JP2014527979A - 増殖性疾患を治療するためのストリゴラクトンおよびストリゴラクトンアナログの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
破線は二重結合であってもよいことを示す;
R1 およびR6は、互いに独立に、H、OH、C1-C6アルキル(ハロゲン原子で置換されていてもよい)、C2-C6 アルケニル、C2-C6 アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、アルキルで置換されていてもよい;
P2は、置換されていてもよい6員環である;
ZおよびYは互いに独立にO、CH、またはNである;ならびに
mおよびnは互いに独立に0または1である;
ただしZがOならば、mは0であり、ZがCHまたはNであるならば、mは1である;ならびに
YがOならば、nは0であり、YがCHまたはNであるならば、nは1である。
R2 またはR5は独立に、H、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、アシルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、N-一置換もしくはN,N-二置換カルバモイル、アミノ、一置換もしくは二置換アミノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール基、または単環式もしくは二環式ヘテロアリール基を表し、このヘテロアリール基は0、1、2もしくは3個の環員窒素原子、および0もしくは1個の酸素原子、および0もしくは1個の硫黄原子を含んでいるが、前記の基はいずれの場合も、非置換または一置換または多置換である;
R3またはR4は独立に、H、ヒドロキシ、ハロゲン、C1-C6アルキル、シクロアルキル、ベンズシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールもしくは置換フェニル、または単環式もしくは二環式ヘテロアリール基を表し、このヘテロアリール基は0、1、2もしくは3個の環員窒素原子、および0もしくは1個の酸素原子、および0もしくは1個の硫黄原子を含んでいるが、前記の基はいずれの場合も、非置換または一置換または多置換である;
R7はH、OH、CH3、CH2OH、またはOAcである;
R8はOまたはOHであって、このR8がOならば、その結合は二重結合となる;
R9はH、OH、またはOAcである。
破線は二重結合であってもよいことを示す;
R1、R2、R3、R4、R5、R6、P、Q、Z、Y、m、およびnは、上記の通りである。
(3aR*,8bS*,E)-3-(((R*)-4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)-メチレン)-3,3a,4,8b-テトラヒドロ-2H-インデノ[1,2-b]フラン-2-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-7-ブロモ-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-(4-ニトロフェニル)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-(2-チエニル)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-[(4-ジメチルアミノ)-フェニル]-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(2E)-7-(1-メトキシナフタレン-2-イル)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、
(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-1,4-ジメチル-シクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、
(2E)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-7-(チオフェン-2-イル)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、
(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-(2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ジオキシン-7-イル)-1,4-ジメチルシクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、
(±)2E-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-6-チオフェン-2-イル-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(3aR*,8bS*,E)-3-(((R*)-4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-3,3a,4,8b-テトラヒドロ-2H-インデノ[1,2-b]フラン-2-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-[(4-ジメチルアミノ)-フェニル]-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(2E)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-7-(チオフェン-2-イル)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、
(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-(2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ジオキシン-7-イル)-1,4-ジメチル-シクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、および
(±)2E-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-6-チオフェン-2-イル-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、ならびに
それらの混合物。
後に続く実施例は、天然ストリゴラクトン(本明細書では「ストリゴラクトン」と呼ぶ)、ストリゴラクトンアナログ、およびそれらの置換基(本明細書では「ストリゴラクトンアナログ」と称する)の、さまざまな哺乳類系および非哺乳類系における抗増殖剤としての効果、ならびに、ヒト癌細胞の増殖阻害剤としてのそれらの有効性、およびさまざまな種類の癌、たとえば乳癌、結腸癌、肺癌、および/または前立腺癌、または黒色腫の治療におけるそれらの有用性を示す。
統計分析
結果は、繰り返し分析の平均±SDとして提示し、少なくとも2つの独立した実験を代表する、または包括する。統計分析は、溶媒対照と対比してスチューデントのt検定(両側、対応あり)を用いて実施したが、P<0.05(*)の場合、有意と見なす。もっと高い検出力(p<0.01, p<0.001)も用いられ、それぞれの図の説明に示している。ストリゴラクトンアナログのIC50 用量は、シグモイド用量反応曲線(Graphpad Prism 4.0ソフトウェア)の内挿によって算出した。簡単に述べると、関連するy軸データポイント間で直線回帰を行い、未知のx軸について内挿を計算した。
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)野生型(WT; Columbia; Col-0)およびmax2-1変異体(http://abrc.osu.edu/)のホモ接合ラインの種子を表面殺菌し、1%ショ糖を添加して0.7%寒天で固めた1/2ムラシゲ・スクーグ(MS)プレート上で発芽させた。プレートを暗下で4℃にて2日間、垂直にインキュベートして、発芽を同調させた。発芽の3日後、ピンセットを用いて苗をそっと1/2 MSプレートに移したが、このプレートはさまざまな濃度のGR-24を4つのジアステレオマーの混合物として含有した:(±)-GR-24および(±)-2’-epi-GR-24。移し換えられた苗の根端を、プレート上で、マークした。プレートは、ガス(たとえばエチレン)の蓄積を防ぐために、密封しないままとし、45°に立てた位置に置き、22℃にて、白色蛍光管からもたらされる光子50-60 mol m-2 s-1の光の強度で、光照射16時間/暗下8時間の光周期のもとで6-12時間インキュベートした。
根端の細胞形態およびコルメラ(columella)細胞内のデンプン粒を調べるために、WT根を、実施例1に記載のようにGR-24プレートおよび対照プレート上で生育させた。このプレート上で6日間生育後、根をヨウ素-ヨウ化カリウム(ルゴール液(Lugol's solution)、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)で染色した。高濃度のルゴール液(5 gヨウ素および10 gヨウ化カリウムを85 ml蒸留水と混合)を使用し、続いて再蒸留水で洗浄した。Nikon DS-Fi1カメラを装備したLeica DMLB光学顕微鏡(Leica Microsystems GmbH)を用いて、それぞれの処理から根端の写真を撮影した。実験は4回繰り返した;それぞれの処理において、実験の繰り返しごとに4つの根端を調べた(図1)。
実施例1に記載のように生育処理された苗からRNAを抽出した。当該遺伝子の断片を増幅することによって、定量的PCRを行った(図6および7)。シロイヌナズナ15SリボソームRNA(GenBank受入番号AT1G04270.1)はRNA量に関する基準遺伝子としての役割を果たし、特異的なプライマー、(フォワード)5’-CAAAGGAGTTGATCTCGATGCTCTT-3’ および(リバース)5’-GCCTCCCTTTTCGCTTTCC-3’を用いて増幅された。本実験は5-6回の生物学的な繰り返し実験で行われた;各回の実験は、8個の植物体を含み、それに対して3回の技術的な繰り返し実験が行われた。平均および標準偏差は、すべての生物学的繰り返し実験から求めた。
細胞は、96ウェルプレートのウェル当たり1500細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-436、およびBJ線維芽細胞)または4000細胞として播種した。翌日、培地を、10%活性炭処理済みウシ胎仔血清(以下FBS)、ならびに指示された用量のストリゴラクトンアナログ、もしくは対照として溶媒(アセトン)のみを添加した、フェノールレッドフリーのDMEMで置き換えた。指示された時点で、個々のプレートを固定してクリスタルバイオレット-メタノール溶液(ウェル当たり50μl)で15分間染色し、蒸留水で数回洗浄し、プレートを一晩風乾した。クエン酸ナトリウム溶液(0.1M)を用いて、結合したクリスタルバイオレットを可溶化し、560 nmで光学濃度を測定した(Glomax(登録商標)-Multi Detectionプレートリーダー、Promega)。
MDA-MB-231細胞をウェル当たり3000細胞として3連で96ウェルプレートに播種した。翌日、培地を、10%活性炭処理済みFBS、ならびに指示された終濃度のストリゴラクトンアナログもしくは溶媒(アセトン)のみを添加した、フェノールレッドフリーのDMEMで置き換えた。48時間後、培地は吸引除去され、培地で希釈したヘキスト色素(2μg/ml)100μlを細胞に添加して、15分間インキュベートした。蛍光顕微鏡(Zeiss 5 Instruments, Thornwood, NY)下で、染色された細胞が観察された。
細胞培養:
細胞を37℃にて、5% CO2-95%空気の加湿環境で増殖させた。MCF-7、MDA-MB-231、MDA-436、HCT116、SW480、PC3、およびBJ 線維芽細胞 (ATCC, Manassas)は、10% FCSを添加したダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(以下DMEM))中で維持された。HT-29、LNCaP、DU145、PC3、およびA549細胞は10% FCS (Sigma)を添加したRPMI中で維持された。MCF-10Aは5%ウマ血清(Atlanta Biologicals)、20 ng/ml上皮増殖因子(EGF)(Sigma)、10μg/mlインスリン(Sigma)、および500 ng/mlヒドロコルチゾン(Sigma)を添加したDMEM中で維持された。
接着細胞を緩やかにトリプシン処理して(0.05%トリプシン/EDTA)、PBSで2回洗浄し、40μmの細胞シーブを通して濾過し、単個細胞懸濁液を得た。細胞を、5μg/mlウシインスリン、20 ng/ml組換え上皮増殖因子、20 ng/ml塩基性線維芽細胞増殖因子、(Gibco)、1× B27サプリメント、0.5μg/mlヒドロコルチゾン(MEGM Bulletkit, Lonza)を添加した、フェノールレッドフリーの無血清MEBM(MEGM Bulletkit, Lonza)で10,000細胞/mlの濃度に希釈した。MDA-MB-231マモスフェア培養のために、前記のように、増殖添加物を加えたフェノールレッドフリーの無血清CnT-27培地(CellnTEC Advanced Cell Systems, Bern, Switzerland)を使用した。超低接着表面(Ultra-Low Attachment)96ウェルプレートのウェル当たり0.1 mlをシードした。翌日、指示された用量のGR-24(ppm)または溶媒のみ(0.6%アセトンf/c)を添加した。培地を3-4日ごとに補充した。マモスフェアの自己複製能力は、再播種して次の世代のマモスフェアを生じることによって判定した。第二代マモスフェアを培養した。10-14日経過した初代マモスフェアの解離(緩やかなボルテックス攪拌によるトリプシン処理)によって、第二代マモスフェアを培養した。上記のように単個細胞懸濁液が得られた。
ストリゴラクトンアナログは、1666.67 ppm (GR-24、MEB-55、ST-362、EG-9c)および7500 ppm (EG-5、ST-357)の原液濃度でアセトン(Sigma)に溶解した。ストリゴラクトンアナログを、適当な増殖培地で、必要とされる最高濃度に希釈することによって、細胞を指示された用量で処理した。それに続くより低い濃度のために段階希釈を行った。SB203580およびSP600125は、Cell Signaling Technology (Danvers, MA)から購入した。すべての阻害剤は、メーカーの説明書にしたがってDMSO中に溶解した。
細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-436、およびBJ線維芽細胞)は、96ウェルプレートのウェル当たり1500または4000細胞を播種した。翌日、培地を、10%活性炭処理済みFBS、および指定された用量のGR-24、ストリゴラクトンアナログ、または対照として溶媒(アセトン)のみを添加したフェノールレッドフリーのDMEMで置き換えた。指定された時点で、個々のプレートを固定し、クリスタルバイオレット溶液(0.5%クリスタルバイオレットおよび25%メタノール)で15分間染色し、蒸留水で数回洗浄して一晩風乾した。クエン酸ナトリウム溶液(0.1M)を用いて結合したクリスタルバイオレットを可溶化し、光学濃度を560nmにて測定した(Glomax(登録商標)- Multi Detectionプレートリーダー、Promega)。
細胞は、通常の増殖培地に3連として、ウェル当たり1500細胞(MCF-10、PC3、DU145、MDA-MB-231、MDA-MB-436、HT-29、SW480)、ウェル当たり1000細胞(K562)、またはウェル当たり4000細胞(MCF-7、HCT116)で、96ウェルプレートに播種した(例外は非接着性白血病細胞株であるK562であって、この細胞株は10%活性炭処理済みFBS添加フェノールレッドフリーDMEMに播種した)。翌日、培地を、10%活性炭処理済みFBS、および指示された終濃度のストリゴラクトンアナログ、または溶媒(アセトン)のみを添加したフェノールレッドフリーDMEMで置き換えた。細胞は3日間インキュベートし、その時点でXTT(2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-[(フェニルアミノ)-カルボニル]-2H-テトラゾリウム分子内塩)還元を用いて、メーカーの説明書(ATCC)にしたがって生存率を測定した。細胞をXTT試薬とともに、加湿された5% CO2-95%空気の環境で37℃にて2-3時間インキュベートした。光度計SPEKTRAFluor Plus, Tecan (Salzburg, Austria)で、450 nmにて吸光度を記録し、参照波長は750 nmとした。細胞生存は、等式:%細胞生存 = 100 × (At-Ac) から概算したが、このAtおよびAcは、それぞれ処理および対照培養のXTT比色反応(ATCC)の吸光度(450 nm)から750 nmで測定された非特異的吸収を引いたものである。培地単独の吸光度も個別の表示数値から引き算した。
接着細胞をトリプシン処理し、PBSで2回洗浄して、40μm細胞シーブを通して濾過した。DNA含量をフローサイトメトリーで評価した。細胞は、6ウェルプレート培養ディッシュで、10%FBS添加DMEMに、ウェル当たり1.5×105 細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-436)、または4x105 細胞(MCF-7およびMCF10A)、または2×105細胞(SW480、HT-29)、または5×105 細胞(HCT116)の密度でシードした。翌日、培地を、指定された濃度のGR-24、または溶媒のみ(アセトン)とともに10%活性炭処理済みFBSを添加したフェノールレッドフリーDMEMで置き換えた。48時間後、細胞をPBS(pH 7.4)で2回洗浄し、4℃にて360gで10分間遠心して、冷却したエタノール(PBS中70%;v/v)中で緩やかにボルテックス混合しながら固定した。DNA含量を測定するために、細胞を40μg/mlヨウ化プロピジウム(以下PI)で染色し、FACSCaliburフローサイトメーター、およびCellQuest解析ソフトウェア(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて分析した。ホスホヒストン-H3染色を行う場合、細胞は、ホスホヒストン-H3に対するポリクローナル抗体とともにインキュベートした後、PI染色の前にFITCとコンジュゲートした二次ヤギ抗ウサギIgGとともにインキュベートした。
細胞は、DNA含量/細胞周期分析に用いたのと同じ条件下で、48時間培養した。すべての細胞を集め、100μl 1 X アネキシンV結合バッファー(Annexin V Binding Buffer)(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)中に再懸濁した。2μl FITC-アネキシンV(BD Biosciences)を添加し、暗下で10分間(室温で)インキュベートした。次に細胞をPI(Sigma, Saint Louis, Missouri, USA)で終濃度5μg/mlとして染色し、細胞を室温にて15分間暗下でインキュベートした。その後、400μlのアネキシンV結合バッファーを添加し、BD FACSCaliburフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーを行った。細胞は、アネキシンV+/PI-(初期アポトーシス)およびアネキシンV+/PI+(後期アポトーシス)であれば、アポトーシスであるとみなされた。それぞれの分析は少なくとも20,000の事象を用いて実施された。
MCF-7マモスフェアをトリプシン処理し、緩やかにボルテックス攪拌して、40μm細胞フィルターを通し、単個細胞懸濁液を作製した。細胞(5x105)を洗浄し、増殖培地(Lonza)に再懸濁した。ALDH1酵素活性を有する、Aldefluor染色される細胞集団を同定するために、Aldefluorキット(Stem Cell Technologies)を使用したが、これは、ヒトALDH1との特異的相互作用による、幹細胞の最適な同定および分離のためにデザインされたものである。簡単に述べると、非荷電ALDH1基質であるBODIPY-アミノアセトアルデヒド(BAAA)を含有するAldefluorアッセイバッファー中に細胞を懸濁し、37℃にて45分間、15分ごとに緩やかにボルテックス攪拌しながらインキュベートした。BAAAは受動拡散により、生きた細胞に取り込まれ、その後細胞内のALDHによって負電荷を持つ反応生成物BODIPY-アミノアセテートに変換されるが、これは高レベルのALDH1を発現する細胞内に保持されるので、その細胞は明るい蛍光を発するようになる。蛍光性のALDH1発現細胞は、FACScan機器(BD Biosciences)の緑色蛍光チャンネルで検出した。一組の細胞を、特異的ALDH阻害剤、ジエチルアミノベンズアルデヒド(DEAB)を用いて同一条件で染色し、実験のネガティブコントロールとした。PI(Sigma)蛍光は、オレンジ蛍光チャンネルで検出した。BAAAおよびDEABとともにインキュベートした細胞を用いて、細胞およびALDH1陽性画分のベースライン蛍光を確立した。Cell Questソフトウェア (BD Biosciences)を用いてデータを解析した。
細胞溶解物は、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、125 mM NaCl、0.5% NP-40、0.1% SDS、0.25% デオキシコール酸ナトリウム、1 mM EDTA、50 mM NaF、1 mM オルトバナジン酸ナトリウム、2.5 mM ピロリン酸ナトリウム、1 mM βグリセロリン酸ナトリウム、1 mM PMSF、およびプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Molecular Biochemicals)を含有する溶解バッファーを用いて調製し、遠心分離により清澄化した。タンパク質濃度は、BCA Protein Assay(Pierce)を用いて測定し、20-50μgの溶解物を4-12%SDS-PAGEゲルで分離した。転写後、膜を、0.1% Tween-20含有Tris緩衝食塩水中5%BSA(Sigma)の中で室温にて15-30分間ブロックした。一次抗体を室温で1.5時間、または4℃で一晩インキュベートした。二次抗体を室温で30-45分間インキュベートし、タンパク質を、West Pico Stable (Pierce)を用いて可視化した。抗体はすべて、特に指定のない限り1:1000希釈として使用した。pT308AKT、AKT、pT180/Y182、pT183/Y185 P38MAPK、pP38MAPK、pT202/Y204 pERK1/2、ERK1、pT183/Y185、pJNK1/2、JNK1、pT71ATF2、pT581MSK1、pT14 Cdc2、Cdc2、pT68Chk2(Cell Signaling)、pT334MAPKAPK、pS82HSP27(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)、α-チューブリン(Biomarkers, 1:50,000)、サイクリンB1 (Santa Cruz Biotechnologies) および西洋ワサビペルオキシダーゼ-結合抗ウサギIgGおよび抗マウスIgG(1:5,000, Pierce)。
ImageJソフトウェア(NIMH)を用いて、デンシトメトリー定量を行った。
GR-24はヒト乳癌細胞株の増殖を阻害する
癌細胞株の長期増殖に及ぼすGR-24の影響(図3)を、クリスタルバイオレットアッセイによって評価した。MCF-7(エストロゲン受容体陽性(ER+)、腫瘍形成性、非転移性)、(A) MDA-MB-231、MDA-MB-436(ER陰性(-)、転移性)、およびBJ線維芽細胞(正常、非腫瘍性株)は、0.5から10 ppm(1.65-33μM)の用量範囲のGR-24により処理した。増殖は、10日に至るまでの間モニターした。指示された時点で、プレートをクリスタルバイオレットにより染色した。データは、溶媒対照に対する吸収パーセント(560 nm)として記録する。平均±標準偏差(SD)。スチューデントt検定(両側、対応あり)を用いて、GR-24処理群を溶媒(対照)群とともに終了時点で評価し、p<0.05 (*)ならば有意、p<0.01 (**)ならば非常に有意、p<0.001 (***)ならばきわめて有意であると見なした。(B) は、指示された用量のGR-24に7日間暴露した後の、吸光度の表示数値(560 nm)を示すグラフである。データは溶媒対照に対するパーセントとして表される。3連サンプルの平均+SD。水平な線(---)は、溶媒対照に対して吸光度(560 nm)の50%減少を示す。右の表は、7日後に増殖を50%減少させるために必要な阻害濃度(IC50/7 d)を示し、これは関連するy軸データポイント間の内挿による直線回帰によって算出された(GraphPad Prismソフトウェア)。
細胞周期進行に及ぼすGR-24の影響を調べるために、フローサイトメトリーを用いてヨウ化プロピジウム染色によって全DNA含量分析を行った。MCF-7、MDA-MB-231、およびMDA-MB-436細胞を、5および10 ppmのGR-24で48時間処理して、非腫瘍形成性乳腺細胞株MCF10Aを対照として使用した。GR-24処理は、G2/M期の細胞パーセンテージの、用量依存性の増加を引き起こし、同時にすべての腫瘍形成性細胞株でG1期の細胞のパーセンテージの減少を引き起こすが、MCF10A細胞の細胞周期分布には、GR-24処理で何の変化も見られなかった(図4)。高い方の濃度(10 ppm)では、GR-24は、溶媒対照と比較して、MDA-MB-231 (4.6倍)およびMDA-MB-436細胞(3.4倍)の、sub-G1/アポトーシス画分の増加を引き起こしたが、これはアポトーシスの増加を示した。MCF-7細胞は、10 ppmでsubG1画分の変化を示さなかった。
腫瘍始原細胞(TIC)もしくは癌幹細胞(CSC)は、従来の化学療法および放射線療法に対して本来、抵抗性である。こうした細胞は、前記治療により根絶された元の腫瘍の細胞成分を再生させることができるので、結局、再発に至る。この細胞集団を標的とすることができることは、有効な治療計画を開発するために重要である。マモスフェア培養は、乳腺CSCを濃縮するために広く行われている。MCF-7は、非接着、無血清の増殖条件下で「マモスフェア」として増殖させることができる。GR-24がMCF-7のマモスフェア形成を阻害することができるかどうかを判定するために、MCF-7細胞をGR-24の存在下または非存在下でマモスフェアとして増殖させた(図5A)。マモスフェア形成は、2.5-5 ppmのGR-24存在下で完全に阻害され、単層増殖を阻害するのに必要な濃度の5分の1に低い1 ppmでは大幅に弱められた(p<0.01)(図5)。0.5 ppm濃度では、増殖阻害の程度は弱かったが、マモスフェアは溶媒処理対照より小さい(<50μm)ことが多かった(p<0.05)。第二代MCF-7マモスフェアをGR-24存在下で増殖させると、同様の結果が得られた(図5B)。GR-24によるマモスフェア増殖阻害の普遍性を評価するために、別の乳癌細胞株MDA-MB-231を調べた(図5C)。GR-24は5 ppmで、MDA-MB-231マモスフェア形成を完全に阻止した。2.5 ppmでは、マモスフェア増殖は大幅に弱められ、マモスフェアは溶媒対照群と比べてかなり小さくなっていた(<50μm)。重要なのは、MCF-7およびMDA-MB-231のマモスフェア形成を阻止するのに必要なGR-24の濃度が、単層増殖のIC50用量よりそれぞれ5.7分の1および2.7分の1に低下していたことである。したがって、マモスフェアは、GR-24の増殖阻害作用に対して単層培養よりも高い感受性を示す。これが興味深い発見であるのは、マモスフェア培養がTIC、ならびに化学療法に対して本質的に抵抗性であると判明している細胞に富んでいると報告されているからである。
マモスフェア生存率は、XTTアッセイ(ATCC)で評価した。指示された濃度のGR-24を添加した5日後、細胞生存率を測定した。5 ppmでは、GR-24は、生存率を約80%(98.4%+ 3.4から16.4%+ 4.6)低下させた(図6A)。興味深いことに、マモスフェア形成が完全に阻害される2.5 ppmでは、生存率は68.6%+12.4にとどまり、このことは阻害の時期が重要であることを示唆している。GR-24により引き起こされるマモスフェア形成阻害をさらに調べるために、乳腺幹細胞マーカーを調べた。
追加の5つの合成ストリゴラクトンアナログを入手し(図16)、それらが結腸癌、前立腺癌、肺癌、骨肉腫、黒色腫、および白血病の癌由来細胞株の増殖を阻害する能力について調べた。MCF-10A細胞は非腫瘍形成性株の一例として含めた。XTT生存率アッセイは、指定用量のストリゴラクトンアナログ存在下で、3日間処理後に行った。結果として生じるストリゴラクトンアナログ処理後の吸光度計測値の差異は、増殖および細胞生存の変化を反映する(図7A-C):細胞は、通常の増殖培地中で、96ウェルプレートにシードした。翌日、10%活性炭処理済み血清および指定用量のストリゴラクトンアナログもしくは溶媒のみ(cont.)を添加したフェノールレッドフリーDMEMで、培地を置き換えた。生存率は、3日後にアッセイした(XTT、ATCC)。IC50濃度を示す(上記表3)。細胞株は、それぞれのストリゴラクトンアナログに対する反応に、相当なばらつきを示したが、すべての癌細胞株の増殖は、ストリゴラクトンアナログ処理によって阻害された。ST-362およびMEB-55は、もっとも強力なストリゴラクトンアナログであった。ST-362のIC50濃度は2.9 ppm(MDA-MB-231)という低い値からであり、MEB-55については下は3.9 ppm(MDA-MB-231)からであった。非腫瘍細胞株MCF-10Aは、ストリゴラクトンアナログ処理の影響に対して、15 ppmの濃度までは抵抗性であったが、例外はST-362であって、これは第10日から14日の間に20%の生存率の減少をもたらした。EG-9Cは、テストしたすべての細胞株において、もっとも有効性の低いストリゴラクトンアナログ(IC50>10-15 ppm)であったが、A549は例外であって、IC50=4.3 ppmという値が測定された。A549細胞は、EG-5、MEB-55、ST-357、およびST-362に対しても、IC50=4.8-6.5 ppmで、感受性を示す。ST-357は、PC3(IC50=5.3ppm)およびMDA-MB-231(IC50=5.0 ppm)細胞の強力な増殖阻害剤であった。一部の細胞株は、低用量の濃度でXTT吸光度の増加を示した。対照の溶媒量は、最高用量だけに合わせたので、全溶媒量は低用量には一致しなかった。溶媒レベルに対する感受性が、
おそらくは、一部の細胞株での低用量との関連で、対照において観察された生存率抑制の主な要因である。
GR-24処理は、G2/M期にあるMCF-7、HCT116、MDA-MB-231、DU145、A549、SW480、およびHT-29細胞のパーセンテージの増加を引き起こし、MDA-MB-231、MDA-MB-436、およびHCT116細胞ではアポトーシスを引き起こす。これらの追加のストリゴラクトンアナログも同じメカニズムの増殖阻害を引き起こすのかどうかを判定するために、細胞周期分析を行った。結果は、G2/M期の細胞パーセンテージの用量依存性の増加を示す(図12):細胞は、10%活性炭処理済み血清、およびIC50/72hもしくはIC50/72h+25%濃度のストリゴラクトンアナログを添加したフェノールレッドフリーDMEM中で、異なる濃度のストリゴラクトンアナログにより48時間処理した。IC50/72h を25%上回る濃度で、subG1画分の細胞パーセンテージが増加し、MDA-MB-231細胞においてアポトーシスが増加している証拠が得られた。MDF-7細胞は、テストした用量では、ストリゴラクトンアナログの作用に対する感受性は低かった。BJ線維芽細胞は、テストした用量では、ストリゴラクトンアナログの作用に対して感受性でなかった(上記表4)。
GR-24と比較して同様の効果を、他のストリゴラクトンアナログが乳癌細胞株増殖に対して有するならば、ストリゴラクトンアナログがMCF-7初代マモスフェア形成にも同じ効果を有することが見込まれた(図10):MCF-7細胞は、ウェル当たり3000細胞として2連で、低接着表面96ウェルプレート内、MEBM培地にシードした。同じ日に指示された用量のストリゴラクトンアナログを添加した。7日後、代表的な画像を撮影した。5つのストリゴラクトンアナログはすべて、マモスフェア形成を、5 ppm以上の濃度で完全に阻止している(図10A)。ST-362およびMEB-55は、2.5 ppmでマモスフェア増殖も阻止する。ST-357は、2.5 ppmでマモスフェア増殖の有意な減少を示す(p<0.01)。ST-357、ST-362、およびMEB-55も、1 ppmでマモスフェア形成を有意に阻害する(p<0.01)。以上のデータは、これらのストリゴラクトンアナログが、もっとも強力なMCF-7単層増殖の阻害剤であることと一致する(図7、表2)。GR-24と同様に、マモスフェア形成を阻害するのに必要とされる用量は、単層培養の増殖を阻害するのに必要な用量より低い(5分の1に低下している;ST-362およびMEB-55、3分の1に低下している;ST-357)。ストリゴラクトンアナログ処理に対する感受性が、マモスフェア形成に特異的であるのか、またはそれが成熟マモスフェアの完全性および生存にまで拡大されるのかを判定するために、MCF-7マモスフェアをストリゴラクトンアナログ非存在下で増殖させて、7日後に(またはマモスフェアが100μmを越える平均直径に到達したら)、ストリゴラクトンアナログを指定された用量で増殖培地に添加した(図10)。MCF-7細胞は、MEBM培地中で、低接着表面96bウェルプレートに、2連で、ウェル当たり3000細胞として播種し、初代マモスフェアを7日間増殖させた。その時点で、指示された用量のストリゴラクトンアナログを培地に添加した。図11Aは、5 ppm濃度で処理されたマモスフェアの代表的画像であるが、これは、ストリゴラクトンアナログに2日間暴露後の解離を示す。EG-9Cで処理されたマモスフェアは、それほど大きな形態変化を示さなかったが、それはこのストリゴラクトンアナログの、マモスフェア形成を阻害する能力の低下と相関している(図11A)。5日間の処理の後に、マモスフェアを、24および48時間後に視覚的にモニターした。24時間のストリゴラクトンアナログ処理の後に変化は観察されなかった。48時間後に、ST-362、ST-357、およびMEB-55により5および2.5 ppmの用量で処理されたマモスフェアは、ほぐれた形を示し、解離しているように見えた(図11B):マモスフェアの数(>100μm)を数えて、溶媒処理対照に対するパーセンテージとしてデータを提示した(図11B)。5 ppmの濃度で、EG-5、EG-9C、ST-357、ST-362、およびMEB-55は、マモスフェアの数をそれぞれ、86.7+6.8(溶媒対照)から23+5、38+6.2、6+2、8.3+3.5、および9.3+1.5%に減少させる。2.5 ppmの濃度では、マモスフェア数は、35+6.9 (EG-5)、52+12.3 (EG-9C)、22+8.5 (ST-357)、6+1.7(ST-362)、および20.7+8.6 (MEB-55)に減少した。予想したとおり、これらの結果は、アナログがマモスフェア形成を阻害する能力と密接に相関している(図5)。XTT生存率アッセイは、解離したマモスフェアについても実施した。5 ppmの濃度で、EG-5, ST-362 and MEB-55は、生存率をそれぞれ3.7+0.5、25.5+8.8、および4.6+1.1%に低下させた。
癌細胞においてストリゴラクトンアナログによって引き起こされるシグナル伝達機構を調べるために、MDA-MB-231、DU145、およびHCT116細胞をストリゴラクトンアナログで1、4、または8時間処理し、溶解物を免疫ブロッティングにより分析した。MAPK酵素ファミリーは、細胞増殖、生存、および細胞ストレス応答に重要な役割を果たす。もっともよく特徴が判明しているMAPKは、3つのファミリー:(i) ポジティブな増殖シグナルに反応して活性化される、マイトジェン活性化細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK1/2)、(ii) c-Junアミノ(N)末端キナーゼ(JNK1/2/3)、ならびに (iii) p38アイソフォーム(p38α、β、γ、δ)に分類されるが、すべてが、DNA損傷、UV照射、および炎症性サイトカインなどの環境ストレス刺激によって活性化される。
PI3K/AKT経路は、生存および増殖を含めて、広範な細胞機能を調節する。AKT活性化は、2つの重要な残基、カルボキシ末端に近いS473のリン酸化を必要とするが、これは、その後のT308リン酸化および最大のAKT活性化のための必要条件とみなされる。pT308 AKTレベルは、MEB-55で処理した細胞において4時間から8時間までに劇的に減少し、24時間時点で低いままであった(図14)。あまり強力でないストリゴラクトンアナログ、EG-5で処理した細胞は、AKTリン酸化の阻害にわずかな遅延を示し、8時間から24時間の間に生じた。GSK3α/β活性は、S9のリン酸化により阻害される。pS9/21GSK3α/βは、pAKTと、それほど密接には相関しなかったが、pGSK3α/βの減少が24時間後に観察された(図14)。PDK1はAKTをT308でリン酸化するが、それ自体はS241のリン酸化によって活性化される。pS241 PDK1のレベルはストリゴラクトン処理で減少し、ストリゴラクトン処理細胞で見られるAKTリン酸化の減少と密接に相関していた(図14)。これらの結果は、ストリゴラクトンアナログは生存シグナル伝達経路を阻害することを示す。
G2から有糸分裂(M)への細胞周期進行は、サイクリンB1の蓄積によって成し遂げられる。サイクリンB1はCdk1(Cdc2)とともに複合体を形成し、成熟促進因子(MPF)となるが、これは染色体凝縮、核膜破壊、および紡錘体極集合などの有糸分裂の初期事象に関与するものである。
ストリゴラクトンアナログが癌細胞の増殖および生存に影響を及ぼすことができる転写プログラムをさらに解明するために、U20S細胞をST-362またはMEB-55(5 ppm)で6時間または24時間処理し、初期および後期の遺伝子発現の変化を区別できるようにした。U20S細胞は、ストリゴラクトン処理に対する感受性の増強に基づいて選択された(図7を参照されたい)。6時間のストリゴラクトンアナログ暴露後、熱ショックタンパク質(HSPA6、HSPA7、HSP1A、HSP1B、HSPB8)および関連遺伝子、HSPA1L、AHSA1、の発現増加によって、顕著なストレス反応が観察された。ストリゴラクトンアナログ暴露は、代謝機能に関わる遺伝子(SLC3A2、SLC44A2、SLC31A2、SLC7A11、ABCB1、CYP24A1、PTGS2/COX2、ALDH1B1)および転写因子(ATF3、FOX01、FOXD1)の発現の変化も誘導した。サイトカイン(CCL3L3, GDF15)および増殖因子(PGF)のアップレギュレーション、ならびにTGFBR11のダウンレギュレーションも指摘された。DDIT3、BIRC3、およびBAG3を含めて、アポトーシスを制御する遺伝子も同定された。DDIT3は、転写因子のCCAAT/エンハンサー結合タンパク質(C/EBP)ファミリーのメンバーをコードしており、他のC/EBPメンバーとヘテロ二量体を形成してそれらのDNA結合活性を妨げることによって、ドミナントネガティブ阻害因子として機能する。DDIT3は、DNA損傷などを含むストレスによって誘導されるが、DDIT3の過剰発現は細胞周期の停止をもたらす可能性がある。MEB-55処理により、6時間後に、p21cip (CDKN1A), Cyclin F (CCNF), Cyclin A2 (CCNA2)の発現が増加し、CDK6の発現が減少したのに対して、ST-362はサイクリンB1(CCNB1)のわずかなダウンレギュレーションを誘導した。したがって、細胞周期制御因子の発現プロファイルの変化は、ストリゴラクトン暴露の網羅的な特徴ではなかった。唯一の例外はサイクリンG2(CCNG2)であったが、この発現はST-362およびMEB-55処理群の両方で高まっていた。サイクリンG2は、増殖阻害と結び付けられる一般的でないサイクリンホモログであり、その発現は、DNA損傷性化学療法により誘導される。
皮下腫瘍を生着させるために、活発に増殖しているMDA-MB-231乳癌細胞を収集し、100μl PBS中1.5×106細胞をマウスの乳房脂肪体に注入した(n=15)。病変は、大きさが平均して約4.5 mm × 4.5 mmになるまで(約3週間)増殖させた。その後、溶媒対照および2つのストリゴラクトンアナログ:ST-362およびST-357を含めて、さまざまな処置をするために、マウスを無作為に3群に分けた。処置は第1日から開始し、10 ppm(10 mg/kg)を週2回、全部で4回治療した。ST-362およびST-357を静脈内に投与した(iv)。体重および腫瘍測定は週2回記録した。腫瘍断面積は、長さ×幅のかけ算によって計算し、腫瘍体積は、長さと幅の平均値を三乗することによって計算した。結果をまとめてプロットした。
データは平均±SDとして表される。統計的有意性は、一元置換分散分析法およびGames-Howell事後検定によって評価した。特に指示しない限り、P<0.05の値を有意と見なしたが、これは未処理対照と比較した有意性を表す。データは、Graphpad PRISM5およびSPSSによって解析した。
ストリゴラクトンアナログは、in vivo異種移植腫瘍モデルの腫瘍細胞の増殖を阻害する。結果から、10mg/kgのストリゴラクトンアナログによる処置は動物の体重に影響を及ぼさないと判断される(図19)。一元置換分散分析およびKruskai-wallisの検定から、3群すべての体重の平均および中央値は同様であることが確認された。P=0.2181. MDA-MB-231細胞をSCIDマウスに注入して腫瘍を生じさせ、腫瘍が12.5 mm3に達したら、ストリゴラクトンアナログによる処置を開始した。動物を、週2回、全部で4回処置した。図18に示すように、ST-362およびST-357はいずれも、腫瘍増殖の阻害に有効であった(p<0.0015)。対照群の平均腫瘍体積は、24.2±5.57 mm3であったが、ST-362処理マウスの平均腫瘍体積は17.7±4.28 mm3であり、ST-357処理群の平均腫瘍体積は15.9±2.61 mm3であった。注射を受けた動物の約10%が、注射部位に軽い炎症を示した。4回目の注射後、動物実験指針にしたがって、動物を屠殺した。
癌の全身的治療は、過酷な毒性作用を引き起こすことの多い化学療法レジメンによって主導されてきた。こうした副作用は、治療の中止につながることが多い。本研究は、ストリゴラクトンアナログが低用量の化学療法薬の効果を増強することを実証した最初のものである。もっとも一般的に使用される化学療法薬の1つがシスプラチンである。
材料および方法
細胞培養および増殖条件
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびカンジダ・オレオフィラ(Candida oleophila)酵母細胞を培養液中で、150 rpmで28℃にて一晩、増殖させた。次にそれを低栄養培養液(Lily)で0.4 ODに希釈し、96ウェルに分注した。細胞をGR-24およびST-362煮より、指定の濃度で処理した。細胞培養増殖は、17時間の間、28℃にて、各ODを読み取る前に緩やかに振盪して、毎時にモニターした。蛍光光度計を用いてODを測定した。
曲線間の統計的差異を、Statistical Modelingパッケージ、statmod(http://bioinf.wehi.edu.au/software/compareCurves/)のcompareGrowthCurves機能を用いて分析し、P≦0.05ならば有意性が決定された。
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)酵母培養を指示された濃度のGR-24で処理すると、細胞培養増殖の有意な減少が生じたが、それはGR-24適用の8時間後にはすでに明白である(図21)。
Claims (18)
- 活性物質が抗腫瘍医薬である、請求項1に記載の使用。
- 抗腫瘍医薬組成物の調製において、P1は次式
破線は二重結合であってもよいことを示す;
R1 およびR6は、互いに独立に、H、OH、C1-C6アルキル(ハロゲン原子で置換されていてもよい)、C2-C6 アルケニル、C2-C6 アルキニル、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、アルキルで置換されていてもよい;
P2は、置換されていてもよい6員環である;
ZおよびYは互いに独立にO、CH、またはNである;ならびに
mおよびnは互いに独立に0または1である;
ただしZがOならば、mは0であり、ZがCHまたはNであるならば、mは1である;ならびに
YがOならば、nは0であり、YがCHまたはNであるならば、nは1である]
を有するものである、
またはその個別の異性体もしくは製薬上許容される塩、またはそれらの混合物である、請求項1に記載の使用。 - P2が
R2 またはR5は独立に、H、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシ、アシルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、N-一置換もしくはN,N-二置換カルバモイル、アミノ、一置換もしくは二置換アミノ、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール基、または単環式もしくは二環式ヘテロアリール基を表し、このヘテロアリール基は0、1、2もしくは3個の環員窒素原子、および0もしくは1個の酸素原子、および0もしくは1個の硫黄原子を含んでいるが、前記の基はいずれの場合も、非置換または一置換または多置換である;
R3またはR4は独立に、H、ヒドロキシ、ハロゲン、C1-C6アルキル、シクロアルキル、ベンズシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールもしくは置換フェニル、または単環式もしくは二環式ヘテロアリール基を表し、このヘテロアリール基は0、1、2もしくは3個の環員窒素原子、および0もしくは1個の酸素原子、および0もしくは1個の硫黄原子を含んでいるが、前記の基はいずれの場合も、非置換または一置換または多置換である;
R7はH、OH、CH3、CH2OH、またはOAcである;
R8はOまたはOHであって、このR8がOならば、その結合は二重結合となる;
R9はH、OH、またはOAcである]
からなる一群から選択される、請求項3に記載の使用。 - 抗腫瘍製剤が、乳癌、肺癌、前立腺癌、もしくは結腸癌、および黒色腫からなる一群から選択される疾患の治療に適している、請求項2に記載の使用。
- 抗腫瘍製剤が、さらに1つもしくは複数の追加の医薬活性化合物を含有する、請求項2に記載の使用。
- 式IIの化合物が、
(3aR*,8bS*,E)-3-(((R*)-4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)-メチレン)-3,3a,4,8b-テトラヒドロ-2H-インデノ[1,2-b]フラン-2-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-7-ブロモ-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-(4-ニトロフェニル)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-(2-チエニル)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-[(4-ジメチルアミノ)-フェニル]-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(2E)-7-(1-メトキシナフタレン-2-イル)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、
(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-1,4-ジメチル-シクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、
(2E)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-7-(チオフェン-2-イル)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、
(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-(2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ジオキシン-7-イル)-1,4-ジメチルシクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、
(±)2E-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-6-チオフェン-2-イル-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(3aR*,8bS*,E)-3-(((R*)-4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-3,3a,4,8b-テトラヒドロ-2H-インデノ[1,2-b]フラン-2-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(±)(2E)-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-7-[(4-ジメチルアミノ)-フェニル]-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、
(2E)-1,4-ジメチル-2-((4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシ)メチレン)-7-(チオフェン-2-イル)-1,2-ジヒドロシクロペンタ[b]インドール-3(4H)-オン、
(2E)-2-[(2,5-ジヒドロ-4-メチル-5-オキソフラン-2-イルオキシ)メチレン]-1,2-ジヒドロ-7-(2,3-ジヒドロチエノ[3,4-b][1,4]ジオキシン-7-イル)-1,4-ジメチル-シクロペンタ[b]インドール-3-(4H)-オン、および
(±)2E-4-メチル-2-(4-メチル-5-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-2-イルオキシメチレン)-6-チオフェン-2-イル-1,4-ジヒドロ-2H-シクロペンタ[b]インドール-3-オン、ならびに
それらの組合せからなる1群から選択される、請求項6に記載の使用。 - 請求項1に記載の式Xの化合物、またはその個別の異性体もしくは製薬上許容される塩、またはそれらの混合物を含んでなる、抗増殖組成物。
- 癌幹細胞(CSC)もしくは腫瘍始原細胞(TIC)を死滅させるのに適している、請求項10に記載の組成物。
- 酵母および真菌の増殖を阻止もしくは阻害し、または酵母および真菌を死滅させるのに適している、請求項10に記載の組成物。
- 局所、腸内、経口、直腸、または非経口投与に適している、請求項10に記載の組成物。
- 増殖性疾患を治療する方法であって、治療の必要な患者に、請求項1に記載の式Xの化合物、またはその異性体もしくは製薬上許容される塩、またはそれらの混合物を投与することを含む、前記方法。
- 式Xの化合物が、少なくとも1つの他の治療薬の前、後、または同時に投与される、請求項14に記載の方法。
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