KR101319552B1 - 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 및 당뇨병 합병증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 및 항산화 조성물, 및 당뇨병과 당뇨병으로 인한 합병증의 예방, 개선 및 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다.

Description

조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 및 당뇨병 합병증의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for prevention or treatment of diabetes mellitus or diabetic complications containing stings of Gleditsia sinensis extracts as an active ingredient}

본 발명은 조각자(stings of Gleditsia sinensis) 추출물의 의약학적 또는 식품학적 용도와 관련된 것이다. 보다 구체적으로, 조각자 추출물을 포함하는 항당뇨 및 항산화 조성물 및 그를 이용한 당뇨병 및 당뇨병으로 인한 합병증, 예를 들면 동맥경화증, 심근경색 등의 심혈관질환, 피부감염, 세소혈관증 등에 의한 피부 증상, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증 등의 예방, 개선 및 치료와 관련된 것이다.

생활 수준의 향상으로 인하여 평균 수명이 증가함으로써 각종 퇴행성 질환에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이 중 당뇨병은 최근 급증하는 추세이며, 전세계적으로 3번째로 심각한 질병으로, 현재 세계 인구 중 2억 5천만 명이 당뇨병 환자로 추정되고 있다. 국내에서도 산업발달, 경제성장으로 인한 식습관, 생활습관의 변화 및 고령화 현상으로 인해 당뇨병의 유병률 및 발생률이 점차적으로 증가하고 있으며, 현재 약 300만 내지 500만 명 정도가 당뇨병 환자로 추정되고 있다. 특히 40대 이후에 주로 발병하는 제2형 인슐린 비의존형 당뇨병(non-insulin dependent diabetes mellitus)은 3대 성인병의 하나로 손꼽히고 있다.

당뇨병(diabetes mellitus)은 인슐린 분비가 감소되거나 인슐린의 기능 저하로 체내 세포가 당을 이용하지 못하여 만성적인 고혈당이 나타나는 상태로 정의된다. 당뇨병은 췌장 베타세포(pancreas β-cell)를 파괴하는 자기 면역 과정이 주원인이 되어 인슐린의 분비가 부족하여 발생하는 인슐린 의존성 당뇨병(제1형 당뇨병)과, 인슐린 저항성, 유전적 원인, 베타세포의 기능 저하 등으로 인한 인슐린 비의존성 당뇨병(제2형 당뇨병)으로 나눠진다. 인슐린 비의존성인 제2형 당뇨병의 경우, 일차적으로 식이요법과 운동으로 혈당을 조절하나, 이러한 방법으로도 혈당이 조절되지 않을 경우 혈당 강하용 약물을 투여한다. 현재 당뇨병 치료를 위해 설포닐우레아계(sulfonylureas), 비구아나이드계(biguanides), 티아졸리딘다이온계(thiazolidinediones)과 같은 치료제가 개발되어 이용되고 있으나, 이러한 치료제들은 효과가 제한적이며, 저혈당 유발, 간독성, 젖산뇨증 등의 부작용을 유발하는 위험을 갖는다. 따라서, 부작용의 위험이 낮고 치료 효능 및 안전성이 높은 당뇨병 치료제에 대한 요구가 여전히 존재한다.

경구용 혈당강하제 중, 알파 글루코시다아제 억제제(α-glucosidase inhibitor)는 소장 점막의 융모에서 음식물 내 소당류와 이당류를 분해시키는 글루코시다아제(말타아제, 이소말타아제, 수크라아제, 글루코아밀라아제 등)의 기능을 저해하여 식후 혈당의 급속한 상승과 그에 따른 혈액 내의 인슐린 반응을 억제한다. 현재 알려져 있는 글루코시다아제 억제제 치료제로는 아카르보오스 (acarbose), 보글리보오스(voglibose), 미글리톨(miglitol)이 있으며, 그 외 건강기능성 식품의 형태로 주로 생산되고 있다. 아카르보오스의 경우, 탄수화물의 분해 및 포도당의 흡수를 지연시켜 식후 고혈당과 고인슐린혈증을 개선하는 것으로 보고되어 있으나, 동시에 아밀라아제 억제능을 보유하여 고분자 전분질의 분해 지연으로 인한 복부팽만감, 설사 등 소화기계 부작용이 수반되므로 (Breitmeier et al., Arch Bilchem. Biophys. 346: 7-14, 1997) 소량씩 서서히 복용량을 증가시켜야 하는 단점이 있다. 또한 비슷한 작용 기작을 갖는 제제로서 보글리보오스가 약품으로 출시된 바 있으나(Basen^?), 경구투여시 다량이 체내로 흡수되므로 저혈당으로 인한 쇼크나, 간 또는 근육 조직에서의 글리코겐 대사 및 글리코프로테인의 생합성 저해의 위험성이 있다(권영인 등, 생물산업. 11(4):49-53, 1998).

한편, 당뇨병 합병증은 당뇨로 인한 장기간의 고혈당 상태로 인해 발생한 자유 라디칼(free radical)이 산화적 스트레스를 유발하여 발생하는 것으로 알려져 있다(Kazuyuki Hayashi, Masakazu Haneda, Daisuke Koya et al. Diabetes Res. Clin. Pract., 52, pp85-96, 2001: Joshua P Klein and Stephen G Waxman. The Lancet Neurology, 2(9), pp548-554, 2003). 정상적인 상황에서 생성된 활성 산소는 세포 내의 항산화 체계와 항산화 효소(글루타치온 S-트랜스퍼라아제, 글루타치온 퍼옥시다아제, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 등)에 의하여 제거된다. 그러나 당뇨와 같은 비정상적 상황에서의 지속적인 고혈당증은 포도당의 자가 산화 및 비효소적 단백 당화(non-enzymatic glycosylation)를 통해 산소 유리기의 생성을 증가시키게 된다(김응진 외, 당뇨병학, 대한당뇨병학회, 1998, 고려의학).

이와 같은 당뇨병 상태에서의 산화적 스트레스는 인슐린 감수성을 줄이고 지방 조직의 당 유입을 줄이거나 췌장 베타-세포의 인슐린 분비를 감소시켜 당 대사를 손상시키며, 간 조직이나 심장근육 및 혈청에서의 지질 과산화값을 증가시켜 뇌졸중이나 심근경색 등의 심혈관계 합병증을 유발하기 쉽다. 또한 당뇨병에서 증가된 비효소적 당화(glycosylation), 단백질과 지질의 산화 및 환원형 글루타치온의 감소는 유해물질에 대한 피부의 저항성을 감소시키고 수정체의 혼탁 및 백내장을 유발한다 (Yarat A., et al., Free Rad, Biol. Med., 31(9), pp1038-1042, 2001). 한편, 일부 연구에서는 항산화물질이 제2형 당뇨병으로 인해 발생될 수 있는 다양한 대사 장애를 개선시켰다고 보고된 바 있다(Rudich 등, 1997; Kaneto 등, 1999).

따라서, 기존에 이용되고 있는 치료제들에 있어서의 부작용을 극복하고, 아울러 고혈당 상태에서의 자유라디칼의 생성을 억제할 수 있는 항산화 활성을 갖는 당뇨병 치료 약물의 개발이 요구된다. 이에 따라 천연 물질의 혈당 강하 및 항산화 효능에 대한 관심이 증대되고 있다. 조각자는 조각자 나무의 가시 부분으로써 조각자 나무(Gleditsia sinensis Lam.)는 콩과에 속하는 낙엽 교목으로, 곳곳에 편평한 가시가 존재하며 잎은 어긋나고 1-2회 깃꼴 겹이다. 특히 가시는 조각자라 하여 시기와 상관없이 채취가 가능하며, 외용약으로 쓰는 경우 가루를 내어 뿌리거나 기초제에 개어 바른다. 약리 실험 결과 평활근 진경 작용, 혈압 강하 작용, 호흡 중추에 대한 흥분 작용이 밝혀졌으며, 항암 효과, 항균 효과, 미백 효과, 항 HIV효과 등의 활성이 보고되었다. 그러나 조각자 추출물의 항당뇨 및 항산화 활성에 의한 당뇨병 및 당뇨병 합병증의 예방 또는 치료효과에 대해서는 개시되거나 교시된 바 없다.

본 발명의 목적은, 안전하고 효과적인 당뇨병 및 당뇨병 합병증의 예방 또는 치료 방법 및 이를 위한 조성물을 제공하는 것이다. 이를 위하여 항당뇨 및 항산화 활성을 가져 당뇨병 및 당뇨병 합병증의 예방 또는 치료효과가 우수한 조성물을 제공하고자 하였다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 조각자 추출물을 유효성분으로 함유하는, 항산화 및 항당뇨 활성을 갖는 당뇨병 및 당뇨병으로 인한 합병증의 예방, 개선 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 국내외에서 자생하고 있는 약용 식물의 추출물을 대상으로 항산화 활성을 가지고 있으며 부작용 없이도 우수한 효과를 갖는 당뇨병 치료용 물질에 대한 연구를 수행한 결과, 조각자의 추출물이 알파-글루코시다아제 억제작용 등에 의한 항당뇨 활성 및 폴리페놀 성분에 기인한 항산화 활성을 보유한다는 것을 확인하였다.

구체적으로, 본 발명의 조각자 추출물은 인 비트로에서 알파-글루코시다아제(α-glucosidase)의 활성을 억제하여 소장에서 이당류의 단당류로의 분해를 감소시키며, 혈당의 급격한 상승 및 혈액 내의 인슐린 반응을 억제함으로써 항당뇨 활성을 나타낸다. 이러한 효과는 조각자 추출물의 처리 농도 및 시간에 따라 증대되는 것으로 나타났다 (실시예 2, 도 1 및 2).

또한 본 발명의 조각자 추출물은, 폴리페놀 성분을 다량 함유하여 자유라디칼 제거하는 등 항산화 효과를 나타내므로, 산화적 스트레스에 기인하는 것으로 알려진 당뇨병 합병증의 예방 및 치료에 효과적이다. 본 발명에 따른 GSM(조각자의 메탄올 추출물) 및 GSE(조각자의 에탄올 추출물)는, 특히 약 1000 ㎍/mL의 농도로 처리된 경우, 양성대조군인 Vit C와 유사한 정도의 라디칼 소거능을 갖는 것으로 나타났다 (실시예 3-2, 표 2). 또한 상기 추출물들은 H₂O₂로 산화적 스트레스를 가한 백혈구에서의 DNA 손상을 유의하게 감소시켜, 산화로 인한 DNA 손상을 억제하는 효능이 있음을 확인하였다 (실시예 3-3, 도 3).

본 발명자들은 나아가 스트렙토조토신-니코틴아미드에 의해 유발된 당뇨 동물모델에서, 본 발명의 조각자 추출물이 공복 혈당 및 당부하 후 혈당 증가를 유의하게 억제하며(도 4 및 5), 혈장의 총 항산화능을 반영하는 수치인 혈장 TRAP(Total Radical-Trapping Antioxidant Potential) 수준을 유의하게 상승시키는 것을 관찰하였다(도 6).

이에 따라, 본 발명자들은 본 발명의 조각자 추출물이 인 비트로 및 인 비보 모두에서 유효한 항당뇨 및 항산화 활성을 나타낸다는 사실을 입증함으로써, 당뇨병 또는 당뇨병으로 인한 합병증의 예방, 치료 또는 개선을 위한 의약 또는 기능성 식품으로 사용될 가능성을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 당뇨병으로 인한 합병증은 관상동맥성 심장 질환, 동맥경화증, 심근경색 등의 심혈관 질환, 피부 감염, 세소혈관증, 신경병증, 치료 약제에 의한 과민 반응 등에 의한 피부 증상 및 수정체의 혼탁과 백내장, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증 및 당뇨병성 신경병증 등의 질환을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은, 상기 조성물을 포함하는 당뇨병 및 당뇨병 합병증의 예방, 개선 및 치료용 의약품 및 건강기능식품을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 조성물을 이용하여 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 알파-글루코시다아제의 활성을 억제하는 방법 및 식후 혈당 추이를 개선하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 조성물을 이용하여 당뇨병 또는 당뇨병 합병증을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 유효성분으로 이용되는 추출물의 소스(source)로서의 "조각자나무(Gleditsia sinensis Lam.)"는 콩과의 갈잎큰키나무이다. 본 명세서에서, 용어 "조각자 추출물"은 조각자나무의 가시로부터 추출하여 얻은 물질을 의미한다. 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 예를 들면 물, 친수성 유기 용매 또는 이들의 혼합용매에 의해 추출된 것일 수 있다. 상기 친수성 유기 용매는 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, n-프로판올, 이소프로판올 및 n-부탄올 등), 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산, 디에틸에테르 또는 부틸 아세테이트 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물 또는 저급 알코올, 보다 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 용매로 하여 얻어진 것이다.

상기 추출물은 추출에 의해 수득되는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 수득되는 건조물 또는 추출액의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 추출물은 총 중량의 약 20배의 메탄올 또는 에탄올을 첨가하여 상온에서 3일간 정치시켜 추출하고, 여과지를 이용하여 여과한 후, 40 ℃에서 감압 농축하는 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 조각자 추출물을 제조할 수 있는 어떤 통상적인 방법을 사용하더라도 무방하다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 조각자 추출물을 함유하는 당뇨병 및 당뇨병으로 인한 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조각자 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과의 결합체나 집합체의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조각자 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰오로스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테라에리트 및 광물유를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 조각자 추출물을 포함하는 약학 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 제형은 경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및 경비투여제제를 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있으나, 바람직하게는 액제, 현탁제, 시럽, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여를 위한 고형 제제로서, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태일 수 있다. 이러한 고형 제제는 상기 조각자 추출물에 적어도 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예를 들면, 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제를 포함할 수 있다. 구체적으로, 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 젤라틴, 칼슘카보네이트, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 사용될 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 경구를 위한 액상 제제로서, 현탁제, 내용 액제, 유제, 시럽제 등의 형태일 수 있다. 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

또다른 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여를 위한 제제일 수 있으며 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 주사제의 경우는 이에 한정되는 것은 아니나, 한크액(Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 생리식염 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액을 사용하여 제조할 수 있다. 또한 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 안정제, 분산제 등을 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 분말 형태로 제조되어, 사용 전에 멸균수와 같은 적당한 담체와 함께 사용될 수 있다. 좌제로 제제화되는 경우, 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조각자 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 내, 또는 정맥 내, 비강 내, 복강 내, 피하 또는 국소 투여 등이 가능하다. 상기 조성물은 또한 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다른 방법 (예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에 기재된 방법들)을 사용할 수도 있다.

본 발명의 조각자 추출물의 적합한 투여량 및 투여시기는 제제화 방법, 투여 대상의 연령, 성별, 체중, 질병 증상의 정도, 배설 속도 및 반응 감응성, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자가 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 성인을 기준으로 1일 0.1 내지 10 g/kg, 바람직하게는 1.5 내지 7.5 g/kg이 되도록 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 수술, 호르몬 치료, 약물 치료, 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법, 식이요법 등과 병행하여 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서는, 상기 조각자 추출물의 유효량을 알파-글루코시다아제를 포함하는 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 알파-글루코시다아제의 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 알파 글루코시다아제는 예를 들면 말타아제, 이소말타아제, 수크라아제, 글루코아밀라아제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또다른 양태에서는, 조각자 추출물을 포함하는 조성물을 개체에 투여함으로써 식후 혈당 추이를 개선하는 방법을 제공한다. 상기 개체는 인간을 포함한 각종 포유동물일 수 있다. 조각자 추출물의 알파-글루코시다아제 억제 활성으로 식후 혈당의 급격한 상승을 제어할 수 있으며, 혈당 추이의 개선이란 고혈당의 억제를 포함하여 고혈당의 가능성이 있는 개체에서의 혈당 상승의 예방도 포함할 수 있다. 상기 개체는 당뇨병 환자에 제한되지 않고 혈당의 개선을 필요로 하는 모든 포유 동물일 수 있다.

본 발명의 또다른 양태에서는, 조각자 추출물을 포함하는 당뇨병 및 당뇨병 합병증 치료용 의약의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 조각자를 적당한 추출용매, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 이용하여 추출하고, 여과하여, 감압 농축하는 단계, 및 선택적으로, 그로부터 생성되는 추출물의 유효량을 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 및 희석제 중 하나 이상과 혼합하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 또한, 당뇨병의 예방 또는 개선을 위한 건강기능성 식품 조성물로서 제조될 수 있다. 뿐만 아니라, 당뇨병이 원인이 되어 나타나는 각종 합병증의 예방 및 개선을 위한 건강 기능성 식품 조성물으로서도 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 당뇨병, 및 당뇨병 합병증의 예방 및 치료의 효과를 나타내는 상기 조각자 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 "건강 기능성 식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"은 인체의 구조 및 기능에 대해 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

이러한 건강 기능성 식품은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능성 식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강 기능성 조성물은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 보조첨가제로는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 필수 성분으로서 상기 조각자 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 글루코오스, 프럭토오스 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등; 당알코올, 예를 들면 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등을 포함한다. 향미제로서, 천연 향미제, 예를 들어 타우마린, 스테비아 추출물(레바우디오시드A, 글리시르히진 등); 및 합성 향미제, 예를 들어 사카린, 아스파르탐 등을 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조각자 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 착색제 및 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술 용어는 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 균등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명에 따른 조성물은 조각자 추출물을 일정 함량 이상 포함함으로써, 항당뇨 및 항산화 효과에 있어서 당업자가 예측할 수 없는 정도로 현저한 효과를 가지며, 천연 물질로 이루어져 인체에 부작용이 거의 없어 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 당뇨병, 및 당뇨병에 의한 합병증, 예를 들면 뇌졸중, 심근 경색 등의 심혈관계 질환, 당뇨병성 안과 질환 등의 예방, 개선 및 치료목적으로 사용될 수 있는 의약품 또는 건강기능식품의 제조를 위하여 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 알파-글루코시다아제의 활성을 억제하는 용도로 사용될 수 있으며, 식후 고혈당의 억제 또는 예방을 위하여 사용될 수 있다.

도 1은 실시예 2에 기술된 바와 같이, 인 비트로에서 본 발명의 일 구체예에 따른 조각자 추출물(GSM, GSE)의 농도에 따른 알파-글루코시다아제 활성 억제 효과를 도시한다.
도 2는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 인 비트로에서 본 발명의 일 구체예에 따른 조각자 추출물(GSM, GSE)의 처리 시간에 따른 알파-글루코시다아제 억제 효과를 도시한다.
도 3은 실시예 3-3에 기술된 바와 같이, 인 비트로에서 H₂O₂에 의한 사람의 백혈구 내 DNA의 산화적 손상에 있어서 본 발명에 따른 조각자 추출물(GSM, GSE)의 효과를 도시한다. 서로 다른 문자로 표시된 수치들은 상호간 p<0.05로 유의한 차이가 있음을 나타낸다.
도 4는 실시예 4-1에 기술된 바와 같이, 스트렙토조토신-니코틴아미드로 유도된 당뇨병 모델 랫트에서, 본 발명에 따른 조각자 추출물(GSE)의 섭취가 공복 혈당 수준에 미치는 효과를 도시한다. 서로 다른 문자(a-c)로 표시된 평균값들은 p<0.05에서 유의한 차이를 나타낸다.
도 5는 실시예 4-2에 기술된 바와 같이, 스트렙토조토신-니코틴아미드로 유도된 당뇨병 모델 랫트에서, 본 발명에 따른 조각자 추출물(GSE)의 섭취가 경구 당부하 후 혈당 수준의 변화에 미치는 효과를 나타낸다. 도 5A는 포도당의 경구 투여 후 시간별(0, 30, 60, 90, 120분) 혈당 측정 결과를 나타내며, 도 5B는 혈당 수치를 포도당 곡선 하 면적으로 나타낸 것이다. 각각의 결과에서, 서로 다른 문자(a-c)로 표시된 평균값들은 p<0.05에서 유의한 차이를 나타낸다.
도 6은 실시예 4-3에 기술된 바와 같이, 스트렙토조토신-니코틴아미드로 유도된 당뇨병 모델 랫트에서, 본 발명에 따른 조각자 추출물(GSE)의 섭취가 혈장 TRAP 수준에 미치는 효과를 도시한다. 서로 다른 문자(a-b)로 표시된 평균값들은 p<0.05에서 유의한 차이를 나타낸다.

이하, 본 발명을 하기 제조예 및 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

재료 및 시약

본 실험에서 사용한 조각자(stings of Gledtsia sinensis)는 2010년 3월 경남 마산시 (주)금강 제약으로부터 제공받아 사용하였으며, 항산화 활성 실험을 위해 사용한 시약으로 Folin-Cicalteau's phenol, 2.2-디페닐-1-피크릴히드라질, 과산화수소, Histopaque 1077, 저융점 아가로스, 일반(normal melting point) 아가로스 Triton X-100, 에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨염, Tris-완충액, 염화나트륨, 수산화나트륨, 브롬화 에티듐(ethidium bromide), 염화칼륨, 인산칼륨, 인산수소이나트륨, 나트륨, 탄산나트륨 등은 Sigma Chemical Co.(St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 항당뇨 활성 실험에서 알파-글루코시다아제 효소로 사용한 래트 장관 아세톤 분말(rat intestinal acetone powder) 시약은 Sigma Chemical Co.(St Louis, MO, USA)에서, 글루코오스 키트는 Bioclinical system (Korea)에서 구입하였다. 그 외 연구에 사용된 여러 종류의 용매 및 시약은 모두 일급 이상 등급의 제품들을 사용하였다.

통계 분석

모든 실험 결과는 SPSS/Windows 11.0 (Statistical Package for the Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하여 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 실험군 간의 평균값의 통계적 유의성과 관련하여, 추출 용매에 따른 총 페놀 함량의 차이는 스튜던트 T-검정(Student T-test)에 의해 P < 0.05 수준에서 유의성을 검증하였고, 던칸의 다중범위 검정(Duncan's multiple range test)에 의해 검정하였다. 추출 용매별 및 농도별 DPPH 라디칼 소거능의 차이와 조각자 추출물의 DNA 손상 억제 정도의 비교는 일원 분산분석법(one way ANOVA)으로 분산분석을 하였으며, 유의성 검정은 P < 0.05 수준에서 던칸의 다중범위 검정으로 실시하였다.

실시예 1. 조각자 추출물의 제조

조각자 5 g을 준비하고, 상기 약재를 100 mL의 메탄올 또는 100 mL의 에탄올과 각각 혼합하여 3일간 정치시켜 추출하였다. 다음 여과지(Advantec, Tokyo, Japan)를 이용하여 여과한 후, 회전감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 40 ℃에서 감압 농축하여 용매를 제거함으로써 각각의 추출물을 얻었다.

상기의 방법으로 수득된 조각자의 메탄올 추출물을 GSM, 에탄올 추출물을 GSE라 명명하고, 실시예 1 내지 3의 항산화 활성 및 항당뇨 활성 시험을 위해 DMSO와 메탄올에 녹여 사용하였다.

실시예 2. 시험관내 ( in vitro ) 항당뇨 활성 측정

알파- 글루코시다아제 억제 활성 측정

섭취된 다당류는 알파-아밀라아제를 통해 이당류로 분해되며, 분해된 이당류는 알파-글루코시다아제에 의해 단당류로 분해되어 소장에 존재하는 융털을 통해 혈관으로 흡수된다. 당뇨병 환자의 경우, 이당류의 분해효소인 알파-글루코시다아제를 억제하여 분해되는 이당류의 양을 감소시킴으로써 당 흡수량을 줄여 급격한 혈당의 증가를 억제할 수 있다. 양성 대조군으로써 시중 판매되는 알파-글루코시다아제 억제제인 아카르보오스(acarbose)를 사용하여, 조각자 추출물인 GSM, GSE의 농도 및 처리 시간에 따른 알파-글루코시다아제 저해 활성을 확인하였다.

방법

알파-글루코시다아제로 사용하기 위해 래트 장관 아세톤 분말 (1.86 유닛/mg) 5 mg에 0.1 M 말레이트 완충액(maleate buffer, pH 6.9) 1 mL를 첨가하여 충분히 섞은 후 30분 동안 차가운 상태를 유지시켜 주면서 초음파 분쇄를 시켜주었다. 이를 11000 rpm, 4 ℃에서 30분간 원심분리한 후 중간층을 취해 사용하였다. 상기 효소 용액 50 ㎕, 추출물 용액 50 ㎕, 및 0.1 M 말레이트 완충액 100 ㎕를 혼합하고 충분히 섞어 37 ℃에서 10분 동안 인큐베이션 시켰다. 여기에 이당류인 4% 말토오스 기질 용액을 첨가하여 다시 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션 시켜준 후, 꺼내어 약 10분 동안 차가운 상태로 유지시켜 주었다. 글루코오스 키트(glucose kit) 1 mL에 상기 용액 10 ㎕를 첨가시켜 37 ℃에서 5분 동안 인큐베이션 후, 405 nm에서 흡광도(A)를 측정하였다. 조각자 추출물을 첨가하지 않은 음성 대조군에서의 활성을 100%로 정하고 대조군 대비 조각자 추출물에 의한 알파-글루코시다아제의 상대적 저해능을 하기 식에 의해 산출하였다.

GSM, GSE 각각에 대하여 500 ㎍/mL, 1000 ㎍/mL의 농도에서 상기 실험을 실시하였으며, 그 결과를 이용하여 계산된 효소저해능을 도 1에 도시하였다. 또한 추출물 처리시간에 따른 결과를 측정하기 위하여 추출물 용액 및 아카르보오스 용액의 농도를 1 mg/mL로 하고, 인큐베이션 시간을 10분, 30분, 60분(양성 대조군의 경우 10분)으로 하여 상기와 동일한 방법으로 실험을 실시하였으며 그 결과를 도 2에 도시하였다.

결과

그 결과 500 ㎍/mL, 1000 ㎍/mL에서 GSM은 각각 10.3%, 17.9%의 효소 저해능을, GSE은 각각 5.1%, 10.3%의 효소 저해능을 갖는 것으로 나타났다 (도 1). 양성 대조군인 아카르보오스의 저해능은 46.2%로 나타났다.

효소 처리시간을 증가시킨 경우, 각각의 저해능은 최대 60분 처리시 GSM의 경우 25%, GSE의 경우 20%로 증가하는 것을 확인하였다 (도 2). 이는 동일한 농도의 아카르보오스를 10분 처리한 경우 약 50%의 저해 활성을 나타낸 것과 비교할 때 약 절반 정도의 활성에 해당하나, 아카르보오스가 단일성분 화합물인 반면 본 발명의 조각자 추출물은 유효성분 외의 다른 성분들도 포함하는 혼합물인 것을 감안한다면 충분히 알파-글루코시다아제 억제로 인한 항당뇨 활성을 갖는다고 판단되었다.

실시예 3. 시험관내 ( in vitro ) 항산화 활성 측정

3-1. 총 페놀 함량 측정

항산화 활성을 갖는 물질의 대부분이 페놀을 함유하고 있으며, 추출물 중 페놀의 함량을 정량함으로써 추출물이 갖는 항산화 활성의 정도를 예측할 수 있다. 본 실시예에서는 양성 대조군으로 몰식자산(gallic acid)을 이용하여 조각자 추출물 GSM, GSE 중의 폴리페놀성 물질의 함량을 측정하였다.

방법

Singleton과 Rossi의 방법(Singleton VL and Rossi JA., Am. J. Enol. Vitic. 16, 144-158, 1965)을 본 실험에 적합하게 변형하여 실시하였다. 조각자 추출물인 GSM 및 GSE 200 ㎕에 1 N-Folin-Ciocalteau 시약을 200 ㎕씩 첨가하여 실온에서 3분 동안 방치하고, 그 다음 10% Na₂CO₃ 200 ㎕를 첨가하여 암실에 1시간 동안 방치하였다. 이를 13.400 x g에서 5분 동안 원심 분리시키고 690 nm에서 반응액의 흡광도를 측정하였다. 표준 검정곡선은 몰식자산을 사용하여 나타냈으며, 총 페놀의 함량은 시료 100 g을 추출 용매에 녹여 나오는 페놀의 함량으로써 결정하였다. 각 측정은 3회에 걸쳐 이루어졌으며, 3회 측정결과의 평균값을 표 1에 나타내었다.

결과

조각자 추출물의 총 페놀 함량

	추출 용매
	GSM	GSE
g / 100g GAE	1.124 ± 0.19	0.602 ± 0.16 NS

* GAE : 몰식자산 당량( gallic acid equivalent )

* NS : 유의한 결과를 보이지 않음( not significant )

조각자 추출물 100 g을 기준으로 했을 때, GSM에서는 1.12 g, GSE에서는 0.6 g의 페놀을 함유하는 것으로 나타났다 (표 1).

3-2. DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)(Cherdshewasart W, Sutjit W.:Correlation of antioxidant activity and major isoflavonoid contents of the phytoestrogen-rich Pueraria mirifica and Pueraria lobata tubers. Phytomedicine 15(1-2), 38-43, 2008)의 라디칼 소거능(radical scavenging activity)은 실질적으로 항산화 활성과 연관성이 높은 시험관내 항산화 활성 측정 방법이다. DPPH의 안정화된 자유라디칼이 토코페롤(tocopherol), 아스코르브산(ascorbate), 플라보노이드(flavonoid) 화합물, 방향족 아민류, 매일라이드(Maillard)형 갈변 생성물질, 펩티드 등의 항산화 활성을 나타내는 생리활성 물질 (주로 방향족 화합물)에 의해 비가역적 환원되어 안정한 분자를 형성함으로써 짙은 자색의 시약이 노랑색으로 탈색되는 정도에 따라 항산화 효과를 수소공여능으로 측정한다.

방법

Thitilertdecha 등의 방법 (Thitilertdecha N., et al., LWT-Food Sci. Technol., 41, 2029-2035, 2008)을 본 실험에 맞게 변형하여 조각자 추출물 GSM, GSE에 대해 실시하였으며, 대조군으로 L-아스코르브산(Vit C)을 사용하였다. 추출한 시료 20 ㎕에 0.2 mM DPPH 용액 80 ㎕를 첨가하여 10초 동안 섞어주고, 실온에서 10분 동안 방치한 후 492 nm에서 흡광도(A)를 측정하였다. 각 추출물에 대해 250, 500, 1000 ㎍/mL의 농도에서 흡광도를 측정하였으며, 하기 식에 그 측정값들을 대입하여 DPPH 라디칼 소거능을 결정하였다.

각 실험군 및 대조군에 대한 측정은 3회에 걸쳐 이루어졌으며, 그 평균값을 사용하여 산출한 결과를 표 2에 나타내었다.

결과

조각자 추출물의 DPPH 라디칼 소거능

	추출 용매			Vit C
	㎍/mL	GSM	GSE
DPPH 소거능(%)	250	C24.2 ± 0.530c	B32.0 ± 1.319c	A77.96 ± 0.50c
	500	B44.7 ± 2.207b	B50.3 ± 4.191b	A80.00 ± 0.24b
	1000	C68.8 ± 2.330a	B70.4 ± 1.801a	A81.73 ± 0.36a

동일한 가로열에서 서로 다른 첨자로 표시된 평균값(A-C)들은 유의한 차이를 나타내고 (P < 0.05), 동일한 세로열에서 서로 다른 첨자로 표시된 평균값(a-c)들은 유의한 차이를 나타냈다.

250, 500, 1000 ㎍/mL에서의 측정 결과, 각각의 농도에서 GSM의 경우 24.2%, 44.6%, 66.8%, GSE의 경우 32.0%, 50.3%, 70.4%의 DPPH 라디칼 소거능을 갖는 것으로 나타났다. Vit C의 경우 동일 조건에서의 라디칼 소거능은 78.0%, 80.0%, 81.7%로, GSM, GSE를 고농도로 처리할 경우 양성 대조군과의 항산화 활성의 차이가 보다 줄어드는 것을 확인하였다.

유리 자유기에 의한 세포 손상은 당뇨병의 발생 및 당뇨병 합병증의 발생과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있으므로, 강력한 항산화 효과를 나타내는 조각자 메탄올 및 에탄올 추출물은 당뇨병 및 당뇨병 합병증의 예방 및 개선에 기여할 수 있다.

3-3. DNA 손상 측정- 코멧 어세이( Comet assay )

항산화제에 의해 전처리된 건강한 성인의 DNA는 산화적 스트레스에 노출시 DNA 손상 보호효과를 갖는 것으로 보고되고 있다. 본 실험에서는 성인 백혈구에 DNA 손상 유발 물질 H₂O₂에 의한 산화적 스트레스를 유발시 조각자 추출물의 DNA 손상 보호 효과를 Comet assay를 이용하여 확인하고자 하였다.

Comet assay는 단일세포 수준에서 DNA 손상 정도를 측정할 수 있는 신속, 간편하며 민감한 방법으로, 다양한 종류의 조직 또는 세포에 적용 가능한 것으로 알려져 있다 (Tice RR emd., Single cell gel/comet assay: Guideline for in vitro and in vivo genotoxicity testing. Enciron Mol Mutagen 35: 206-21, 2000). 세포핵 내의 DNA 가닥을 전기영동법을 통해 관찰하는 경우 손상되거나 절단된 DNA가 혜성(comet) 모양으로 나타나는데, 이 혜성의 꼬리 길이와 넓이를 측정하여 DNA의 손상 정도를 측정한다.

방법

신선한 전혈 5 mL를 Histopaque 1077을 이용하여 백혈구만을 분리해 낸 후 본 실험에 사용하였다. 조각자 추출물 GSM과 GSE를 각각 1, 5, 10, 50 ㎍/mL의 농도로 백혈구에 처리한 후 37 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 백혈구에 산화적 손상을 주기 위해 200 μM의 과산화수소(H₂O₂)를 4 ℃에서 5분 동안 처리한 후 PBS로 세척하였다. 음성 대조군으로 백혈구에 PBS만을 처리하였으며, 양성 대조군으로서 조각자 추출물 대신 PBS를 사용하여 반응시킨 후 200 μM H₂O₂를 처리하였다.

Comet assay를 위해 반응을 끝낸 백혈구를 0.7% 저융점 아가로오스 겔(low melting agarose, LMN) 75 ㎕와 혼합하고, 1.0% 일반 아가로오스(normal melting agarose, NMA)를 미리 코팅한 슬라이드 상에 세포현탁액과 LMA의 현탁액이 균등 분산되도록 하여 커버글래스로 덮어 4 ℃ 냉장고에 보관하였다. 젤이 굳으면 커버글래스를 벗기고 그 위에 다시 0.7% LMA 용액 75 ㎕를 한 층 더 도포하였다. 미리 준비해둔 차가운 알칼리 용해 완충액 (alkali lysis buffer, 2.5 M NaCl, 100 mM Na₂EDTA, 10 mM tris)에 1% Triton X-100을 사용 직전에 혼합한 후, 슬라이드를 담가 저온, 암실에서 1시간 동안 침지시켜 DNA의 이중 가닥을 풀어주었다. 용해과정(lysis)이 종료된 후, 슬라이드를 전기영동 수조에 배열하고 4 ℃의 차가운 전기영동 완충액 (300 mM NaOH, 10 mM Na₂EDTA, pH>13)을 채워 40분 동안 언와인딩(unwinding)시켜 DNA의 알칼리 취약 부위(alkali labile site)가 노출되도록 하였다. 빛에 의한 DNA의 부가적 손상을 방지하기 위해 전기영동 수조를 어두운 천으로 덮은 상태로, 25 V/300±3 mA의 전압을 걸어 20분 동안 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 0.4 M Tris 완충액 (pH 7.4)에 5분 동안 담가 세척하는 과정을 3회 반복 실시하여 슬라이드를 건조시켰다. 20 ㎍/mL 농도의 브롬화에티듐(ethidium bromide)로 핵을 염색하여 커버글래스로 덮고 형광 현미경(Leica, Wetzlar Germany) 상에서 관찰하였다. CCD 카메라 (Nikon, Tokyo, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 이미지는 Comet 영상 분석 시스템 (Komet 5.0, Kinetic Imaging, Liverpool, UK)이 설치된 컴퓨터상에서 분석하였다.

백혈구의 H₂O₂에 의한 DNA 손상 및 각 시료에 의한 손상 억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리부분으로 떨어져 나간 꼬리 내 DNA %함량(tail intensity)을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리군에서 2 개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하였으며 각 처리군은 최소 3회 반복 실험하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

결과

건강한 성인의 백혈구에 산화적 스트레스를 유도하는 200 μM H₂O₂ 처리시 DNA 손상은 유의적으로 증가한 반면, 조각자 추출물 GSM과 GSE 첨가에 의해 그 손상은 모두 유의적으로 감소되었으며, 특히 GSM은 농도 의존적인 경향을 확인할 수 있었다 (도 3).

실시예 4. 스트렙토조토신 - 니코틴아미드 유도 당뇨병 모델쥐에서의 항당뇨 및 항산화 활성 측정

시료의 준비

조각자 1.8 kg에 EtOH 20 L를 첨가하고 3일 동안 상온 추출하여 65 g의 조 추출물을 수득하였으며, 이를 증류수에 녹여 동결건조를 실시하였다. 3일간 동결건조 후 얻어진 고형분을 -20 ℃에서 냉동 보관하면서 사용하였다.

실험동물의 사육

약 100 g 정도의 5주령 Spargue-Dawley 흰색 랫트(수컷) 28 마리를 구입하여 1주일간 Lab-chaw 식이 (2018S Teklad global 18% protein rodent diet, USA)를 제공하면서 적응시켰다. 제2형 당뇨를 유발시키기 위해 스트렙토조토신(streptozotocin) 45 mg/kg을 0.01 M 시트르산에 용해시켜 복강 주사에 의해 투여하고, 15분 후 니코틴아미드(nicotinamide) 110 mg/kg을 증류수에 용해시켜 복강 주사를 재실시하였다 (Pari L and Srinivasan S., Biomed . Pharmacother. 64, 477-481, 2010). 1주일 후, 상기 래트의 미정맥에서 혈액을 채취하여 공복 혈당 농도를 측정한 결과, 모두 300 mg/dl 이상인 것으로 나타나 스트렙토조신 및 니코틴아미드에 의해 당뇨가 유발된 것을 확인하였다. 체중에 따라 난괴법에 의해 당뇨군, 아카르보오스 섭취군 (acarbose, AC) 및 조각자 추출물 투여군 (Gleditschiae Spina extract, GSE)으로 나누었으며, 여기에 당뇨를 유발시키지 않은 대조군(normal control, NC)을 포함하여 총 4군을 대상으로 10주 동안 동물 실험을 수행하였다.

실험동물은 한 마리씩 케이지에 넣어 사육하였으며, 사육실의 온도는 20℃, 습도는 55%로 유지하고, 명암은 12시간을 주기로 자동 조절하였다. 식이는 AIN-93G를 기준으로 조제하였으며, 4 ℃에 보관하면서 해당 식이를 자유로이 섭취하도록 하였다. 대조군과 당뇨군은 일반 물을 섭취하였으며, AC 섭취군은 아카르보오스 4 mg/kg, GSE 투여군은 GSE 50 mg/kg을 매일 제공되는 물에 혼합하여 섭취하도록 하였다.

4-1. 식이섭취 , 체중 및 혈당에 대한 효과

방법

10주의 사육기간 동안, 상기와 같이 처리한 실험동물 각각에 대해 매일 식이섭취량 및 음료섭취량을 기록하고, 매주 체중과 혈당을 측정하였다. 식이 및 음료 섭취량, 체중 변화량 및 이들로부터 산출된 식이 효율을 각 군별로 평균값을 사용하여 (n=7) 표 3에 나타냈으며, 1주일 간격으로 혈당 추이를 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.

결과

	체중증가량(g/일)	식이섭취량 (g/일)	음료섭취량( mL /일)	FER 3 )
NC1 )	143.0±4.62)a	19.5±0.2a	31.9±1.1a	0.104±0.003a
DC	15.0±8.8b	23.9±1.7b	157.8±3.5d	0.000±0.008b
AC	-3.8±12.8b	24.0±0.5b	114.2±3.0b	-0.002±0.007b
GSE	3.0±11.2b	23.9±1.3b	140.1±4.3c	0.02±0.006b

¹⁾ NC: 정상 대조군, DC: STZ-니코틴아미드 유도 당뇨군, AC: STZ-니코틴아미드 유도 당뇨+아카르보오스(4 mg/kg) 투여군, GSE: STZ-니코틴아미드 유도 당뇨+GSE(50 mg/kg) 투여군.

²⁾ 평균 ± 표준 오차(S.E.) (n=7)

³⁾ FER = 식이섭취량 (g/일) / 체중증가량 (g/일)

^a-d) 동일한 세로열에서 서로 다른 첨자(a-d)로 표시된 평균값들은 던칸 다중범위 검정에 의해 유의한 차이를 나타낸다 (P < 0.05).

일주일간의 적응기를 거친 후 당뇨유발군에는 스트렙토조토신-니코틴아미드를 처리하여 당뇨를 유발시킨 후 체중을 측정한 결과, 정상군에 비해 당뇨유발군인 DC, AC, GSE군에서는 체중이 감소하는 것을 확인하였으며, 실험이 진행됨에 따라 몸무게의 변화량은 정상군에서는 증가하는 반면, 당뇨유발군인 DC, AC, GSE군에서는 미미하게 감소하거나 소폭 증가하는 것를 확인할 수 있었다.

식이 섭취량의 경우, 정상군에 비해 당뇨유발군인 DC, AC, GSE의 그룹에서 식이섭취량이 높은 것을 확인하였으며, 이것은 당뇨의 증상인 다식증에 의한 것으로 예측된다, 다만, AC군에서는 DC군에 비해 섭취량이 더욱 증가한 반면, GSE군에서는 DC군에 비해 식이 섭취량이 감소하는 것을 확인하여, 조각자 추출물 투여시 다식증을 완화시키는 효과가 있는 것으로 판단되었다. 음료 섭취량에 있어서, 당뇨의 증상인 다갈증으로 인해 NC군에 비하여 당뇨유발군인 DC, AC, GSE 군에서는 물의 섭취량이 현저하게 증가한 것을 확인하였다, 다만, DC군에 비해 AC, GSE 군에서는 그 섭취량이 감소한 것을 확인하였다.

각각의 군에 대한 공복혈당 변화량의 측정 결과, 정상군은 10주 동안 정상 수준의 혈당량 범위를 유지하였고, 당뇨유발군인 DC, AC 및 GSE 군에서는 453 내지 600 mg/dl으로 혈당 수준이 유의하게 상승된 것을 확인하였다. 양성대조군인 아카르보오스 투여군의 경우, 7주차의 혈당이 577 mg/dl였으나, 8주차의 혈당은 465 mg/dl, 9주차의 혈당은 312 mg/dl, 10주차의 혈당은 314 mg/dl로 나타나, 8주차부터 공복혈당이 유의적으로 감소하였다.

GSE 투여군은 9주차의 혈당은 508 mg/dl으로서, 9주차까지 DC군에 비해 감소된 혈당량을 나타내었으나 유의한 차이를 보이지는 않다가, 10주차의 혈당은 361 mg/dl로 DC군(530 mg/dl)보다 공복혈당이 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과에 비추어, 10주 이상의 계속적인 GSE 섭취시 아카르보오스와 유사한 수준의 혈당상승 억제 효과를 나타낼 것으로 예측된다.

4-2. 경구 당부하 검사 ( Oral glucose tolerance test , OGTT )

GSE 섭취가 streptozotocin-nicotinamide로 유발된 당뇨 랫트의 당대사 기능에 미치는 영향을 알아보고자 경구 당부하 검사를 실시하였다. 경구 당부하 검사는 공복 상태에서 당을 섭취한 후 정맥혈청 혈당의 증가 추이를 측정하며, 당뇨, 내당능장애 또는 인슐린 분비 장애 등의 진단에 이용된다.

방법

실험종료 3일 전에 실험동물들을 12시간 동안 절식시켰다. 공복시 미정맥에서 채혈하여 측정된 혈당 수준을 초기 혈당으로 하였으며, 포도당 2 g/kg을 경구 투여한 후 30분 간격으로 (포도당 투여 30, 60, 90, 120분 경과 시점) 채혈하여 혈당측정기(Accu-check, Roche, Germany)로 혈당 수준을 측정하였다. 시간에 따른 혈당량 측정 결과 및 이러한 혈당 수치를 포도당 곡선하 면적(area of under curve, AUC)으로 나타낸 결과를 각각 도 5A 및 5B에 나타내었다.

결과

모든 군에 있어서 포도당 경구 투여 30분 후부터 혈당이 상승하기 시작하였으며, 정상 대조군의 경우 199 mg/dl, DC군의 경우 766 mg/dl, AC군의 경우 382 mg/dl, GSE군의 경우 515 mg/dl로, 정상 대조군보다 당뇨유발군(DC, AC, GSE)에서 유의적으로 상승한 것을 관찰할 수 있었다 (도 5A).

당뇨유발군 중에서는, 포도당 투여 30-90분 후의 혈당 수준이 DC군에 비해 AC군 및 GSE군에서 약 300 내지 400 mg/dL 더 낮게 나타나, 양성대조약물 또는 본 발명의 조각자 추출물의 투여시 혈당 상승을 유의하게 억제시키는 효과를 나타냈다. 한편, GSE군과 AC군 간에는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이와 같은 경향은 포도당 투여 후 90분까지 지속되었으며, 120분 경과시 DC군의 혈당 수준은 공복 수준으로 감소하여, AC 또는 GSE 섭취 군의 혈당 수준과 유의한 차이를 나타내지 않았다.

혈당의 수치를 포도당 곡선 하면적(AUC)으로 나타낸 결과, DC군 (47046 min·mg/dL)보다 AC군 (30446 min·mg/dL) 및 GSE 군(31860 min·mg/dL)에서 AUC 값이 유의하게 감소하여 혈당 상승 억제 효과를 보였다 (도 5B).

4-3. 혈장 총 유리기 포집 항산화능 측정

혈장 TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant Potential)은 Rice-Evans과 Miller의 방법(Rice-Evans C and Miller NJ., In Methods in Enzymology. Academic Press, NewYork P279-293, 1994)은 혈장 내에 존재하는 항산화제들의 복합된 활성을 측정하여 혈장의 총 유리기 포집 항산화능을 나타내는 방법이다. TRAP법의 원리는 ABTS (2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline 6-sulfonate), 150 μM)와 메트미오글로빈 (2.5 μM)을 H₂O₂ (75 μM)로 활성화시킴으로써 생성되는 페릴 미오글로빈 라디칼 종(ferryl myoglobin radical species)과의 상호 작용으로 생성된 ABTS 라디칼 양이온의 흡광도를 측정하는데 기초한다. 흡광도의 억제 정도는 시료 (0.84 % 혈장) 중의 항산화능에 비례한다.

방법

시험관에 PBS, ABTS, 메트미오글르빈을 혼합한 후 시료를 넣고 H₂O₂로 반응시켜 740 nm의 파장에서 UV/VIS 분광광도계 (Shimadzu UV-1601, Tokyo, Japan)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 혈장의 TRAP 농도는 트롤록스(trolox)의 검량선을 이용하여 산출된 값을 TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity, mM)로 표현하였으며, 도 6에 각 군에 따른 결과를 나타내었다.

결과

혈장 TRAP 수준은 정상군의 경우 0.90 mM, DC군의 경우 0.75 mM, AC군의 경우 0.83 mM, GSE군의 경우 0.91 mM 정상군에 비해 DC군에서 감소하는 경향을 보였으며, AC군의 혈장 TRAP은 DC군보다 다소 상승되었으나 이들 모두 유의한 차이는 보이지 않았다. 그러나 GSE 투여군에서는 DC군에 비해 혈장 TRAP 수준이 유의적으로 증가하여, 본 발명의 조각자 추출물이 혈장의 전반적 항산화능을 향상시키는데 기여함을 알 수 있었다. 따라서 이러한 혈장 TRAP의 증가는 조각자 추출물에 의한 유리 라디칼 소거능에 기인한 것으로, 제2형 당뇨 모델 랫트의 산화적 스트레스를 감소시키는 역할을 수행하는 것으로 생각된다.

Claims (11)

1. 조각자(stings of Gleditsia sinensis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병에 의한 합병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 당뇨병에 의한 합병증은 심혈관질환, 신경병증, 피부감염, 세소혈관증 또는 치료약제에 의한 과민 반응에 의한 피부 증상, 수정체의 혼탁과 백내장, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증 및 당뇨병성 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 약학 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 심혈관질환은 관상동맥성 심장질환, 동맥경화 또는 심근경색인 것인 약학 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조각자 추출물은 메탄올 또는 에탄올 용매로 추출한 것인 약학 조성물.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물로 제조되는, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 액제, 현탁제, 에멀젼, 시럽제, 엑스제, 동결건조 제제, 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 당뇨병 또는 당뇨병 합병증의 예방 및 치료용 의약 제제.
6. 삭제
7. 유효량의 조각자 추출물을 포함하는 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 식후 혈당 추이를 개선하는 방법.
8. 조각자를 메탄올 또는 에탄올로 추출하고, 여과하고, 감압 농축하여 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물을 생성하는 단계, 및 상기 추출물의 유효량을 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 중 하나 이상과 혼합하는 단계를 포함하는, 당뇨병 및 당뇨병 합병증의 예방 또는 치료용 의약의 제조 방법.
9. 조각자 추출물을 함유하는 당뇨병 및 당뇨병 합병증의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물.
10. 조각자 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 당뇨병 및 당뇨병 합병증의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품.
11. 제10항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 산제, 과립제, 액제, 현탁제, 차, 젤리, 또는 음료의 형태인 건강 기능성 식품.

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