CN101297806B - 腺苷酸激活的蛋白激酶抑制剂Compound C在制备预防和治疗肥胖的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂compound C的在制备预防和治疗肥胖的药物中的应用。AMPK活性抑制剂compound C可通过抑制前脂肪细胞向脂肪细胞的分化进程。在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中,compound C除了抑制AMPK活性外,还剂量依赖性抑制脂质的形成,下调前脂肪细胞分化早期关键转录因子C/EBP家族和PPARγ的表达水平,抑制前脂肪细胞分化早期的克隆性增殖过程。本发明所述的AMPK抑制剂Compound C的新应用,将为临床预防和治疗肥胖提供一种新药物。
Description
技术领域
本发明涉及腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂compound C的新应用。
背景技术
Compound C(6-[4-(2-piperidin-1-yl-etoxy)-phenyl)]-3-pyridin-4-yl-pyrrazolo[1,5-a]pyrimidine),又称dorsomorphin,是一种具有细胞渗透性的化合物,分子式为C24H25N5O,结构式为:
Compound C为腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂,竞争其ATP结合位点。在5μMATP并且缺失AMP的条件下其Ki值为109nM。研究表明,compound C选择性抑制AMPK活性,对于其它一些结构相关的激酶,包括ZAPK,spleen tyrosine kinase(SYK),protein kinaseC-θ(PKCθ),protein kinase A(PKA)和Janus kinase 3(JAK3),均无明显抑制作用。据报道,compound C可降低小鼠的食物摄取,抑制AICAR和metformin的作用,如肝细胞中AICAR诱导的ACC磷酸化和脂肪酸氧化等。在脂肪细胞中,compound C还可通过上调肉碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)的活性来刺激长链脂肪酸的氧化。新近研究发现,compound C可以有效地抑制缺氧诱导的缺氧诱导因子-1(HIF-1)的激活;还可抑制骨形态发生蛋白(BMP)I型受体ALK2,ALK3和ALK6的功能,从而阻断BMP介导的SMAD1/5/8的磷酸化、靶基因的转录以及成骨分化。但是,至今为止尚未见到有关AMPK抑制剂compound C,抑制脂肪细胞分化,从而用于制备防治肥胖药物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂compound C的新用途。
实现上述目的的技术方案如下:
腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂compound C在制备预防和治疗肥胖的药物中的应用。
本发明的腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂compound C在制备预防和治疗肥胖的药物中的应用,其中,腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂compound C的浓度为优选为10-20μM,更优选为10-15μM。
本发明的依据是:一方面,能量代谢平衡失调是肥胖发生的主要原因。AMPK信号通路是调节细胞状态的中心环节,它通过关闭合成代谢,开启分解代谢,促使周围组织的代谢恢复平衡;同时可以通过激素、细胞因子和胞外配体调控整体水平的能量摄入和消耗。多方面的协同作用降低了机体循环中葡萄糖和脂质的水平,减少了脂质异位沉积,增强了胰岛素敏感性。目前认为AMPK信号通路有望成为防治肥胖的新靶点,以AMPK为靶点的新型药物,将会为肥胖的治疗提供新的希望和保证。另一方面,脂肪细胞分化是正常机体内脂肪贮存的生理基础,也是肥胖发生的病理基础。当成熟脂肪细胞的数量及其贮存的脂肪含量超过一定限度时,便出现了肥胖的病理状况。肥胖传统的治疗方法常以降低成熟脂肪细胞脂质含量为目标,但这些脂肪细胞仍存在着合成脂质所需要的酶和关键蛋白,具有重新台成大量脂肪的能力,这是导致肥胖治疗失败的一个重要因素。因此,抑制脂肪细胞分化才有可能对肥胖进行根本性的治疗。
经大量试验研究发现,AMPK活性抑制剂compound C可通过抑制前脂肪细胞向脂肪细胞的分化进程。在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中,compound C除了抑制AMPK活性外,还剂量依赖性抑制脂质的形成,下调前脂肪细胞分化早期关键转录因子C/EBP家族和PPARγ的表达水平,抑制前脂肪细胞分化早期的克隆性增殖过程。本发明所述的AMPK抑制剂Compound C的新应用,将为临床预防和治疗肥胖提供一种新药物。
附图说明
图1为compound C对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响示意图;
图2显示在3T3-L1前脂肪细胞分化不同阶段compound C对几种分化早期脂肪细胞特异转录因子表达水平的影响示意图;
图3为compound C对3T3-L1前脂肪细胞分化早期克隆性增殖的影响示意图;
图4为compound C对3T3-L1前脂肪细胞分化过程中AMPK活性的影响示意图。
具体实施方式
实施例1:compound C对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响
当3T3-L1前脂肪细胞生长至完全融合后2天,换成分化培养液(含0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤,1μM地塞米松,5μg/ml胰岛素和10%胎牛血清的DMEM高糖培养液),诱导其向脂肪细胞分化。同时分别加入终浓度为0.1μM、1μM、5μM、10μM、15μM和20μMcompound C,以DMSO为正常对照。诱导分化2天后换成含5μg/ml胰岛素和10%胎牛血清的DMEM高糖培养液,并分别加入以上终浓度的compound C,培养2天。随后以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液继续培养,每隔2天换1次培养液,同时加入以上终浓度的compound C。在诱导分化的第8天固定细胞,进行Oil Red O染色,显微镜下观察染色情况并拍照。之后,对染色结果进行定量分光光度分析,用100%的异丙醇萃取染液,用酶标仪读取A500nm值。A500nm值代表了细胞中的甘油三酯含量,反映了3T3-L1前脂肪细胞的分化程度。
参见图1,各数值表示为四次检测的平均值±SD。*,与未经compound C处理的分化后细胞相比p<0.05;#,与未经compound C处理的分化后细胞相比p<0.001。
从图1-A可以看出,对照组细胞分化良好,胞质中形成许多饱满的脂滴,而经compound C处理后细胞内脂滴的形成明显受到抑制,并且这种抑制效应随着compound C剂量的增加而增强。细胞染色定量分光光度分析的结果如图1-B所示,对照组呈现最高的染色水平,低剂量compound C(0.1μM、1μM和5μM)处理的细胞其脂质染色水平略有降低。而10μM compoundC处理明显降低细胞的脂质含量,与对照组相比差异具有显著性(p<0.05);高剂量compoundC(15μM和20μM)处理则显著抑制脂滴的形成,甚至完全阻断脂质生成,与对照组相比差异具有显著性(p<0.001)。此结果表明,compound C抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化,且作用方式呈量效关系。
实施例2:compound C对前脂肪细胞分化早期特异转录因子表达水平的影响
诱导3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化,同时加入15μM compound C,以DMSO为正常对照。分别在诱导分化后的第0、2、8、16、24、36和48小时收集细胞,提取总RNA,进行荧光实时定量PCR分析,检测在分化早期C/EBPβ和C/EBPδ表达水平的变化。诱导3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化,同时分别加入10μM和15μM compound C,以DMSO为正常对照。分别在分化的第0、2、4和8天收集细胞,提取总RNA,进行荧光实时定量PCR分析,检测前脂肪细胞分化早期转录因子C/EBPα和PPARγ表达水平的变化。
参见图2。各数值表示为三次检测的平均值±SD。*,与分化不同时期未经compound C处理的细胞相比p<0.05;#,与分化不同时期未经compound C处理的细胞相比p<0.001。
从图2-A可以看出,对照组C/EBPβ和C/EBPδmRNA表达水平在诱导分化后2小时内急剧上升并达到峰值,之后的表达水平逐渐降低,16小时后其表达量趋于稳定。然而,在诱导分化后的8小时内,compound C明显抑制C/EBPβ表达量的上调,差异具有显著性(p<0.05)。但16小时以后,即对照组C/EBPβ表达量维持在较低水平时,compound C的抑制作用消失。相反地,在分化初期的48小时内,C/EBPδ的表达水平始终被compound C抑制在对照组的50%左右,差异具有显著性(p<0.05)。
从图2-B可以看出,对照组C/EBPα和PPARγ的表达在分化第2天显著升高,并在后续分化过程中保持高水平表达。然而,10μM compound C处理组C/EBPα和PPARγ的表达水平明显降低,15μM compound C则完全阻断了C/EBPα和PPARγ的表达。C/EBPβ和C/EBPδ的活性可以调解C/EBPα和PPARγ的表达水平,从而诱导分化过程中一系列基因的表达。该结果表明compound C通过抑制C/EBPβ和C/EBPδ的表达来抑制C/EBPα和PPARγ的表达,进而抑制一系列脂肪特异基因的转录,从而抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化。
实施例3:Compound C对前脂肪细胞分化早期克隆性增殖的影响
诱导3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化,同时加入10μM和15μM compound C,以DMSO为正常对照。分别在分化的第0、1、2和3天,对不同处理的细胞进行计数。
参见图3,各数值表示为四次检测的平均值±SD。*,与分化不同时期未经compound C处理的细胞相比p<0.05;#,与分化不同时期未经compound C处理的细胞相比p<0.001。
从图3可以看出,在分化早期,对照组细胞有一个明显的克隆扩增过程,与第0天相比,第3天的细胞数目增长到3倍。然而,10μM和15μM compound C处理的细胞组则明显抑制了细胞增殖的过程,与第0天相比,第3天的细胞数目分别增长到2倍和1.5倍。前脂肪细胞分化初期的克隆性增殖是脂肪细胞分化所必需的过程,该结果表明,compound C显著抑制前脂肪细胞分化初期的克隆性增殖,从而抑制前脂肪细胞的分化。
实施例4:compound C对前脂肪细胞分化过程中AMPK活性的影响。
诱导3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化,同时加入不同浓度的compound C(1μM、10μM和20μM),以DMSO为正常对照。在诱导分化的第八天收集细胞,进行Western Blotting检测,分析磷酸化ACC(p-ACC)、总ACC(t-ACC)、磷酸化AMPKα(p-AMPKα)和总AMPKα(t-AMPKα)的水平。从图4-A可以看出,随着compound C使用剂量的增加,p-ACC和t-ACC的水平逐渐下降,但p-ACC降低的程度明显高于t-ACC降低的程度,表明compoundC剂量依赖性抑制AMPK的活性。相反地,p-AMPKα和t-AMPKα的水平并未受到compoundC的影响,因为compound C虽然抑制AMPK的活性,但并不影响AMPK上游激酶的活性,所以它仅引起ACC磷酸化水平的下降,而不降低AMPKα自身的磷酸化程度。
诱导3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化,同时加入10μM compound C,以DMSO为正常对照。分别在分化的第0、2、4天收集细胞,进行Western Blotting检测,分析p-ACC和t-ACC的水平。从图4-B可以看出,在分化早期对照组ACC的表达和磷酸化水平逐渐升高,尤其在分化的起始阶段(前2天)磷酸化ACC水平显著增加。然而,10μM compound C处理则明显抑制ACC磷酸化水平的上升,表明compound C抑制前脂肪细胞分化早期AMPK的活性,从而抑制前脂肪细胞的分化。
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