KR101085954B1 - 조각자 가시 추출물을 포함하는 이상증식 혈관 질환의 예방또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조각자 가시 추출물을 유효성분으로 포함하는 이상증식 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 조각자나무 가시 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 평활근세포에 대한 우수한 세포독성을 나타내며, 세포주기 조절인자인 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B의 발현 및 활성을 억제하여 세포주기를 G2/M 단계에서 어레스트 하며, 전사인자 NF-κB 및 AP-1의 활성을 방해하여 평활근세포의 MMP-9의 활성을 억제하여 세포의 마이그레이션을 효과적으로 저해하고, 또한 ERK, p38MAP 키나아제 및 JNK와 같은 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 활성을 촉진하여 세포의 아폽토시스를 유도한다. 또한, 본 발명의 조성물은 오랫동안 한약재로 이용되고 있는 조각자나무 가시 추출물을 유효성분으로 포함하기 때문에 안전성이 우수하다.

이상증식 혈관 질환, 평활근세포, 동맥경화, 조각자, MMP-9, 세포주기, MAPK

Description

조각자 가시 추출물을 포함하는 이상증식 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing or Treating Hyperproliferative Vascular Disorders Comprising Extracts from Thorns of Gleditsia sinensis}

본 발명은 조각자 가시 추출물을 포함하는 이상증식 혈관 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

20세기 초기에는 심장혈관 질환으로 인한 사망이 전체 사망원인의 10% 미만을 차지했으나, 최근에 이르러서는 이 심혈관 질환으로 인한 사망률이 선진국에서는 약 50%, 개발도상국에서는 약 25% 정도를 차지하고 있다. 심혈관 질환의 대부분을 차지하는 동맥경화증은 흡연, 당뇨병 등의 여러 요인에 의해 혈관이 손상을 받거나 혈관내피 세포의 기능에 문제가 생기는 경우 발생하게 되는데, 동맥경화반의 생성과 이로 인한 혈전의 생성은 각 장기로의 원활한 혈액 공급을 저해해 심각한 결과를 초래한다.

이와 같은 동맥경화의 발생과 진행을 초래하는 원인에 대해서는 아직 잘 모르고 있으나, 동맥경화를 유발하고 진행을 촉진시키는 주요 위험인자로는 고콜레스테롤혈증(≥240 ㎎/㎗), 고혈압(≥140/90 mmHg), 흡연, 저-고밀도지단백(HDL<40 ㎎ /㎗), 당뇨병, 가족력 또는 연령증가 등이 있다고 알려져 있으며, 잠재적 위험인자로는 운동부족, 과체중 또는 비만이 있다. 따라서 한 사람이 상기 위험인자를 많이 가질수록 동맥경화가 조기에 발생하고 아울러 그 정도가 더 심해지고 또 진행이 촉진된다.

한편, 국내에서 현재 사용되고 있는 동맥 경화의 치료법으로는 풍선도자 확장술이나 관상 동맥 스탠트 삽입술과 같은 내과적 혈관확장술이 보편적으로 이용되고 있으나, 시술 후 약 30%에 이르는 혈관 재협착증이 여전히 문제로 남아있다(Pharmacol , Ther ., 92:165-178(2001)). 또한, 치료에 따른 부작용과 더불어 상당한 경제적 부담감을 지니는 단점을 지니고 있다. 따라서 약제의 효능, 안정성, 체내 흡수효과가 우수한 저분자 화합물 중에서 새로운 동맥경화 치료제제의 개발이 요구되고 있으며, 이러한 신물질의 유력한 후보로서 생약 소재가 주목받고 있다. 한약에는 수천 년간의 임상경험을 바탕으로 선별되어 낮은 독성과 높은 치료효과를 가진 약재들이 많이 존재하고 있으며, 새로운 동맥경화치료제의 탐색소재로서 생약재를 사용하는 시도 또한 여러 나라에서 활발히 이루어지고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 신규한 이상증식 혈관 질환 치료제를 개발하기 위하여, 다양한 한약재를 스크리닝 하였고 그 결과 종래에 한약재로 이용되고 있는 조각자나무의 가시추출물이 평활근세포에 대한 우수한 세포독성을 나타내며, 세포주기 조절인자인 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B의 발현 및 활성을 억제하여 세포주기를 G2/M 단계에서 어레스트 하며, 전사인자 NF-κB 및 AP-1의 활성을 방해하여 평활근세포의 MMP-2 및 MMP-9의 활성을 억제하여 세포의 마이그레이션(migration)을 효과적으로 저해하고, 또한 ERK, p38MAP 키나아제 및 JNK와 같은 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 활성을 촉진하여 세포의 아폽토시스를 유도한다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 평활근세포 증식 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 이상증식 혈관 질환(hyperproliferative vascular disorders)의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 유효성분으로서 조각자나무 추출물을 포함하는 평활근세포 증식 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 유효성분으로서 조각자나무 추출물을 포함하는 이상증식 혈관 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 신규한 동맥경화 치료제를 개발하기 위하여, 다양한 한약재를 스크리닝 하였고, 그 결과 종래에 한약재로 이용되고 있는 조각자나무의 가시추출물이 평활근세포에 대한 우수한 세포독성을 나타내며, 세포주기 조절인자인 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B의 발현 및 활성을 억제하여 세포주기를 G2/M 단계에서 어레스트 하며, 전사인자 NF-κB 및 AP-1의 활성을 방해하여 평활근세포의 MMP-2 및 MMP-9의 활성을 억제하여 세포의 마이그레이션을 효과적으로 저해하고, 또한 ERK, p38MAP 키나아제 및 JNK와 같은 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 활성을 촉진하여 세포의 아폽토시스를 유도한다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “평활근”은 인체 내부장기의 벽을 구성하는 근육계통으로서 인체의 무의식적인 생리현상, 특히 각종 내장(예컨대, 위장관, 혈관, 방광 또는 자궁 등)의 운동을 관장하는 조직이며, 평활근세포는 상기 조직으로부터 분리한 세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “동맥경화”는 동맥벽의 탄력이 소실되고 그 벽이 두꺼워져서 경화되는 질환군을 의미한다. 좀더 자세히 설명하면 혈중의 콜레스테롤이 내막안으로 침투하고 그로인해 여러 물질이 분비되면 동맥의 내막이 두터워지고, 콜레스테롤이 축적되어 혈관안쪽으로 돌출하는 죽종이 생기게 되는데, 죽종 내부는 그 주위가 섬유화되어 점차 단단해지는 질병을 의미한다.

본 발명의 유효성분으로 이용되는 추출물의 소스(source)로서의 “조각자나무(Gleditsia sinensis Lam.)”는 콩과의 갈잎큰키나무이다. 본 명세서에서, 용어 “조각자나무 추출물”은 조각자나무의 다양한 기관(예컨대, 잎, 줄기, 뿌리 또는 가시)로부터 추출하여 얻은 것을 의미하며, 가장 바람직하게는 조각자나무의 가시로부터 추출하여 얻은 것을 의미한다. 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 바람직하게는, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 헥산, (i) 디에틸에테르, 또는 (j) 부틸아세테이트를 이용하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물 또는 저급 알코올, 보다 바람직하게는 물, 메탄올 또는 에탄올, 가장 바람직하게는 물(특히, 열수)을 용매로 하여 얻어진 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 이상증식 혈관 질환의 치료 또는 예방에 유효하다. 본 명세서에서, 용어 “이상증식 혈관 질환”은 혈관에 존재하는 세포, 특히 혈관 평활근 세포의 과도한 증식에 의해 야기되는 질환 또는 질병을 의미한다. 이상증식 혈관 질환은 다양한 질환을 포함하며, 예를 들어, 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 재발협착증 및 협착증을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료 또는 예방되는 이상증식 혈관 질환은 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증 또는 재발협착증이다. 아테 롬성 동맥경화증은 동맥의 내층에 지방 물질이 침착되거나 섬유화(fibrosis)되어 있는 질환이다. 한편, 재발협착증은 혈관벽이 손상(traumatization)된 후 혈관 통로가 좁혀지는 질환이다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서의 조각자 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있고, 비경구 투여되는 경우에는 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 ㎎/㎏(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 후박나무 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이 한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 평활근세포 증식 억제 및 이상증식 혈관 질환 치료 또는 예방에 매우 유용하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 평활근세포 증식 억제 및 이상증식 혈관 질환(hyperproliferative vascular disorders)의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물 및 식품 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 조각자나무 추출물, 바람직하게는 조각자나무 가시 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 평활근세포에 대한 우수한 세포독성을 나타내며, 세포주기 조절인자인 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B의 발현 및 활성을 억제하여 세포주기를 G2/M 단계에서 어레스트 하며, 전사인자 NF-κB 및 AP-1의 활성을 방해하여 평활근세포의 MMP-2 및 MMP-9의 활성을 억제하여 세포의 마이그레이션을 효과적으로 저해하고, 또한 ERK, p38MAP 키나아제 및 JNK와 같은 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 활성을 촉진하여 세포의 아폽토시스를 유도하는 효능을 갖는다.

(ⅲ) 특히, 본 발명의 조성물은 오랫동안 한약재로 이용되고 있는 조각자나무 추출물, 바람직하게는 조각자나무 가시 추출물을 유효성분으로 포함하기 때문에 안전성이 우수하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 조각자 추출물의 제조

조각자 추출물을 수득하기 위하여, 건조된 조각자 나무의 가시(조각자)를 물로 10시간 동안 95℃에서 환류 추출한 다음, 추출액을 회전 증발기(rotary evaporator)에서 농축시킨 후, 동결건조기에서 2일 동안 건조시켜 추출물의 분말을 수득하였다. 최종 수율은 약 10% 이었다.

실시예 2: 대동맥유래 평활근세포주를 이용한 인 비트로 항동맥경화효과 연구

대동맥유래 평활근세포주(VSMC: vascular smooth muscle cell, primary cell line)를 96 웰-플레이트에 2 × 10⁵의 농도로 계대 배양하고 48시간 후 조각자 추출물을 처리하였다. 24시간 후 조각자 추출물에 의한 세포상태 및 세포 성장 억제 정도를 세포주기 관찰 및 신호전달체계를 이용하여 분석하였다.

세포증식 분석(MTT 분석)

조각자 추출물에 의한 평활근세포의 성장 억제능력평가를 위하여 평활근세포 주를 이용하여 다음과 같이 MTT 분석을 실시하였다. 상기 평활근세포를 96 웰-플레이트에서 배양한 후, 세포 생존도를 MTT 시약 [tetrazolium salt 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2-tetrazolium]을 이용하여 측정하였다. 최종적으로, ELISA 판독기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각각의 측정값은 조각자 추출물을 처리하지 않은 대조군 값을 생존도 100%로 하여 상대적인 값으로 나타내었다(도 1).

도 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 조각자 추출물은 평활근세포주 VSMC의 성장 능력을 농도-의존적으로 억제하였다.

티미딘 업테이크 시험(thyymidine uptake assay)

조각자 추출물이 평활근세포주의 DNA 합성능력을 억제하는지 여부를 공지의 방법(Marshall, E. S. et al. European J. Cancer, 30A:1370-1376(1994))에 따라 ³H-티미딘 업테이크 분석을 실시하여, 평활근세포의 DNA 합성 저해 정도를 측정하였다. RPMI-1640 배지에 FBS를 10%로 첨가하고, 페니실린 100 IU/㎖, 스트렙토마이신 100 ㎍/mL을 첨가한 배지를 이용하여, 5% CO₂ , 37℃ 배양기에서 평활근세포를 배양하였다. 세포 배양에 사용한 배지 조성물들은 모두 GIBCO BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다. 상기 배양한 평활근세포를 96-웰 플레이트에 1 × 10⁴ 개 세포를 분주하고, 조각자 추출물을 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖ 및 1000 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 72 시간 동안 배양하였다. 세포를 회수하기 6 시간 전에 웰당 1 μCi ³H-티미딘을 첨가하여 배양하였다. 세포 회수 기구를 이용하여 세포를 유리 섬유 필터에 회수하고, 회수된 세포에 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail, Wallac, Turku, Finland) 3 mL를 혼합하여 액체 신틸레이션 카운터(liquid scintillation counter, Wallac, Turku, Finland)로 방사능을 측정하였다.

도 2에서 볼 수 있듯이, 조각자 추출물을 처리함에 따라서 농도 의존적으로 평활근세포의 DNA 합성 능력이 억제되었다.

MAP 키나아제 분석( Mitogen - activated protein kinase assay )

세포의 증식과 분화의 조절에 있어서 성장 조절인자, 성장 호르몬 및 사이토카인 등에 의해 발생되는 세포외 시그널을 세포내로 전달하는데 중요한 역할을 하는 ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 MAPK(p38 Mitogen-activated protein kinase) 및 JNK(C-Jun N-terminal kinase)와 같은 MAP 키나아제의 활성을 측정하여, 조각자 추출물이 세포의 신호경로(signal pathway)의 신호전달에 영향을 미칠 수 있는 지 여부를 평가하였다. 또한, 조각자 추출물이 ERK, p38 MAPK 및 JNK의 인산화에 직접적인 영향을 미치는 지 여부도 알아보았다. MAPK 활성을 조사하기 위하여 MAPK Assay Kit(New England Biolabs, Inc.)를 사용하였다.

평활근세포에 600 ㎍/㎖의 조각자 추출물을 처리한 후(12시간 처리하였음) 세포를 용해용액(20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM 소듐 파이로포스페이트(sodium pyrophosphate), 1 mM 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 1 mM Na₃VO₄, 1 ㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin), 및 1 mM PMSF)으로 4℃에서 15분간 용출시켜 파쇄물을 10,000 × g에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 MAPK 분석에 사용하였다. 또한, 인산화의 억제를 위해서는 ERK의 억제자인 U0126, JNK의 억제자인 SP600125, 및 p38 MAPK의 억제자인 SB203580을 10 μM의 양으로 처리하였다.

도 3에서 보는 바와 같이, 조각자 추출물의 처리에 의해 ERK, p38 MAPK 및 JNK 인산화(phosphorylation), 즉 활성화가 증가됨을 알 수 있다. 또한, 조각자 추출물을 처리하고, U0126, SP600125 및 SB203580을 각각 처리한 경우, ERK, p38 MAPK 및 JNK의 인산화가 일어나지 않는 것으로 볼 때, 조각자 추출물은 ERK, p38 MAPK 및 JNK의 인산화에 직접적인 영향을 미친다는 것을 알 수 있다.

FACS 분석

평활근세포주의 세포주기는 유세포분석법(Flow Cytometry)을 사용하여 분석하였다. 상기 세포를 수확한 후, 70%의 에탄올로 고정 하였으며 -20℃에서 보관하였다. 다음으로, 세포를 냉각한 PBS로 두 번 세척한 후 RNase를 처리하여 배양 하였으며 DNA 염색은 프로피디움 요오드화물(propidium iodide; PI)을 이용하였다. 형광의 세기는 유세포분석기(FACStar, Becton Dickinson, MountainView, CA, USA) 를 사용하여 결정하였으며, 분석은 셀 피트 소프트웨어(CELLFIT software, Becton Dickinson, USA)를 사용하여 행하였다. 실험 결과는 표 1 에 나타나 있다.

시료	G0/G1	S	G2/M
대조군	50	49	1
조각자 추출물 (600 ㎍/㎖)	52	43	5
조각자 추출물 (800 ㎍/㎖)	53	41	6
조각자 추출물 (1000 ㎍/㎖)	50	41	9

표 1에서 확인할 수 있듯이, 조각자 추출물 처리에 의해 G2/M 세포주기의 어레스트(arrest)가 유도됨을 알 수 있다.

세포주기 관련 단백질의 발현 수준 측정

FACS 분석 실험 후, 그 결과에 따른 세포주기 상태에서 G2/M 세포주기 관련 단백질의 발현 수준의 변화를 측정하기 위하여 평활근세포주에 조각자 추출물 600 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖ 및 1000 ㎍/㎖ 처리 후 세포주기 양성조절자(positive regulator) 단백질인 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B1의 발현수준 변화를 웨스턴 블롯팅(참조: Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press)으로 평가하였다(도 4).

실험결과, 도 4와 같이 조각자 추출물을 처리함에 따라서 세포주기 조절인자 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B1의 발현 억제가 유도 되었다.

조각자 추출물에 의한 평활근세포의 마이그레이션을억제능력평가

최근 보고 된 바에 의하면, 평활근세포의 마이그레이션에 매트릭스 메탈로프로테나아제(matrix metalloproteinase, MMP)-2 와 MMP-9의 역할이 중요하다는 사실이 규명되었다(L.A. Liotta, Cancer Res. 46:1-7(1986); L.A. Liotta et al, Lab . Invest ., 49:636-649(1983); M.J. Duffy, Clin . Exp . Metastasis 10:145-155(1992); 및 W.G. Stetler-Stevenson, Cancer Metastasis Rev. 9:289-303(1990)). 따라서, 자이모그래피 시험(Zymography assay)을 실시하여 조각자 추출물에 의한 평활근세포의 마이그레이션 억제능력을 평가하였다(도 5).

본 실험에서는 젤리틴 자이모그래피를 약간 변형하여, 후박 추출물에 의한 MMP 활성 변화를 측정하였다. 우선 아크릴아미드 젤 제조 시, MMP의 기질인 젤라틴이 1.0 ㎎/㎖ 첨가된 분리 젤을 제조하였다. 상기 평활근세포주를 배양한 무혈청 배양액 또는 평활근세포주의 세포 파쇄액(cell lysate)을 SDS 시료 완충액(4% SDS, 125 mM Tris-HCl(pH 6.8), 10% 글리세롤)으로 상기 젤 상에서 전기영동하였다. 이어, Triton X-100이 포함된 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액으로 아크릴아미드 젤을 30분간 2회 세척하여 SDS를 제거한 후, 자이모그래피 용 인큐베이션 완충액(50 mM Tris-HCl(pH7.5), 10 mM CaCl₂, 0.01% NaN₃)으로 20분간 다시 세척하였다. 그런 다음, 자이오그래피 용 인큐베이션 완충액을 아크릴아미드 젤과 혼합하여 37℃에서 20시간 배양한 다음 젤을 0.1% CBB(Bio-Rad, USA)로 염색시킨 후 탈색하여 MMP 활성을 측정하였다. 세포가 거의 컨플루언시(confluency)에 이르면, 혈청-결여 배지에서 하루 배양 후 조각자 추출물을 처리하였다. 1일이 경과한 후, 세포배양액의 상등액을 수거한 후 젤라틴 자이모그래피를 실시하였고, 플레이트에서의 세포배양추출물(lysates)에 대해서도 역시 젤라틴 자이모그래피를 실시하였다. 젤라틴 분해능이 현저하게 감소된 것을 MMP 활성 억제능이 있는 것으로 판단하였다.

실험결과, 도 5와 같이 조각자 추출물이 평활근세포의 MMP-2와 MMP-9의 활성을 농도-의존적으로 억제함으로써 평활근세포의 마이그레이션 능력을 억제함을 나타내었다.

젤 쉬프트 분석( Gel shift assay )

지금까지 보고 된 바에 의하면, 사이토카인 TNF-α에 의해 유도된 MMP-9의 발현의 증가는 MMP-9 유전자의 프로모터에 의해서 조절되며, 이 프로모터의 조절에는 전사인자 NF-κB 및 AP-1이 관여한다는 사실이 규명되었다(Moon SK et al, Biochem Biophys Res Commun ., 301:1069-1078(2003); 및 Moon SK et al, Cell Physiol ., 198:417-427(2004)). 이에, 본 발명의 조각자 추출물이 이들 전사인자 NF-κB 및 AP-1의 활성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하였다. 분석은 기본적으로 젤 쉬프트 분석에 따라 실시하였다.

우선, 평활근세포의 핵 추출물을 다음과 같이 준비하였다: 평활근세포주의 펠릿을 회수하여 완충액 A(10 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.4 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1 mM 소듐 플루오라이드, 1 mM Na₃VO₄)에 재현탁 시켰다. 이어, 0.1% 노니뎃(Nonidet) P-40을 상기 재현탁액에 첨가하여 10분 동안 얼음 위에서 인큐베이션한 후 10분 동안 3000 × g에서 원심분리하였다. 이렇게 하여 얻어진 핵 펠릿을 완충액 B(10 mM HEPES, 400 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.4 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 15% 글리세롤, 1 mM 소듐 플루오라이드, 1 mM Na₃VO₄)에 재현탁시킨 후, 완충액 C(20 mM HEPES, 200 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.4 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 15% 글리세롤, 1 mM 소듐 플루오라이드, 1 mM Na₃VO₄) 1 L에서 4℃, 2시간 동안 투석하였다. 핵 추출물을 4℃, 15분, 14000 × g 로 원심분리 한 후 단백질을 정량하였다. 이어, ³²P-레이블링된 DNA 프로브(NF-κB 프로브: CAGTGGAATTCCCCAGCC, AP-1 프로브: CTGACCCCTGAGTCAGCACTT)를 상온에서 결합 완충액(50 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 mM Tris-Cl(pH 7.5), 10% 글리세롤, 1 ㎍ 연어 정자 DNA, 1 ㎍ 폴리(dI-dC))에서 상기 핵 추출물과 혼합하고 인큐베이션 하였다. 그런 다음, 반응 결과물을 전기영동하고 젤을 건조시킨 후 필름에 노출하여 밴드를 검출 및 분석하였다(도 6). 세포가 거의 컨플루언시(confluency)에 이르면, 혈청-결여 배지에서 하루 배양 후, TNF-α와 조각자 추출물을 처리하였다. 1일이 경과한 후, 세포배양액의 상등액을 수거하고, 젤라틴 자이모그래피를 실시하였고, 플레이트에서의 세포배양추출물(lysates)에 대해서도 역시 젤라틴 자이모그래피를 실시하였다.

도 6에서 볼 수 있듯이, TNF-α에 의해 NF-κB 및 AP-1의 활성이 증가하였는데, 이 결과는 결국 NF-κB 및 AP-1의 활성이 세포의 마이그레이션과 함께 증가함을 보여주는 것이다. 또한, TNF-α에 의해 증가된 NF-κB 및 AP-1의 활성이 본 발명의 조각자 추출물에 의하여 크게 감소되고 있음을 알 수 있다.

실험 결과, 도 6에서와 같이 본 발명의 조각자 추출물은 전사인자 NF-κB 및 AP-1 활성을 저해함으로써 평활근세포주의 TNF-α에 의한 MMP-9의 활성을 억제하여 세포의 마이그레이션을 효과적으로 막을 수 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 MTT 분석(MTT assay)을 통하여 조각자(Gleditsia sinensis Lam) 추출물의 평활근세포주에 대한 성장 억제 능력 평가 결과를 보여주는 도면이다.

도 2는 티미딘 업테이크 시험(thymidine uptake assay)을 통하여 조각자 추출물의 평활근세포주에 대한 DNA 합성 억제 결과를 보여주는 도면이다.

도 3은 MAP 키나아제 분석(Mitogen-activated protein kinase assay)을 통하여 조각자 추출물 처리 시 평활근세포내에서 ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 MAPK(p38 Mitogen-activated protein kinase) 및 JNK(C-Jun N-terminal kinase) 인산화반응을 유도하는 결과를 보여주는 도면이다.

도 4는 표 1의 결과에 따른 G2/M 세포주기 조절인자 Cdc25c, Cdc2 및 사이클린 B1의 발현 억제를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.

도 5는 자이모그래피 시험(Zymography assay)을 통하여 조각자 추출물 처리 시 평활근세포내에서 MMP-2와 MMP-9의 활성을 억제하는 결과를 보여주는 도면이다.

도 6은 젤 쉬프트 분석(Gel shift assay)을 통하여 평활근세포에 조각자 추출물 처리 시 TNF-α에 의해 증가된 전사인자 NF-κB 및 AP-1활성을 저해하는 결과를 보여주는 도면이다.

Claims (6)

1. 조각자나무가시 추출물을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식 억제용 조성물.
2. 조각자나무가시 추출물을 유효성분으로 포함하는 이상증식 혈관 질환(hyperproliferative vascular disorders)의 치료 또는 예방용 조성물.
3. 삭제
4. 제 1 항에 또는 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1 항에 또는 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 2 항에 있어서, 상기 이상증식 혈관 질환은 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 재발협착증 또는 협착증인 것을 특징으로 하는 조성물.

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