CN104053655A - 独脚金内酯和独脚金内酯类似物在治疗增殖性病症中的用途 - Google Patents

独脚金内酯和独脚金内酯类似物在治疗增殖性病症中的用途 Download PDF

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Abstract

式X化合物或者其各种异构体或药物可接受的盐、或者其混合物，用于制备用于预防或抑制细胞增殖或用于诱导细胞死亡之活性剂，其中P1为包含一个6元环和两个5元环的稠环系统；v表示S或R构型。

Description

独脚金内酯和独脚金内酯类似物在治疗增殖性病症中的用途
技术领域
本发明涉及独脚金内酯(strigolactone)和/或独脚金内酯类似物，单独或者与一种或更多种另外的药物活性化合物任意组合，作为活性剂在预防或抑制细胞增殖中的用途。
背景技术
整个本申请提到的所有出版物全部通过引用并入本文，包括其中引用的所用参考文献。
瘤病症以瘤形成(细胞的异常增殖)导致的组织之异常质量为特征。所述病症通常引起肿块(lump)或肿瘤。瘤可以为良性的、恶化前的(原位癌)或恶性的(癌症)。人类癌症疾病(如乳腺癌和肺癌)目前每年在全世界夺走数百万生命。癌症最近已经变成了世界上最主要的死亡原因。尽管在过去的几十年里在乳腺癌和肺癌的治疗中采用了积极的方法，然而例如肺癌5年的存活率维持在＜15％。手术、化学治疗和放射治疗通常已经不令人满意，特别是在晚期疾病的治疗中。因此，明显需要基于对疾病生物学之更好的理解的新药物以提高各种类型之恶性癌症的治疗效力。
来自植物提取物的天然化合物或者这些化合物的衍生物已经显示具有作为抗癌剂的活性，所述抗癌剂用作人类癌细胞的生长抑制剂，如紫杉醇(paclitaxel)，其用于乳腺癌和非小细胞肺癌的治疗。
紫杉醇由美国国家癌症研究所(US National Cancer Institute)于1967年发现，在那里的研究中其从太平洋紫杉树(Taxus brevifolia)的树皮中被分离出来并命名为泰素(taxol)。药物由Bristol-Myers Squibb商业开发，因此其通用名称改为紫杉醇。在最近的研究中已经发现紫杉醇通过在癌细胞内诱导Bcl-2的磷酸化来导致程序性细胞死亡(如Haldar，S.等，CancerRes.56，1253-1255，1996所描述的)。另一个实例涉及包括天然及合成维生素A衍生物在内的视黄醛衍生物，其已显示出通过与核受体相互作用来调整细胞生长以及正常和瘤上皮细胞的分化，所述核受体起视黄醛衍生物依赖性转录因子的作用(例如由Amos和Lotan，Methods Enzymol，190，217-225，1990所描述的)。最显著地，视黄酸正在被用于治疗一些白血病(即PML)。
式I的天然独脚金内酯
其中，例如R1为H、OH或OAc，R2为H、OH或OAc且R3为H或甲基，是一组已经与茎分枝(shoot branching)的抑制有关并作为植物相互作用之信号分子的植物激素(如Dun等，Trends Plant Sci.，14，364-372，2009所描述的)。这些天然产生的化学物质是一组多数植物可能使用类胡萝卜素作为起始原料合成的密切相关的分子(closely-related molecule)。独脚金内酯引发寄生植物种子(例如它们由其得名的独脚金(Striga))的萌发并刺激共生的菌根真菌菌丝之分枝。
天然产生的独脚金内酯之类似物是合成的植物激素(3aR＊，8bS＊，E)-3-(((R＊)-4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基)亚甲基)-3，3a，4，8b-四氢-2H-茚并[1，2-b]呋喃-2-酮(GR-24)，其影响根分生组织中的细胞周期。该化合物保留了天然独脚金内酯之生物活性，具有用于在种植期望作物前诱导寄生种子萌发的潜能。
程序性细胞死亡本质上是植物界多细胞机体中作为对于环境提示(environmental cue)之应答的共同特征。植物中程序性细胞死亡的实例为例如秋季的叶落和病原体攻击期间的高灵敏度应答(hypersensitivereponse)。活性氧物质已经涉及多种类型细胞死亡的调控。然而，活性氧物质参与导致细胞死亡开始和接下来的牵制(containment)之过程的准确机制目前是未知的。已经证明了拟南芥(Arabidopsis)蛋白GRIM REAPER参与调控胁迫条件下活性氧物质诱导的细胞死亡。
抗增殖剂具有有价值的用途，所述用途超出了在人类和动物健康中非常重要的用途并可应用于植物、酵母、真菌等。
本发明的一个目的是提供用于预防或抑制多种有机体中细胞增殖的活性剂。
本发明的另一个目的是提供包含独脚金内酯和独脚金内酯类似物的药剂，其可以有利地用于多种癌症病症的治疗，且与已知方法和治疗相比副作用降低。
本发明的另一个目的是提供包含独脚金内酯和/或独脚金内酯类似物的组合物和药剂，及其在治疗癌症中的用途。所述组合物和药剂可以包含另外的抗癌剂、其他活性剂和其他添加剂。
在另一方面，本发明提供了通过施用独脚金内酯和/或独脚金内酯类似物治疗癌症的方法。
此外，本发明的使用减轻或者消除了已知癌症治疗之不期望的副作用。
本发明的上述和其他目的和优点将随着说明的进行变得明显。
发明内容
已经出人意料地发现，天然独脚金内酯(在下文中“独脚金内酯”)和取代的独脚金内酯类似物(在下文中“独脚金内酯类似物”)可以在许多应用(如人类癌细胞)中用作预防或抑制细胞增殖的活性剂，并因此可用于治疗多种癌症，如乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌。
根据本发明的一个实施方案，用于预防或抑制细胞增殖的活性剂适于治疗多种疾病和病症(包括动物(包括人)中的瘤病症)，以及治疗细菌和真菌感染。
根据本发明的一个具体实施方案，药剂是抗肿瘤制剂。根据本发明的一个实施方案，该抗肿瘤制剂适于治疗选自乳腺症、肺癌、前列腺癌或结肠癌以及黑素瘤的病症。任选地，该抗肿瘤制剂进一步包含一种或者更多种另外的活性剂。
因此，本发明及式X化合物或者其各种异构体或药物可接受的盐、或者其混合物在制备用于预防或抑制细胞增殖或者用于诱导细胞死亡之活性剂中的用途
其中P1为包含一个6元环和两个5元环的稠环系统(fused-ring system)；且其中表示S或者R构型。
根据本发明的一个实施方案，式X化合物的P1具有以下式或者其各种异构体或药物可接受的盐、或者其混合物，用于制备抗肿瘤药物组合物
其中，
表示连接点；
虚线表示任选的双键；
R1和R6独立地为H、OH、任选地被卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、环烷基、芳基或者任选地被烷基取代的杂芳基；
P2为任选取代的6元环；
Z和Y独立地为O、CH或N；并且
m和n独立地为0或1；
条件是如果Z为O，则m为0，且如果Z为CH或N，则m为1；并且条件是如果Y为O，则n为0，且如果Y为CH或N，则n为1。
根据本发明的另一实施方案，式X化合物的P2选自
其中
R2或R5独立地表示H、羟基、卤素、低级烷氧基、酰氧基、羧基、低级烷氧羰基、氨甲酰基、N-单取代或N，N-二取代的氨甲酰基、氨基、单取代或二取代氨基、环烷基、杂环基、芳基、或者包含0、1、2或3个环氮原子和0或1个氧原子和0或1个硫原子的单或双环杂芳基，在每种情况下所述基团是未取代的或者是单取代或多取代的；
R3或R4独立地表示H、羟基、卤素、C1-C6烷基、环烷基、苯并环烷基、杂环基、芳基或取代的苯基、或者包含0、1、2或3个环氮原子和0或1个氧原子和0或1个硫原子的单或双环杂芳基，在每种情况下所述基团是未取代的或者是单取代或多取代的；
R7为H、OH、CH3、CH2OH或OAc；
R8为O或OH，其中如果R3是O，该键为双键；并且
R9为H、OH或OAc。
在一个具体的实施方案中，式X化合物为式I的化合物
其中R7、R8和R9如上文所定义；并且R10为H、OH或OAc。
在本发明的另一个具体实施方案中，P1具有以下式II
其中
表示连接点；
虚线表示任选的双键；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、P、Q、Z、Y、m和n如上文所定义。
在一个具体实施方案中，式II化合物选自
3aR＊，8bS＊，E)-3-(((R＊)-4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基)-亚甲基)-3，3a，4，8b-四氢-2H-茚并[1，2-b]呋喃-2-酮，
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-1，4-二氢-2H-环戊(cyclopenta)并[b]吲哚-3-酮，
(±)(2E)-7-溴-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-1，4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮，
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-7-(4-硝基苯基)-1，4-二氢-2H环戊并[b]吲哚-3-酮，
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-7-(2-噻吩基)-1，4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮，
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-7-[(4-二甲基氨基)-苯基]-1，4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮，
(2E)-7-(1-甲氧基萘-2-基)-1，4-二甲基-2-((4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基)亚甲基)-1，2-二氢环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮，
(2E)-2-[(2，5-二氢-4-甲基-5-氧代呋喃-2-基氧基)亚甲基]-1，2-二氢-7-[4-(二甲基氨基)苯基]-1，4-二甲基-环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮，
(2E)-1，4-二甲基-2-((4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基)亚甲基)-7-(噻吩-2-基)-1，2-二氢环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮，
(2E)-2-[(2，5-二氢-4-甲基-5-氧代呋喃-2-基氧基)亚甲基]-1，2-二氢-7-(2，3-二氢噻吩并[3，4-b][1，4]二氧杂芑-7-基)-1，4-二甲基环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮，
(±)2E-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-6-噻吩-2-基-1，4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮，
(3aR＊，8bS＊，E)-3-(((R＊)-4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基)亚甲基)-3，3a，4，8b-四氢-2H-茚并[1，2-b]呋喃-2-酮，
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-1，4-二氢-2H环戊并[b]吲哚-3-酮，
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-7-[(4-二甲基氨基)-苯基]-1，4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮，
(2E)-1，4-二甲基-2-((4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基)亚甲基)-7-(噻吩-2-基)-1，2-二氢环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮，
(2E)-2-[(2，5-二氢-4-甲基-5-氧代呋喃-2-基氧基)亚甲基]-1，2-二氢-7-(2，3-二氢噻吩并[3，4-b][1，4]二氧杂芑-7-基)-1，4-二甲基-环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮，和
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-6-噻吩-2-基-1，4-二氢-2H环戊并[b]吲哚-3-酮，以及
其组合。
本发明的另一个方面涉及抗增殖组合物，其包含式X化合物或者其各种异构体或药物可接受的盐、或者其混合物。所述组合物适于杀死癌症干细胞(cancer stem cell，CSC)或肿瘤起始细胞(tumor initiating cell，TIC)，并适于表面、经肠、经口、经直肠或胃肠外施用。所述组合物还适于预防或抑制酵母和真菌的生长或者破坏酵母和真菌。
本发明进一步涵盖治疗增殖性病症的方法，其包括向有此需要的患者施用式X化合物或者其异构体或药物可接受的盐、或者其混合物。所述方法可以包括在至少一种其他癌症治疗之前施用式X化合物、至少一种其他癌症治疗之后施用式X化合物或者与至少一种其他癌症治疗一起施用式X化合物。
在本发明的一个具体实施方案中，式I化合物选自
可以根据本发明利用之式X的另外的天然独脚金内酯具有以下式：
本发明进一步涉及上文所定义的式X化合物，其用作抗增殖剂。
除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的具有相同的含义。虽然可以在本发明实施方案的实践或测试中使用与本文描述的相似或者相当的方法和材料，但是示例性方法和/或材料描述如下。在有冲突的情况下，本专利的说明书(包括定义)将占优。此外，材料、方法和实例仅仅是说明性的，不旨在必定为限制性的。
附图说明
本发明的上述和其他特征和优点通过下文的实例并参考附图会更明显，其中：
图1描绘了GR-24对根尖的作用。显示了GR-24的摩尔浓度。箭头指向肿胀的根尖。比例尺：50μm。LR-侧根。
图2描绘了GR-24对根尖细胞之组织的作用。显示了GR-24的摩尔浓度。箭头指向异常的细胞分裂位点。比例尺：50μm。LR-侧根。
图3显示了GR-24对乳腺癌细胞系增殖的作用：(A)暴露于GR-24之MDA-MB-231、MDA-MB-436、MCF-7和BJ“正常”成纤维细胞的吸光度图。(B)显示了暴露于GR-247天后吸光度(560nm)的图。
缩写：Abs.(吸光度)、cont.(对照)、T.(时间)、d.(天数)、Fib.(成纤维细胞)。
图4描绘了GR-24对细胞周期进程的作用。数据是两个独立实验的代表性数据。
缩写：Cell Cyc.Ph.(细胞周期时相(Cell Cycle phases))。
图5描绘了GR-24存在下的球囊形成(mammosphere formation)。图像是在GR-24、载体对照(vehicle control)或者未处理(-)存在下生长的初级球囊(A)或次级球囊(B)或MDA-MB-231初级球囊(C)的代表性明视野图像(放大倍率：10×(A，B)，20×(C))，比例尺100μm。相应的柱状图显示了在5×放大倍率下可见的96孔板每孔球囊(在100μm直径内)的平均数量。数据以一式三份孔的平均值±标准差(SD)来报告并代表至少两个独立的实验。使用学生t检验(双尾、配对)评价了GR-24处理组与载体(对照)组且如果p＜0.05(＊)则认为是显著的，如果P＜0.01(＊＊)则认为是非常显著的，如果p＜0.001(＊＊＊)则认为是极显著的。
缩写：cont.(对照)、conc.(浓度)、Pri.Mam.(初级球囊)、Sec.Mam.(次级球囊)。
图6显示了GR-24处理后的生存力和ALDH表达：(A)对用GR-24处理的MCF-7次级球囊的XTT生存力检测。数据以载体对照的百分数报告。柱为一式三份样品的平均值±标准差(SD)。使用学生t检验(双尾、配对)评估了5ppm处理组和对照组，p＝0.0065(＊＊)。(B)ALDH1在初级MCF-7球囊中表达的分析。
缩写：Viab.(生存力)、cont.(对照)、conc.(浓度)、Ad.(贴壁(adherent))、Sec.Mam.(次级球囊)、Pri.(初级)、exp.(表达)。
图7的(A)-(C)描述了独脚金内酯类似物对人类癌细胞系生长和生存力的影响。图代表对每个分析用一式两份复制孔(duplicate replicate well)进行的两个独立实验。
缩写：Viab.(生存力)、cont.(对照)、conc.(浓度)。
图8描述了用独脚金内酯类似物处理的癌细胞系的细胞周期分析。
缩写：Cell Cyc.Dis.(细胞周期分布)、SL.Ana.(独脚金内酯类似物)。
图9显示了独脚金内酯类似物诱导MDA-MB-231细胞中的凋亡：(A)用独脚金内酯类似物ST-362处理的MDA-MB-231细胞的Hoechst33342染色(放大倍率200×。比例尺50μM)。(B)-(E)于独脚金内酯暴露后之XTT生存力检测。数据以载体对照组的百分数报告。柱代表平均值±SD。统计分析为相对于载体对照的学生t检验(双尾、配对)，且如果P＜0.05(＊)、P＜0.01(＊＊)、P＜0.001(＊＊＊)就认为是显著的。
缩写：Vehi.(载体)、Viab.(生存力)、cont.(对照)、conc.(浓度)、SL.RelT.(独脚金内酯释放时间)、hr.(小时)。
图10显示了独脚金内酯类似物对MCF-7球囊形成的影响：(A)大于100μm直径球囊数量的计数。(B)XTT生存力的评估。(C)使用双尾学生t检验进行在独脚金内酯类似物处理后球囊数量的统计分析，p≤0.05(＊)，p≤0.005(＊＊)，p≤0.001(＊＊＊)。
缩写：Vehi.(载体)、Mam.Num.(球囊数量)、cont.(对照)、SL.Ana.(独脚金内酯类似物)、Viab.(生存力)。
图11描述了独脚金内酯类似物对初级MCF-7球囊完整性和生存力的影响：(A)独脚金内酯处理2天后球囊的代表性图像(放大倍率100×，比例尺，100μM。插图，放大的图像)。(B)-(C)独脚金内酯处理5天后球囊数量和生存力的统计分析。
统计分析，双尾学生t检验，p＜0.05(＊)，p＜0.01(＊＊)，p＜0.001(＊＊＊)。
缩写：Vehi.(载体)、Mam.Num.(球囊数量)、cont.(对照)、SL Ana.(独脚金内酯类似物)、Viab.(生存力)。
图12显示了独脚金内酯类似物处理引起G2停顿(arrest)并诱导多种癌细胞系的凋亡(A)-(C)。(D)+(G)的柱状图显示了HCT116细胞在独脚金内酯类似物处理后早期(膜联蛋白-/PI+，灰色柱)细胞凋亡和晚期(膜联蛋白+/PI+，黑色柱)细胞凋亡中的分布。(E)磷酸化丝氨酸10组蛋白-H3(垂直)相对于用指定剂量的ST-357(中间图)或MEB-55(下图)处理之HCT116细胞DNA含量(水平)的代表性FACS分析。(F)用独脚金内酯类似物处理的HCT116细胞的FACS分析(膜联蛋白V染色)。
缩写：Cell Cyc.Dis.(细胞周期分布)、Apo.(凋亡)、Vehi.(载体)。
图13是MDA-MB-231和HCT116细胞(A)-(F)或者DU145细胞(G)-(L)的免疫印迹分析，其显示了独脚金内酯类似物诱导应激反应(stressresponse)：(A)在用ST-362或者仅用载体(-)处理后细胞的免疫印迹分析。(B)柱状图显示了如(A)所示的pP38水平的光密度计量化。(C)在用载体或ST-362(10ppm)处理的细胞中HSP27磷酸化的免疫印迹分析。(D)用MEB-55(10ppm)或载体处理MDA-MB-231细胞4小时后蛋白质表达水平的免疫印迹分析。(E)仅用ST-362或者与SB一起处理的细胞的免疫印迹分析。(F)仅用MEB-55或者与SB一起处理的细胞的免疫印迹分析。(G)用MEB-55或者仅用载体处理后细胞的免疫印迹分析。(H)柱状图显示了如(G)所示的多种磷酸化蛋白质的光密度计量化。(I)在用载体或MEB-55处理的细胞中P38、JNK和ERK磷酸化的免疫印迹分析。(J)用ST-37或MEB-55处理后的pP38的免疫印迹分析。(K)仅用MEB-55或与SB一起处理后的pHSP27的免疫印迹分析。(L)仅用MEB-55或者与SB一起处理的细胞中的pJNK和pHSP27的免疫印迹分析。(M)图显示了仅用MEB-55或者与SB处理的细胞的存活。
缩写：αt-tub.(α-微管蛋白)、Fol.Chan.(倍数变化(fold change))、Vehi.(载体)、Ac.(丙酮)、SB(SB203580)、hr.(小时)、Sur.(存活)。
图14是仅用载体或者用10ppm的EG-5或MEB-55处理的MDA-MB-231细胞的免疫印迹分析，其显示了独脚金内酯类似物抑制存活信号。
图15显示了独脚金内酯类似物的稳定性。
缩写：Sur.(存活)、Vehi.(载体)、cont.(对照)、conc.(浓度)、fr.(新鲜(fresh))。
图16是基本独脚金内酯5-脱氧独脚金醇以及独脚金内酯类似物GR-24、EG-5、EG-9C、ST-357、ST-362和MEB-55的示意图。
图17显示了结肠(A)或前列腺(B)-(H)细胞经历响应于独脚金内酯处理的G2/M停顿和凋亡：(A)用独脚金内酯类似物处理的HCT116细胞中之细胞周期蛋白B的免疫印迹。(B)用MEB-5处理的DU145细胞的免疫印迹。(C)用ST-362或MEB-5处理的HCT116细胞的免疫印迹。(D)用MEB-5处理的U20S细胞的免疫印迹。(E)相对于用MEB-55处理的A549或HCT116细胞中的GAPDH之细胞周期蛋白B1mRNA的定量实时PCR分析。(F)用ST-362或MEB-55处理的DU145细胞的免疫印迹。(G)MEB-55对细胞周期进程的影响。(H)在蛋白酶体抑制剂ALLN存在下，用ST-362或MEB-55处理的DU145细胞的免疫印迹。
缩写：tub.(微管蛋白)、Vehi.(载体)、cont.(对照)、Prop.Iod.(碘化丙啶)、hr.(小时)、Cell Cyc.Ph.(细胞周期时相)。
图18为显示了用ST-357或ST-362处理的小鼠中肿瘤之平均肿瘤体积的图。
缩写：Mea.Tum.Vol.(平均肿瘤体积)、cont.(对照)。
图19为显示了独脚金内酯类似物处理不影响体重的图。
缩写：Wei.(重量)、gr.(克)、cont.(对照)。
图20为显示了顺铂和独脚金内酯类似物联合处理之协同作用的图。缩写：Sur.Fra.(存活比例)、cis.(顺铂)
图21为显示了GR-24对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)培养物生长随时间之影响的图。
缩写：lily(仅生长培养基)、DMSO(仅溶剂)、H(小时)、OD(光密度)，显示了GR-24的μM浓度。
图22为显示了ST-362对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)培养物生长之影响的图。
缩写：lily(仅生长培养基)、DMSO(仅溶剂)、H(小时)、OD(光密度)，显示了ST-362的μM浓度。
图23为显示了ST-362对橄榄假丝酵母(Candida oleophila)培养物生长之影响的图。
缩写：lily(仅生长培养基)、DMSO(仅溶剂)、H(小时)、OD(光密度)，显示了ST-362的μM浓度。
具体实施方式
以下的实例例示了天然独脚金内酯(本文称为“独脚金内酯”)、独脚金内酯类似物和其取代物(本文称为“独脚金内酯类似物”)在多种哺乳动物和非哺乳动物系统中作为抗增殖剂的作用及其作为人类癌细胞生长抑制剂的疗效，和它们在治疗多种癌症(如乳腺癌、结肠癌、肺癌和/或前列腺癌，或者黑素瘤)中的用处。
本文描述的式X化合物显示了对癌细胞生长特异的和显著的抑制以及对肿瘤细胞程序性死亡的诱导，并可用于癌症疾病的治疗。
在以下的描述和实例中参考在本文称为“独脚金内酯类似物”的式II化合物及其异构体(根据IUPAC系统编号方式标记原子数)。
至少一个不对称碳原子可以存在于(R)-、(S)-或(R，S)-构型中，优选地存在于式II化合物之(R)-或(S)-构型中。因此，式II化合物可以非对映异构体的混合物或外消旋混合物或纯异构体存在，任选地以对映体纯异构体存在，即个体异构体或其异构体的混合物。
下表1列出了本发明独脚金内酯类似物的实例，提及所述类似物的化学名称和给予的代码。
表1
除非另有说明，在上文中和下文中使用的一般术语在本公开内容上下文中优选具有以下含义。
如本发明中所用，术语“C1-C6烷基”指包含至少一个碳原子和至多6个碳原子的直的或分支的烃链，包括取代的烃链，如卤烷基。
术语“烯基”在本文中指其中至少一个键为双键的直的或分支的烃链。
术语“炔基”在本文中指其中至少一个键为三键的直的或者分支的烃链。
术语“环烷基”在本文中指非芳香性的环状化合物。
术语“杂烷基”在本文中指在环中含有至少一个非碳原子(如N、O或S)的非芳香性环状化合物。
术语“芳基”在本文中指其中至少一个环为取代或未取代的芳香环的环系统。
术语“可交换地”在本文中指可以交换的两个相邻的化学基团，即如果基团P在位置2，则基团Q一定在位置3，反之亦然，如果基团P在位置3，则基团Q一定在位置2。
术语“凋亡”在本文中指发生在多细胞机体中的程序性细胞死亡过程。
术语“MCF-7”、“MDA-MB-436”、“MDA-231”、“T47D”等等在本文中指不同类型的乳腺癌细胞系。
术语“球囊”在本文中指在某些环境下形成的乳腺细胞块。球囊培养物已经用于乳腺癌干细胞(Cancer Stem Cell，在下文中称为CSC)的富集。MCF-7和MDA-231细胞可以在非贴壁、无血清生长条件下繁殖为“球囊”。
术语“细胞周期蛋白B1”(在下文中CYCB1)指M期促进因子的调节亚基，其对于有丝分裂的开始至关重要。所述细胞周期蛋白的失调涉及瘤性转化，因此其对抗增殖性治疗是有用的。
当分析靶向细胞周期蛋白B1的小干扰RNA(siRNA)对不同人类肿瘤细胞系的影响时，细胞周期蛋白B1siRNA降低了细胞周期蛋白B1在HeLa、MCF-7、BT-474和MDA-MB-435肿瘤细胞中的蛋白质水平，因此降低了Cdc2/细胞周期蛋白B1在HeLa细胞中的激酶活性并显著抑制了转染后不同来源肿瘤细胞的增殖并增加了凋亡。
优选地使用有机酸或无机酸由具有碱性氮原子的式II化合物形成例如作为酸加成盐的式II化合物的药物可接受盐。
合适的无机酸为例如氢卤酸(如盐酸或氢溴酸)、硫酸和磷酸。合适的有机酸为例如膦酸、磺酸(如甲磺酸或乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸或氨基磺酸)、羧酸(如乙酸和丙酸、乙醇酸、乳酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、己二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、金刚烷甲酸、呋喃甲酸、三苯基乙酸、安息香酸、水杨酸、邻苯二甲酸、扁桃酸、肉桂酸)或其他有机质子酸(如抗坏血酸)、氨基酸(如赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺(aspargine)、谷氨酸和天冬氨酸)、脂肪酸(如硬脂酸、软脂酸和月桂酸)。
式X化合物能够抑制肿瘤起源细胞系的生长，但是不抑制正常成纤维细胞的生长。这些化合物是有用的，特别是用于瘤疾病的治疗(如良性或恶性肿瘤)。所述化合物能够影响肿瘤退缩(tumor regression)并预防转移扩散和微转移(micrometastase)的生长。特别地，它们可以用于治疗疾病，如乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌，以及黑素瘤。
在响应于GR-24的所有癌细胞中观察到了受损的细胞周期进程。此外，在肿瘤干细胞培养物中注意到的对GR-24敏感度的增加导致在较低浓度GR-24下球的分离和凋亡。GR-24的外源应用导致在根尖中细胞分裂和分化的改变。如图1中描绘的，WT苗暴露在13.5μM外源供给的GR-24导致根尖的变形，使根尖看起来肿胀；此外，两倍增加的GR-24(27μM)消除了囊轴细胞(columella cell)中的淀粉颗粒。
本文提供的实验结果表明，施用GR-24时根尖形态的改变明显与根尖中细胞分裂的变化相关。
如图2所描绘的，细胞水平的检测显示与对照相比，根冠细胞在GR-24处理下变得混乱。细胞分裂随着在根尖分生组织区细胞的随机分裂而异常；囊轴细胞膨胀且其组织改变。此外，侧根分生组织受到GR-24的影响小于初生根中的分生组织受到的影响，前者受到减少的对根尖形态、细胞分裂和囊轴细胞组织的影响。
如通过根尖中CYCB1基因转录之水平确定的，GR-24处理降低了CYCB1转录水平，所述转录水平作为细胞分裂水平的量度。在较低水平的GR-24处理(2.7μM)下，CYCB1转录相对于对照未受影响(0.97±0.47)。如图2所描绘的，观察到在用该GR-24浓度和对照处理的根之间的细胞分裂无差异。然而，在更高浓度的GR-24(13.5μM)下，与对照相比，CYCB1转录在GR-24处理过的根尖中显著地减少(0.16±0.00)。因此，在这些情况下，观察到在GR-24处理过的根和对照之间细胞分裂的差异(图2)。
3μM GR-24的外源应用导致GRIM REAPER(GRI)[NM_104192]基因表达水平的显著提高，其通过2.3倍GR-24处理诱导，其中所述GRI基因表达作为细胞死亡活化剂与果蝇(Drosophila)中的凋亡相关。
相反，GR-24处理时在独脚金内酯信号中突变的max2-1突变体中未诱导所述GRI基因转录，且因为max2-1对独脚金内酯类似物不敏感，所以表明GRI表达对独脚金内酯和独脚金内酯类似物信号通路是特异的。所述GRI转录的上升，且与此一致的CYCB1转录的下降通过量化PCR实验检验，详见下表2，其证明了在用GR-24(3μM)和对照处理过的WT和max2-1苗中的GRI和CYCB1转录水平。
表2
独脚金内酯类似物抑制MCF-7单层生长
ND-未确定
本文中详细描述的结果表明，GR-24的施用导致了植物根部细胞周期活性的降低以及细胞死亡相关基因之特异性诱导，后者在WT中而非在独脚金内酯不敏感性突变体中。
检验了ST-357和ST-362施用对CYCB1转录的作用，如表2详述的，其中ST-362与GR-24类似，在苗处理后导致CTCB1转录水平明显下降。不希望受任何特定理论的限制，CYCB1转录的这种下降显示独脚金内酯类似物ST-362与GR-24的作用类似，导致了植物根部中细胞周期活性的降低。
IC50值在本文中定义为在孵育期结束时每个孔的细胞数量仅为对照培养物中细胞数量50％时的活性成分浓度。因此，对于式II化合物，IC50值确定为大约0.1μmol/升至50μmol/升。化合物GR-24对于管腔(雌激素受体阳性)和基底(雌激素受体阴性)之乳腺癌细胞的IC50值在微摩尔级浓度范围内。
如本文在下面实验部分详述的，GR-24抑制了人乳腺癌细胞系的生长。通过结晶紫试验(crystal violet assay)评估了GR-24对于长期癌细胞系生长的作用。用0.5至10ppm(1-65-33μM)剂量范围的GR-24处理了MCF-7(雌激素受体(ER+)，致瘤性，非转移性)、MDA-MB-231、MDA-MB-436(ER-，转移性)和BJ成纤维细胞(正常，非瘤系(non-neoplastic line))。监测其生长直至10天。与载体处理的对照相比，2.5ppm至5ppm浓度的GR-24导致生长显著减少。如图3A所描绘的，BJ成纤维细胞的生长显示出在该时间段内甚至在高达10ppm的浓度下无显著减少。图3B证明了7天后50％的长期增殖被抑制时GR-24的浓度(IC50)，其中第7天的光密度绘制为载体对照的百分比。MDA-MB-231、MDA-MB-436和MCF-7细胞的IC50浓度分别为6.7ppm(22.1μM)、5.7ppm(18.8μM)和5.7ppm(18.8μM)。
如本文在下面实验部分进一步详述的，GR-24诱导了癌细胞中的G2停顿和凋亡。为了研究GR-24对细胞周期进程的作用，如图4所描绘的，通过碘化丙啶(PI)染色使用流式细胞术进行了DNA含量分析。用5ppm、2.5ppm和0.5ppm浓度的GR-24处理了MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞48小时。图4证明了细胞周期每个时相中细胞的百分比。GR-24处理引起在所有检测的癌细胞系中G2期细胞百分比剂量依赖性的增加和G1期细胞百分比伴随的减少。在较高浓度(5ppm)下，GR-24引起亚G1/凋亡比例的增加，表明凋亡增加。相反，用GR-24处理无限增殖化、非转化的乳腺细胞系MCF10A导致在细胞周期的G1期而非在G2/M期停顿的细胞之增加，但是未观察到凋亡的增加。如本文在下面实验部分进一步详述的，GR-24抑制了乳腺癌干细胞的生长并降低了其生存力。本身对传统的化学和放射治疗有抵抗力的肿瘤起始细胞(在下文中TIC)或癌症干细胞(CSC)能够再生被所述治疗去除之原始肿瘤的细胞组分，并最终导致复发。为了确定GR-24是否可以抑制MCF-7球囊形成，如图5A所描绘的，MCF-7细胞在存在或不存在GR-24下生长为球囊。在0.5ppm至2.5ppm GR-24的存在下，球囊形成被完全抑制，且在1ppm下被严重削弱(P＜0.01)，所述浓度比图4所显示的抑制单层生长所需的浓度低5倍。在0.5ppm浓度下，虽然球囊通常比载体处理的对照小(＜50μM)，将生长抑制在较低的程度(p＜0.05)。如图5B所证明的，当次级MCF-7球囊在GR-24的存在下生长时，获得了相似的结果。另一个乳腺癌细胞系MDA-MB-231如图5C所描绘进行检测。在5ppm下，GR-24完全阻断了MDA-MB-231球囊形成。在2.5ppm下，严重削弱球囊生长，且与载体对照组相比，球囊基本上更小(＜50μM)。GR-24阻断MCF-7和MDA-MB-231球囊形成的必要浓度分别比单层生长的IC50剂量低5.7和2.7倍。
不希望受任何特定理论的限制，球囊出人意料地展现出相对于单层培养对于GR-24的生长抑制作用更高的敏感度，虽然TIC已经显示出固有地抵抗化学治疗，如例如Xiaoxian Li等，J.Nat.Cancer Inst.(JNCI)，Vol.100(9)：672-679，2008所示。
Ginestrier C.等，Cell Stem Cell，1：555-567，2007已经报告了具有增加的乙醛脱氢酶活性(aldehyde dehydrogenase，ALDH)的正常和癌症人类乳腺上皮细胞具有干/祖特性，以及高ALDH活性确定致瘤细胞比例，能够自我更新(self-renewal)并能够产生重演(recapitulate)亲本肿瘤异质性的肿瘤。PE Burger和R Gupta，Stem Cells，27(9)：2220-8，2009显示了高水平的乙醛脱氢酶1(在下文中称为ALDH1)活性在前列腺上皮细胞的亚群中存在，所述前列腺上皮细胞共表达了其他来源的干/祖细胞上发现的许多抗原(CD9、Bcl-2、CD200、CD24、prominin、Oct3/4、ABCG2和巢蛋白)。几乎所有这些表达了高水平ALDH1活性的细胞还表达Sca-1，且其中三分之一表达高水平的这种抗原。有高水平ALDH活性的细胞比低ALDH活性的细胞具有更大的体外增殖潜力。
肿瘤含有癌症干细胞(CSC)小群体，所述癌症干细胞负责其维持和复发。这些CSC的分析可以引导对于癌症患者治疗的有效预后和治疗策略。Feng Jiang等，Mol.Cancer Res.，7(3)：330-8，2009证明使用Aldefluor检验(Aldefluor assay)之后通过荧光激活细胞分选分析鉴别来自人肺癌细胞的CSC。具有较高乙醛脱氢酶1(ALDH1)活性的分离的癌细胞显示CSC的体外特征，包括增殖、自我更新和分化的能力，抵抗化学治疗的能力和表达CSC表面标记物CD133的能力。体内实验显示ALDH1阳性细胞可以产生重演亲本癌细胞异质性的肿瘤。因此，ALDH1已经显示在多种癌症类型的TIC分离中作为功能性标记物。通常使用Aldefluor试剂盒，所述试剂盒被设计成通过与人类ALDH1特异性相互作用来最佳地鉴别和分离干细胞。因此，细胞悬浮在含有无电荷ALDH1底物和BODIPY-氨基乙醛(BAAA)的Aldefluor检测缓冲液中，所述BAAA被孵育，接下来通过被动扩散使活细胞吸收BAAA，然后通过细胞内ALDH转化成带负电荷的反应产物BODIPY-氨基乙酸酯/盐，所述产物保持在表达高水平ALDH1的细胞内，使得这些细胞变得具有明亮的荧光。
如本文在下面实验部分进一步详述的，通过2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)-羰基]-2H-四唑内盐(在下文中XTT)检测(ATCC)评估了GR-24对球囊生存力以及对干细胞标记物表达(ALDH1)的作用。在5ppm下，GR-24减少了大约80％的生存力(98.4％+3.4至16.4％+4.6)。在2.5ppm下，其中球囊形成完全被抑制，生存力保持在68.6％+12.4，表明增加的细胞死亡不能解释在此浓度下球囊形成中的抑制。为了进一步研究GR-24诱导的球囊形成之抑制，检测了乳腺干细胞标记物的表达。检测了次级球囊的ALDH活性以保证相对于贴壁培养的富集。如图6B中所描述的，次级球囊表现出了2.4倍ALDH活性的富集。初级球囊表现出ALDH活性从6％至8％的提高。初级球囊的GR-24处理将ALDH的活性从6％降至2％。
不希望受任何特定理论的限制，ALDH活性的降低表示GR-24通过调控癌症干细胞标记物部分地抑制了球囊的形成。
如本文在下面实验部分进一步详述的，通过检测独脚金内酯类似物ST-357、ST-362、EG-9c、EG-5和MEB-55抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的能力证明，所述独脚金内酯类似物为多种类型癌细胞系的有效生长抑制剂。将MCF-10A细胞用作非致瘤系且编译(compile)多种衍生自其他类型之实体瘤的细胞系，所述细胞系包括结肠(HCT116、HT29、SW480)、前列腺(PC3、DU145、LNCaP)、肺(A549)、骨肉瘤(U20S)和黑素瘤(T11)细胞系。还包括非贴壁白血病癌细胞系K562以进一步丰富组(cohort)(图7)。细胞系在其对每一种独脚金内酯类似物的响应中显示出实质上的变化，然而独脚金内酯类似物处理抑制了所有细胞系的生长，其中MEB-55和ST-362的IC50浓度为2.9ppm至12.8ppm，而对于EG-5、EG-9c和ST-357为3.9ppm至18.3ppm。有趣的是，骨肉瘤衍生系U20S对所有五种独脚金内酯类似物显示了相似的敏感度(IC50＝2.7ppm至4.5ppm)，而除了EG-9c外的所有独脚金内酯类似物抑制了激素依赖性的前列腺系LNCaP的生长。
表3
独角金内酯类似物的IC50浓度
如本文在下面实验部分进一步详述的，独角金内酯和独脚金内酯类似物通过G2-期停顿抑制生长并在较高浓度下引起凋亡，其中GR-24处理引起G2-期MCF-7和MDA-MB-231细胞百分比的增加。用独脚金内酯类似物处理了细胞以确定其是否以同样的方式改变细胞周期进程。观察到了G2期中细胞百分比剂量依赖性的增加。在比IC50/72h高25％的浓度下，观察到了MDA-MB-231细胞中增加的凋亡和亚G1比率中细胞百分比的增加。使用Hoechst染色以分析细胞核中的变化。以10ppm至15ppm的ST-362处理导致核浓缩(nuclear condensation)和断裂(fragmentation)的增加、指示凋亡的变化。为了确定连续的独脚金内酯类似物暴露是否是生长抑制和减少细胞存活所需要的，用ST-362或MEB-55以10ppm和5ppm处理了MDA-MB-231细胞2小时、4小时和24小时。在每个时间点移除独脚金内酯类似物并用新鲜的生长培养基替换培养基。在总共24小时后，进行了XTT检测。在独脚金内酯类似物处理4小时后，诱导了生存力的显著降低(p＜0.01)。2小时后未观察到显著的变化。与暴露4小时相比，连续暴露(24h)于每种独脚金内酯类似物诱导了细胞生存力更大的降低(p＜0.001)，表明长期的处理策略在降低癌细胞生存力上更有效(图9)。
如本文在下面实验部分进一步详述的，独脚金内酯类似物ST-357、ST-362、EG-9c、EG-5和MEB-55能够在5ppm及以上的浓度下完全阻断球囊形成(图10)。ST-362和MEB-55能够在2.5ppm下阻断球囊生长。ST-357在2.5ppm下显示出球囊生长的显著减少(p＜0.01)。ST-357、ST-362和MEB-55在1ppm下显著抑制了球囊形成(p＜0.01)。上述独脚金内酯类似物作为G2停顿诱导剂的效能于单层MCF-7培养物中在图8中描述。然而，与GR-24类似，抑制球囊形成所需的剂量低于在单层培养物中抑制增殖所需的剂量(对于ST-362和MEB-55，低5倍；对于ST-357，低3倍)。为了确定对独脚金内酯类似物处理的敏感度是否对球囊形成是特异性的，或者其是否扩展到成熟球囊的完整性和存活，MCF-7球囊在不存在任何独脚金内酯类似物的情况下生长，并在7天后(或者一旦球囊已经达到100μM以上的平均直径)以指定剂量向生长培养基添加如图11所描述的独脚金内酯类似物。在48小时后，用ST-362、ST-357和MEB-55以2.5ppm至5ppm的剂量处理的球囊显示出更松散的形态并表现出分离。图11A显示了用5ppm浓度处理的球囊之代表性图像。
因此，在本发明的一个方面中，提供了独脚金内酯和/或独脚金内酯类似物或者其各种异构体或异构体的混合物和这类化合物之药物可接受的盐任选地与一种或更多种其他药物活性化合物组合在制备用于治疗响应于细胞生长抑制之疾病的抗瘤药物组合物中的用途，所述独脚金内酯和/或独脚金内酯类似物为式X化合物，其中所述疾病为瘤疾病。
此外，本文提供了具有式X的独脚金内酯和/或独脚金内酯类似物或者其各种异构体或异构体的混合物和这类化合物之药物可接受的盐任选地与一种或更多种其他药物活性化合物组合在制备用于治疗乳腺癌、肺癌、前列腺癌和结肠癌以及黑素瘤的药物组合物中的用途。
通过向需要治疗的温血动物施用有效肿瘤抑制量的式X化合物或其药物可接受的盐，上述药剂也适于治疗患有肿瘤疾病的温血动物。
此外，本发明的药物组合物适合用于人体或动物体的治疗处理。根据物种、年龄、个体状况、施用模式和个体综合征向体重大约70kg的温血动物施用有效剂量。
可以用来生产用于制备在治疗处理人体或动物体中使用的药物组合物之药剂的式II化合物或者其盐的实例为：3aR＊，8bS＊，E)-3-(((R＊)-4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基)-亚甲基)-3，3a，4，8b-四氢-2H-茚并[1，2-b]呋喃-2-酮、(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-1，4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮、(±)(2E)-7-溴-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-1，4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮、(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-7-(4-硝基苯基)-1，4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮、(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-7-(2-噻吩基)-1，4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮、(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-7-[(4-二甲基氨基)-苯基]-1，4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮、(2E)-7-(1-甲氧基萘-2-基)-1，4-二甲基-2-((4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基)亚甲基)-1，2-二氢环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮、(2E)-2-[(2，5-二氢-4-甲基-5-氧代呋喃-2-基氧基)亚甲基]-1，2-二氢-7-[4-(二甲基氨基)苯基]-1，4-二甲基-环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮、(2E)-1，4-二甲基-2-((4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基)亚甲基)-7-(噻吩-2-基)-1，2-二氢环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮、(2E)-2-[(2，5-二氢-4-甲基-5-氧代呋喃-2-基氧基)亚甲基]-1，2-二氢-7-(2，3-二氢噻吩并[3，4-b][1，4]二氧杂芑-7-基)-1，4-二甲基-环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮、(±)2E-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2，5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-6-噻吩-2-基-1，4-二氢-2H环戊并[b]吲哚-3-酮。
还提供了使用式X化合物或者其各种异构体或异构体的混合物和这类化合物之药物可接受的盐来制备用于杀死癌症干细胞的药物组合物之方法。还提供了用式X化合物或者其各种异构体或异构体的混合物和这类化合物之药物可接受的盐来治疗已经进行了癌症治疗之对象的方法。本发明的方法可以在多种情况下杀死癌症干细胞并减少对象中癌症复发的风险。
本文提供了药物组合物，其包含抗增殖有效量、特别是但不限于有效治疗瘤病症之量的式X活性成分以及药物可接受载体，所述药物可接受载体适于表面、经肠(例如经口或经直肠)或肠胃外施用且可以为无机的或有机的固体或液体。
还提供了药物组合物，其包含本文所述的式X化合物以及另外的药物可接受之添加剂或赋形剂。可以使用的赋形剂包括本领域已知的用于生产固体剂型的任何赋形剂，如葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、赤藓糖醇、麦芽糖糊精、普通或预胶凝化淀粉、聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶、瓜耳胶、黄原胶、柠檬酸、硅铝酸钠、硬脂酸镁、聚乙二醇、丙二醇、聚山梨醇酯20、40、60或80、二氧化钛、滑石等。
式X化合物之制备是本领域已知的，因此为了简要，本文没有详细描述。式II化合物(即独脚金内酯类似物)可以通过例如Prandi等，Eur.J.Org.Chem.，2011，3781-93；Asami T & Ito S.，Design and Synthesis ofFunction Regulators of Plant Hormones and their Application toPhysiology and Genetics，J.Synthetic Org.Chem.Japan，2012，70：36-49；Malik H.等，A new efficient synthesis of GR-24and dimethyl A-ringanalogues.germinating agents for seeds of the parasitic weeds Striga andOrobanche spp.，Tetrahedron，2010，66：7198-7203；Mwakaboko A.S.等，Single step synthesis of strigolactone analogues from cyclic keto enols，germination stimulants for seeds of parasitic weeds，Bioorg.& Med.Chem.，2011，19：5006-5011；Boyer FD，等，Structure-activity relationshipstudies of strigolactone-related molecules for branching inhibition ingarden pea：molecule design for shoot branching，Plant Physiology，2012.所述制备。
本文通过例如式I代表的天然独脚金内酯可以通过以下所述进行制备，例如：Xie等，Annu.Rev.Phytopathol.，2010，48：93-117，以及其中引用的参考文献；Yoneyama等，Plant Growth Regul.，2011，65：495-504；和Ueno等，J.Agric.Food Chem.，2011，59：9226-9231；Chen VX等，Stereochemistry，Total Synthesis，and Biological Evaluation of the NewPlant Hormone Solanacol.Chemistry-a European Journal，2010，16：13941-13945；Kitahara S.等，First synthesis of(+/-)-sorgomol，thegermination stimulant for root parasitic weeds isolated from Sorghumbicolor，Tetrahedron Lett.，2011，52：724-726；Reizelman A.等，Synthesisof all eight stereoisomers of the germination stimulant strigol，Synthesis-Stuttgart，2000，1944-1951；Reizelman A.等，Synthesis of thegermination stimulants(+/-)-orobanchol and(+/-)-strigol via an allylicrearrangement，Synthesis-Stuttgart，2000，1952-1955；Sasaki M.，Synthesis and biological activity of strigolactones，J.Pesticide Science，2009，34：315-318。
以下的实施例进一步说明本发明，且不应该解释为以任何方式限制其范围。
应当注意，本文使用的“独脚金内酯类似物”包括式II的独脚金内酯的所有形式，包括其预成型(pre-form)、前药、衍生物、重组体或者其任何与天然独脚金内酯具有相似活性的可接受形式。
应当注意，本文使用的“独脚金内酯”包括天然独脚金内酯的所有形式，包括式I的那些，包括其预成型、前药、衍生物、重组体或者其任何具有活性的可接受形式。
术语“前药”意指施用时，化合物通过新陈代谢过程进行化学转化，然后变成药理学活性物质。通常，所述前药将为本申请化合物的功能性衍生物，其容易在体内转化成活性独脚金内酯。
根据本发明的组合物可有利地用于治疗瘤病症或由其引起的症状。本发明的组合物可以用来治疗患瘤病症(例如癌症)的人(或者动物)，其中所述患者经口施用独脚金内酯类似物的治疗活性剂量。
在本发明的另一个方面中，独脚金内酯有利地用于治疗所有癌症类型(例如肺癌、结肠癌、乳腺癌、皮肤癌、黑素瘤等)。所述治疗可以使得与癌症相关的全部或者部分症状消失或减轻。
在一个具体实施方案中，独脚金内酯或者独脚金内酯类似物和包含二者的组合物稳定至少1个月至1年。本文使用的术语“稳定”意指活性成分保持其生物活性。
对于活性剂的术语“有效量”，其包括有效地治疗、减少、减轻、改善、消除或预防寻求治疗之疾病或者寻求避免或治疗之病症的一种或更多种症状的量，或者另外地产生在该疾病或病症之病理学中临床可识别的有利变化的量。活性剂可在剂型中以有效量存在，或者在大约同时使用的多个剂型中以总有效量存在。
术语“患者”包括人和非人的动物。优选地，待治疗患者为哺乳动物。
本文使用的术语“治疗”包括其通常接受的含义，即管理和照顾患者，其目的在于预防、阻止、限制、减轻、改善、减缓、停止、延缓或逆转如本文所描述的疾病、紊乱或病理病症的进程或严重性，其包括症状或并发症的缓解或减轻，或者该疾病、紊乱或病症的治愈或消除。
以下提出的实施例进一步说明本发明的独脚金内酯及其类似物。然而，以下实施例不应以任何方式解释为限制本发明。
实施例
统计分析
结果以重复分析之平均值±SD呈现，且为代表性的或者包括至少两个独立实验。使用学生t检验(双尾，配对)相对于载体对照进行了统计分析，并且当p＜0.05(＊)时，则认为是显著的。还采用更高的功效(p＜0.01，p＜0.001)并在每个附图说明中指定。独脚金内酯类似物的IC50剂量通过S形剂量反应曲线的内插进行计算(Graphpad Prism4.0软件)。简要的说，在相关的y轴数据点之间进行线性回归并对x轴未知数进行内插计算。
实施例1
拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子的萌芽
对拟南芥野生型(WT；Columbia；Col-0)的纯合系种子和max2-1突变体(http：//abrc.osu.edu/)进行表面灭菌并在补充1％蔗糖并用0.7％琼脂固化的1/2Murashige和Skoog(MS)板上萌芽。将板在黑暗中于4℃下垂直孵育2天以同步萌芽。萌芽后3天，使用镊子将苗轻轻地转移至1/2MS板，所述板含有作为4种非对映异构体：(±)-GR-24和(±)-2’-表-GR-24之混合物的多个浓度的GR-24。在板上标记了转移的苗的根尖。板保持未密封以预防气体(如乙烯)的积聚，且以相对垂直45°位置放置，在22℃于暴露于光16小时/在黑暗中8小时的光周期下以50mol至60mol光子m-2s-1的光强度孵育6-12天，所述光子通过白色荧光管提供。
在2.7×10-6M至13.5×10-6M的浓度下进行了GR-24处理。在3×10-6M的浓度下进行了ST-357和ST-362处理。
首先将GR-24、ST-357和ST-362分别溶解在丙酮中，产生4.5mM、10μM和10μM的溶液，然后进一步将所述溶液用二次蒸馏无菌水(double-distilled sterile water，DDW)稀释。因此，除了未处理的根，实验对照包含用丙酮在分别在GR-24、ST-357和ST-362处理中使用的浓度下处理的根。在每一个试验中，将未处理的根与各自的丙酮对照相比较。如果在多个对照间未观察到差异，则显示未处理的根。如果在未处理和丙酮对照之间记录到差异，则在GR-24、ST-357和ST-362处理和丙酮处理的根之间进行比较。
实施例2
根尖结构和细胞形态的确定
为了检测根尖细胞形态和囊轴细胞中的淀粉颗粒，WT根在如实施例1所述的GR-24和对照板上生长。在这些板上生长6天后，将根用碘-碘化钾染色(Lugol’s溶液，Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)。使用浓缩的Lugol’s溶液(5g碘和10g碘化钾与85ml蒸馏水混合)，其后用二次蒸馏水洗涤。使用装备了Nikon DS-Fil照相机的Leica DMLB光学显微镜(Leica Microsystems GmbH)对来自每个处理的根尖拍照。每个实验重复4次；在每个处理中，每个实验重复检测4个根尖(图1)。
为了检测根冠细胞的顺序和结构，WT根在如实施例1所述的GR-24和对照板上生长。在所述板上生长6天后，根尖用苯胺蓝溶液(Sigma-Aldrich)染色5分钟，随后立即用Calcofluor溶液[含100mgCalcofluor白(Sigma-Aldrich)的5ml蒸馏水]染色。立即使用共聚焦显微镜(Olympus1X81，Tokyo，Japan)检测染过色的根。每个实验重复4次；在每个处理中，每个实验重复检测4个根尖(图2)。
实施例3
使用量化PCR确定基因转录水平
从如实施例1所述生长和处理的苗中提取了RNA。通过扩增感兴趣的基因片段进行量化PCR(表6和7)。拟南芥15S核糖体RNA(GenBank登录号AT1G04270.1)作为RNA量的参考基因，并使用特异引物(正向)5’-CAAAGGAGTTGATCTCGATGCTCTT-3’和(反向)5’-GCCTCCCTTTTCGCTTTCC-3’扩增。以5-6次生物复制进行了实验；每次复制包含8个植物，在所述植物上进行了3次技术重复。从所有生物复制确定平均值和标准误差。
使用PrimerQuest软件(Integrated DNA Technologies)设计了引物。使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和生产厂商的规程提取了RNA。使用Superscript第一链cDNA合成试剂盒(Invitrogen)在20μl总体积中反转录1μg RNA。使用ABI-Prism7900仪器(Applied Biosystems，Foster City，CA)和SYBR Green I探测(Applied Biosystems)根据生产厂商的规程一式三份地进行了PCR。将每个目标基因的表达归一化至GAPDHRNA的表达，并以目标基因对GAPDH RNA的比率呈现，表达为2-ΔCt，其中Ct为临界循环(threshold cycle)而ΔCt＝Ct目标-Ct GAPDH。
实施例4
结晶紫单层生长试验的准备
细胞以96孔板的每孔1500(MDA-MB-231、MDA-MB-436和BJ成纤维细胞)或者4000细胞接种。第二天，将培养基替换为无苯酚的DMEM，其补充有10％木炭剥离胎牛血清(在下文中FBS)和指定剂量的独脚金内酯类似物或者作为对照的单独载体(丙酮)。在指定的时间点，固定各个板并用结晶紫-甲醇溶液(每孔50μl)染色15分钟，用蒸馏水多次洗涤并将板风干过夜。使用柠檬酸钠溶液(0.1M)来溶解成束的结晶紫并在560nm下测量了光密度(-Multi Detection plate reader，Promega)。
实施例5
Hoechst33342染色
将MDA-MB-231细胞一式三份地以每孔3000细胞接种入96孔板。第二天，将培养基替换为无苯酚的DMEM，其补充有10％木炭剥离FBS和指定最终浓度的独脚金内酯类似物或者单独载体(丙酮)。48小时后，抽提培养基，且将用培养基稀释的100μl Hoechst染料(2μg/ml)添加至细胞并孵育15分钟。在荧光显微镜下观察了染色后的细胞(Zeiss5Instruments，Thornwood，NY)。
实施例6
独脚金内酯类似物是生长为球囊之乳腺癌细胞系自我更新和存活的有效抑制剂，甚至短的暴露导致对于球囊分离和细胞死亡不可逆转的影响。免疫印迹分析揭示了独脚金内酯类似物诱导P38和JNK1/2MAPK模块介导的应激反应的活化并抑制PI3K/AKT活化。一并考虑，该研究表明独脚金内酯是有前途的抗癌剂，其活性可以通过调整应激和存活信号通路实现。独脚金内酯类似物抑制了癌细胞增殖并诱导凋亡(在低微摩尔范围内)。独脚金内酯类似物是球囊形成和癌症干样细胞存活的有效抑制剂。此外，独脚金内酯类似物抑制了激素反应性和激素依赖性乳腺癌细胞系。免疫印迹分析揭示了独脚金内酯类似物活化了应激诱导的MAPK、P38和JNK12并抑制了PDK1和AKT。
一并考虑，本研究表明，独脚金内酯和独脚金内酯类似物是有前途的抗癌剂，其作用机理可包含应激和存活信号调整。
方法
细胞培养
细胞在37℃下于5％二氧化碳-95％空气的潮湿气氛下生长。将MCF-7、MDA-MB-231、MDA-436、HCT116、SW480、PC3和BJ成纤维细胞(ATCC，Manassas)维持在补充有10％FCS的Dulbecco’s ModifiedEagle’s培养基(下文DMEM)中。将HT-29、LNCaP、DU145、PC3和A549细胞维持在补充有10％FCS(Sigma)的RPMI中。将MCF-10A维持在补充有5％马血清(Atlanta Biologicals)、20ng/ml表皮生长因子(EGF)(Sigma)、10μg/ml胰岛素(Sigma)和500ng/ml氢化可的松(Sigma)的DMEM中。
球囊生长
用胰蛋白酶温和地消化贴壁细胞，(0.05％胰蛋白酶/EDTA)在PBS中洗涤两次，并通过40μM细胞筛过滤以获得单细胞悬液。将细胞在补充有5μg/ml牛胰岛素、20ng/ml重组表皮生长因子、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(Gibco)、1×B27添加剂、0.5μg/ml氢化可的松(MEGMBulletkit，Lonza)的无血清无酚红MEBM(MEGM Bulletkit，Lonza)中稀释至10,000细胞/ml的浓度。对于MDA-MB-231球囊培养物，如前所述使用了具有生长添加剂(CellnTEC Advanced cell systems，Bern，Switzerland)的无血清无酚红CnT-27培养基。在超低吸附96孔板的每个孔接种了0.1ml。第二天，添加了指定剂量的GR-24(ppm)或者仅添加载体(0.6％丙酮f/c)。每3-4天补充培养基。通过重铺板(re-plating)确定了球囊的自我更新能力并产生球囊的更多代。次级球囊通过10至14天大的初级球囊分离(用温和的涡旋混匀进行胰蛋白酶消化)而培养。如上所述获得了单细胞悬液。
独脚金内酯处理
将独脚金内酯类似物以1666.67ppm(GR-24、MEB-55、ST-362、EG-9c)和7500ppm(EG-5、ST-357)的原液浓度(stock concentration)溶解于丙酮(Sigma)中。在指定剂量下通过稀释独脚金内酯类似物至需要的最高浓度在合适的生长培养基中处理了细胞。为接下来较低的浓度进行了一系列的稀释。从Cell Signaling Technology(Danvers，MA)购买SB203580和SP600125。根据制造厂商的说明书将所有的抑制剂溶剂于DMSO中。
结晶紫生长试验：
将细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-436和BJ成纤维细胞)以96孔板每孔1500或4000细胞接种。第二天，将培养基替换为无苯酚的DMEM，其补充有10％木炭剥离FBS和指定剂量的GR-24、独脚金内酯类似物或者作为对照的单独载体(丙酮)。在指定的时间点，固定各个板并用结晶紫溶液(0.5％结晶紫和25％甲醇)染色15分钟，用蒸馏水多次洗涤并将板风干过夜。使用柠檬酸钠溶液(0.1M)来溶解成束的结晶紫并在560nm下测量了光密度(-Multi Detection plate reader，Promega)。
XTT生存力检测：
将细胞以每孔1500细胞接种(MCF-10、PC3、DU145、MDA-MB-231、MDA-MB-436、HT-29、SW480)、每孔1000细胞(K562)或每孔4000细胞(MCF-7、HCT116)一式三份接种至96孔板的普通生长培养基中(除了非贴壁白血病细胞系K562以外，其接种于补充有10％木炭剥离FBS的无苯酚DMEM中)。第二天，将培养基替换为无苯酚的DMEM，其补充有10％木炭剥离FBS和指定最终浓度的独脚金内酯类似物或者单独载体(丙酮)。将细胞孵育3天，其间根据制造厂商的说明书使用XTT(2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)-羰基]-2H-四唑内盐)还原对生存力定量(ATCC)。将细胞与XTT试剂在37℃下于5％二氧化碳-95％空气的潮湿气氛下孵育2至3小时。通过光度计SPEKTRAFluor Plus，Tecan(Salzburg，Austria)在450nm下以750nm为参考波长记录了吸光度。由公式：％细胞存活＝100×(At-Ac)估计了细胞存活，其中At和Ac为XTT比色反应(ATCC)在处理的和对照培养物中的各自吸光度(450nm)减去750nm下测量的非特异吸光度。培养基本身的吸光度也从具体读数中扣除。
细胞周期分析：
胰蛋白酶消化贴壁细胞，用PBS洗涤两次并通过40μM细胞筛过滤。通过流式细胞术评估了DNA含量。将细胞在6孔平板培养皿中以每孔1.5×105细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-436)、或4×105细胞(MCF-7和MCF10A)、或2×105细胞(SW480、HT-29)、或5×105细胞(HCT116)的密度接种于含10％FBS的DMEM中。第二天，将培养基替换为无苯酚的DMEM，其补充有具有指定浓度的GR-24或单独载体(丙酮)的10％木炭剥离FBS。48小时后，用PBS(pH7.4)洗涤细胞两次，在4℃下以360g离心10分钟，并用温和的涡旋混合固定在冷乙醇(70％；v/v，在PBS中)中。为了确定这些细胞的DNA含量，将细胞用40μg/ml的碘化丙啶(在下文中PI)染色并使用FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest分析软件(Becton Dickinson，San Jose，CA)分析。如果进行磷酸化组蛋白-H3染色，则将细胞与针对磷酸化组蛋白H3的多克隆抗体孵育，然后在PI染色前与缀合至FITC的次级山羊抗兔IgG-孵育。
膜联蛋白V染色
将细胞在与DNA含量/细胞周期分析中使用的相同条件下培养48小时。收集所有细胞并重悬浮在100μl1×膜联蛋白V结合缓冲液(BDBiosciences，San Jose，CA，USA)中。添加2μlFITC-膜联蛋白V(BDBiosciences)并在黑暗中孵育10分钟(室温)。然后将细胞用PI(Sigma，Saint Louis，Missouri，USA)染色至5μg/ml的最终浓度，并将细胞在室温下于黑暗中孵育15分钟。然后，添加400μl的膜联蛋白V结合缓冲液，并使用BD FACSCalibur流式细胞仪进行流式细胞术。如果细胞为膜联蛋白V+/PI-(早期凋亡)和膜联蛋白V+/PI+(晚期凋亡)，则认为所述细胞凋亡。每个分析使用至少20,000个事件进行。
Aldeflour表达：
胰蛋白酶消化MCF-7球囊，将其温和地涡旋并通过40μM细胞筛过滤以获得单细胞悬液。洗涤细胞(5×105)并重悬浮在生长培养基(Lonza)中。为了确定Aldefluor染色的细胞群具有的ALDH1酶活性，使用了Aldefluor试剂盒(Stem Cell Technologies)，所述试剂盒被设计成用来通过与人类ALDH1的特异性相互作用最佳地确定和分离干细胞。简要地说，将细胞悬浮在包含无电荷的ALDH1-基质、BODIPY-氨基乙醛(BAAA)的Aldefluor检验缓冲液中，并在37℃下孵育45分钟，每15分钟温和地涡旋。活细胞通过被动扩散吸收BAAA，然后通过细胞内的ALDH转化成带负电荷的反应产物BODIPY-氨基乙酸盐/酯，所述产物保持在表达高水平ALDH1的细胞内，从而使得细胞变得具有明亮的荧光。在FACScan仪器(BD Biosciences)的绿色荧光通道(520nm至540nm)检测到表达荧光ALDH1的细胞。使用特异性ALDH抑制剂二乙氨基苯甲醛(DEAB)在同样条件下对一组细胞染色以作为所述实验的阴性对照。使用橙色荧光通道检测PI(Sigma)荧光。用与BAAA和DEAB孵育的细胞建立了细胞的基准荧光和ALDH1-阳性率(positive fraction)。使用Cell Quest软件(BDBiosciences)分析了数据。
免疫印迹：
使用裂解缓冲液制备了细胞裂解物，所述裂解缓冲液含有：50mMTris-HCl(pH7.5)、125mM NaCl、0.5％NP-40、0.1％SDS、0.25％脱氧胆酸钠、1mM EDTA、50mM NaF、1mM原钒酸钠、2.5mM焦磷酸钠、1mMβ-甘油磷酸钠、1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(RocheMolecular Biochemicals)并通过离心澄清。使用BCA蛋白质检测(Pierce)确定了蛋白质浓度，并在4％至12％的SDS-PAGE凝胶中分离了20μg至50μg的裂解物。转移后，在室温下于含有0.1％Tween-20的Tris-缓冲之盐水中的5％BSA(Sigma)中阻断膜15至30分钟。一级抗体在室温下孵育1.5小时或者在4℃下孵育过夜。二级抗体在室温下孵育30至45分钟，且蛋白质用West Pico Stable(Pierce)显现。除非另有说明，所有的抗体在1∶1000的稀释度下使用。pT308AKT、AKT、pT180/Y182、pT183/Y185P38MAPK、pP38MAPK、pT202/Y204pERK1/2、ERK1、pT183/Y185、pJNK1/2、JNK1、pT71ATF2、pT581MSK1、pT14Cdc2、Cdc2、pT68Chk2(细胞信号传导(cell signaling))、pT334MAPKAPK、pS82HSP27(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)、α-微管蛋白(Biomarkers，1∶50,000)、细胞周期蛋白B1(Santa Cruz Biotechnologies)以及辣根过氧化酶-缀合的抗兔IgG和抗小鼠IgG(1∶5,000，Pierce)。
免疫印迹量化
使用ImageJ软件(NIMH)进行了光密度量化。
结果
GR-24抑制人乳腺癌细胞系的生长
通过结晶紫试验评估了GR-24对于长期癌细胞系生长的作用(图3)。以0.5ppm至10ppm(1.65μM至33μM)的剂量范围用GR-24处理了MCF-7(雌激素受体阳性(ER+)，致瘤性，非转移性)、(A)MDA-MB-231、MDA-MB-436(雌激素受体阴性(ER-)，转移性)和BJ成纤维细胞(普通，非瘤系)。监测其生长直至10天。在指定的时间点，用结晶紫将板染色。数据以载体对照的百分比吸光度(560nm)来报告。平均值±标准差(SD)。使用学生t检验(双尾，配对)在最终时间点评价GR-24处理组与载体(对照)组，且如果p＜0.05(＊)则认为是显著的，如果p＜0.01(＊＊)则认为是非常显著的，p＜0.001(＊＊＊)则认为是极显著的。(B)的图显示暴露于指定剂量的GR-247天后光吸收度的读数(560nm)。数据以载体对照的百分比表达。三份样品的平均值+SD。水平线(---)标记了相对于载体对照吸光度(560nm)减少50％。右侧的表显示了7天后减少50％生长需要的抑制浓度(IC50/72d)，并通过用相关y轴数据点之间内插进行线性回归计算(GraphPad Prism软件)。
与载体处理的对照比较，2.5ppm至5ppm浓度的GR-24导致MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-436生长的显著减少。在这段时间，BJ成纤维细胞的生长未显示显著减少(图3)。在最高浓度(10ppm)下观察到少量的减少，然而当与同样浓度的GR-24在MCF-7和MDA-MB-231细胞中达到的生长抑制相比时，所述减少是较小的。为了确定7天后长期增殖的50％被抑制时GR-24的浓度(IC50)，将第7天的光密度绘制为载体对照的百分比(图3B)并通过内插计算了浓度。MDA-MB-436、MDA-MB-231和MCF-7细胞的IC50浓度分别为5.2ppm(17.2μM)、5.7ppm(18.8μM)和5.7ppm(18.8μM)(图3B)。
GR-24诱导G2/M停顿和凋亡
为了研究GR-24对细胞周期进程的作用，通过碘化丙啶染色使用流式细胞术进行了总DNA含量分析。用5ppm和10ppm的GR-24处理MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞48小时，并使用非致瘤性乳腺细胞系MCF10A作为对照。GR-24处理引起所有致瘤性细胞系中G2/M期细胞百分比剂量依赖性的增加和G1期细胞百分比伴随的减少，但是在GR-24处理的MCF10A细胞的细胞周期分布中未观察到变化(图4)。更高浓度(10ppm)下，与载体对照相比，GR-24引起MDA-MB-231(4.6倍)和MDA-MB-436(3.4倍)细胞之亚G1/凋亡比例的增加，表明凋亡增加。在10ppm下，MCF-7细胞未显示出亚G1比例的变化(图4)。
GR-24对乳腺癌症干样细胞富集的球囊培养物之生长抑制和生存力减少
肿瘤起始细胞(TIC)或者癌症干细胞(CSC)本身对传统的化学和放射治疗有抵抗力。这些细胞能够再生被所述治疗去除的原始肿瘤的细胞组分，并最终导致复发。靶向该细胞群的能力对于开发有效的治疗方案是重要的。球囊培养物已经广泛地用于乳腺CSC的富集。MCF-7细胞可在非贴壁、无血清的生长条件下繁殖为“球囊”。为了确定GR-24是否可以抑制MCF-7球囊形成，使MCF-7细胞在存在或不存在GR-24的情况下生长为球囊(图5A)。在2.5ppm至5ppm的GR-24存在下，球囊形成被完全抑制，且在1ppm下被严重削弱(P＜0.01)，该浓度比抑制单层生长所需浓度低5倍(图5)。在0.5ppm浓度下，将生长抑制在较低的程度，然而，球囊通常小于(＜50μM)载体处理的对照(p＜0.05)。当次级MCF-7球囊在GR-24的存在下生长时，获得了相似的结果(图5B)。为了评估GR-24对球囊生长抑制的普遍性，检测了另一个乳腺癌细胞系MDA-MB-231(图5C)。在5ppm下，GR-24完全阻断了MDA-MB-231球囊形成。在2.5ppm下，严重削弱球囊生长，与载体对照组相比，球囊本质上较小(＜50μM)。重要地，GR-24阻断MCF-7和MDA-MB-231球囊形成的必要浓度分别比单层生长的IC50剂量低5.7倍和2.7倍。因此，球囊展现出相对单层培养对于GR-24的生长抑制作用更高的敏感度。这是有趣的发现，因为报告的球囊培养物富含TIC且TIC已显示对化学治疗具有天然的抵抗力。
GR-24对球囊生存力和干细胞标记物表达的作用
通过XTT检测(ATCC)评估了球囊的生存力。在添加指定浓度的GR-245天后，确定了细胞生存力。在5ppm下，GR-24减少了大约80％的生存力(98.4％+3.4至16.4％+4.6)(图6A)。有趣地，在2.5ppm下，其中球囊形成完全被抑制，生存力保持在68.6％+12.4，其表明抑制的时机至关重要。进一步研究GR-24诱导的球囊形成之抑制，检测了乳腺干细胞标记物的表达。
乙醛脱氢酶(ALDH1)已经显示在许多癌症类型TIC的分离中作为功能性标记物，且MCF-7TIC可以在其ALDH活性与其他表面标记物组合的基础上选取。ALDH活性在相对于贴壁培养物的初级球囊中富集，且次级球囊培养物达到了进一步的富集(图6B)：将贴壁MCF-7细胞和8天大的次级球囊制备为单细胞悬液，并根据近生产厂商的说明书分析了ALDH表达(Aldefluor试剂盒，Stem Cell echnologies，Vancouver，CA)：右图显示了于贴壁MCF-7培养物，初级(Adh)，在5ppm、1ppm GR-24或单独载体(对照)(0.6％丙酮)的存在下生长的初级球囊以及8天大的次级球囊(sec.)之一中的ALDH阳性细胞百分比。次级球囊表现出了2.4倍ALDH活性的富集。初级球囊表现出ALDH表达阳性从6％至8％的小幅提高。GR-24处理使得ALDH的表达从6％降至2％。该数据表明GR-24是球囊形成的有效抑制剂，且GR-24对ALDH的下调可以解释该活性。而且，该数据表明独脚金内酯为球囊形成的有效抑制剂。
独脚金内酯类似物为不同范围之癌症来源细胞系的有效生长抑制剂
获得了5种另外合成的独脚金内酯类似物(图16)并检测其抑制结肠、前列腺、肺、骨肉瘤、黑素瘤和白血病癌症来源细胞系生长的能力。包含MCF-10A细胞作为非致瘤系的实例。处理3天后，在指定剂量的独脚金内酯类似物的存在下，进行了XTT生存力检测。独脚金内酯类似物处理后吸光度读数结果的不同反映了增殖和细胞存活的变化(图7A-C)：将细胞接种至96孔板的普通生长培养基中。第二天，将培养基替换为无苯酚的DMEM，其补充有10％木炭剥离血清和指定剂量的独脚金内酯类似物或者单独载体(对照)。3天后检测了生存力(XTT，ATCC)。指出了IC50浓度(上表3)。细胞系在其对每一种独脚金内酯类似物的响应中表现出实质上的变化，然而独脚金内酯类似物处理抑制了所有癌细胞系的生长。ST-362和MEB-55为最有效的独脚金内酯类似物。ST-362的IC50浓度从低至2.9ppm开始(MDA-MB-231)，而对于MEB-55，低至3.9ppm(MDA-MB-231)。非肿瘤细胞系MCF10A，对于独脚金内酯类似物处理的作用之抵抗力可以高达15ppm的浓度，除了ST-362以外，其引起在第10天至14天之间生存力20％的减少。EG-9C在检测的所有细胞系中是效力最低的独脚金内酯类似物(IC50＞10-15ppm)，除了A549，其中测量的IC50值为4.3ppm。A549细胞还显示出对EG-5、MEB-55、ST-357和ST-362的敏感度，其IC50＝4.8ppm至6.5ppm。ST-357是PC3(IC50＝5.3ppm)和MDA-MB-231(IC50＝5.0 ppm)细胞有效的生长抑制剂。一些细胞系在较低剂量浓度下表现出增加的XTT吸光度。对照中的载体体积仅与在最高剂量下的体积匹配，且总载体体积不匹配较低较量。对载体水平的敏感度可能可以解释一些细胞系中在对照中观察到的与较低剂量相关的生存力抑制。
表4
独脚金内酯类似物在癌细胞系中的IC 50 浓度
在独脚金内酯类似物处理3天后对生存力达到50％抑制需要的抑制浓度(IC50)。数值通过线性内插计算(Graphpad Prism 4.0)。
为了评估独脚金内酯类似物在水溶液中的稳定性，将每一种独脚金内酯类似物于培养基中稀释至期望浓度，并在4℃下储存3天，此时将含有独脚金内酯类似物的培养基覆盖在接种入96孔板的MCF-7细胞上，所述MCF-7细胞在补充有5％木炭剥离血清的无苯酚DMEM中。3天后，检测了生长和生存力(XTT，ATCC)并将结果与用新鲜稀释的独脚金内酯类似物处理之细胞进行比较(图15)(吸光度读数以对照的百分数给出。平均值+SD)。除了完全没有抑制MCF-7生长的EG-5以外，所有独脚金内酯类似物在该时间段内保持了相似水平的活性。因为此原因，将所有的独脚金内酯类似物从丙酮原液新鲜稀释入培养基至期望浓度，并在1小时内覆盖在细胞上。如果需要，每3天更新培养基。
独脚金内酯类似物抑制细胞周期进程并诱导凋亡
GR-24处理引起了在G2/M期中的MCF-7、HCT116、MDA-MB-231、DU145、A549、SW480和HT-29细胞百分比的增加，以及MDA-MB-231、MDA-MB-436和HCT116细胞的凋亡。为了确定这些另外的独脚金内酯类似物是否还诱导类似的生长抑制机制，进行了细胞周期分析。结果显示G2/M期细胞百分比剂量依赖性的增加(图12)：将细胞用不同浓度的独脚金内酯类似物在无苯酚DMEM中处理48小时，所述无苯酚DMEM补充有10％木炭剥离血清和在IC50/72h或～IC50/72h+25％浓度下的独脚金内酯类似物。在超过IC50/72h25％的浓度下，在MDA-MB-231细胞中有凋亡增加的迹象，在亚G1级分中细胞的百分比增加。在检测的剂量下，MCF-7细胞对于独脚金内酯类似物的作用较不敏感。在检测的剂量下，BJ成纤维细胞对于独脚金内酯类似物的作用不敏感(上表4)。
有丝分裂的染色体浓缩伴随着组蛋白H3的磷酸化。因此，为了确定细胞是否在G2或M期停顿，在暴露于独脚金内酯类似物后，分析了HCT116细胞的pS10组蛋白H3。结果(图12E)显示在独脚金内酯处理后，对p组蛋白H3呈染色阳性之细胞百分比有剂量依赖性减少(在载体对照中为2.7％，且在用7.5ppm和5ppm ST-357分别处理的细胞中为0.3％和0.7％，并且在用7.5ppm和5ppm MEB-55分别处理的细胞中为0.9％和1.45％)，表明M期细胞分布的减少(图12E)。为了进一步量化独脚金内酯处理后在体外观察到的生长抑制是否部分由于凋亡，用膜联蛋白V和PI(碘化丙啶)对HCT116细胞双重染色。膜联蛋白V染色显示质膜内小叶(inner leaflet)的翻转(inversion)，其为凋亡的早期事件。晚期凋亡通过失去膜的完整性且细胞变得对PI可渗透来表征。如图12F所示，HCT116细胞的独脚金内酯类似物处理以剂量依赖性方式增加了早期(膜联蛋白V+/PI-)和晚期(膜联蛋白V+/PI+)凋亡细胞的百分比：将HCT116细胞以每孔4×105细胞接种至2个6孔板的10％DMEM培养基中。第二天，将培养基替换为无酚红DMEM，其补充有10％木炭剥离血清和指定的独脚金内酯类似物。使用的剂量代表IC50和IC50+25％。将细胞孵育48小时，然后用膜联蛋白-V和PI共染色(图12F)。用10ppm和15ppmMEB-55处理后，晚期凋亡细胞的百分比从3.6％分别增加到62％和85％(图12F，较低的图版)。用10ppm和15ppm EG-9c处理后，晚期凋亡细胞的比率分别增加到12.5％和43.3％(图12F，中间的图版)。该数据还和其他独脚金内酯类似物(EG-5、ST-357和ST-362)的结果以柱状图的形式给出(图12G)。在独脚金内酯处理后，还对两个其他的结肠癌细胞系(SW480、HT29)进行双重膜联蛋白V/PI染色分析。在MEB-55处理后，在这些细胞系中观察到以剂量依赖性方式增加的凋亡(图12D)。
使用Hoechst染色以分析细胞核中的变化。在5ppm至10ppm下的ST-362处理导致预示凋亡的核浓缩(nuclear condensation)和断裂改变的增加(图9A)。为了确定连续的独脚金内酯类似物暴露是否是生长抑制和减少细胞存活需要的，用ST-357、ST-362或MEB-55以5ppm、10ppm或20ppm处理MDA-MB-231、HCT116和U20S细胞1、2、4、8或24小时。在每个时间点移除独脚金内酯类似物并用新鲜的不含独脚金内酯类似物的生长培养基替换培养基。然后将细胞固定在1％的低聚甲醛中，并用Hoechst33342染色，显示出细胞收缩的迹象，观察到核浓缩和核断裂以及偏心核(eccentric nuclei)(插入图9A)。此外，24小时后，用XTT检测评估了MDA-MB-231细胞的生存力(图9B)。ST-362和MEB-55以剂量依赖和孵育时间依赖方式诱导细胞生存力的不可逆降低：用指定浓度的独脚金内酯类似物处理了MDA-MB-231乳腺癌细胞(图9B)。在2、4或24小时后，移除培养基，洗涤细胞并用减去独脚金内酯类似物的生长培养基替换培养基。在24小时的时候，评估了细胞生存力：早在独脚金内酯类似物处理4小时的时候，就诱导了生存力的显著降低(p＜0.01)。2小时暴露后未观察到细胞生存力的变化。与暴露4小时相比，连续暴露(24h)于每种独脚金内酯类似物诱导了细胞生存力更大的降低(p＜0.001)。这些结果表明，独脚金内酯类似物诱导了不可逆和时间依赖的细胞生存力降低。因此，可以得出结论，独脚金内酯也诱导不可逆和时间依赖的细胞生存力降低。
在HCT116细胞(图9C)中，1小时后，ST357、ST362和MEB55产生了生存力的中度降低(分别为10ppm；75％、82％和75％，20ppm；63％、80％和68％)。处理4至8小时后，ST-362(20ppm)将细胞生存力从60％降低至30％。ST-357将生存力从50％降低至10％。MEB-55是检测的最有效的类似物，其在4小时的时候产生了生存力的明显降低(10ppm，18％和20ppm，0％)。在DU145细胞中观察到了相似的结果(图9D)。U20S细胞表现出对于独脚金内酯类似物处理1至4小时更高的敏感度(图9E)，其与该细胞系中较低的IC50值相关(图7中的表)。1小时后，ST-357、ST-362和MEB-55处理过的细胞在10ppm浓度下，生存力分别从80％、65％和52％降低，并在20ppm浓度下分别降低至77％、65％和40％。然而，4小时后，ST-357、ST-362和MEB-55处理过的细胞在10ppm浓度下，生存力分别从62％、25％和0％减少，并在20ppm浓度下分别减少至10％、11％和0％。这些结果显示，独脚金内酯处理的损伤作用在短时间暴露后诱导并且在独脚金内酯移除后不可逆。
表5
用独脚金内酯类似物处理之细胞系的细胞周期分析
独脚金内酯类似物处理对BJ成纤维细胞和MDA-MB-231细胞之细胞周期进程的作用。使用总DNA含量的流式细胞术分析来估计在细胞周期不同时相的细胞数量，包括独脚金内酯类似物处理后的亚G1峰检测。用指定剂量的EG-5、ST-362和MEB-55处理细胞48小时。数据代表两个独立实验。
通过独脚金内酯处理抑制MCF-7球囊生长
考虑到与GR-24相比，其他独脚金内酯类似物对于乳腺癌细胞系生长有相似的作用，我们期望独脚金内酯类似物也会对MCF-7初级球囊的形成有相似作用(图10)：将MCF-7细胞一式两份地以每孔3000细胞接种至低吸附96孔板的MEBM培养基中。同一天添加了指定剂量的独脚金内酯类似物。7天后，拍摄了代表性图像。所有5种独脚金内酯类似物在5ppm浓度及以上的浓度下完全阻断了球囊形成(图10A)。ST-362和MEB-55也在2.5ppm下阻断球囊生长。ST-357在2.5ppm下显示出对球囊生长的显著减少(p＜0.01)。ST-357、ST-362和MEB-55在1ppm下也显著抑制了球囊形成(p＜0.01)。这些数据与作为MCF-7单层生长之最有效抑制剂的这些独脚金内酯类似物是一致的(图7，表2)。与GR-24类似，抑制球囊形成需要的剂量低于在单层培养物中抑制增殖所需的剂量(低5倍；ST-362和MEB-55，低3倍；ST-357)。为了确定对于独脚金内酯类似物处理的敏感度是否对球囊形成是特异性的，或者其是否扩展到成熟球囊的完整性和存活，使MCF-7球囊在不存在独脚金内酯类似物的情况下生长，并在7天后(或者一旦球囊已经达到了100μM以上的平均直径)，向生长培养基以指定剂量添加独脚金内酯类似物(图10)。将MCF-7细胞一式两份地以每孔3000细胞接种至低吸附96孔板的MEBM培养基中，且让初级球囊生长7天。此时向培养基中加入指定剂量的独脚金内酯类似物。图11A是用5ppm浓度处理之球囊的代表性图像，其显示了暴露于独脚金内酯类似物2天后的分离。用EG-9C处理的球囊显示出较不明显的形态变化，这与所述独脚金内酯类似物抑制球囊形成效能的降低有关(图11A)。处理5天，在24和48小时后，肉眼监测球囊。独脚金内酯类似物处理24小时后，未观察到变化。48小时后，用ST-362、ST-357和MEB-55在5ppm和2.5ppm剂量下处理的球囊表现出更松散的形态并表现出分离(图11B)：计数球囊数量(＞100μM)且数据以载体处理对照的百分比给出(图11B)。在5ppm浓度下，EG-5、EG-9C、ST-357、ST-362和MEB-55将球囊数量从86.7+6.8(载体对照)分别减少至23+5、38+6.2、6+2、8.3+3.5和9.3+1.5％。在2.5ppm浓度下，球囊数量减少至35+6.9(EG-5)、52+12.3(EG-9C)、22+8.5(ST-357)、6+1.7(ST-362)和20.7+8.6(MEB-55)。正如预期地，这些结果与类似物抑制球囊形成的能力密切相关(图5)。还对分离的球囊进行了XTT生存力检测。在5ppm的浓度下，EG-5、ST-362和MEB-55分别将生存力降低至3.7+0.5、25.5+8.8和4.6+1.1％。
独脚金内酯类似物激活应激活化的MAPK并抑制存活信号
为了研究独脚金内酯类似物在癌细胞中引起的信号机制，用独脚金内酯类似物处理MDA-MB-231、DU145和HCT116细胞1、4或者8小时，并用免疫印迹分析了裂解物。MAPK酶家族在细胞生长、存活和细胞应激反应中起到关键作用。最有特点的MAPK分为3个家族：(i)丝裂原(mitogen)活化的细胞外信号调控激酶(ERK1/2)，其响应于阳性增殖信号而活化，(ii)c-Jun氨基(N)-末端激酶(JNK1/2/3)和(iii)p38亚型(p38α、β、γ、δ)，所有这些家族均由环境应激刺激(如DNA损伤、UV照射和炎性细胞因子)所活化。
对用独脚金内酯类似物处理的MDA-MB-231和HCT116细胞进行了免疫印迹分析。图13A显示了MDA-MB-231细胞在用ST-362以10ppm或5ppm的浓度或单独载体(-)处理指定时间后的免疫印迹：虽然在pERK1/2中注意到了一些剂量依赖性变化，但是ERK1/2的总蛋白质水平没有变化(图13A)。然而，ST-362诱导了时间依赖和剂量依赖性之pP38水平的提高，所述提高在暴露于独脚金内酯类似物4小时后首先明显。在4小时和8小时后，与载体对照相比，在ST-362处理后，pP38的水平分别提高了5倍和13倍(图13B-柱状图显示了如图13A所示之pP38水平的光密度量化)。为了确定pP38水平是否翻译为下游信号的活化，分析了核P38基质、活化转录因子2(ATF2，其属于碱性区亮氨酸拉链蛋白的ATF/cAMP响应元件结合(CREB)蛋白家族)、MSK1(丝裂原和应激活化蛋白激酶)和热休克蛋白27(HSP27)。在MDA-231细胞中响应于MEB-55或ST-362诱导了ATF2和HSP27的磷酸化(图13A和图13C)。在ST-362处理后4至8小时，水平显著提高，并因此与pP38MAPK遵循相似的活化时间进程。在pMSK1中没有变化。重要的是，pT581MSK1也是ERK1/2的目标，其磷酸化在独脚金内酯类似物处理后未变化。在MDA-231细胞中4小时后，MEB-55和ST-362也可诱导P38ATF2和HSP27的磷酸化(图13D和图13F)。在P38和JNK1/2之间存在显著的交联(cross talk)，且两个模块分享MAPKKK的亚群。独脚金内酯类似物处理还在4小时后导致pJNK1/2的增加(图13D)。
为了确定P38是否为独脚金内酯诱导之ATF2和HSP27磷酸化的直接原因，在添加独脚金内酯类似物之前，用药理学P38抑制剂SB203580预处理MDA-231细胞1小时，并仅用ST-362或MEB-55或者与SB203580一起处理细胞4小时。通过对直接的P38目标pT334MAPKAPK的免疫印迹确认了SB203580的功能。在SB203580暴露后，pT334MAPKAPK磷酸化以剂量依赖性方式减少(图13E)。当MEB-55处理时，与pMSK1类似，pT334MAPKAPK未增加(图13A和图13D)，表明独脚金内酯处理仅诱导了特异性p38目标亚群的活化。在添加独脚金内酯类似物之前用SB203580于2μM和10μM浓度下预处理MDA-231细胞1小时足够抑制由ST-362和MEB-55诱导之HSP27的磷酸化(图13F)，但是在独脚金内酯类似物处理后，甚至20μM至40μM的SB203580都没有抑制ATF2的磷酸化(图13E)，反而造成了pATF2水平剂量依赖性提高。
pP38MAPK水平也在SB203580处理过的细胞中提高，该现象也在试剂数据表(reagent datasheet)中报告(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)。这些结果显示，在该系统中P38对ATF2磷酸化不起作用。ATF2也可直接通过JNK1/2和Ras-ERK1/2通路在T69和T71上磷酸化。因为暴露于独脚金内酯时ERK1/2活化没有改变(图13A)，所以JNK1/2似乎是可能的候选。
MEB-55诱导了pP38中时间依赖性的增加，其在独脚金内酯类似物处理4小时的时候首先明显并在24小时的时候保持上升(图13G和14H)。由于p38MAP激酶通路活化的结果，由MAPKAP激酶2在Ser15、Ser78和Ser82处直接磷酸化HSP27(P38的下游目标)。响应于MEB-55，pSer82HSP27水平以与pP38相似的时间依赖性方式提高。JNK1/2在4小时的时候表现出准确和稳健(15倍提高)的磷酸化，所述磷酸化在8小时的时候降低了50％并在24小时的时候回到了基准水平。相反地，在处理1小时后，pERK1/2水平降低4倍，其在4至8小时进一步降低并在24小时的时候保持抑制。同样地，pAKT水平在8小时的时候降低6倍，并在24小时的时候降低至无法检测的水平。还在“普通”BJ成纤维细胞系中检测了MAPK的活化(图13I)。pP38水平于独脚金内酯处理后在BJ成纤维细胞中基本保持不变。pERK1/2水平仅在4小时的时候降低但是在8小时的时候回到基准并实际上在24小时的时候提高到基准以上，这显示了与DU145细胞相比不同的响应动力学(图13I)。图13J为P38和pP38在HCT116细胞中用ST-357或MEB-55处理4小时后的免疫印迹分析。
为了确定应激活化的MAPK活化对于独脚金内酯类似物诱导的生长抑制和凋亡诱导是否是需要的，利用了P38(SB203580)和JNK1/2(SP600125)的药理学抑制剂。仅用ST-362或MEB-55或者与SB203580一起处理了DU145和U20S细胞。pHSP27的免疫印迹分析确认了SB203580能够完全抑制独脚金内酯类似物诱导的P38活化(图13K)。用SP600125的相似分析仅部分减少了JNK1/2激酶的活化，同时SP600125浓度的增加对细胞是有毒的(图13L)。在随后的群体存活检测(colonysurvival assay)中，用50μM SB203580预处理了U20S细胞2小时或者仅用不同剂量的ST-362处理了U20S细胞6小时。然后用胰蛋白酶消化细胞，并以有限稀释的2×103细胞/孔重接种于6孔板中。允许细胞形成群体14天，由此固定细胞并用结晶紫和70％的EtOH染色。计数50个或者更多细胞的群体并在图13M中给出存活曲线。虽然ST-362浓度的增加减少了细胞存活，但是用SB203580预处理细胞能够部分增加细胞存活并拯救(rescue)独脚金内酯类似物抑制功能。
独脚金内酯类似物抑制存活信号通路
P13K/AKT通路调控广泛的细胞功能，包括存活和增殖。AKT活化需要2个关键残基(羧基末端附近的S473)的磷酸化，所述羧基末端附近的S473被认为是随后T308磷酸化和最大AKT活化所需要的。pT308AKT水平在MEB-55处理过4至8小时的细胞中明显降低，并在24小时的时候保持低水平(图14)。用较低效的独脚金内酯类似物EG-5处理的细胞表现出在抑制AKT磷酸化上发生于8至24小时之间的轻微延迟。S9上的磷酸化抑制了GSK3α/β活性。pS9/21GSK3α/β不与pAKT密切相关，然而在24小时后观察到了pGSK3α/β的降低(图14)。PDK1在T308上磷酸化AKT，T308在S241上通过磷酸化自活化。当独脚金内酯处理时pS241PDK1的水平降低，并与在独脚金内酯处理的细胞中观察到的减少的AKT磷酸化密切相关(图14)。这些结果表明，独脚金内酯类似物抑制存活信号通路。
结肠细胞经历响应于独脚金内酯处理的G2/M停顿和凋亡
从G2至有丝分裂(M)的细胞周期进程伴随着细胞周期蛋白B1的积累。细胞周期蛋白B1与Cdk1(Cdc2)复合以形成成熟促进因子(MaturationPromoting Factor，MPF)，其涉及到有丝分裂的早期事件(如染色体浓缩、核膜分解和纺锤体极组装)。
将HCT116细胞以4×105细胞每孔接种入3个6孔板中的10％DMEM培养基中。第二天，将培养基替换为补充有指定独脚金内酯类似物(10ppm)或单独载体(vehi.)的生长培养基。将细胞孵育8小时或24小时。产生的裂解物对细胞周期蛋白B1进行免疫印迹，且微管蛋白作为加样对照(loading control)(图17A)。
在DU145(图17B)、HCT116(图17C)和A549(图17D)中细胞周期蛋白B1水平的蛋白质印迹分析显示在独脚金内酯类似物处理24小时后，细胞周期蛋白B1的水平下降了5至10倍。在较早的时间点上未检测到细胞周期蛋白B1水平的变化。在Thr14处Cdk1(Cdc2)的脱磷酸化对于其活化是关键事件，以允许有丝分裂进入。如同pT14Cdc2水平，Cdk1蛋白水平保持不变(图17B)。进行了定量实时PCR(Quantitative Real-timePCR)以确定细胞周期蛋白B1抑制是否部分处于转录水平。与载体对照相比，在用10ppm的MEB-55处理的HCT116和A549细胞中观察到了细胞周期蛋白B1mRNA两倍的减少(图17E)。
为了确定细胞周期蛋白B1的抑制是否是可逆的，用ST-362或MEB-55处理了DU145细胞24小时，然后在PBS中洗涤细胞并将培养基替换为不含独脚金内酯类似物的普通生长培养基处理另外24小时。MEB-55和ST-362处理以剂量依赖性方式降低了细胞周期蛋白B1水平，且在移除独脚金内酯之后，细胞周期蛋白B1之蛋白质水平回到了仅用载体对照的水平(图17F)。为了确定独脚金内酯类似物诱导的G2停顿是否在独脚金内酯移除后也是可逆的，用MEB-55处理了DU145细胞24小时，在PBS中洗涤细胞两次，然后用减去MEB-55的新鲜生长培养基重叠并再孵育48小时(图17G)。结果表明，在5ppm和10ppm的浓度下，MEB-55分别诱导了G2/M比率从18％至46％和50％的增加。在独脚金内酯类似物移除后48小时，与对照细胞(其G2/M比率此时也已经增加至30.7％(未处理)和28.5％(载体对照))相比，在5ppm和10ppm处理的细胞中G2/M比率都减少至29％。
在细胞周期进程中，通过在中期-后期转换的APC/C依赖性蛋白体降解调控细胞周期蛋白B1水平。为了确定独脚金内酯类似物是否通过细胞周期蛋白B1稳定性的调整抑制细胞周期进程，用MEB-55或ST-362处理了DU145细胞24小时。然后向培养基中添加蛋白体抑制剂ALLN再处理4或8小时(图17H)。结果表明，ALLN处理诱导了独脚金内酯类似物处理后细胞周期蛋白B1水平的部分拯救(ST-362；2倍，MEB-55；1.3倍)。然而，细胞周期蛋白B1水平保持低于对照裂解物中的水平，表明独脚金内酯类似物仅部分通过增强的降解调控细胞周期蛋白B1水平。
独脚金内酯和其他独脚金内酯类似物对乳腺癌细胞系生长和存活有抑制作用。所有证实的独脚金内酯类似物诱导乳腺癌细胞系中的G2/M停顿以及不同程度的凋亡。非肿瘤“普通”系(MCF10A和BJ成纤维细胞)仅表现有限的生长抑制且仅在最高剂量范围检测到，表明致瘤细胞对于独脚金内酯类似物的生长抑制作用更加敏感，且独脚金内酯类似物诱导了在癌症和普通细胞中不同的响应。而且，独脚金内酯抑制作用不限于乳腺癌细胞，结肠、肺和前列腺癌细胞也对独脚金内酯类似物的生长抑制作用表现出增加的敏感度。ST-362和MEB-55在仅4小时后诱导了细胞生存力不可逆的降低，这与p38MAPK、JNK1/2和AKT之抑制的磷酸化有关。p38和JNK1/2是应激活化的MAPK，其在应激信号级联中起到至关重要的作用，并与一些细胞系统中的细胞周期停顿和凋亡相关。已经报告p38MAPK连接并活化p53，且引起p53诱导的凋亡。虽然独脚金内酯类似物在表达野生型(MCF-7)和突变体(MDA-MB-231、MDA-MB-436、T47D)p53的细胞中都能够诱导凋亡，但是MCF-7细胞较不敏感。当p38药理学抑制剂阻断HSP27磷酸化时，其不阻断ATF2磷酸化的增加，所述磷酸化也可通过JNK1/2活化。
细胞对于独脚金内酯类似物的不同响应(细胞抑制对细胞毒)为剂量依赖性的但也可以通过细胞周期阶段确定。所有例示的独脚金内酯类似物对于MDA-MB-231细胞的IC50剂量相对于MCF-7细胞低2-3倍。这与MDA-MB-231系增殖率的上升(S-期比率，14％至18％相对于MCF-7中的2％至4％)相关，并进一步支持了独脚金内酯类似物基于其靶向快速分裂细胞之能力的癌症治疗作用。生长为“干样细胞富集”球囊的乳腺癌细胞表现出与单层生长细胞相比对独脚金内酯类似物敏感度的增加。独脚金内酯类似物减少了球囊生长并诱导了球囊分离，其与独脚金内酯类似物降低生存力的能力相关。独脚金内酯类似物对植物干细胞相似的作用表明普遍的作用机理，且由于其与天然独脚金内酯结构的相似性，表明后者以相似的方式起作用。
独脚金内酯类似物诱导的基因表达变化
为了进一步说明转录程序，通过所述程序独脚金内酯类似物可以影响癌细胞的生长和存活，用ST-362或MEB-55(5ppm)处理了U20S细胞6或24小时以允许区别早期和晚期基因表达变化。U20S细胞基于其对独脚金内酯处理增强的敏感度选取(见图7)。独脚金内酯类似物暴露6小时后，观察到了明显的应激反应和热休克蛋白(HSPA6、HSPA7、HSP1A、HSP1B、HSPB8)和相关基因(HSPA1L、AHSA1)表达的上升。独脚金内酯类似物暴露还诱导了参与新陈代谢功能之基因(SLC3A2、SLC44A2、SLC31A2、SLC7A11、ABCB1、CYP24A1、PTGS2/COX2、ALDH1B1)表达和转录因子(ATF3、FOX01、FOXD1)表达的变化。还注意到了细胞因子(CCL3L3、GDF15)和生长因子(PGF)的上调以及TGFBR11的下调。还识别了凋亡调控基因，包括DDIT3、BIRC3和BAG3。DDIT3编码了转录因子之CCAAT/增强子-结合蛋白(C/EBP)家族的成员，并通过与其他C/EBP成员形成异源二聚体并阻止其他C/EBP成员之DNA结合活性发挥显性负抑制剂(dominant-negative inhibitor)。通过应激诱导DDIT3，所述应激包括DNA损伤，且DDIT3过表达可以诱导细胞周期停顿。6小时后，MEB-55处理与p21cip(CDKN1A)、细胞周期蛋白F(CCNF)、细胞周期蛋白A2(CCNA2)表达的增加和CDK6表达的减少相关，而ST-362仅诱导了细胞周期蛋白B1(CCNB1)中度的下调。因此，细胞周期调控因子表达谱中的变化不是独脚金内酯暴露的总体特点(global hallmark)。仅有的例外是细胞周期蛋白G2(CCNG2)，其表达在ST-362和MEB-55处理组二者中都上升了。细胞周期蛋白G2是非传统的细胞周期蛋白同系物，其与生长抑制有联系，且其表达通过DNA损伤化学治疗诱导。
独脚金内酯类似物处理24小时以参与RNA加工和翻译之基因(RN7SK、SNORD3A、SNORD3C、SNORD3D)的上调和参与细胞粘附(celluar adhesion)之基因(LAMA1、AMPH、ITGA2、SPP1/OPN1、ESM1、CYR61)的表达改变为标记。ESM1表达在MEB-55和ST-362处理组中分别为第二(21.2倍)和第三(6.9倍)最上调的基因。ESM1是分泌的蛋白聚糖，其表达通过炎性细胞因子上调。ESM1改变的表达也已经显示出诱导细胞周期停顿。对比6小时的时间点，24小时的独脚金内酯类似物处理与热休克蛋白的上调无关，而在ST-362和MEB-55处理组中单个热休克蛋白(HSPA5)均下调。若干新陈代谢基因(DHRS2、SLC7A11、DUSP5、SCG5、ABCA13)以及转录因子(E2F2、EGR1)和生长因子(TGFB1、CTGF)显示出改变的表达模式。编码蛋白质IAP家族成员并且是凋亡抑制剂的BIRC3在24小时处理组中保持上调。出人意料地，参与细胞周期调控的唯一基因是KIF20A，其在ST-362和MEB-55处理组二者中于24小时后改变，且其为参与胞质分裂的有丝分裂驱动蛋白。仅有ST-362处理与其他有丝分裂驱动蛋白(KIF23、KIF4A、KIF11、KIFC1、KIF2C、IF15)和细胞周期调控因子的下调相关，所述细胞周期调控因子包括细胞周期蛋白(CCNB2、CCNA2、CCNF)和细胞周期调控蛋白(CCNBP1、CDKN3、CDC2、CDCA3、CDC20、CDC25C、CDCA2)。细胞周期蛋白B1还通过单独的ST-362在24小时的时候保持下调。
下表5和6提供了在用独脚金内酯类似物分别处理细胞6和24小时期间表达之选取基因的列表：
实施例7
肿瘤植入和处理
为了建立皮下肿瘤，收获了活化的生长MDA-MB-231乳腺癌细胞且将在100μlPBS中的1.5×106个细胞注射入小鼠(n＝15)的乳腺脂肪垫(mamamary fat pad)。使病变生长直至其平均尺寸为大约4.5mm×4.5mm(约3周)。然后将小鼠随机分为3组进行不同处理，所述处理包含载体对照和两种独脚金内酯类似物：ST-362和ST-357。在第一天开始处理，每周进行两次10ppm(10mg/Kg)处理，总计4次。ST-362和ST-357静脉内(iv.)施用。每周记录两次体重和肿瘤测量值。肿瘤截面积通过长与宽相乘计算，而肿瘤体积通过求长与宽之平均值的立方计算。总结并绘制结果。
统计分析
数据以平均值±SD表达。通过单因素方差分析(ANOVA)和Games-Howell事后检验评估了统计显著性。除非另有说明，认为p＜0.05的值是显著的，且与未处理的对照相比表现显著性。通过GraphpadPRISM5和SPSS分析了数据。
结果
独脚金内酯类似物抑制了体内异种移植肿瘤模型的肿瘤细胞生长。所述结果确定，用10mg/kg的独脚金内酯类似物处理未影响动物体重(图19)。单因素方差分析和Kruskai-wallis检验证实，所有三组的平均和中值体重是相似的。P＝0.2181。将MDA-MB-231细胞注射入SCID小鼠以产生肿瘤，且当肿瘤达到12.5mm3时，开始用独脚金内酯类似物处理。每周对动物进行两次处理，总计4次。如图18所示，ST-362和ST-357二者在抑制肿瘤生长中是有效的(p＜0.0015)。对照组中的平均肿瘤体积为24.2±5.57mm3，而ST-362处理之小鼠中的平均肿瘤体积为17.7±4.28mm3，且在ST-357处理组中的平均肿瘤体积为15.9±2.61mm3。约10％注射过的动物显示出在注射位点较小的刺激。动物在第4次注射后根据动物护理指南(animal care guideline)处死。
实施例8
与独脚金内酯类似物的组合治疗和标准化学治疗方案
癌症的系统治疗已经由化学治疗方案所主导，其经常引起严重的毒性作用。这些副作用经常导致治疗的中止。本发明首先证明了独脚金内酯类似物增强低剂量化学治疗药物的疗效。最常用的化学治疗药物之一为顺铂。
前面的XTT生存力检测确定了ST-362对于MDA-231乳腺癌细胞的IC50和IC20浓度(分别2.9ppm和1.5ppm)。为了确定ST-362的这些浓度是否可以增强低剂量顺铂的疗效，用不同浓度的顺氯氨铂在ST-362IC50和IC20浓度存在下处理了MDA-231细胞。ST-362与低剂量顺铂(0.01μM至0.1μM)的组合产生了比单独用每种药物更大的作用(图20)。根据Chou和Talalay通过CalcuySyn软件包(Biosoft)进行的组合指数(CombinationIndex，CI)分析(CI＜1)表明了顺铂与ST-362之间的协同作用(表8)：
表8
治疗组合之间的相互作用
CI
顺铂 0.8
顺铂+ST-362(IC20) 0.597
顺铂+ST-362(IC50) 0.353
实施例9
确定天然独脚金内酯和类似物对酵母细胞培养物生长的作用 材料和方法
细胞培养和生长条件
使酿酒酵母和橄榄假丝酵母细胞在28℃，150rpm下于高营养培养基(reach nutrient media)中过夜生长。随后，将细胞在低营养培养基(Lily)中稀释至0.4OD且分入96孔中。用GR-24或ST-362在指定浓度下处理细胞。在28℃下每小时监测细胞培养物生长达17小时，且在每个OD读数前温和地摇晃。使用荧光计测定OD。
统计分析
使用来自统计模型(Statistical Modeling)包statmod(http：//bioinf.wehi.edu.au/software/compareCurves/)的compareGrowthCurves功能分析了曲线间的统计差异，一旦p≤0.05，则确定为显著性。
结果
用GR-24以指定浓度处理酿酒酵母培养物，导致细胞培养物生长的显著减少，其在GR-24应用后8小时已经明显(图21)。
用ST-362以0.1μM及以上的浓度处理酿酒酵母培养物，导致细胞培养物生长的显著减少。该作用从施用时起明显(图22)。而且，用ST-362以相似的方式处理橄榄假丝酵母培养物，造成在10μM浓度下细胞培养物生长的减少，且该作用在ST-362施用后8小时明显(图23)。
这是第一个评估独脚金内酯和独脚金内酯类似物(植物激素的新种类)对细胞增殖和哺乳动物细胞(特别是癌细胞)之作用的研究。该工作证明了独脚金内酯和独脚金内酯类似物代表了抗增殖治疗和抗癌治疗的新种类，其能够靶向大块肿瘤(bulk tumor)且还有效地靶向“癌症干样细胞”。作用机制可包含应激信号活化和通过抑制AKT抑制存活信号。
在描述本发明的上下文中没有数词限定的术语或相似指代(特别是在接下来权利要求的上下文中)应解释为包括单数和复数二者，除非本文另外指明或者明显同上下文矛盾。术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应解释为开放的术语(即意为“包括但不限于”)，除非另有注明。本文数值范围的叙述仅仅是期望作为个别地涉及落入该范围之每个单独值的简化方法(shorthand method)，除非本文另有指明，且每个单独的值并入说明书中，如同其在本文个别地列举。本文描述的所有方法可以任何合适的顺序实施，除非本文另外指明或者明显同上下文矛盾。本文提供的任何和所用实例或者示例性语言(例如，“如”)的使用仅仅是期望更好地说明本发明，并不形成对本发明范围的限制，除非另有要求。在说明书中任何语言都不应解释为指定任何未要求保护的要素对于本发明之实践是必要的。
虽然已经在上文连同某些说明性的实施方案描述了本发明，但是应了解，可以使用其他相似的实施方案或者可以在不偏离本发明的情况下对描述的实施方案进行修改和增加以实现与本发明相同的功能。而且，公开的所有实施方案不一定是相替换的，因为可以组合本发明不同的实施方案以提供期望特征。本领域普通技术人员可以进行变化而不偏离本发明实质和范围。因此，本发明不应限于任何单个的说明性实施方案，而应根据所附权利要求之叙述的宽度和范围解释。

Claims (18)

1.式X化合物
或者其各种异构体或药物可接受的盐、或者其混合物在制备用于预防或抑制细胞增殖或者用于诱导细胞死亡之活性剂中的用途，
其中，
P1为包含一个6元环和两个5元环的稠环系统；
表示S或R构型。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述活性剂是抗肿瘤药物。
3.根据权利要求1所述的用途，或者其各种异构体或药物可接受的盐、或者其混合物，用于制备抗肿瘤药物组合物，其中P1具有以下式
其中
表示连接点；
虚线表示任选的双键；
R1和R6独立地为H、OH、任选地被卤素原子取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、环烷基、芳基或者任选地被烷基取代的杂芳基；
P2为任选取代的6元环；
Z和Y独立地为O、CH或N；以及
m和n独立地为0或1；
条件是如果Z为O，则m为0，且如果Z为CH或N，则m为1；并且
条件是如果Y为O，则n为0，且如果Y为CH或N，则n为1。
4.根据权利要求3所述的用途，其中P2选自：
其中
R2或R5独立地表示H、羟基、卤素、低级烷氧基、酰氧基、羧基、低级烷氧羰基、氨甲酰基、N-单取代或N,N-二取代的氨甲酰基、氨基、单取代或二取代氨基、环烷基、杂环基、芳基、或者包含0、1、2或3个环氮原子和0或1个氧原子和0或1个硫原子的单或双环杂芳基基团，在每种情况下所述基团是未取代的或者是单取代或多取代的；
R3或R4独立地表示H、羟基、卤素、C1-C6烷基、环烷基、苯并环烷基、杂环基、芳基或取代的苯基、或者包含0、1、2或3个环氮原子和0或1个氧原子和0或1个硫原子的单或双环杂芳基基团，在每种情况下所述基团是未取代的或者是单取代或多取代的；
R7为H、OH、CH3、CH2OH或OAc；
R8为O或OH，其中如果R3是O，则该键为双键；并且
R9为H、OH或OAc。
5.根据权利要求3所述的用途，其中所述式X化合物为式I化合物
其中
R7、R8和R9如权利要求4中所定义；并且
R10为H、OH或OAc。
6.根据权利要求1所述的用途，其中P1具有以下式II
其中
表示连接点；
虚线表示任选的双键；
R1、R6、P、Q、Z、Y、m和n如权利要求3中所定义；并且
R2、R3、R4和R5如权利要求4中所定义。
7.根据权利要求2所述的用途，其中所述抗肿瘤制剂适于治疗选自乳腺癌、肺癌、前列腺癌或结肠癌和黑素瘤的病症。
8.根据权利要求2所述的用途，其中所述抗肿瘤制剂还包含一种或更多种另外的药物活性化合物。
9.根据权利要求6所述的用途，其中所述式II化合物选自
3aR＊,8bS＊，E)-3-(((R＊)-4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基)-亚甲基)-3,3a,4,8b-四氢-2H-茚并[1，2-b]呋喃-2-酮，
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-1,4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮，
(±)(2E)-7-溴-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-1,4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮，
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-7-(4-硝基苯基)-1,4-二氢-2H环戊并[b]吲哚-3-酮，
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-7-(2-噻吩基)-1,4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮，
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-7-[(4-二甲基氨基)-苯基]-1,4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮，
(2E)-7-(1-甲氧基萘-2-基)-1,4-二甲基-2-((4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基)亚甲基)-1,2-二氢环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮，
(2E)-2-[(2，5-二氢-4-甲基-5-氧代呋喃-2-基氧基)亚甲基]-1，2-二氢-7-[4-(二甲基氨基)苯基]-1,4-二甲基-环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮，
(2E)-1,4-二甲基-2-((4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基)亚甲基)-7-(噻吩-2-基)-1,2-二氢环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮，
(2E)-2-[(2，5-二氢-4-甲基-5-氧代呋喃-2-基氧基)亚甲基]-1，2-二氢-7-(2，3-二氢噻吩并[3，4-b][1，4]二氧杂芑-7-基)-1,4-二甲基环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮，
(±)2E-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-6-噻吩-2-基-1,4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮，
(3aR＊,8bS＊，E)-3-(((R＊)-4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基)亚甲基)-3，3a，4,8b-四氢-2H-茚并[1，2-b]呋喃-2-酮，
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-1，4-二氢-2H环戊并[b]吲哚-3-酮，
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-7-[(4-二甲基氨基)-苯基]-1,4-二氢-2H-环戊并[b]吲哚-3-酮，
(2E)-1,4-二甲基-2-((4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基)亚甲基)-7-(噻吩-2-基)-1,2-二氢环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮，
(2E)-2-[(2，5-二氢-4-甲基-5-氧代呋喃-2-基氧基)亚甲基]-1，2-二氢-7-(2，3-二氢噻吩并[3，4-b][1，4]二氧杂芑-7-基)-1,4-二甲基-环戊并[b]吲哚-3(4H)-酮，和
(±)(2E)-4-甲基-2-(4-甲基-5-氧代-2,5-二氢呋喃-2-基氧基亚甲基)-6-噻吩-2-基-1,4-二氢-2H环戊并[b]吲哚-3-酮，以及
其组合。
10.抗增殖组合物，其包含如权利要求1所定义的式X化合物或者其各种异构体或药物可接受的盐、或者其混合物。
11.根据权利要求10所述的组合物，其适于杀死癌症干细胞(CSC)或者肿瘤起始细胞(TIC)。
12.根据权利要求10所述的组合物，其适于预防或抑制酵母和真菌的生长或者破坏酵母和真菌。
13.根据权利要求10所述的组合物，其用于表面、经肠、经口、经直肠或肠胃外施用。
14.治疗增殖性病症的方法，其包括向有此需要的患者施用如权利要求1所定义的式X化合物、或者其异构体或药物可接受的盐、或者其混合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述式X化合物在至少一种其他治疗剂之前、之后施用或与至少一种其他治疗剂一起施用。
16.根据权利要求5所述的用途，其中所述式I化合物选自
17.根据权利要求1所述的用途，其中所述式X化合物选自
18.如权利要求1所定义的式X化合物，其用作抗增殖剂
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