CN108348561A - 药用豚草属植物提取物 - Google Patents

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穆罕默德·法赫尔·埃尔-丁·埃尔-萨维
莱拉·穆罕默德·法赫尔·埃尔-丁·埃尔-萨维
谢里纳·哈桑·阿巴斯·埃尔米
马克·劳伦斯·达伊
约翰·罗纳德·鲁宾
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El Sawy Mohamed Fakhr El Din
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El Sawy Layla Mohamed Fakhr El Din
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Abstract

描述来自海生豚草或刚毛豚草植物的有机提取物的植物药物组合物及其用于治疗癌症的用途。

Description

药用豚草属植物提取物
先前相关申请
本发明要求2016年6月1日提交的US62/334,124和2015年9月11日提交的US62/217,609的优先权。两份专利均以引用的方式整体并入本文。
联邦政府资助的研究的声明
不适用。
微缩胶片附件的引用
不适用。
公开领域
本公开涉及癌症疗法的领域，并且具体地涉及用于治疗癌症的植物性药物组合物的领域。
公开背景
基于植物的治疗剂自古以来就已为人所知并使用，并且每年仍为我们提供30％-40％的新候选药物。植物中含有的组分的复杂性尚未完全了解，并且应理解，当例如在叶、茎等中发现的植物组分的深入生物化学分析可继续揭示用于治疗各种疾病(像微生物感染或偏头痛一样多种多样)的有价值的治疗性化合物。
近来，对于研究许多很久以前发现的植物的植物化学特性以确定其潜在的药物益处(特别是次级代谢产物)有相当大的兴趣。除了生命所必需的初级代谢之外，植物还具有产生有助于其生长和发育的化合物的次级代谢。次级代谢产物的共同作用是抵御动物、害虫和病原体的防御机制。这些化合物已成为许多药理学关注的焦点。
天然治疗剂的一个此类目标科是菊科(Asteraceae)(或菊科(Compositae))。此科具有显著的生态学和经济学意义并且从极地地区到热带地区都存在，定植于所有可用的栖息地，然而最常见于干旱地区。由于次级代谢所产生的活性化合物的数量和种类，菊科被认为是有前途的植物科。菊科的一些常见用途是草药产品，诸如茶(洋甘菊、松果菊)或香薰(万寿菊)。然而，有证据表明菊科含有可有利于治疗许多疾病的次级代谢产物。
癌症是经常用于指示各种类型的恶性肿瘤(即通过比正常组织更迅速地进行细胞增殖来生长的异常组织)中的任一种的通用术语，所述恶性肿瘤大部分侵入周围组织，可转移到若干部位，在尝试去除后可能复发，并且除非充分治疗否则会导致死亡。尽管多年来已可用并且常用多种癌症治疗方法(包括手术切除、放射疗法和化学疗法)，但癌症仍然是世界上造成死亡的主要原因之一。
癌症涉及受影响细胞中若干个重要的信号途径。在增殖与程序性细胞死亡之间的平衡在患有癌症的患者中受到干扰，并且已在癌中发现某些细胞凋亡信号传导途径的遗传紊乱，从而导致肿瘤发展和进展。癌症研究方面的许多工作都对准信号途径将其作为阻止癌症进展和治疗患者的手段。
已显示植物中天然存在的许多化合物引起癌症治疗、癌症治疗的副作用和/或癌症本身进展的一些改进。然而，需要寻找和开发更多用于癌症治疗的基于植物的化合物，并且了解它们如何影响信号途径，以使得可以将所述化合物组合以用于更有效的治疗计划。
公开概述
本文公开了从植物科菊科的成员提取的若干种药物化合物以及使用这些化合物用于癌症治疗的方法。这些化合物已在体外和体内动物模型的实验室模型中证明有效抵抗膀胱癌、前列腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、常规和化学抗性肺癌以及胰腺癌。此外，已显示所述化合物可抑制初级和次级球体形成，这可引起循环肿瘤细胞的治疗和消除。
本发明化合物涉及一种来源于菊科植物(包括海生豚草(Ambrosia maritima)或刚毛豚草(Ambrosia hispida))的有机级分的具有药物潜力的提取物。海生豚草大量分枝，并且具有灰色多毛的芳香芬芳的叶以及绿色、实心且有条纹并带有微弱的脊的茎。这种植物主要存在于北非地中海区域沿岸地带以及埃及和苏丹的尼罗河的泥泞河岸中。刚毛豚草也被称为沿海生豚草(Coastal Ragweed)，原产于北美，主要是墨西哥北部。它也是一种具有银色/灰色阔叶的木本植物。
许多关于海生豚草的研究已表明它具有一些药理作用。Alard等进行的研究表明，在以粉末或以甲醇提取物形式口服施用5g/kg的植物干叶之后，以及持续4周在饲料中掺入50,000ppm粉末叶之后，均未检测到毒性体征。此外，在使用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)菌株TA97、TA98、TA1538、TA100和TA1535(Alard 1991)进行的诱变性测试中未检测到诱变效应。
已表明海生豚草在水流中以3000mg/L的浓度杀死血吸虫病(Schistosomiasis)和肝片吸虫病(Fascioliasis)(两者均是寄生虫感染)的中间宿主(M.F.El-Sawy 1977和1986)。海生豚草中的一些化合物具有相当大的细胞毒性作用(Abdallah 1991)和抗微生物活性(Badawy2014)。此外，海生豚草已表明用作肠、子宫和血管的肌肉松弛剂；以增加每日尿排出量；并有助于减轻体重。
海生豚草和刚毛豚草含有若干种具有可能的药理学作用的化合物，诸如氯代豚草素、豚草素、二氢豚草素、新豚草素(neoambrosin)、farnserin、hymendin、hymenin、stamonin-b、anhydrofranserin、三萜、s-香树素、芹菜素、香豆素、甾醇、β-谷甾醇、丹宁酸、挥发油、香芹酮、莰酮(comphor)、石竹烯、桉树脑、盐以及其他倍半萜内酯。然而，本发明方法的焦点在于倍半萜内酯的使用。
倍半萜内酯(SL)是在植物提取物的有机级分中发现的化合物。这种有机提取物中的SL主要是双官能性倍半萜内酯，并且发现它们与癌细胞中靶蛋白的半胱氨酸侧链特异性地且共价地反应。植物来源的倍半萜内酯的α,β-不饱和酮部分在生理条件下与蛋白质半胱氨酸巯基迈克尔供体发生自发反应时表现为迈克尔受体。图1A示出了典型的双官能倍半萜内酯，其中箭头指向两个迈克尔受体位点，所述倍半萜内酯允许SL充当两个蛋白质半胱氨酸侧链之间的交联剂。然而，在海生豚草中发现的若干种SL在同一分子中含有两个或更多个迈克尔受体位点。图1B示出了在豚草属植物提取物中发现的三种其他SL。
SL也是多效化合物，其表现出并且靶向细胞内多于一个的信号传导分子，并且显示以高亲和力直接结合不同蛋白质的能力。因此，在多个靶蛋白上形成共价加合物的治疗作用包括阻断癌细胞增殖途径(即NF-κB和STAT3)和促进凋亡细胞杀伤途径(即半胱天冬酶3、7和6)。
海生豚草和刚毛豚草有机提取物中存在许多不同的SL，包括豚草素、二氢豚草素、新豚草素、银胶菊素、心菊内酯、三溴豚草素等。本发明方法优选使用有机提取物中发现的全部种类的SL进行治疗。但是，可以分离出并纯化单个SL用于治疗，或者通过有机化学方法合成特定的SL。尽管预期大多数癌细胞会响应来自豚草属植物的有机提取物中发现的全部种类的SL，但是一些癌症也可受益于有机提取物中发现的单个SL或SL子集的治疗。从整个提取物中选择单个SL可以是可调的，因此允许纯化的单个SL以有机提取物中通常不存在的比率进行组合。
在本发明方法中，将海生豚草或刚毛豚草植物与有机溶剂(诸如乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮或其混合物)混合以提取SL。优选使用极性有机溶剂。
通常将植物组织和极性有机溶剂的混合物放置，从而允许进行提取。可替代地，可在Soxhlet设备等中用极性有机溶剂充分提取植物组织。
植物组织可以是新鲜的、冷冻的或干燥的，并且可以呈粉碎的形式。然后通常将提取物与植物组织分离，并且通过干燥或沉淀等从溶剂提取物中去除溶剂。在去除溶剂之后，剩余的初级提取物可通过已知技术(诸如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、HPLC、沉淀、结晶、进一步溶剂提取以及反相色谱法等)进一步纯化。剩余的植物组织可使用相同或替代性溶剂进一步提取。
图1C-1D示出了海生豚草(1C)和刚毛豚草(1D)的有机提取物中SL的色谱指纹图谱。两者均产生类似的倍半萜内酯组合物，这表明菊科中存在许多可以用于本文所述的药物制品的植物。
植物材料的有机提取物的一种或多种活性成分可以按原样使用，或者可以与已知的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂一起配制。
例如，可以生产含有提取物的干燥有机和/或纯化化合物的明胶胶囊，其含有合适剂量的活性成分。任选地，可以提供含有干燥提取物的包装，以用于与例如待口服的热流体混合。提取物也可以与固体载体一起配制以压制成丸剂或片剂形式，特别是与延迟释放赋形剂一起配制成每天一次的丸剂/片剂形式。其他药物制剂可以是待口服施用的液体或固体载体和/或赋形剂。
药学上可接受的载体也可以是纳米生物学载体，诸如高密度脂蛋白，其将特异性地归巢并靶向患有癌症的患者中的肿瘤。抗体也可用于此类靶向。
还可以制备适用于非口服施用途径的活性成分的形式，诸如吸入、口腔、舌下、鼻腔、栓剂或胃肠外剂型。
更详细地，本发明可包括以下中的一个或多个：
—一种组合物，其包含海生豚草的有机提取物以及药学上可接受的载体；一种海生豚草有机提取物，所述提取物当针对植物材料的粗细胞提取物进行测定时比天然细胞形式的SL稳定10、100或1000倍或更多倍；一种海生豚草有机提取物，所述提取物比天然细胞形式的SL浓缩至少100倍，优选1000倍、或10,000倍或更多倍；本文所述的组合物中的任一种，其还包含药学上可接受的赋形剂、缓冲剂、螯合剂或延迟释放基质或其组合；本文所述的组合物中的任一种，其呈用于口服使用的明胶胶囊形式、丸剂形式或液体形式。
—一种组合物，其包含刚毛豚草的有机提取物以及药学上可接受的载体；一种刚毛豚草有机提取物，所述提取物当针对植物材料的原始细胞提取物测定时比天然细胞形式的SL稳定10、100或1000倍或更多倍；一种刚毛豚草有机提取物，所述提取物比天然细胞形式的SL浓缩至少100倍，优选1000倍、或10,000倍或更多倍；本文所述的组合物中的任一种，其还包含药学上可接受的赋形剂、缓冲剂、螯合剂或延迟释放基质或其组合；本文所述的组合物中的任一种，其呈用于口服使用的明胶胶囊形式、丸剂形式或液体形式。
—一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的患者施用有效量的以上组合物中的任一种；一种治疗三阴性乳腺癌(TNBC)的方法，其包括向患有TNBC的患者施用有效量的所述组合物；一种治疗膀胱癌的方法，其包括向患有膀胱癌的患者施用有效量的所述组合物；一种治疗肺癌的方法，其包括向患有肺癌的患者施用有效量的所述组合物；一种治疗前列腺癌的方法，其包括向患有前列腺癌的患者施用有效量的所述组合物。
—一种制备所述药物组合物的方法，所述方法包括粉碎海生豚草、从所述粉碎的海生豚草中提取有机可溶性组分、以及向所述有机可溶性组分中加入药学上可接受的载体；一种制备本文的药物组合物的方法，所述方法包括粉碎海生豚草、从所述粉碎的整株植物中提取有机可溶性组分、纯化所提取的有机可溶性化合物、以及向所述纯化的有机可溶性组分中加入药学上可接受的载体。
—一种制备所述药物组合物的方法，所述方法包括粉碎刚毛豚草、从所述粉碎的刚毛豚草中提取有机可溶性组分、以及向所述有机可溶性组分中加入药学上可接受的载体；一种制备本文的药物组合物的方法，所述方法包括粉碎刚毛豚草、从所述粉碎的整株植物中提取有机可溶性组分、纯化所提取的有机可溶性化合物、以及向所述纯化的有机可溶性组分中加入药学上可接受的载体。
药物组合物可以每日施用一次、每周施用3-4次或每周施用一次。给药时间为至少6周，其中优选的给药范围是6-12周、8-10周或9周。优选口服施用6-12周来进行每日治疗，但是在一些情况下，根据癌症的程度及其等级，时间的长度会延长。
提供本概述来介绍一些概念，这些概念将在以下详述中进一步描述。本概述既不旨在鉴别要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用来帮助限制要求保护的主题的范围。
如本文所用，“植物物质”是指单独或成组地获得的植物的任何部分，并且不限于叶、花、根和茎。
如本文所用，术语“有机提取物”是指根据以下程序(诸如本文所述的那些程序)通过使植物材料与有机溶剂接触来制备的组合物。所述术语涵盖通过简单的有机提取制备的粗提取物以及已经历一个或多个分离和/或纯化步骤的粗提取物，包括通过使粗提取物经历一次或多次另外的提取、浓缩、分馏、过滤、凝结、蒸馏或其他纯化步骤而从粗提物获得的基本上纯化的和纯化的活性成分和浓缩物或级分。植物提取物可以呈液体形式(诸如溶液、浓缩物或馏出物)、半液体形式(诸如凝胶或糊状物)，或者所述植物提取物可以呈固体形式(诸如颗粒或粉末形式)。植物物质可以是新鲜的、干燥的、冷冻的或呈粉碎形式。
术语“活性成分”包括一种或多种活性成分(例如，具有至少针对膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌以及可能的其他疾病的药物功效的化合物)，其可从至少海生豚草和/或刚毛豚草分离并且潜在地从其他豚草属物种或甚至其他植物科分离。它包括合成(化学制造)和天然(来源于植物)形式的活性成分。
当参考具有药物活性的一种或多种化合物使用时，术语“分离的”是指一种活性成分的形式，其相对不含蛋白质、核酸、脂质、细胞壁、碳水化合物或在活体植物中与所述活性成分自然缔合的其他材料。
当参考活性成分使用时，术语“浓缩的”是指当通过HPLC分析时纯度为至少50％的活性成分的形式。
当参考活性成分使用时，术语“基本上纯化的”是指当通过HPLC分析时纯度为至少75％的活性成分的形式。
当参考活性成分使用时，术语“纯化的”是指当通过HPLC分析时纯度为至少90％并且优选至少95％、98％或99％的化合物的形式。
如本文可互换使用，术语“疗法”和“治疗”是指为了改进接受者的医疗状态而执行的干预。所述改进可以是主观的或客观的，并且涉及改善与所治疗的疾病、病症或病状相关联的症状、预防所述疾病、病症或病状的发展或改变所述疾病、病症或病状的病理。因此，术语疗法和治疗以最广泛的意义使用，并且包括预防(prevention/prophylaxis)、调节、减轻和治愈多种阶段的疾病、病症或病状。这些术语也涵盖预防接受者的状态恶化(即稳定疾病、病症或病状)。需要疗法/治疗的受试者包括已经患有疾病、病症或病状的受试者，以及倾向于患有疾病、病症或病状或处于发展疾病、病症或病状的风险下的受试者，以及待预防疾病、病症或病状的受试者。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指需要治疗的动物。如本文所用，术语“动物”是指人类和非人类动物，包括但不限于哺乳动物、鸟类和鱼类。
如本文所用，“有效量”是指赋予生物学或有意义的患者益处(诸如医生或其他医学专业人员所寻求的生物学或医学的应答或改进)所需要的有机提取物或SL的量。在一方面，术语“有效量”旨在意指药物将在受试者的癌症生长、症状或疾病方面引起生物学上有意义的改进的量。优选表现出大治疗指数的剂量。如本领域技术人员所认识的，有效量可根据例如施用途径、剂型、包含另外的活性剂以及受试者的年龄、体重、敏感性、癌症类型和健康状态而变化。
如本文所用，术语“植物性药物”是指具有治疗特性的包含植物的组合物。
如本文所用，“蛋白酶‘切口’”意指加工、成熟和活化其他蛋白质(例如半胱天冬酶)。
成像结果的“显著变化百分比”被认为是图像微阵列轮廓中每个点的定量像素密度的10％及以上。计算对照和治疗之间的任何差异，其中超过10％的任何差异都被认为是显著的。
除非上下文另外指出，否则在权利要求书或说明书中的单词“一个/种(a/an)”当结合术语“包含”使用时意指一个或多于一个。
术语“约”意指所述数值加上或减去测量的误差界限或者加上或减去10％(如果没有指出测量方法)。
除非明确地指出仅是指替换项或者如果所述替换项是互相排斥的，在权利要求书中使用的术语“或”用于意指“和/或”。
当用于权利要求书中时，术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”(及其变化形式)是开放式的系动词并且允许添加其他要素。
词语“由…组成”是封闭式的，并且排除所有额外要素。
词语“基本上由…组成”排除额外的物质要素，但允许包括实质上不改变本发明的性质的非物质要素。
本文使用以下缩略语：
附图简述
图1A.示例性SL豚草素的化学结构，其中箭头指向迈克尔反应点。
图1B.在豚草属植物中发现的另外三种示例性SL的化学结构。
图1C.从海生豚草中提取的倍半萜内酯的色谱指纹图谱。
图1D.从刚毛豚草中提取的倍半萜内酯的色谱指纹图谱。
图2A示出破坏NF-κB/DNA相互作用的豚草素的结合和NF-κB的p65亚基的抑制。
图2B示出在Cys 122和Cys 207处结合至NF-κB DNA对接结构域的豚草素的另一个视图。
图2C示出在Cys 122和Cys 207处结合至NF-κB DNA对接结构域的豚草素(球体簇)。
图2D示出结合至NF-κB P65的倍半萜内酯的第二视图。
图3示出显示倍半萜内酯(50μg/mL)在多个膀胱癌细胞系中对ErbB家族的重要癌症相关成员以及p65表达的抑制结果的凝胶电泳(蛋白质印迹)。
图4A示出倍半萜内酯(球体)之一与STAT3的结合以破坏其与DNA的结合。倍半萜内酯豚草素结合Cys 251和Cys 328。图4B示出图4A中的结合区域的放大图。
图5A示出连接两个半胱天冬酶-7同源二聚体的倍半萜内酯豚草素。图5B示出使得同源二聚体稳定的与对称性相关的Cys 290和Cys290'侧链的相互作用的放大图。
图6A示出连接Rho家族GTP酶的GTP结合位点的倍半萜内酯。图6B示出显示SL与Cys157和Cys 18的结合的这种连接的放大图。
图7示出在暴露于从海生豚草植物提取的各种浓度的倍半萜内酯之后如通过MTS测定的各种癌症相关细胞系的细胞浓度。
图8示出在暴露于从海生豚草植物提取的低浓度的倍半萜内酯之后如通过MTS测定的各种癌症相关细胞系的细胞浓度。
图9示出磷酸激酶阵列，其示出25μg/mL从海生豚草中提取的倍半萜内酯对UM-UC-6膀胱癌和MCF7乳腺癌中的癌症相关信号传导蛋白的影响。
图10示出在用UM-UC-6细胞异种移植的对照小鼠以及用UM-UC-9细胞注射但使用从海生豚草中提取的倍半萜内酯处理的小鼠中的表皮生长因子受体和Ki-67的组织病理学。倍半萜内酯的浓度为100μg/剂量。
图11A示出在对照小鼠(上部)以及用从海生豚草中提取的倍半萜内酯处理的小鼠中原位注射的SUM-159乳腺癌细胞的组织病理学。
图11B示出在对照小鼠(上部)以及用从海生豚草中提取的倍半萜内酯处理的小鼠中原位注射的MDA-MB-231乳腺癌细胞的组织病理学。
图11C示出用含有来自海生豚草的所有倍半萜内酯的有机提取物、仅含有豚草素的纯化的次级分和仅含有二氢豚草素的纯化的次级分处理的原位注射的MDA-MB-231三阴性乳腺细胞的结果。
图12示出在使用和不使用每日倍半萜内酯处理的情况下在用PC-3LUC、UM-UC-9LUC或UM-UC-10LUC膀胱细胞系异种移植的小鼠中的肿瘤重量的结果。
图13示出原位注射到动物中的UM-UC-5LUC膀胱细胞系的组织病理学，以及对照小鼠以及用从海生豚草中提取的倍半萜内酯的有机提取物以200μg/天的剂量处理的小鼠的膀胱重量。
图14示出原位注射到动物中的UM-UC-10LUC膀胱细胞系的组织病理学，以及对照小鼠以及用从海生豚草中提取的倍半萜内酯的有机提取物以200μg/天的剂量处理的小鼠的膀胱重量。
图15示出来自已经用倍半萜内酯处理过(右列)的或未处理(左列)的不同膀胱细胞系的球体形成的图像。
图16示出由UM-UC-9形成并用倍半萜内酯处理的次级球体的球体形成测定。
图17示出由UM-UC-9形成并用倍半萜内酯处理的三级球体的球体形成测定。
图18示出对用海生豚草有机提取物中发现的倍半萜内酯处理的UM-UC-5膀胱癌细胞系进行的IC50实验的结果。
图19A-19D示出对用从海生豚草有机提取物中纯化的特定倍半萜内酯处理的膀胱癌细胞系进行的IC50实验的结果。纯化的倍半萜内酯是银胶菊素、豚草素、二氢豚草素以及新豚草素。膀胱癌细胞系为UM-UC-17(图19A)、UM-UC-9(图19B)、UM-UC-15(图19C)以及UM-UC-7(图19D)。
图20A示出对用刚毛豚草有机提取物中发现的倍半萜内酯处理的UM-UC-5膀胱癌细胞系进行的IC50实验的结果。图20B示出对用刚毛豚草有机提取物中发现的倍半萜内酯处理的UM-UC-9膀胱癌细胞系进行的IC50实验的结果。图20C示出对用从刚毛豚草有机提取物中纯化的豚草素处理的膀胱癌细胞系进行的IC50实验的结果。
图21A示出对乳腺癌细胞系SUM159进行的IC50实验的结果，并且图21B示出用从海生豚草中提取的倍半萜内酯有机提取物处理的乳腺癌细胞系MDA-MB-231的结果。
图22示出对用从海生豚草有机提取物中纯化的特定倍半萜内酯处理的乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行的IC50实验的结果。纯化的倍半萜内酯是银胶菊素、豚草素、二氢豚草素以及新豚草素。
图23示出对用从海生豚草有机提取物中纯化的特定倍半萜内酯处理的乳腺癌细胞系MDA-MB-468进行的IC50实验的结果。纯化的倍半萜内酯是银胶菊素、豚草素、二氢豚草素以及新豚草素。
图24示出对用从海生豚草有机提取物中纯化的特定倍半萜内酯处理的乳腺癌细胞系BT-474进行的IC50实验的结果。纯化的倍半萜内酯是银胶菊素、豚草素、二氢豚草素以及新豚草素。
图25A-25B示出对用海生豚草有机提取物中发现的倍半萜内酯处理的乳腺癌细胞系MDA-MB-231(25A)和BT-20(25B)进行的IC50实验的结果。图25C-25D示出对用从刚毛豚草有机提取物中纯化的豚草素处理的乳腺癌细胞系MDA-MB-231(25C)和BT-20(25D)进行的IC50实验的结果。
图26A-26B示出对肺癌细胞系SK-LU-1(图26A)和A549(图26B)执行的功效和IC50实验。
图27示出对胰腺癌细胞系ASPC-1执行的功效和IC50实验。
图28A-28D示出有机提取的不同纯化的次级分(1＝银胶菊素、3＝豚草素、4＝二氢豚草素、5＝新豚草素)对前列腺癌细胞系进行的IC50实验结果，其中IC50为4.878(28A)、2.715(28B)、1.160(28C)以及264.5(28D)。浓度以μmol计。
公开的实施方案的描述
本发明提供了基于植物的化合物以及涉及其在癌症治疗中的用途的新方法。具体地说，来自菊科中的海生豚草和/或刚毛豚草植物的有机提取物用于治疗各种癌症。已发现有机提取物中的一组特定组分(即倍半萜内酯)干扰癌症进展中的多种分子信号途径并减小肿瘤，从而实现有效的癌症治疗。此外，有机提取物可以与处理其他信号途径的其他抗癌化合物或治疗剂组合以用于更完整的治疗。
本发明方法包括以下实施方案中任一种、其一种或多种的任何组合：
—一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的患者施用有效量的包含海生豚草或刚毛豚草的有机提取物以及药学上可接受的载体的组合物。具体地，所述癌症是膀胱癌、前列腺癌、三阴性乳腺癌、肺癌以及胰腺癌。有效量的组合物每日施用，持续至少6周。此外，包含至少一种倍半萜内酯的有机提取物是不含蛋白质，因此致热性较小。
—一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的患者施用有效量的包含从海生豚草或刚毛豚草提取的倍半萜内酯以及药学上可接受的载体的组合物。具体地，所述癌症是膀胱癌、前列腺癌或三阴性乳腺癌，并且每日施用有效量的组合物，持续至少6周。
—一种减少癌症转移的方法，其包括向患有癌症的患者施用有效量的包含从海生豚草或刚毛豚草提取的倍半萜内酯以及药学上可接受的载体的组合物。
—一种用于增强患者中对p65、STAT3、GPR30、EGFR家族受体、β-连环蛋白途径和Rho-GTp酶家族活性的抑制的方法，其包括向患者施用有效量的包含从海生豚草或刚毛豚草提取的倍半萜内酯以及药学上可接受的载体的组合物。
—一种制备含有倍半萜内酯的药物提取物的方法，其涉及用其中至少一种所述倍半萜内酯可溶的有机溶剂处理海生豚草植物、蒸发有机溶剂以产生粗提取物、使粗提物穿过或通过使用第二有机溶剂的色谱分离以获得倍半萜内酯的干净提取物、以及收集单个倍半萜内酯的级分。
—一种制备含倍半萜内酯的药物提取物的方法，其涉及用其中至少一种所述倍半萜内酯可溶的有机溶剂处理刚毛豚草植物、蒸发有机溶剂以产生粗提取物、使粗提物穿过或通过使用第二有机溶剂的色谱分离以获得倍半萜内酯的干净提取物、以及收集单个倍半萜内酯的级分。
本发明方法中的倍半萜内酯(SL)可以用于靶向多种癌症特异性信号途径。下文的实施例证明了SL对癌细胞增殖途径(即NF-κB和STAT3)和促进凋亡性细胞死亡途径(即半胱天冬酶3、7和6)的影响及其与G蛋白偶联受体的相互作用。但是，预期SL也可以影响其他信号途径，并且所述实施例不应解释为限制SL影响癌症的机制。
一旦确定SL影响各种癌症特异性信号途径的概念证明，就使用膀胱癌细胞系、乳腺癌细胞系和前列腺癌细胞系执行一系列体外实验以证明功效。
并非所有涉及癌症形成、生长和进展的信号途径都是已知的。因此，以下实施例仅旨在是说明性的，并且不会不当地限制所附权利要求书的范围。此外，尽管利用了有限数量的癌症细胞系，但预期本发明治疗方法适用于单独或与其他治疗方式组合来治疗大多数癌症。
提取方法
简言之，提取使用有机溶剂，诸如甲醇、乙醇和任何碳基溶剂。整个有机提取物将被干燥并用氯仿化学分馏。最终步骤是将最好的级分合并并蒸发氯仿。然后最终产物可以用于治疗。
更详细地，海生豚草的提取方法可以如下：
1)将干燥的海生豚草全株植物使用常规手段粉末化。
2)使粉末化的植物与有机溶剂或有机溶剂的组合接触，并使其接触持续预定的时间量以使干燥植物中的SL移动到有机相中。
3)然后将有机溶剂与干燥的植物材料分离。
4)通过本领域中任何已知的手段将有机提取物干燥。
5)将干燥的提取物用氯仿进行化学分馏，并且将富含必需SL的级分合并。
6)将氯仿蒸发，留下干燥的具有药物活性的组分。
7)不同浓度的活性组分用于处理各种癌细胞系。
可以对刚毛豚草和菊科植物中的其他植物执行相同的提取步骤。
当适用于有机可溶性组分时，可以采用其他提取方法。例如，此类方法包括水性两相系统、酸/碱提取等。为了制备用于提取的植物，植物应当在空气中在不加热的情况下干燥然后可以通过冻融循环进一步处理，和/或通过冻融物理裂解然后提取等。
植物材料的有机提取物的一种或多种活性成分可以在使用之前与其他活性成分组合，但优选单独使用。植物材料的有机提取物的一种或多种活性成分可以按原样使用，或者可以与已知的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂一起配制。
例如，可以生产含有干燥有机提取物的明胶胶囊，其含有合适剂量的活性成分。任选地，可以提供含有干燥提取物的包装，以用于与例如待口服的热流体混合。提取物也可以与固体载体一起配制以压制成丸剂形式，特别是与延迟释放赋形剂一起配制成每天一次的片剂形式或将口服施用的任何药物形式。
还可以制备适用于非口服施用途径的活性成分的形式，诸如吸入、口腔、舌下、鼻腔、栓剂或胃肠外剂型。
上文的提取物比天然产物显著地更稳定，甚至呈液体形式并且特别是当用缓冲剂和螯合剂配制时也是如此。它还比天然形式更浓缩，从而在不必消耗大量植物材料的情况下提供功效。此外，使用浓缩的、部分纯化的或纯化的材料更容易控制剂量。
还使用TLC和HPLC进一步纯化待进一步研究的活性成分并确定其功效，然而这项工作正在进行中。通过另外的纯化步骤从有机提取物中去除某些组分可以导致更少的副作用。海生豚草和刚毛豚草是以其过敏原作用而闻名的豚草。因此，有机提取物的纯化将导致人体免疫应答减少。在一些实施方案中，从海生豚草和刚毛豚草的有机提取物纯化的材料可以用于改进中断癌细胞中的信号途径的能力并增加所提取材料的稳定性。
NF-KB途径
癌症生长的常见分子机制包括：
—自给自足生长和丧失生长抑制机制
—细胞凋亡阈值的抑制
—增强的血管生成特性
—侵入局部组织并转移到不同部位的能力
已知这些细胞过程中的每一个都受到NF-κB途径的影响。NF-κB是由真核细胞广泛使用的蛋白质复合物，其作为控制细胞增殖和细胞存活的基因的调节因子。在哺乳动物细胞中，NF-κB家族由五个成员构成：RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50/p105(NF-κB1)以及p100(NF-κB2)。在大多数基础条件下，NF-κB复合物主要通过与κB(IκB)蛋白质家族的抑制剂相互作用而维持为非活性形式。然而，癌症是一种源于多种病因的疾病，所述病因具有不同的受影响的细胞靶标，因此表现出非常复杂的性质。在癌性细胞中，增殖和动态平衡产生极大的改变。因此，NF-κB复合物变得快速调控异常。因此，许多不同类型的人类肿瘤具有调控异常的NF-κB：即，NF-κB具有组成型活性。癌症研究的一个重要领域聚焦于靶向癌细胞中具有组成型活性的NF-κB。
对来自海生豚草的含有倍半萜内酯的有机提取物进行测试以确定对NF-κB途径的影响(如果有的话)。参见计算对接分析，存在一个潜在的结合位点。通过蛋白质印迹证实所述结合位点，其中在处理细胞的30分钟内观察到对p65(RelA)的抑制。
图2A-2D示出一种倍半萜内酯豚草素对NF-κB/DNA结合结构域的结合预测。图2A中的箭头显示豚草素(球体簇)可以与NF-κB结合以破坏其在P65单元处与DNA(图中心的螺旋结构)的结合。由于两个迈克尔反应位点，预期这种倍半萜内酯会结合至NF-κB结构上的Cys122和Cys 207，如图2B和2C所示。通过以选择性结合方式与一者或两者结合，豚草素阻断这些半胱氨酸，并且NF-κB不再可用作DNA结合的转录因子，因此减慢了肿瘤的进展。
使用四种膀胱癌细胞系测试倍半萜内酯阻断NF-κB DNA结合的能力：UM-UC-6(H.B.Grossman University of Texas M.D.Anderson Cancer Center)、UM-UC-9(H.B.Grossman University of Texas M.D.Anderson Cancer Center)、UM-UC-10(H.B.Grossman University of Texas M.D.Anderson Cancer Center)、SW-780(ATCC)。
图3示出从海生豚草中提取的50μg/mL的倍半萜内酯对UM-UC-6、UM-UC-9、UM-UC-10和SW-780细胞系的凝胶电泳结果。倍半萜内酯抑制所有四种膀胱癌细胞系中的EGFR、HER-2、HER-3。特别重要的是抑制HER-2。HER-2是p65NF-κB的转录靶基因之一。通过加入含有倍半萜内酯的有机提取物对HER-2的抑制证实了破坏NF-κB/DNA结合的能力并且证实了图2中提出的机制。因此，SL抑制EGFR家族的受体。
STAT3
对细胞因子、生长因子和其他多肽配体的正常细胞应答由被称为信号转导和转录活化因子(STAT)的潜在细胞质转录因子家族介导。异常STAT3导致细胞和生物学过程的诱导，所述过程包括增殖、分化、存活、发育、炎症、侵袭以及癌症中的转移。
已显示许多人类恶性肿瘤具有组成型活性的STAT3，其有助于癌细胞内的许多细胞和生物学过程。
通过靶向和抑制STAT3的DNA结合结构域，可以抑制STAT3的转录活性。STAT3/DNA结合结构域与应答基因启动子区中的共有DNA结合序列的物理相互作用是STAT3功能的一个非常重要的步骤。倍半萜内酯对蛋白质DNA相互作用的破坏有可能抑制阻断其肿瘤促进功能的STAT3依赖性基因转录。
图4A-4B示出所提出的机制，通过所述机制提取的倍半萜内酯可连接STAT3的DNA结合结构域上的Cys 328和Cys 251。这种连接将会阻断DNA的结合并破坏转录，从而减慢癌症的生长。
使用蛋白激酶阵列，确定STAT3、STAT5和STAT6全部受到从海生豚草中提取的SL对细胞的处理的影响。将执行更多测试以显示SL可以破坏STAT3/DNA结合。
半胱天冬酶稳定性
细胞凋亡或受控细胞死亡响应于许多不同的环境刺激或因为疾病条件而发生。在细胞凋亡期间，形态学和生物化学变化触发细胞过程和隔室的分解。缺陷性细胞凋亡表示癌症发展和进展的主要发病因素。此外，肿瘤细胞逃避参与细胞凋亡的能力可以在其对常规治疗方案的抗性中起重要作用。
凋亡性细胞死亡的最保守性生物化学特征之一是半胱天冬酶的活化。半胱天冬酶(半胱氨酰基引导的天冬氨酸特异性蛋白酶)是高度特异性蛋白酶家族，其在凋亡性细胞死亡期间发挥关键作用。半胱天冬酶被分组为细胞凋亡起始子或效应子，这取决于它们进入细胞死亡过程的位置。起始子半胱天冬酶以单体形式(即无活性前体形式)存在，其必须二聚化以完全活化，而效应子半胱天冬酶以二聚酶原形式存在，其必须加工以完全活化。一旦活化，效应子半胱天冬酶裂解细胞内的其他酶原蛋白底物，以触发被活化的半胱天冬酶的级联和细胞凋亡过程。
半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7是主要的细胞凋亡执行蛋白酶，并直接裂解在细胞凋亡期间蛋白分解的大多数蛋白。效应子半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7同源二聚体被2个蛋白酶‘切口’活化，从而产生具有20KDa和10KDa链的活性四聚体形式。这种四聚体的稳定促进细胞凋亡。
SL能够通过穿过分子二重对称轴形成共价交联来稳定四聚体结构。图5A示出在Cys 290和Cys 290'处连接两个半胱天冬酶-7同源二聚体的豚草素。图5B示出这种连接的放大图。在这些分子模型中豚草素与四聚体的相互作用通过计算对接得到证实。
在不具有使半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7的活化四聚体稳定的SL的情况下，四聚体会分解并在15-30分钟内蛋白水解，从而破坏细胞凋亡过程。通过SL连接，四聚体以活性形式无限地稳定并且细胞凋亡照常进行。
G蛋白偶联受体30(GPR30)
所有激素(包括类固醇，诸如雌激素)的作用均由特异性受体介导，所述特异性受体识别并结合将这种信息传递到下游效应子的激素。在三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤中，雌激素受体α(ER-α)和孕酮受体不表达，并且Her/2neu基因低表达。这使得治疗更加困难，因为大多数化学疗法靶向三种受体之一，因此这类乳腺癌对内分泌疗法不敏感。患有TNBC的患者死亡率是ER-α阳性肿瘤死亡率的两倍。因此，迫切需要为TNBC患者开发一种创新性药理学靶向疗法。
近年来，大量报告描述与经典的核雌激素受体相似或不同的膜相关性雌激素受体。据推测这些受体介导细胞雌激素功能的方面，包括传统的基因组(转录)信号传导以及新的非基因组(快速)信号传导。
雌二醇或更精确地17β-雌二醇是一种人类性激素和类固醇，并且是主要的雌性激素。17β-雌二醇的大多数非基因组快速信号传导事件是由于G蛋白偶联受体30(GPR30)。GPR30在TNBC中高度表达并且普遍存在，并且与TNBC的高复发率和死亡率相关联。GPR30与17β-雌二醇的结合增加TNBC细胞增殖。在TNBC治疗中需要结合、靶向并抑制GPR30的有效抑制剂以阻断这种受体与其配体的结合。
分子对接是用于计算结合亲和力并预测模式和结合位点的常用计算工具，对于SL结合GPR30受体并阻止17β-雌二醇的接收的能力执行所述分子对接。分子对接预测倍半萜内酯在Cys-205和Cys-130处与GPR30的结合。类似于STAT3上的两个半胱氨酸残基的交联，预期SL与GPR30上的这两个位点结合并阻止17β-雌二醇的对接。实际上，这会降低TNBC细胞增殖。
另外，GTP酶的Rho家族是小(～21kDa)信号传导G蛋白家族。人类GTP酶的Rho家族包括CDC42、RhoA和Rac1。这些蛋白质在正常细胞中起调节细胞迁移、内吞作用和细胞周期进展的作用。通过与Dbl癌蛋白产物的相互作用使这些关键调节蛋白调节异常，会导致致癌细胞转化。分子对接计算强烈表明，植物来源的倍半萜内酯可以特异性结合Rho家族GTP酶的GTP结合位点，从而替换GTP并使酶失活(图6A和6B)。当用倍半萜内酯处理时，这将有效地阻断膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌细胞的增殖和迁移。
体外结果
用多种膀胱癌和前列腺癌细胞系执行体外实验，其在表1中示出。
将不同浓度的SL加入细胞系，并且在48小时将结果列成表格。对于低于0.08％的SL浓度，使用DMSO来溶解化合物。
首先，使用MTS测定以及从海生豚草中提取的50、100和200μg/mL的SL浓度来测试细胞活力，其结果示出在图7中。与DMSO对照细胞相比，所有细胞系都在SL处理的细胞中显示细胞活力显著降低。用于溶解SL的DMSO浓度和在对照中的DMSO浓度不超过0.08％。
针对多个膀胱癌细胞系测试较低浓度的SL(10、25和50μg/mL)，测试其功效。图8示出这些结果。在降低的倍半萜内酯浓度下，即使在10μg/mL的最低浓度下，细胞也通过MTS表现出较低的活力来应答。图9是磷酸激酶阵列，其示出25μg/mL SL对UM-UC-6膀胱癌和MCF7乳腺癌中的癌症相关信号传导蛋白的影响。所述磷酸激酶阵列显示，已用浓度25μg/mL的SL处理3小时处理持续时间的细胞造成对在癌细胞存活中重要的重要信号传导和能量蛋白(诸如AMPK、TOR、β-Cat等)的抑制。磷酸激酶阵列的结果也很重要，因为它们证实了图2及以下等提出的结合预测。
体内结果
向30只NOD-SCID小鼠皮下注射100万个UM-UC-6细胞。在注射后一周，并在肿瘤建立之后，开始4μg/g SL的每日处理。在开始每日处理之后6周将动物处死。图10示出异种移植处理动物和对照动物的组织病理学，其示出表皮生长因子受体(EGFR)和Ki-67的量。EGFR在癌症进展中很重要，并且Ki-67指示有丝分裂活性。在这里，EGFR和Ki-67在处理的动物中较少。这指示SL每日处理抑制癌症进展，并且具有较低的有丝分裂活性和较少的癌症增殖。
对原位注射到小鼠中的三种乳腺癌细胞系进行另外的体内实验。原位注射乳腺癌细胞是研究癌症生长的所有方面的有力模型。将每个MDA-MB-231、SUM-159和MDA-MB-468的一百万个细胞注射到小鼠的乳腺脂肪垫中以形成肿瘤。一旦建立肿瘤，就用海生豚草的含SL有机提取物以200μM总SL/动物的每日剂量处理肿瘤。
图11A-11B示出在用从海生豚草中提取的SL处理的小鼠中对比在对照动物中的肿瘤区域针对SUM-159和MDA-MB-231细胞系的组织病理学。这些结果表明用SL处理的动物的肿瘤尺寸小于对照。
图11C示出在使用MDA-MB-231三阴性细胞系异种移植的动物中的HER2和p65的表达水平的结果以及相应的柱形图，所述柱形图示出对于对照动物和用SL有机提取物、仅豚草素的纯化的提取物和仅二氢豚草素的纯化的提取物处理的动物的抑制作用。使用SL有机提取物观察到HER2和p65的最大降低，但仅用豚草素和二氢豚草素处理也观察到显著的改进。因此，这些组分可以从SL有机级分中单独纯化，并且然后作为潜在的治疗组合。
还执行三种不同荧光素酶标记的细胞系的肿瘤大小的比较，并且结果示出在图12中。在这一系列实验中，将PC-3LUC和UM-UC-9LUC细胞系皮下注射，而将UM-UC-10LUC细胞系注射到NOD/SCID小鼠的膀胱内。在这之前，将所有动物每天处理持续6周，然而剂量率为100μgSL/动物。在处理6周之后将动物处死，并且评估湿肿瘤重量以检查SL对肿瘤生长的影响。如图12所证明，与未处理的小鼠相比，所有三种细胞系的肿瘤大小均显著减少。所有三种细胞系的差异置信水平为至少95％。这些结果指示SL是用于癌症治疗的潜在药物化合物。
图13示出原位注射到用有机提取物以200μg SL/天的剂量处理的动物中的UM-UC-5LUC的组织病理学。在对照动物中，EGFR和Ki-67(抗人类)染色肿瘤，在另一方面，处理的动物中肿瘤减小。在UM-UC-10LUC原位注射的动物中发现相同的结果，图14。
前列腺癌和三阴性乳腺癌细胞系获得类似的结果。
球体形成
除了体外和体内实验之外，还测试使用SL防止球体形成的能力。
球体形成测定已广泛用于基于其报告的在单个细胞水平下体外评估自我更新和分化的能力来回顾性地鉴定干细胞。研究SL对癌症祖细胞(干细胞)的影响，在用SL处理之后对细胞执行球体形成测定。
图15示出已用25μg/mL SL处理的和未处理的UM-UC-9和5637膀胱细胞系的细胞球体的图像。在此浓度下，UM-UC-9细胞系的球体形成减少。因此，正如预期的，UM-UC-9显示比5637细胞系更少的球体形成。
还将UM-UC-9细胞接种在具有Mammocult培养基(Stem Cell Technologies，Inc.)的低粘附性平板中并孵育7天以形成初级球体。然后，收集初级形成的球体并使其破碎，然后以大约200个细胞/孔接种在低粘附96孔板中。第二天，用不同浓度的SL处理细胞，并且在7天之后分析次级(第2次)球体形成。次级球体代表肿瘤祖细胞群体。如图16所示，与DMSO对照处理相比，浓度为25、50和100μg/mL的SL极大地减少次级球体形成。对于每种浓度的SL，都可以看到次级球体的完全抑制。
还测试三级球体形成，并且结果示出在图17中。同样，球体形成受到抑制。β-连环蛋白途径也是SL抑制肿瘤球体的潜在靶标。
减少或抑制球体形成的能力进一步证明了SL在癌症治疗中的药理学优势。
体外剂量应答研究
MTS用于评估SL对各种膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌细胞系的IC50(引起所需活性的50％抑制的药物浓度)。
膀胱癌细胞系：用海生豚草提取物测试膀胱癌细胞系UM-UC-5。将细胞以1000个细胞/孔和2000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。如图18所示，1000个细胞/孔的IC50为2.273μg/mL，并且2000个细胞/孔的IC50为5.709μg/mL。
然后进行MTS测试以评估多种细胞系的不同IC50。执行纯化以将SL的有机提取物分离成不同的组分。在体外测试不同SL银胶菊素、豚草素、二氢豚草素和新豚草素的微摩尔剂量，而不是微克，如通过其分子量所确定。理想的是，对于药物治疗，优选10-15之间的微摩尔重量。将每种细胞系以1000个细胞/孔的密度接种，并且IC50结果示出在图19A-19D和表2中。
正如由其他实验所预期的，豚草素和二氢豚草素的IC50结果最好。即使是肌肉浸润性膀胱癌UM-UC-9，IC50也远低于10μM的药物治疗靶标范围。
尽管新豚草素在这四种SL中表现出最低的功效，但它仍然可以用于使用整个提取物的治疗或与其他SL组合使用。
在回顾针对其IC50进行测试的SL之间的结果时，可以推断，不同的膀胱癌细胞系对不同的SL应答不同。因此，针对膀胱癌测试的不同细胞系具有不同程度的敏感性。
使用来自刚毛豚草的有机提取物执行类似的测试。图20A-20C示出使用整个提取物以及仅使用从有机提取物中纯化的豚草素对UM-UC-5和UM-UC-9膀胱细胞系进行的IC50测试的结果。
乳腺癌细胞系：缺乏雌激素受体、孕酮受体的表达和HER2低表达的肿瘤被认为是三阴性乳腺癌(TNBC)。TNBC肿瘤进一步细分为包括密封蛋白低肿瘤(claudin-low tumor)的分子亚型，所述密封蛋白低肿瘤除了上皮至间质转化特征之外具有与干细胞类似的特性。富含干扰素的亚型是具有比正常乳腺样亚型更好的预后的肿瘤。
在体外测试若干种TNBC细胞系，并将其用连续浓度的从海生豚草中提取的SL处理以确定IC50。图21A-21B示出SUM-159(基底，密封蛋白低)和MDA-MB-231(基底，密封蛋白低)细胞系的IC50实验结果。SL在不同浓度的SL下均表现出抑制三阴性乳腺癌的功效。结果汇总于表3中。
还测试纯化的SL银胶菊素、豚草素、二氢豚草素和新豚草素针对MDA-MB-231细胞系(图22)、MDA-MB-468(基底亚型正常)细胞系(图23)和浸润性导管癌细胞系(管腔亚型B)BT-474细胞系(图24)的IC50。结果汇总于表4中。
像膀胱细胞测试结果一样，细胞系对不同的SL敏感。可以看出在新豚草素的情况下最敏感，但银胶菊素对BT-474也有效。
使用来自刚毛豚草的有机提取物执行类似的测试。图25A-25B示出对用海生豚草有机提取物中发现的倍半萜内酯处理的乳腺癌细胞系MDA-MB-231(25A)和BT-20(25B)进行的IC50实验的结果。图25C-25D示出对用从刚毛豚草有机提取物中纯化的豚草素处理的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT-20进行的IC50实验的结果。
正如预期的，不同的细胞系对SL提取物具有不同的敏感性。出乎意料的是，两种乳腺癌细胞系都对纯化的豚草素具有更高的IC50。这可能是由于不同细胞系中的不同分子活性。
肺癌细胞系：还对肺癌细胞系执行功效和IC50实验。SK-LU-1是肺腺癌细胞系，并且A549是长肺癌细胞系。将这些细胞系用不同的倍半萜内酯处理，并且三种处理功效的平均值示出在图26A-26B中。IC50以微摩尔计算。
胰腺癌细胞系：将一个胰腺细胞系(腹水转移)AsPC-1用微摩尔浓度的不同SL处理。所得到的IC50如图27所示。
图28A-28D示出有机提取的不同纯化的次级分(1＝银胶菊素、3＝豚草素、4＝二氢豚草素、5＝新豚草素)对前列腺癌细胞系进行的IC50实验结果，其中IC50为4.878(图28A)、2.715(图28B)、1.160(图28C)以及264.5(图28D)。浓度以μmol计。正如预期的，一些次级分对细胞系的影响程度比其他级分要大得多。
溴尿苷测序实验
细胞中特定RNA的稳态水平是其生产速率与降解速率之间的平衡。为了更好地理解特定转录物的调节机制，了解RNA合成和降解对这些转录物的稳态水平的相对贡献是至关重要的。因此，当环境刺激或压力改变细胞动态平衡时，一些RNA的稳态水平将会改变。然后可以使用这种变化来确定随后的基因表达是否是改变的RNA合成、稳定性或两者的结果。
因此，癌细胞的RNA可以被测序并与正常细胞比较以查看何处存在更多或更少(即改变)的RNA。这可有助于产生可能触发癌症的基因或蛋白质。
监测RNA变化的常用方法是用溴尿苷标记新RNA，然后分离RNA以查看新RNA制备的位置。溴尿苷测序是本领域熟知的。
使用这种方法监测UM-UC-9(膀胱)和BT-20(乳腺)癌症细胞系中的RNA，以检测在用SL处理之后基因组上的新生转录水平。将两种细胞系同时用整个有机级分处理，或者用从有机级分中纯化的豚草素以不同剂量处理3.5小时。然后将RNA用溴尿苷标记半小时并测序以检测基因组中的新生转录水平。
然后回顾在处理时在其转录中受到影响的标志性靶标。一些标志与癌症进展和增殖直接相关，无论是用有机级分还是纯化的豚草素进行治疗都通过将基因以比对照更低的水平进行转录而导致所述基因失去调节。
在用有机级分或纯化的豚草素以不同剂量处理时，影响细胞凋亡途径、活性氧途径以及对癌症进展至关重要的基因被上调。因此，SL和豚草素能够减少(如果不是停止的话)这些途径中的一些途径，并且减慢或减少癌症进展。
本发明结合使用来自海生豚草和刚毛豚草植物的提取物的实施例和描述来举例说明。然而，这仅是示例性的，并且本发明可以广泛地应用于任何豚草属植物。此外，预期在这些植物中发现的任何SL对于癌症治疗都表现出一定水平的细胞毒性。前述实施例仅旨在是说明性的，并且不会不当地限制所附权利要求书的范围。
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Claims (13)

1.一种治疗膀胱癌、前列腺癌、三阴性乳腺癌、肺癌或胰腺癌的方法，所述方法包括向患有癌症的患者施用有效量的包含海生豚草的有机提取物以及药学上可接受的载体的组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述有效量每日施用，持续至少6周。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述有机提取物包含至少一种倍半萜内酯。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述有机提取物包含以下倍半萜内酯中的一种或多种：银胶菊素、豚草素、二氢豚草素和新豚草素。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述有机提取物包含银胶菊素、豚草素、二氢豚草素和新豚草素。
6.一种治疗膀胱癌、前列腺癌、三阴性乳腺癌、肺癌或胰腺癌的方法，所述方法包括向患有癌症的患者施用有效量的包含从刚毛豚草中提取的倍半萜内酯以及药学上可接受的载体的组合物。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述有效量每日施用，持续至少6周。
8.一种减少癌症转移的方法，所述方法包括向患有癌症的患者施用有效量的包含从海生豚草中提取的倍半萜内酯以及药学上可接受的载体的组合物。
9.一种用于增强患者中对p65、STAT3、GPR30、EGFR家族受体、β-连环蛋白途径和Rho-GTp酶家族活性的抑制的方法，所述方法包括向患者施用有效量的包含从海生豚草中提取的倍半萜内酯以及药学上可接受的载体的组合物。
10.一种制备用于药学用途的含倍半萜内酯提取物的方法，所述方法包括：
a)使用一种或多种倍半萜内酯可溶的有机溶剂处理植物海生豚草；
b)蒸发所述有机溶剂以产生粗提取物；
c)使所述粗提取物经历使用第二有机溶剂进行的色谱以获得所述一种或多种倍半萜内酯的干净提取物；以及；
d)收集单个所述一种或多种倍半萜内酯的级分。
11.一种制备用于药学用途的含倍半萜内酯提取物的方法，所述方法包括：
a)使用一种或多种倍半萜内酯可溶的有机溶剂处理植物刚毛豚草；
b)蒸发所述有机溶剂以产生粗提取物；
c)使所述粗提取物经历使用第二有机溶剂进行的色谱以获得所述一种或多种倍半萜内酯的干净提取物；以及；
d)收集单个所述一种或多种倍半萜内酯的级分。
12.一种组合物，所述组合物包含海生豚草或刚毛豚草的有机提取物以及药学上可接受的载体，其中所述有机提取物与海生豚草的原始细胞提取物相比稳定至少100倍，并且所述有机提取物比所述原始细胞提取物更浓缩至少1000倍。
13.一种组合物，所述组合物包含海生豚草或刚毛豚草的有机提取物以及药学上可接受的载体，其中所述有机提取物与海生豚草的原始细胞提取物相比稳定至少1000倍，并且所述有机提取物比所述原始细胞提取物更浓缩至少10000倍。
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