KR101008922B1 - 조각자 가시 추출물을 포함하는 대장암 예방 또는 치료용조성물 - Google Patents
조각자 가시 추출물을 포함하는 대장암 예방 또는 치료용조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 조각자 가시 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 조각자나무 가시 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 대장암 세포에 대한 우수한 세포독성을 나타내며, 세포주기 조절인자인 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B의 발현 및 활성을 억제하여 세포주기를 G2/M 단계에서 어레스트 하며, 전사인자 NF-κB 및 AP-1의 활성을 방해하여 대장암 세포의 MMP-9의 활성을 억제하여 암세포의 전이를 효과적으로 저해하고, 또한 Erk, p38MAP 키나아제 및 JNK와 같은 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 활성을 촉진하여 암세포의 아폽토시스를 유도하고, 동물 개체 수준에서도 우수한 항암 활성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 조성물은 오랫동안 한약재로 이용되고 있는 조각자나무 가시 추출물을 유효성분으로 포함하기 때문에 안전성이 우수하다.
대장암, 조각자, 가시, MMP-9, 세포주기, MAPK
Description
본 발명은 조각자 가시 추출물을 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
2003년 보건복지부 통계연보에 의하면 2002년 우리나라 사망원인 1위가 암인데, 인구 10만명 당 암으로 인한 사망자가 130명, 이어 뇌혈관질환 77명, 심장질환 37명 및 당뇨병 25명 등의 순으로 나타났다. 암으로 인한 사망률은 매해 증가하였으며, 암은 오랫동안 난치의 병으로 간주되어 왔다.
따라서 이러한 암을 치료하기 위한 연구가 지난 수년간 매우 활발히 진행되어 일부의 방법은 어느 정도의 치료효과를 보이기도 하였지만 아직도 획기적인 치료효과를 나타내는 방법은 없는 실정이다.
기존의 암 치료법에는 외과적 수술, 방사선요법 및 항암화학요법 등이 있으 며, 최근에는 종양을 면역조절방법으로 치료하려는 면역치료요법 등의 바이오치료법이 증가추세에 있다. 그러나 많은 치료방법에도 불구하고 암으로 인한 사망은 매년 계속 증가하고 있는 이유는, 기존의 치료방법들이 외과적 수술로 암을 제거하고 방사선요법과 항암제 투여에 의해 암 성장을 일시적으로 억제할 수는 있지만, 치료 후 잔여 암세포로부터 생기는 침윤(invasion)과 전이과정으로 예측할 수 없는 조직에 새로운 악성종양이 생기고, 결국 이러한 고형암은 항암제에 대한 내성이 매우 증가하여 항암약물요법 등의 이전 치료방법으로는 환자의 생명을 구할 수 없기 때문이다.
한편, 국내에서 현재 사용되고 있는 대장암 치료법으로는 외과적 수술, 방사선치료 및 항암 치료제 등이 있으나, 치료에 따른 부작용과 더불어 상당한 경제적 부담감을 지니는 단점을 지니고 있다. 따라서 약제의 효능, 안정성, 체내 흡수효과가 우수한 저분자 화합물 중에서 새로운 항암 치료제제의 개발이 시급하며, 이러한 신물질의 유력한 후보로서 생약 소재가 주목받고 있다. 한약에는 수 천년 간의 임상경험을 바탕으로 선별되어 낮은 독성과 높은 치료효과를 가진 약재들이 많이 존재하고 있으며, 따라서 새로운 암치료제의 탐색소재로서 생약재를 사용하는 시도가 동아시아 국가뿐만 아니라 미국에서도 활발히 이루어지고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확 하게 설명된다.
본 발명자들은 신규한 대장암 치료제를 개발하기 위하여, 다양한 한약재를 스크리닝 하였고 그 결과 종래에 한약재로 이용되고 있는 조각자나무의 가시추출물이 대장암 세포주에 대한 우수한 세포독성(cytotoxicity)를 나타내며, 세포주기 조절인자인 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B의 발현 및 활성을 억제하여 세포주기를 G2/M 단계에서 어레스트 하며, 전사인자 NF-κB 및 AP-1의 활성을 방해하여 대장암 세포의 MMP-9의 활성을 억제하여 암세포의 전이를 효과적으로 저해하고, 또한 Erk, p38MAP 키나아제 및 JNK와 같은 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 활성을 촉진하여 암세포의 아폽토시스를 유도하고, 동물 개체 수준에서 항암 작용을 한다는 사실을 발견함으써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 대장암 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 대장암 치료 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 약제학적 유효량의 조각자나무 가시추출물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 대장암 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 유효성분으로서 조각자나무 가시 추출물을 포함하는 대장암 치료 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 신규한 대장암 치료제를 개발하기 위하여, 다양한 한약재를 스크리닝 하였고 그 결과 종래에 한약재로 이용되고 있는 조각자나무의 가시추출물이 대장암 세포주에 대한 우수한 세포독성(cytotoxicity)를 나타내며, 세포주기 조절인자인 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B의 발현 및 활성을 억제하여 세포주기를 G2/M 단계에서 어레스트 하며, 전사인자 NF-κB 및 AP-1의 활성을 방해하여 대장암 세포의 MMP-9의 활성을 억제하여 암세포의 전이를 효과적으로 저해하고, 또한 Erk, p38MAP 키나아제 및 JNK와 같은 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 활성을 촉진하여 암세포의 아폽토시스를 유도하고, 동물 개체 수준에서 항암 작용을 한다는 사실을 발견하였다.
지금까지 보고된 바에 의하면, MMP-9이 암의 전이와 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다(L.A. Liotta, Tumor invasion and metastasisrole of the extracellular matrix: Rhoads Memorial Award Lecture, Cancer Res . 46 (1986) 1-7; L.A. Liotta, C.N. Rao, S.H. Barsky, Tumor invasion and extracellular matrix, Lab . Invest . 49 (1983) 636-649; M.J. Duffy, The role of proteolytic enzymes in cancer invasion and metastasis, Clin . Exp . Metastasis 10 (1992) 145-155; 및 W.G. Stetler-Stevenson, Type IV collagenases in tumor invasion and metastasis, Cancer Metastasis Rev. 9 (1990) 289-303). MMP-9은 사이토카인 TNF-α 등에 의해 유도된다고 알려져 있다(Shin KY, Moon HS, Park HY, Lee TY, Woo YN, Kim HJ, Lee SJ, Kong G. Effects of tumor necrosis factor-alpha and interferon-gamma on expressions of matrix metalloproteinase-2 and -9 in human bladder cancer cells. Cancer Lett. 2000 Oct 31;159(2):127-34). TNF-α에 의한 MMP-9의 유도에는 전사인자 NF-κB 및 AP-1이 관여하고 있다고 규명되어 있다(Moon SK, Cho GO, Jung SY, Gal SW, Kwon TK, Lee YC, Madamanchi NR, Kim CH. Biochem Biophys Res Commun 2003;301:1069-1078; 및 Moon SK, Cha BY, Kim CH. ERK1/2 mediates TNF-alpha-induced matrix metalloproteinase-9 expression in human vascular smooth muscle cells via the regulation of NF-kappaB and AP-1: Involvement of the ras dependent pathway. J Cell Physiol 2004;198:417-427). 따라서, MMP-9의 활성을 억제하는 MMP 저해제를 탐색하는 전략이 효과적이며, 본 발명자들도 이러한 전략에 따라 효과적인 암 전이 억제를 통한 항암제를 개발하기 위하여 연구하였다.
본 발명의 유효성분으로 이용되는 추출물의 소스(source)로서의 “조각자나무(Gleditsia sinensis Lam.)”는 콩과의 갈잎큰키나무이다. 본 명세서에서, 용어 “조각자나무 가시추출물”은 조각자나무의 가시로부터 추출하여 얻은 것을 의미한다. 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 바람직하게는, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 헥산, (i) 디에틸에테르, 또는 (j) 부틸아세테이트를 이용하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물 또는 저급 알코올, 보다 바람직하게는 물, 메탄올 또는 에탄올, 가장 바람직하게는 물(특히, 열수)을 용매로 하여 얻어진 것이다.
본 발명의 조성물은 대장암의 예방 또는 치료에 이용된다.
본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 항암 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서의 조각자 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있고, 비경구 투여되는 경우에는 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 후박나무 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 암의 치료 또는 예방에 매우 유용하다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 대장암 치료 또는 예방용 약제학적 조성물 및 식품 조성물을 제공한다. 조각자나무 가시 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 대장암 세포에 대한 우수한 세포독성을 나타내며, 세포주기 조절인자인 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B의 발현 및 활성을 억제하여 세포주기를 G2/M 단계에서 어레스트 하며, 전사인자 NF-κB 및 AP-1의 활성을 방해하여 대장암 세포의 MMP-9의 활성을 억제하여 암세포의 전이를 효과적으로 저해하고, 또한 Erk, p38MAP 키나아제 및 JNK와 같은 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 활성을 촉진하여 암세포의 아폽토시스를 유도하고, 동물 개체 수준에서도 우수한 항암 활성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 조성물은 오랫동안 한약재로 이용되고 있는 조각자나무 가시 추출물을 유효성분으로 포함하기 때문에 안전성이 우수하다. 흥미 롭게도, 본 발명의 조성물은 대장암 치료에 사용되는 약물 젤로다(Xeloda)와 거의 유사한 인 비보 대장암 치료 효능을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 조각자 추출물의 제조
조각자 추출물을 수득하기 위하여, 건조된 조각자 나무의 가시(조각자)를 물로 10시간 동안 95℃에서 환류 추출한 다음, 추출액을 회전 증발기(rotary evaporator)에서 농축시킨 후, 동결건조기에서 2일 동안 건조시켜 추출물의 분말을 수득하였다. 최종 수율은 약 10% 이었다.
실시예 2: 인간유래 대장암 세포주를 이용한 인 비트로 항암효과 연구
인간유래 대장암 세포주인 HCT116(ATCC)을 96 웰-플레이트에 2 × 105의 농도로 계대 배양하고 48시간 후 조각자 추출물을 처리하였다. 24시간 후 조각자 추출물에 의한 세포상태 및 세포 성장 억제 정도를 세포주기 관찰 및 신호전달체계를 이용하여 분석하였다.
세포증식 분석(MTT 분석)
조각자 추출물에 의한 대장암세포의 성장 억제능력평가를 위하여 대장암 세포주(HCT 116 세포주)를 이용하여 다음과 같이 MTT 분석을 실시하였다. 상기 암세포를 96 웰-플레이트에서 배양한 후, 세포 생존도를 MTT 시약 [tetrazolium salt 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2-tetrazolium]을 이용하여 측정하였다. 최종적으로, ELISA 판독기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각각의 측정값은 조각자 추출물을 처리하지 않은 대조군 값을 생존도 100%로 하여 상대적인 값으로 나타내었다(도 1).
도 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 조각자 추출물은 대장암 세포주 HCT 116의 성장 능력을 농도-의존적으로 억제하였다.
티미딘 업테이크 시험(thyymidine uptake assay)
조각자 추출물이 대장암 세포주의 DNA 합성능력을 억제하는지 여부를 공지의 방법(Marsh all, E. S. et al. European J. Cancer, 30A:1370-1376(1994))에 따라 3H-티미틴 업테이크 분석을 실시하여, 대장암 세포의 DNA 합성 저해 정도를 측정하 였다. RPMI-1640 배지에 FBS를 10%로 첨가하고, 페니실린 100 IU/mL, 스트렙토마이신 100 ㎍/mL을 첨가한 배지를 이용하여, 5% CO2 , 37℃ 배양기에서 대장암 세포인 HCT116을 배양하였다. 세포 배양에 사용한 배지 조성물들은 모두 GIBCO BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다. 상기 배양한 대장암 세포를 96-웰 플레이트에 1 × 104 개 세포를 분주하고, 조각자 추출물을 400 ㎍/mL, 600 ㎍/mL, 800 ㎍/mL, 및 1000 ㎍/mL 농도로 첨가하여 72 시간 동안 배양하였다. 세포를 회수하기 6 시간 전에 웰당 1 μ Ci 3H-티미틴을 첨가하여 배양하였다. 세포 회수 기구를 이용하여 세포를 유리 섬유 필터에 회수하고, 회수된 세포에 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail, Wallac, Turku, Finland) 3 mL를 혼합하여 액체 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter, Wallac, Turku, Finland)로 방사능을 측정하였다.
도 2에서 볼 수 있듯이, 조각자 추출물을 처리함에 따라서 농도 의존적으로 HCT116 세포의 DNA 합성 능력을 억제되었다.
MAP
키나아제
분석(
Mitogen
-
activated
protein
kinase
assay
)
암세포의 증식과 분화의 조절에 있어서 성장 조절인자, 성장 호르몬 및 사이토카인 등에 의해 발생되는 세포외 시그널을 세포내로 전달하는데 중요한 역할을 하는 ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38MAPK(p38 Mitogen-activated protein kinase) 및 JNK(C-Jun N-terminal kinase)와 같은 MAP 키나아제 의 활성을 측정하여, 조각자 추출물이 암세포의 신호경로(signal pathway)의 신호전달에 영향을 미칠 수 있는 지 여부를 평가하였다. MAPK 활성을 조사하기 위하여 MAPK Assay Kit(New England Biolabs, Inc.)를 사용하였다. HCT116 세포에 800 ㎍/mL의 조각자 추출물을 3, 6 및 12시간 동안 처리한 후 세포를 용해용액(20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na 3VO 4, 1 μg/ml leupeptin, 및 1 mM PMSF)으로 4℃에서 15분간 용출시켜 파쇄물을 10,000 × g에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 MAPK 분석에 사용하였다. MAPK 활성은 MAPK Assay Kit(New England Biolabs, Inc.)로 분석하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, 조각자 처리에 의해 ERK, p38 MAPK 및 JNK 인산화(phosphorylation), 즉 활성화가 증가됨을 알 수 있다. 본 결과는 ERK, p38 MAPK 및 JNK의 활성화는 아폽토시스를 유도 및 세포성장을 억제하는 작용을 한다는 최근의 지견과 일치한다.
FACS
분석
대장암 세포주 HCT 116의 세포주기는 유세포분석법(Flow Cytometry)을 사용하여 분석하였다. 상기 세포를 수확한 후, 70%의 에탄올로 고정 하였으며 -20℃에서 보관하였다. 다음으로, 세포를 냉각한 PBS로 두 번 세척한 후 RNase를 처리하여 배양 하였으며 DNA 염색은 프로피디움 요오드화물(propidium iodide; PI)을 이용하였다. 형광의 세기는 유세포분석기(FACStar, Becton Dickinson, MountainView, CA, USA)를 사용하여 결정하였으며, 분석은 셀 피트 소프트웨어(CELLFIT software, Becton Dickinson, USA)를 사용하여 행하였다. 실험 결과는 표 1 및 도 4에 나타나 있다.
| 시료 | G0/G1 | S | G2/M |
| 대조군 | 61 | 38 | 1 |
| 조각자 추출물 (600 ㎍/mL) |
59 | 37 | 4 |
| 조각자 추출물 (800 ㎍/mL) |
61 | 34 | 5 |
| 조각자 추출물 (1000 ㎍/mL) |
57 | 36 | 7 |
도 4 및 표 1에서 확인할 수 있듯이, 조각자 추출물 처리에 의해 G2/M 세포주기의 어레스트(arrest)가 유도됨을 알 수 있다.
세포주기 관련 단백질의 발현 수준 측정
FACS 분석 실험 후, 그 결과에 따른 세포주기 상태에서 G2/M 세포주기 관련 단백질의 발현 수준의 변화를 측정하기 위하여 대장암 세포주에 조각자 추출물 600, 800 및 1000 ㎍/mL 처리 후 세포주기 양성조절자(positive regulator) 단백질인 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B1의 발현수준 변화를 웨스턴 블롯팅(참조: Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press)으로 평가하였다(도 5).
실험결과, 도 5와 같이 조각자 추출물을 처리함에 따라서 세포주기 조절인자 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B1의 발현 억제가 유도 되었다.
젤
쉬프트
분석(
Gel
shift
assay
)
지금까지 보고 된 바에 의하면, 암세포의 전이에 필수적인 사이토카인 TNF-α에 의해 유도된 MMP-9의 발현의 증가는 MMP-9 유전자의 프로모터에 의해서 조절되며, 이 프로모터의 조절에는 전사인자 NF-κB 및 AP-1이 관여한다는 사실이 규명되었다(Moon SK, Cho GO, Jung SY, Gal SW, Kwon TK, Lee YC, Madamanchi NR, Kim CH. Biochem Biophys Res Commun 2003;301:1069-1078; 및 Moon SK, Cha BY, Kim CH. ERK1/2 mediates TNF-alpha-induced matrix metalloproteinase-9 expression in human vascular smooth muscle cells via the regulation of NF-kappaB and AP-1: Involvement of the ras dependent pathway. J Cell Physiol 2004;198:417-427). 이에, 본 발명의 조각자 추출물이 이들 전사인자 NF-κB 및 AP-1의 활성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하였다. 분석은 기본적으로 젤 쉬프트 분석에 따라 실시하였다.
우선, 대장암 세포주인 HCT 116 세포의 핵 추출물을 다음과 같이 준비하였다: HCT 116 세포주의 펠릿을 회수하여 완충액 A(10 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.4 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1 mM 소듐 플루오라이드, 1 mM Na3VO4)에 재현탁 시켰다. 이어, 0.1% 노니뎃(Nonidet) P-40을 상기 재현탁액에 첨가하여 10분 동안 얼음 위에서 인큐베이션한 후 10분 동안 3000 x g에서 원심분리하였다. 이렇게 하여 얻어진 핵 펠릿을 완충액 B(10 mM HEPES, 400 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.4 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 15% 글리세롤, 1 mM 소듐 플루오라이드, 1 mM Na3VO4)에 재현탁시킨 후, 완충액 C(20 mM HEPES, 200 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.4 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 15% 글리세롤, 1 mM 소듐 플루오라이드, 1 mM Na3VO4) 1 L에서 4℃, 2시간 동안 투석하였다. 핵 추출물을 4℃, 15분, 14000 x g 로 원심분리 한 후 단백질을 정량하였다. 이어, 32P-래이블링된 DNA 프로브(NF-κB 프로브: CAGTGGAATTCCCCAGCC, AP-1 프로브: CTGACCCCTGAGTCAGCACTT)를 상온에서 결합 완충액(50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 mM Tris-Cl(pH 7.5), 10% 글리세롤, 1 ㎍ 연어 정자 DNA, 1 ㎍ 폴리(dI-dC))에서 상기 핵 추출물과 혼합하고 인큐베이션 하였다. 그런 다음, 반응 결과물을 전기영동하고 젤을 건조시킨 후 필름에 노출하여 밴드를 검출 및 분석하였다(도 6). 세포가 거의 컨플루언시 (confluency)에 이르면, 혈청-결여 배지에서 하루 배양 후, TNF-α와 조각자 추출물을 처리하였다. 1일이 경과한 후, 세포배양액의 상등액을 수거하고, 젤라틴 자이모그래피를 실시하였고, 플레이트에서의 세포배양추출물(lysates)에 대해서도 역시 젤라틴 자이모그래피를 실시하였다.
도 6에서 볼 수 있듯이, TNF-α에 의해 NF-κB 및 AP-1의 활성이 증가하였는데, 이 결과는 결국 NF-κB 및 AP-1의 활성이 암세포의 전이와 함께 증가함을 보여주는 것이다. 또한, TNF-α에 의해 증가된 NF-κB 및 AP-1의 활성이 본 발명의 조각자 추출물에 의하여 크게 감소되고 있음을 알 수 있다.
실험 결과, 도 6에서와 같이 본 발명의 조각자 추출물은 전사인자 NF-κB 및 AP-1 활성을 저해함으로써 대장암 세포주의 TNF-α에 의한 MMP-9의 활성을 억제하여 암세포의 전이를 효과적으로 막을 수 있음을 알 수 있다.
실시예
3:
조각자
추출물의 인 비보 항암효과 연구
실험재료 및 방법
1) 시험계획 및 이종이식(xenograft) 모델 구축
마우스를 체중에 의해 군 분리한 후 조각자 추출물을 아래의 시험군에 따라 음용수에 첨가하여 공급하였고, 6일 후에 HCT 116 인간 대장암 암세포주(ATCCCCL-247)107개를 누드마우스에 피하주사 방법으로 주입하여 종양 모델을 만들었다.
2) 투여량 및 시험군의 구성
마우스를 체중에 따라 각 시험군이 균일한 구성 개체를 갖도록 군 분리를 실시한 후, 조각자 추출물을 0.2-3.2 mg 범위로 3 가지 농도 시험군을 위의 표와 같이하여 음용수로 공급하였다. 또한 양성 대조군으로 실제 대장암 치료에 사용되는 약물 젤로다(Xeloda)를 사용하였다(표 2).
| 시험군 | 조각자 추출물 | 마리수 |
| 대조군 | - | 10 |
| 조각자추출물 A군 | 0.2 mg | 10 |
| 조각자추출물 B군 | 0.8 mg | 10 |
| 조각자추출물 C군 | 3.2 mg | 10 |
| Xeloda | - | 10 |
실험 결과
1) 사망률
시험 전 기간을 통하여 대조군 및 조각자 추출물을 공급한 누드마우스에서 사망한 사례는 전혀 관찰되지 않았다.
2) 체중변화
체중 변화에서는 대조군과 0.2-3.2 mg 범위의 조각자 추출물 시험군 간의 이상 체중변화는 관찰되지 않았다.
3) 음수량 변화
대조군과 조각자 추출물의 0.2-3.2 mg 범위의 시험군 간에 음수량 변화는 다소의 차이를 나타내지 않았다.
4) 종양체적의 변화
이종이식 동물모델(HCT116 대장암세포주 이식)을 이용한 조각자 추출물의 암 치료효능평가 결과에 의하면, 0.2 mg의 음용수 농도에서 30% 이상의 암성장을 억제하는 인 비보 예방효능을 보였고, 조각자 추출물 투여량을 16배 증가한 3.2 mg 농도에서도 의존적인 암 성장억제 효과는 나타나지 않았다(도 7).
도 7에서 확인할 수 있듯이, 상기 시험 조건에서의 연구결과에 의하면 조각자 추출물의 0.2-3.2 mg 범위에서 30-55% 암 성장억제 효과를 나타내어 마우스의 종양성장을 매우 유의하게 억제하는 것으로 관찰되었다.
이상과 같이, 이종이식 대장암 모델을 이용한 조각자 추출물의 암 성장 억제 인 비보 효능은 조각자추출물의 0.2 mg 투여량 범위에서 가장 우수한 암 성장억제 효능을 보였고, 투여량을 증가하여도 예방효능이 증가하지는 않았다. 따라서 조각자 추출물을 제품화하는데 훨씬 우수한 여건이 갖추어 지는 것으로 판단된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 MTT 분석(MTT assay)을 통하여 조각자(Gleditsia sinensis Lam) 추출물의 대장암 세포주(HCT116)에 대한 성장 억제 능력 평가 결과를 보여주는 도면이다.
도 2는 티미딘 업테이크 시험(thymidine uptake assay)을 통하여 조각자 추출물의 HCT116에 대한 DNA 합성 억제 결과를 보여주는 도면이다.
도 3은 MAP 키나아제 분석(Mitogen-activated protein kinase assay)을 통하여 조각자 추출물 처리 시 HCT116 세포내에서 ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 MAPK(p38 Mitogen-activated protein kinase) 및 JNK(C-Jun N-terminal kinase) 인산화반응을 유도하는 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 FACS 분석을 통하여 조각자 추출물 처리 시 HCT116 세포내에서 G2/M 세포주기의 어레스트(arrest)가 유도되는 결과를 보여주는 도면이다. 도 4에서, (A)는 대조군, (B)는 조각자 추출물 600 ㎍/mL, (C)는 조각자 추출물 800 ㎍/mL 및 (D)는 조각자 추출물 1000 ㎍/mL 처리군이다.
도 5는 도 4의 결과에 따른 G2/M 세포주기 조절인자 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B1의 발현 억제를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 6은 젤 쉬프트 분석(Gel shift assay)을 통하여 HCT116에 조각자 추출물 처리 시 TNF-α에 의해 증가된 전사인자 NF-κB 및 AP-1활성을 저해하는 결과를 보여주는 도면이다.
도 7은 본 발명의 조각자 추출물의 대장암 동물 모델에서의 항암효능을 보여 주는 인 비보 실험 결과이다.
Claims (2)
- (a) 약제학적 유효량의 조각자나무 가시추출물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 상기 조각자나무 가시 추출물은 대장암 세포의 사멸을 유도하고 대장암 세포 분열을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장암 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
- 유효성분으로서 조각자나무 가시 추출물을 포함하며, 상기 조각자나무 가시 추출물은 대장암 세포의 사멸을 유도하고 대장암 세포 분열을 억제하는 것을 특징으로 하는 대장암 치료 또는 예방용 식품 조성물.
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