアルカリ還元手段を用いることができ、例えば、任意のアルカリ還元装置やアルカリ還元整水器により実施することができる。
　例えば、ゼマイティス製のアルカリ還元水・強酸化水連続生成器「プロテックＡＴＸ－５０１」、エヌアイシー製のアルカリ還元水製造装置「テクノスーパー５０２」、マルタカ製「ミネリア・ＣＥ－２１２」、クレッセント製「アキュラブルー」、株式会社日本鉱泉研究所製「ミネラル還元整水器」等の装置を例示することができる。

　かかるアルカリ還元処理により濾液を電気分解し、陰極側から得られるアルカリ還元溶液が細胞保存液（モズクを発酵させた液；モズク発酵液）である。
　かかる細胞保存溶液には、ウロン酸誘導体とペプチドとの結合体が溶液中に含有されており、前記アルカリ還元処理によりウロン酸およびペプチドの結合が生じている。
　上記アルカリ還元処理を、例えば２～１０回繰り返すことにより、反応が高まることから、アルカリ還元処理を複数回繰り返して行なうことが好ましい。
　得られた細胞保存液中に含まれる結合体は、凍結乾燥することにより粉末化されて用いることもできる。
　また、前記還元反応物から、ウロン酸誘導体を分離し精製することは純度の高い物質を得ることができることから好ましい。かかる精製方法としては、分離用の樹脂等の公知の精製操作を利用することができる。

　このようにして得られた細胞保存液と、羊毛根肌組織とを用いて、以下の工程を行なうことにより、コラーゲン産生促進懸濁液（肌細胞フレッシュエキス）を調製する。
　羊毛根肌組織には、肌細胞の表皮組織及び真皮組織が含有される。
　羊は学名Ovis ariesであり、品種はメリノが主流であるが、アワシ、カラクルなど他の品種も利用できる。
　羊毛根肌組織の採取は生検、毛刈りの際の毛組織からの採取でも良く、屠殺時の毛根肌組織を用いることもできるが、製造するコラーゲン産生促進懸濁液の上記効果を有効に発揮させるため、新鮮な状態で採取することが好ましい。
　また、取得した羊毛根肌組織は、採取後１時間以内に、本発明の製造方法に適用されることが望ましく、これは製造するコラーゲン産生促進懸濁液のコラーゲン産生作用を高めることができるからである。

　得られた羊毛根肌組織は、上記細胞保存液で洗浄後、コラゲナーゼを含有する細胞保存液に分散することにより、コラーゲン産生促進懸濁液が調製される。

　かかる洗浄には、洗浄液として、肌細胞を守る目的で上記細胞保存液が利用される。
　かかる細胞保存液には、上記したように、糖質や糖脂質が含有されており、これらの糖質と糖脂質が肌細胞を保護する。肌細胞が保護されることにより肌細胞内の糖質分解酵素や脂質分解酵素の働きが抑制されることで、得られるコラーゲン産生促進懸濁液によるコラーゲン産生を効果的に発揮することができる。
　例えば、羊毛根肌組織の１質量部に対して、洗浄液として利用する細胞保存液の量は質量比で１０倍以上となることが好ましい。

　次いで、洗浄された羊毛根肌組織を、コラゲナーゼを含有させた細胞保存液に分散させる。
　細胞保存液に含有させるコラゲナーゼは、特に限定されず、市場で入手し得る任意のコラゲナーゼを用いることができ、例えば、微生物を発酵して得られるタイプ、組織から得られるタイプのいずれを用いてもよく、新田ゼラチン製のコラゲナーゼＬやヤクルト製のコラゲナーゼは放線菌から分離され精製された酵素であるが、品質が高く、力価が高いことから好適に用いることができる。
　コラゲナーゼの添加量は、羊毛根肌組織の１質量部に対してコラゲナーゼを０．０００１～０．００１質量部添加することが望ましく、溶媒として、上記細胞保存液が用いられる。

　このように、細胞保存液にコラゲナーゼを溶解させて含有させることにより、コラゲナーゼによる細胞破壊を防御でき、新鮮な状態で肌細胞を分離し採取することが可能となる。これは、細胞保存液中に糖質と糖脂質が豊富に含まれるからであり、これにより細胞膜を保護することに起因している。
　更に、コラゲナーゼ含有細胞保存液は、壊れかけた肌細胞を破壊し、また生きた細胞だけを選択することができる。破壊された肌細胞は生きている状態とは異なり、肌に対する働きが減少し、逆に、肌に対する刺激になる場合があることから、かかる処理を行なうことが好ましい。

　次いで、コラゲナーゼ含有細胞保存液は羊毛根肌組織とともに加温される。
　加温する温度は３５～４５℃が好ましい。温度が３５℃未満であると、コラゲナーゼが十分に反応しないおそれがあり、一方、温度が４５℃を超えると、肌細胞に障害が及ぶ可能性がある。
　反応時間は、例えば約１時間～６時間が好ましく、細胞の分離状態を観察しながら、適宜時間を設定する。
　また、反応中に、液をゆっくり懸濁することは反応を促進することから好ましい。

　コラゲナーゼ含有細胞保存液中で反応後、直ちに氷冷する。
　氷冷によりコラゲナーゼの反応が停止する。
　次いで、該反応液に、上記細胞保存液を添加し、例えば１００メッシュの篩等により濾過する。
　濾過により得られた濾液を、常法により遠心分離して、細胞画分を採取する。
　好ましくは、更に少なくとも１回、上記細胞保存液を用いて、得られた細胞画分の洗浄を繰り返す。得られた肌細胞の数を計数し、細胞保存液１ｍＬ当たり１００００万個の細胞が含有されるように濃度に調製することが、肌細胞を安定させることができるため好ましい。
　このようにして、肌細胞が懸濁された肌細胞懸濁液であるコラーゲン産生促進懸濁液（肌細胞フレッシュエキスとも称す）を製造することができる。

　また、製造された肌細胞懸濁液を、超音波やホモジナイザー等により肌細胞を微粒子として、肌細胞微罪粒子懸濁液とし、コラーゲン産生促進懸濁液として調製することもできる。
　製造されたコラーゲン産生促進懸濁液の保存は、フレッシュな状態を維持してコラーゲン産生促進性能を保持するために、４℃以下の冷蔵状態で保存することが好ましい。

　製造されたコラーゲン産生促進懸濁液は、例えば、塗布や経口投与等することで、コラーゲン産生促進性能を発揮することができる。
　例えば、化粧料として、常法に従って必要に応じて添加される界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。化粧料の形態は、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状とすることができ、例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等とすることで、コラーゲン産生を促進する化粧料となる。

　また、コラーゲン産生促進懸濁液を経口投与の形態や医薬品開発に用いる場合には、コラーゲン産生促進懸濁液を更に精製して用いることが、純度を高め、不純物をさらに除去できる点から好ましい。
　医薬品としては注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として、また、医薬部外品としては、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用することができる。
　経口剤としては錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が例示でき、錠剤及びカプセル剤とする場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等の通常用いられる材料とともに用いることができる。また、錠剤は、シェラックや砂糖で被覆することもできる。

　カプセル剤の場合には、上記例示した材料に加えて、更に油脂等の液体担体を含有させることもできる。シロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等の通常用いられる材料を添加することができる。
　また、非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が例示でき、外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。
　注射剤としては、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。

　更に、食品製剤として美容を目的とした美容食品、美容を目的とした食品、肝臓細胞の維持を目的とした滋養強壮剤などに利用される。また、保健機能食品として、栄養機能食品や特定保健用食品に利用することが好ましい。
　また、得られた食品製剤はヒトだけでなく、イヌやネコなどのペットや家畜動物に利用することができ、皮膚の健康を維持する目的として、飼料やサプリメントとして利用することが可能である。

　本発明を以下の製造例、実施例及び試験例により説明する。
１．モズク発酵液の調製
　本発明のコラーゲン増加作用を有する化粧用懸濁液の調製に用いる細胞保存液であるモズク発酵液の製造例を以下に示す。

（製造例１）
　沖縄産のモズクの１０ｋｇを水洗後、粉砕機（株式会社奈良機械製作所製、スーパー自由ミル）に精製水１０Ｌとともに粉砕して、粉砕によるロス部分を除いた湿潤粉砕物１９ｋｇを得た。
　当該湿潤粉砕物を乾燥器を用いて４０℃で１８時間乾燥することによりモズク粉末を得た。
　かかるモズク粉末１２０ｇを清浄なステンレス製の寸胴に移し、該寸胴に精製水を１０Ｌ添加して懸濁させ、得られた懸濁液に、更に、水洗した日本産の大豆１２０ｇを添加し、次いで９５℃で１時間保持して煮沸滅菌した。
　煮沸滅菌した液を、撹拌式発酵タンク（横河電機社製、ＦＰ２１１）に移し、納豆菌（Bacillus subtilis；高橋菌）により４２℃で１８時間発酵させた。

　このようにして得られた発酵液の上清を濾過布により粗濾過して濾液を得た。
　かかる濾液に、分岐シクロデキストリン（塩水港精糖社製）１２０ｇを添加して攪拌し、次いで、プロテアーゼＭ（天野エンザイム製、「アマノ」ＳＤ）１２ｇを添加し、３７℃に加温して撹拌しながら３時間保持した。
　得られた反応液を濾紙（東洋濾紙）により吸引ろ過し、得られた濾液をパールウォーターＤＸ－７０００（製品名、第一産業株式会社製）を用いて電気分解し、陰極側よりアルカリ還元された溶液１３２ｍLを得た。
　かかる溶液を細胞保存液（モズクを発酵させた液）（１）とした。

（製造例２）
　北海道産のモズクの３ｋｇを水洗後、粉砕機（株式会社奈良機械製作所製、スーパー自由ミル）に精製水３Ｌとともに粉砕して、粉砕によりロス部分を除いた湿潤粉砕物５ｋｇを得た。
　当該湿潤粉砕物を乾燥器を用いて４０℃で１８時間乾燥することによりモズク粉末を得た。
　かかるモズク粉末１００ｇを清浄なステンレス製の寸胴に移し、該寸胴に精製水を７Ｌ添加して懸濁させ、得られた懸濁液に、更に、水洗した日本産の大豆１００ｇを添加し、次いで９５℃で１時間保持して煮沸滅菌した。
　煮沸滅菌した液を、撹拌式発酵タンク（横河電機社製、ＦＰ２１１）に移し、納豆菌（Bacillus　subtilis；高橋菌）４２℃で２４時間発酵させた。

　このようにして得られた発酵液の上清を濾過布により粗濾過して濾液を得た。
　かかる濾液に、分岐シクロデキストリン（塩水港精糖社製）１１０ｇを添加して攪拌し、次いで、プロテアーゼＭ（天野エンザイム製、「アマノ」ＳＤ）１１ｇを添加し、３７℃に加温して攪拌しながら室温で３時間保持した。
　得られた反応液を濾紙（東洋濾紙）により吸引ろ過し、得られた濾液をパールウォーターＤＸ－７０００（製品名、第一産業株式会社製）を用いて電気分解し、陰極側からアルカリ還元された溶液９５ｍLを得た。
　かかる溶液を細胞保存液（モズクを発酵させた液）（２）とした。

　上記製造例１及び製造例２で得られた細胞保存液（１）及び（２）の性状を以下の表１及び２に示す。

２．コラーゲン産生促進懸濁液（肌細胞フレッシュエキス）
[実施例１]
　北海道夕張地区で飼育された生後１年のメリノ種の羊より毛根肌組織を採取した。
　かかる羊毛根肌組織は採取１時間後に、上記製造例１の細胞保存液（１）を用いて室温で十分に洗浄した。
　具体的には、羊毛根肌組織３ｋｇに対して、上記細胞保存液（１）を３０Ｌ用いて室温で洗浄した。
　また細胞保存液（１）３ＬにコラゲナーゼＬ（新田ゼラチン製）３ｇを添加して室温で溶解させた。

　上記洗浄後の羊毛根肌組織を、清浄なタンクに移し、前記コラゲナーゼＬ（新田ゼラチン製）３ｇを含有させたモズク発酵液（１）３Ｌに分散させて、３７℃で攪拌しながら２時間反応させた。
　得られた反応液を４℃に氷で冷却し、ステンレス製の１００メッシュの篩により濾過した。
　濾液を遠心分離機（日立株式会社製）を用いて、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈殿した肌細胞を採取し、細胞保存液（１）１０Ｌを用いて室温で洗浄した。
　洗浄した肌細胞を再度、上記と同様の条件で肌細胞を遠心分離し、沈殿した肌細胞を採取し、細胞保存液（１）に懸濁した。
　なお、採取した肌細胞数を血球計算器と顕微鏡を用いて計数し、細胞保存液（１）中に含まれる肌細胞を１０００万個／ｍＬの濃度に調整した。

　かかる肌細胞を１０００万個／ｍＬの濃度で含む細胞保存液３９０ｇをホモジナイザーにて懸濁することで、３５０ｇの肌細胞微細粒子懸濁液であるコラーゲン産生促進懸濁液を得た。
　かかる肌細胞微細粒子懸濁液を４℃に保管した。

[実施例２]
　北海道夕張地区で飼育された生後９か月のメリノ種の羊より毛根肌組織を採取した。
　かかる羊毛根肌組織は採取３０分後に、上記製造例２の細胞保存液（２）を用いて室温で十分に洗浄した。
　具体的には、羊毛根肌組織１ｋｇに対して、上記細胞保存液（２）を１０Ｌを用いて室温で洗浄した。
　また細胞保存液（２）１ＬにコラゲナーゼＬ（新田ゼラチン製）１ｇを添加して室温で溶解させた。

　上記洗浄後の羊毛根肌組織を、清浄なタンクに移し、前記コラゲナーゼＬ（新田ゼラチン製）１ｇを含有させた細胞保存液（２）１Ｌに分散させて、３７℃で攪拌しながら２時間反応させた。
　得られた反応液を４℃に氷で冷却し、ステンレス製の１００メッシュの篩により濾過した。
　濾液を遠心分離機（日立株式会社製）を用いて、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈殿した肌細胞を採取し、細胞保存液（２）３Ｌを用いて室温で洗浄した。
　洗浄した肌細胞を再度、上記と同様の条件で遠心分離し、沈殿した肌細胞を採取し、細胞保存液（２）に懸濁した。
　なお、採取した肌細胞数を血球計算器と顕微鏡を用いて計数し、細胞保存液（２）中に含まれる肌細胞を１０００万個／ｍＬの濃度に調整した。

　かかる肌細胞を１０００万個／ｍＬの濃度で含む細胞保存液１５０ｇをホモジナイザーにて懸濁することで、１２２ｇの肌細胞微細粒子懸濁液であるコラーゲン産生促進懸濁液を得た。
　かかる該肌細胞微細粒子懸濁液を４℃に保管した。

[実施例３]
　北海道夕張地区で飼育された生後１０か月のメリノ種の羊より毛根肌組織を採取した。
　かかる羊毛根肌組織は採取５０分後に、上記製造例２の細胞保存液（２）を用いて室温で十分に洗浄した。
　具体的には、羊毛根肌組織１ｋｇに対して、上記細胞保存液（２）を１０Ｌを用いて室温で洗浄した。
　また細胞保存液（２）１ＬにコラゲナーゼＬ（新田ゼラチン製）１ｇを添加して室温で溶解させた。

　かかる肌細胞を１０００万個／ｍＬの濃度で含む細胞保存液１４０ｇをホモジナイザーにて懸濁することで、１３２ｇの肌細胞微細粒子懸濁液であるコラーゲン産生促進懸濁液を得た。
　かかる肌細胞微細粒子懸濁液を４℃に保管した。

３．コラーゲン産生試験
[試験例１]
　クラボウ株式会社より入手したヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を用い、培養液として５％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ製）を用いて培養した。
　ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）１０００個を３５ｍｍ培養シャーレ（ＦＡＬＣＯＮ製）に播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。
　これに、上記実施例１で得られたコラーゲン産生促進懸濁液（１）と、対照として線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、Ｓｉｇｍａ製）をそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、５％炭酸ガス下、３７℃で、４８時間培養した。ＦＧＦは皮膚線維芽細胞を増殖させ、コラーゲンを産生させる生理物質として従来より利用されているものである。
　また、溶媒および溶媒対照としてリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を用いた。
　細胞を剥離後、細胞数を計数した。また、シャーレは５枚を用いてその平均値を算出した。
　その結果を表３に示す。

　本発明により製造された実施例１で得られたコラーゲン産生促進懸濁液（１）を０．１ｍｇ／ｍｌ添加することにより、線維芽細胞数が溶媒対照群に比して平均値として３０５％に増加した。また、コラーゲン量をＥＬＩＳＡキット（和光純薬製）により定量した結果、溶媒対照群に比して平均値で４３９％になった。
　更に、対照としたＦＧＦでは細胞数が対照群に比して１７７％であり、産生されたコラーゲン量は２２７％となった。従って、本発明により製造された実施例１で得られたコラーゲン産生促進懸濁液（１）は、コラーゲン量の増加に優れていることが明らかである。

[試験例２]
　液体窒素中に保存している正常ヒト繊維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を解凍し、試験を実施するに十分な細胞数となるまで５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地にて培養を行なった。
　予備試験にて細胞に毒性を示さない濃度を確認して、得られた正常ヒト繊維芽細胞を０．５％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地で希釈して、以下の表４に示す３つの濃度の、実施例２で得られたコラーゲン産生促進懸濁液を用いた試験試料溶液を作成した。
　試験を実施するのに十分な量となった細胞を、トリプシン処理により回収した後、９６ウェウマイクロプレートの各ウェルに播種し、２４時間、３７℃で前培養を行なった。
　該プレートから培地を除去し、表４に示す試験試料を含む培地に置き換え、更に４８時間培養を続行した。

　ヒトコラーゲン　タイプ１　ＥＬＩＳＡのプロトコルに従って、各試験試料によるコラーゲン生成量を算出し、また細胞を培養したプレートから培地を除去し、ＭＴＴアッセイにより細胞生存率を測定し、細胞生存率１００％あたりのコラーゲン濃度（μｇ/ｍＬ）を算出した。但し、試験は２回行ない、平均値にて評価を行なった。
　試験試料濃度に対する細胞生存率１００％当りのコラーゲン濃度（細胞数に応じたコラーゲン量）を表４及び図１に示す。なお、対照としての培地のみの場合も示す。

　上記表４及び図１より、本発明により製造されたコラーゲン産生促進懸濁液は、コラーゲン濃度が上昇しており、コラーゲン産生性能に優れていることがわかる。

　本発明のコラーゲン産生促進剤は、皮膚化粧料及び美容飲食品、薬品等に用いることができ、皮膚の老化の予防や改善等に有効に利用される。

Claims

　モズク及び大豆を納豆菌で発酵させ、得られた発酵液に分岐シクロデキストリンを添加してプロテアーゼ処理し、次いでアルカリ還元処理をすることで調製された細胞保存液に、コラゲナーゼを配合してコラゲナーゼ含有細胞保存液を調製し、次いで該コラゲナーゼ含有細胞保存液に羊毛根肌組織を添加分散させて反応させ、反応後の肌細胞を細胞保存液に懸濁させて懸濁液とすることを特徴とする、コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法。
　請求項１記載のコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法において、羊毛根肌組織をコラゲナーゼ含有細胞保存液に添加分散させて反応させる前に、該羊毛根肌組織を細胞保存液で洗浄することを特徴とする、コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法。
　請求項１または２記載のコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法において、反応後に得られた肌細胞を細胞保存液に懸濁させる前に、該肌細胞を細胞保存液で洗浄することを特徴とする、コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法。
　請求項１乃至３いずれかの項記載のコラーゲン産生促進懸濁液の製造方法において、反応後の肌細胞を細胞保存液に懸濁させた懸濁液を、超音波破砕処理又はホモジナイザー処理することにより肌細胞微細粒子懸濁液とすることを特徴とする、コラーゲン産生促進懸濁液の製造方法。