CN105671125A - 一种酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶抑制剂或促进剂的筛选方法，具体涉及一种利用薄层色谱生物自显影技术筛选酪氨酸酶抑制剂或促进剂的方法，包括如下步骤：(1)将供试品溶解于有机溶剂中，然后将供试品溶液点样于薄层板上，挥干溶剂，备用；(2)将步骤(1)得到的薄层板浸渍于酪氨酸酶溶液中，挥干溶剂后再浸渍于1～20mmol/L的左旋多巴磷酸缓冲盐溶液中，取出薄层板后在20℃～40℃下进行酶促反应；(3)根据酶促反应后薄层板上的斑点颜色筛选供试品。本发明的方法不需要复杂的仪器和设备，操作简单，实验耗费低，适合一般实验室操作，而且灵敏度和专属性高于常规筛选方法，筛选结果直观、易于辨识和记忆。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶抑制剂或促进剂的筛选方法，具体涉及一种筛选酪氨酸酶抑制剂或促进剂的方法。
背景技术
酪氨酸酶是一种含铜酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。具有独特的双重催化功能，是黑色素代谢和儿茶酚胺的关键酶，并且是白癜风自身免疫的重要抗原。酪氨酸酶能催化L-酪氨酸和L-多巴氧化生成黑色素。酪氨酸酶作为黑色素合成的关键酶，其异常过量表达可导致人体的色素沉着性疾病，果蔬褐变。酪氨酸酶抑制剂可以治疗目前常见的色素沉着皮肤病如雀斑、黄褐斑、老年斑，也被用作食品保鲜剂。酪氨酸酶促进剂可以用于治疗白癜风。酪氨酸酶也与昆虫蜕皮过程中的鞣化作用有关。鉴于酪氨酸酶的广泛应用，国内外很多学者致力于寻找具有特异的、高效的酪氨酸酶抑制剂或促进剂的研究方法，及其作用机理、动力学原理和如何应用。
目前临床上使用的酪氨酸酶抑制剂都有比较大的毒副作用。曲酸和维生素C虽然对酪氨酸酶有较强的抑制作用，但它们相对较不稳定，保质期较短；果酸对人体皮肤有较大的刺激作用，也不受人们的好评；动物胎盘提取液、芦荟提取液成本高而且成分较复杂且易变质，也有一定的不足之处。白癜风目前还没有确定显著疗效的药物,所以酪氨酸酶的抑制剂或促进剂在生物、农学、药学和医学等研究领域有着重要的意义。
从天然药物中寻找有效、低毒、价廉的酪氨酸酶抑制剂或促进剂更是成为目前酪氨酸酶研究的主要方向。传统的酪氨酸酶抑制剂或促进活性筛选方法都要求化合物从中药中分离、提纯出来并且需要足够大的量，通过体内外多种实验方法评价药用样品的活性，但是许多从中药中得到的天然化合物却难以满足这些条件。薄层色谱—生物自显影技术可以弥补以上技术的不足。薄层色谱—生物自显影是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法，具有操作简单、实验耗费低、灵敏度和专属性高以及可以实现对生物活性的快速测定的特点。
SakulnaWangthong等人采用的酪氨酸酶抑制剂筛选方法是以L-酪氨酸为底物。每块板以喷雾法使每平方厘米含20ul的100U-200U/ml的酪氨酸酶和200ul的2×10-3-3×10-3mM的L-酪氨酸，反应10min后显示出效果。其曲酸的最低检测线为0.020ug(WangthongS,TonsiripakdeeI,MonhapholT,etal.PostTLCdevelopingtechniquefortyrosinaseinhibitordetection.BiomedicalChromatography,2007,21(1):94-100)。其不足之处在于：反应灵敏度偏低，反应时间偏长。此外，其采用喷雾法操作不易掌握。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种快速筛选复杂天然产物或者单体化合物中酪氨酸酶抑制剂或促进剂的方法。该方法具有操作简单、实验耗费低、灵敏度和专属性高以及能够在复杂体系中对样品的生物活性进行快速测定的特点。
本发明的技术方案为：采用薄层色谱—生物自显影技术建立酪氨酸酶抑制剂或促进剂的活性筛选方法，该方法能够高通量地筛选不同实验室的不同样品的抑制或促进酪氨酸酶的活性。该方法以色彩图像形式提供结果，形象直观，易于辨认和记忆；该方法以薄层板作为媒介，不受溶剂和样品浓度的限制，因此受试样品的范围比紫外分光光度法更为广泛。
本发明的酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法，基于酪氨酸酶和底物通过酶促反应会产生灰黑色的反应产物——黑色素(melanin)，抑制或促进酪氨酸酶活性的物质正是通过抑制或促进该反应的发生，从而在薄层板上表现为灰黑色背景下的白色或深黑色斑点。
具体而言，本发明提供了一种酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将供试品溶解于有机溶剂中，然后将供试品溶液点样于薄层板上，挥干溶剂，备用；
(2)将步骤(1)得到的薄层板浸渍于酪氨酸酶溶液中，挥干溶剂后再浸渍于1～20mM/L的左旋多巴(L-DOPA)磷酸缓冲盐溶液中，取出薄层板后在20℃～40℃条件下进行酶促反应；
(3)根据酶促反应后薄层板上的斑点颜色筛选供试品。
在一优选例中，所述步骤(1)中还包括将点样于薄层板上的供试品在展开剂中展开的步骤。
在另一优选例中，所述展开剂选自石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸、氨水和醋酸铵中的一种或一种以上。
在另一优选例中，所述供试品溶液的浓度为0.001mg/ml～200mg/ml，所述供试品溶液的点样量为1～20μL。
在另一优选例中，所述薄层板为硅胶板。
在另一优选例中，所述酪氨酸酶溶液可由如下方法制得：
将酪氨酸酶直接溶于pH值为6.0～8.0的20mmol/L的磷酸盐缓冲液，配制成酪氨酸酶浓度为50～300U/mL的酪氨酸酶溶液。
在另一优选例中，所述酶促反应的时间为5～40分钟。
在另一优选例中，所述步骤(3)包括：酶促反应后，若在所述薄层板的灰黑色背景下出现白色斑点，则所述供试品为酪氨酸酶抑制剂；若在所述薄层板的灰黑色背景下出现深黑色斑点，则所述供试品为酪氨酸酶促进剂。
相对于现有技术，本发明的方法具有如下优点：
(1)操作简单，实验耗费低，不需要复杂的仪器和设备；
(2)以色彩图像形式提供结果，形象直观，易于辨认和记忆；
(3)以薄层板作为媒介，不受溶剂和样品浓度的限制，因此受试样品的种类比紫外分光光度法更为广泛；
(4)以反应自身为底色，实验步骤简单，误差因素少；
(5)薄层色谱具有分离功能，对于混合物或者植物提取物，能够先对其进行分离后再检测。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
图1为实施例1中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对曲酸的活性检测结果图。
图2为实施例2中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对不同浓度曲酸活性检测的结果图(1为效果图，2为扫描结果图，3数据图)。
图3为实施例3中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对维生素C的活性检测结果图(1为曲酸样品，2为维生素C样品)。
图4为实施例4中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对木犀草素的活性检测结果图(1为曲酸样品，2为木犀草素样品)。
图5为实施例5中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对白茯苓的活性检测结果图(1为曲酸样品，2为白茯苓样品)。
图6为实施例6中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对红景天乙酸乙酯部分提取物的筛选结果图。
图7为实施例7中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对曲酸、白茯苓、维生素C的活性检测的不同时间及不同底物的结果图。
图8为实施例8中利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对曲酸的活性检测的不同时间及不同底物的扫描数据结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利申请说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例1
1.1药物与试剂
曲酸(K3125-5G，LOT#BCBG6172V，购自sigma)，酪氨酸酶(T3824-50KU，LOT#SLBG4386V，购自sigma)，L-DOPA(V90425-100G，LOT#WXBB1676V，购自sigma)，磷酸二氢钾(批号F20100202，购自国药集团化学试剂有限公司)，磷酸氢二钾(批号F20100118，购自国药集团化学试剂有限公司)，95％乙醇(批号F20130723，购自国药集团化学试剂有限公司)
1.2仪器
超级恒温槽(上海比朗仪器有限公司)，电子分析天平(BP211D，Sartorius，德国)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A型，上海一恒科技有限公司)，薄层色谱成像仪(CAMAGREPROSTAR3，瑞士)
1.3实验方法
1.3.1溶液的配制
缓冲液：配制酶促反应缓冲液：称取磷酸氢二钾4.5644g，蒸馏水定容至1L和磷酸二氢钾2.7218g，蒸馏水定容至1L。取磷酸二氢钾16ml和磷酸氢二钾84ml配制成PH＝7.5的磷酸缓冲液。在2-10℃下保存。
酪氨酸酶溶液：称取酪氨酸酶粉末适量，精密称定，用PH7.5的磷酸盐缓冲液配制成200U/ml的酶溶液，临用前配制。
L-DOPA溶液：称取L-DOPA粉末适量，精密称定，用PH7.5的磷酸盐缓冲液配制成1mM/L的L-DOPA溶液，临用前配制。
样品溶液：称取曲酸粉末适量，精密称定，用95％乙醇配制成0.085mg/ml的曲酸溶液，在2-10℃下保存。
利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对曲酸的活性进行测定。
在3cm×4cm的硅胶板上，样品溶液点3个点，每个点隔1cm，点样量为2μL，吹干样品溶剂。然后将硅胶板在200U/ml的酪氨酸酶溶液中浸渍，拭去硅胶板表面多余液滴，再在1mM/L的L-DOPA中浸渍，将硅胶板置于35℃水浴的条件下，在35℃水浴的条件下反应35分钟，具有抑制酪氨酸酶活性的物质抑制了反应的发生，在硅胶板上表现为灰黑色背景下的白色斑点。结果见附图1。
曲酸为目前公认的酪氨酸酶抑制剂，采用L-DOPA为底物的薄层色谱生物自显影方法，曲酸样品的薄层板在灰黑色背景上显示了白色斑点，说明曲酸具有明显的抑制酪氨酸酶的活性(见图1)，由此证明本发明的方法可以用于筛选酪氨酸酶抑制剂。在下面的实例中以曲酸作为阳性药。
实施例2
2.1药物与试剂
曲酸(K3125-5G，LOT#BCBG6172V，购自sigma)，酪氨酸酶(T3824-50KU，LOT#SLBG4386V，购自sigma)，L-DOPA(V90425-100G，LOT#WXBB1676V，购自sigma)，磷酸二氢钾(批号F20100202，购自国药集团化学试剂有限公司)，磷酸氢二钾(批号F20100118，购自国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(批号20140513，购自国药集团化学试剂有限公司)。乙醇95％(批号F20130723，购自国药集团化学试剂有限公司)。
2.2仪器
超级恒温槽(上海比朗仪器有限公司)，电子分析天平(BP211D，Sartorius，德国)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A型，上海一恒科技有限公司)，薄层色谱成像仪(CAMAGREPROSTAR3，瑞士)，薄层色谱扫描仪(CAMAGSCANNER3，瑞士)。
2.3实验方法
2.3.1溶液的配制
缓冲液：配制酶促反应缓冲液：称取磷酸氢二钾4.5644g，蒸馏水定容至1L和磷酸二氢钾2.7218g，蒸馏水定容至1L。取磷酸二氢钾28.0ml和磷酸氢二钾72.0ml配制成PH＝7.2的磷酸缓冲液。在2-10℃下保存。
酪氨酸酶溶液：称取酪氨酸酶粉末适量，精密称定，用PH7.2的磷酸盐缓冲液配制成147U/ml的酶溶液，临用前配制。
L-DOPA溶液：称取L-DOPA粉末适量，精密称定，用PH7.2的磷酸盐缓冲液配制成2.3mM/L的L-DOPA溶液，临用前配制。
样品溶液：称取曲酸粉末适量，精密称定，用95％乙醇配制成0.001mg/ml、0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml和0.01mg/ml的曲酸溶液，在2-10℃下保存。
利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对曲酸的活性进行测定。
在3cm×4cm的硅胶板上点6个点，每个浓度的样品溶液点1个点，每个点隔1cm，每个点点样量为1μL，吹干样品溶剂，将硅胶板在147U/ml的酪氨酸酶溶液中浸渍，拭去硅胶板表面多余液滴，再在2.3mM/L的L-DOPA中浸渍，将硅胶板置于24℃水浴的条件下反应17分钟。
具有抑制酪氨酸酶活性的物质抑制了反应的发生，在硅胶板上表现为灰黑色背景下的白色斑点。550nm波长下扫描，不同浓度扫描峰面积结果见附图2。从附图2中可见1-10ng的曲酸都有明显酪氨酸酶抑制活性，其中当曲酸为1ng时，扫描面积为78.8，信噪比大于3。由此可见本发明的方法的检测限为1ng，比文献方法低20倍。
实施例3
3.1药物与试剂
L-维生素C(A7506-100G，LOT#SLBB4329V，购自sigma)，曲酸(K3125-5G，LOT#BCBG6172V，购自sigma)，酪氨酸酶(T3824-50KU，LOT#SLBG4386V，购自sigma)，L-DOPA(V90425-100G，LOT#WXBB1676V，购自sigma)，磷酸二氢钾(批号F20100202，购自国药集团化学试剂有限公司)，磷酸氢二钾(批号F20100118，购自国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(批号20140513，购自国药集团化学试剂有限公司)。乙醇95％(批号F20130723，购自国药集团化学试剂有限公司)。
3.2仪器
超级恒温槽(上海比朗仪器有限公司)，电子分析天平(BP211D，Sartorius，德国)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A型，上海一恒科技有限公司)，薄层色谱成像仪(CAMAGREPROSTAR3，瑞士)。
3.3实验方法
3.3.1溶液的配制
缓冲液：配制酶促反应缓冲液：称取磷酸氢二钾4.5644g，蒸馏水定容至1L和磷酸二氢钾2.7218g，蒸馏水定容至1L。取磷酸二氢钾87.7ml和磷酸氢二钾12.3ml配制成PH＝6.0的磷酸缓冲液。在2-10℃下保存。
酪氨酸酶溶液：称取酪氨酸酶粉末适量，精密称定，用PH6.0的磷酸盐缓冲液配制成250U/ml的酶溶液，临用前配制。
L-DOPA溶液：称取L-DOPA粉末适量，精密称定，用PH6.0的磷酸盐缓冲液配制成5mM/L的L-DOPA溶液，临用前配制。
样品溶液：称取维生素C粉末适量，精密称定，用甲醇配制成0.211mg/ml的维生素C溶液。
阳性药溶液：称取曲酸粉末适量，精密称定，用95％乙醇配制成0.071mg/ml的曲酸溶液，在2-10℃下保存。
利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对L-维生素C的活性进行测定。
在3cm×4cm的硅胶板上，样品溶液点3个点，阳性药溶液点3个点，每个点隔1cm，每个点点样量3μL，吹干样品溶剂。将硅胶板在250U/ml的酪氨酸酶溶液中浸渍，拭去硅胶板表面多余液滴，再在5mM/L的L-DOPA中浸渍，将硅胶板置于25℃水浴的条件下，在25℃水浴的条件下反应15分钟，具有抑制酪氨酸酶活性的物质抑制了反应的发生，在硅胶板上表现为灰黑色背景下的白色斑点。结果见附图3。
实施例4
4.1药物与试剂
木犀草素(购自上海中药标准化中心)，曲酸(K3125-5G，LOT#BCBG6172V,购自sigma)，酪氨酸酶(T3824-50KU，LOT#SLBG4386V，购自sigma)，L-DOPA(V90425-100G，LOT#WXBB1676V，购自sigma)，磷酸二氢钾(批号F20100202，购自国药集团化学试剂有限公司)，磷酸氢二钾(批号F20100118，购自国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(批号20140513，购自国药集团化学试剂有限公司)。乙醇95％(批号F20130723，购自国药集团化学试剂有限公司)。
4.2仪器
超级恒温槽(上海比朗仪器有限公司)，电子分析天平(BP211D，Sartorius，德国)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A型，上海一恒科技有限公司)，薄层色谱成像仪(CAMAGREPROSTAR3，瑞士)。
4.3实验方法
4.3.1溶液的配制
缓冲液：配制酶促反应缓冲液：称取磷酸氢二钾4.5644g，蒸馏水定容至1L和磷酸二氢钾2.7218g，蒸馏水定容至1L。取磷酸二氢钾68.5ml和磷酸氢二钾31.5ml配制成PH＝6.5的磷酸缓冲液。在2-10℃下保存。
酪氨酸酶溶液：称取酪氨酸酶粉末适量，精密称定，用PH6.5的磷酸盐缓冲液配制成50U/ml的酶溶液，临用前配制。
L-DOPA溶液：称取L-DOPA粉末适量，精密称定，用PH6.5的磷酸盐缓冲液配制成16mM/L的L-DOPA溶液，临用前配制。
样品溶液：称取木犀草素粉末适量，精密称定，用甲醇配制成0.229mg/ml的木犀草素溶液。
阳性药溶液：称取曲酸粉末适量，精密称定，用95％乙醇配制成0.099mg/ml的曲酸溶液，在2-10℃下保存。
利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对木犀草素的活性进行测定。
在3cm×4cm的硅胶板上，样品溶液点3个点，阳性药溶液点3个点，每个点隔1cm，每个点点样量4μL，吹干样品溶剂。将硅胶板在50U/ml的酪氨酸酶溶液中浸渍，拭去硅胶板表面多余液滴，再在16mM/L的L-DOPA中浸渍，将硅胶板置于20℃水浴的条件下，在20℃水浴的条件下反应20分钟，具有抑制酪氨酸酶活性的物质促进了反应的发生，在硅胶板上表现为灰黑色背景下的深黑色斑点。结果见附图4。
木犀草素为目前已知的酪氨酸酶促进剂，采用L-DOPA为底物的薄层色谱生物自显影方法，木犀草素样品的薄层板在灰黑色背景上显示了深黑色斑点，说明木犀草素具有明显的促进酪氨酸酶活性(见图4)，由此证明本发明的方法不仅可用于筛选酪氨酸酶抑制剂，还可以用于筛选酪氨酸酶促进剂。
实施例5
5.1药物与试剂
白茯苓购自康桥饮片厂，曲酸(K3125-5G，LOT#BCBG6172V，购自sigma)，酪氨酸酶(T3824-50KU，LOT#SLBG4386V，购自sigma)，L-DOPA(V90425-100G，LOT#WXBB1676V，购自sigma)，磷酸二氢钾(批号F20100202，购自国药集团化学试剂有限公司)，磷酸氢二钾(批号F20100118，购自国药集团化学试剂有限公司)，乙醇95％(批号F20130723，购自国药集团化学试剂有限公司)
5.2仪器
超级恒温槽(上海比朗仪器有限公司)，电子分析天平(BP211D，Sartorius，德国)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A型，上海一恒科技有限公司)，薄层色谱成像仪(CAMAGREPROSTAR3，瑞士)。
5.3实验方法
5.3.1溶液的配制
缓冲液：配制酶促反应缓冲液：称取磷酸氢二钾4.5644g，蒸馏水定容至1L和磷酸二氢钾2.7218g，蒸馏水定容至1L。取磷酸二氢钾38ml和磷酸氢二钾62ml配制成PH＝7.0的磷酸缓冲液。在2-10℃下保存。
酪氨酸酶溶液：称取酪氨酸酶粉末适量，精密称定，用PH7.0的磷酸盐缓冲液配制成100U/ml的酶溶液，临用前配制。
L-DOPA溶液：称取L-DOPA粉末适量，精密称定，用PH7.0的磷酸盐缓冲液配制成10mM/L的L-DOPA溶液，临用前配制。
样品溶液：称取白茯苓药材适量，精密称定，用10倍50％乙醇溶液超声30min，过滤，滤液旋干，得白茯苓提取物。称取白茯苓提取物适量，精密称定，用50％的乙醇配制成120mg/ml的白茯苓提取物溶液。
阳性药溶液：称取曲酸粉末适量，精密称定，用95％乙醇配制成0.114mg/ml的曲酸溶液，在2-10℃下保存。
利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对上述样品的活性进行测定。
在3cm×4cm的硅胶板上，样品溶液点3个点，阳性药溶液点3个点，每个点隔1cm，每个点点样量5μL，吹干样品溶剂。将硅胶板在100U/ml的酪氨酸酶溶液中浸渍，拭去硅胶板表面多余液滴，再在10mM/L的L-DOPA中浸渍，将硅胶板置于30℃水浴的条件下，在30℃水浴的条件下反应30分钟，具有抑制酪氨酸酶活性的物质抑制了反应的发生，在硅胶板上表现为灰黑色背景下的白色斑点。结果见附图5。
实施例6
6.1药物与试剂
红景天药材(批号140330-1，产地：西藏，购自上海虹桥)，酪氨酸酶(T3824-50KU，LOT#SLBG4386V，购自sigma)，L-DOPA(V90425-100G，LOT#WXBB1676V，购自sigma)，磷酸二氢钾(批号F20100202，购自国药集团化学试剂有限公司)，磷酸氢二钾(批号F20100118，购自国药集团化学试剂有限公司)，乙酸乙酯(批号20140110，购自国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(批号20140513，购自国药集团化学试剂有限公司)。
6.2仪器
超级恒温槽(上海比朗仪器有限公司)，电子分析天平(BP211D，Sartorius，德国)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A型，上海一恒科技有限公司)，薄层色谱成像仪(CAMAGREPROSTAR3，瑞士)。超声仪(KQ-250DB型号，工作频率40KHz，昆山市超声仪器有限公司)
6.3实验方法
6.3.1溶液的配制
缓冲液：配制酶促反应缓冲液：称取磷酸氢二钾4.5644g，蒸馏水定容至1L和磷酸二氢钾2.7218g，蒸馏水定容至1L。取磷酸二氢钾5.3ml和磷酸氢二钾94.7ml配制成PH＝8.0的磷酸缓冲液。在2-10℃下保存。
酪氨酸酶溶液：称取酪氨酸酶粉末适量，精密称定，用PH8.0的磷酸盐缓冲液配制成300U/ml的酶溶液，临用前配制。
L-DOPA溶液：称取L-DOPA粉末适量，精密称定，用PH8.0的磷酸盐缓冲液配制成20mM/L的L-DOPA溶液，临用前配制。
样品溶液：称取红景天药材适量，精密称定，用20倍甲醇超声30min，滤过，旋干。用适量水溶解提取物，用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯部分，旋干，称取乙酸乙酯部分提取物适量，精密称定，用乙酸乙酯配制成10mg/ml的红景天乙酸乙酯部分的样品。
阳性药溶液：称取曲酸粉末适量，精密称定，用95％乙醇配制成0.128mg/ml的曲酸溶液，在2-10℃下保存。
展开：将红景天样品溶液点于硅胶板上，点样量为5μL，带宽6mm。展开剂为乙酸乙酯:甲醇(7:1，体积比)，在层析缸中展开后，挥干溶剂。
利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对红景天乙酸乙酯部分具有酪氨酸酶抑制或促进作用的成分进行筛选。
将硅胶板在300U/ml的酪氨酸酶溶液中浸渍，拭去硅胶板表面多余液滴，再在20mM/L的L-DOPA中浸渍，拭去硅胶板表面多余液滴，将硅胶板置于40℃水浴的条件下，在40℃水浴的条件下反应40分钟，具有抑制酪氨酸酶活性的物质抑制了反应的发生，在硅胶板上表现为灰黑色背景下的白色斑点。结果见附图6。
实施例7
7.1药物与试剂
白茯苓购自康桥饮片厂，L-维生素C(A7506-100G，LOT#SLBB4329V，购自sigma)，曲酸(K3125-5G，LOT#BCBG6172V，购自sigma)，酪氨酸酶(T3824-50KU，LOT#SLBG4386V，购自sigma)，L-DOPA(V90425-100G，LOT#WXBB1676V，购自sigma)，L-酪氨酸(批号20131025，62023534，购自国药集团化学试剂有限公司)，磷酸二氢钾(批号F20100202，购自国药集团化学试剂有限公司)，磷酸氢二钾(批号F20100118，购自国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(批号20140513，购自国药集团化学试剂有限公司)。乙醇95％(批号F20130723，购自国药集团化学试剂有限公司)。
7.2仪器
超级恒温槽(上海比朗仪器有限公司)，电子分析天平(BP211D，Sartorius，德国)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A型，上海一恒科技有限公司)，薄层色谱成像仪(CAMAGREPROSTAR3，瑞士)。
7.3实验方法
7.3.1溶液的配制
缓冲液：配制酶促反应缓冲液：称取磷酸氢二钾4.5644g，蒸馏水定容至1L和磷酸二氢钾2.7218g，蒸馏水定容至1L。取磷酸二氢钾85.0ml和磷酸氢二钾15.0ml配制成PH＝6.1的磷酸缓冲液。在2-10℃下保存。
酪氨酸酶溶液：称取酪氨酸酶粉末适量，精密称定，用PH6.1的磷酸盐缓冲液配制成117U/ml的酶溶液，临用前配制。
L-DOPA溶液：称取L-DOPA粉末适量，精密称定，用PH6.1的磷酸盐缓冲液配制成2.1mM/L的L-DOPA溶液，临用前配制。
L-酪氨酸溶液：称取L-酪氨酸粉末适量，精密称定，用PH6.1的磷酸盐缓冲液配制成2.1×10-3mM的L-酪氨酸溶液，临用前配制。
样品溶液：称取白茯苓药材适量，精密称定，用10倍50％乙醇溶液超声30min，过滤，滤液旋干，得白茯苓提取物。称取白茯苓提取物适量，精密称定，用50％的乙醇配制成180mg/ml的白茯苓提取物溶液。称取维生素C粉末适量，精密称定，用甲醇配制成0.26mg/ml的维生素C溶液。
阳性药溶液：称取曲酸粉末适量，精密称定，用95％乙醇配制成0.057mg/ml的曲酸溶液，在2-10℃下保存。
点样：每个样品点一块板，每块板点三个点，每个点点样量7μL。
利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对上述样品的活性进行测定。
以L-酪氨酸为底物的反应：将每块硅胶板(3cm×4cm)先喷240ul的117U/ml的酪氨酸酶溶液，再喷2400ul的2.1×10-3mM的酪氨酸溶液。将硅胶板置于22℃水浴的条件下反应，5分钟后，观察到在灰黑色背景下白色斑点。
以L-DOPA为底物的反应：将硅胶板在117U/ml的酪氨酸酶溶液中浸渍，拭去硅胶板表面多余液滴，再在2.1mM/L的L-DOPA中浸渍，将硅胶板置于22℃水浴的条件下反应，5分钟内均可观察到灰黑色背景下白色斑点。
具有抑制酪氨酸酶活性的物质抑制了反应的发生，在硅胶板上表现为灰黑色背景下的白色斑点。在分别在1分钟，3分钟，5分钟，10分钟，15分钟时拍照，并对图片进行了模拟扫描，结果见附图7和表1。
表1不同方法筛选抑制酪氨酸酶活性的薄层扫描峰面积
从附图7和表1可见，将本发明的方法和文献方法进行比对，无论样品是曲酸、Vc、还是白茯苓，本发明的方法都能快速观察到实验结果，可见此法快速、灵敏。尤其是活性较强的化合物在1分钟就可以看出抑制效果，大大节省了筛选时间，提高了效率。
实施例8
8.1药物与试剂
曲酸(K3125-5G，LOT#BCBG6172V，购自sigma)，酪氨酸酶(T3824-50KU，LOT#SLBG4386V，购自sigma)，L-DOPA(V90425-100G，LOT#WXBB1676V，购自sigma)，L-酪氨酸(批号20131025，62023534，购自国药集团化学试剂有限公司)，磷酸二氢钾(批号F20100202，购自国药集团化学试剂有限公司)，磷酸氢二钾(批号F20100118，购自国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(批号20140513，购自国药集团化学试剂有限公司)。乙醇95％(批号F20130723，购自国药集团化学试剂有限公司)。
8.2仪器
超级恒温槽(上海比朗仪器有限公司)，电子分析天平(BP211D，Sartorius，德国)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A型，上海一恒科技有限公司)，薄层色谱成像仪(CAMAGREPROSTAR3，瑞士)，薄层色谱扫描仪(CAMAGSCANNER3，瑞士)。
8.3实验方法
8.3.1溶液的配制
缓冲液：配制酶促反应缓冲液：称取磷酸氢二钾4.5644g，蒸馏水定容至1L和磷酸二氢钾2.7218g，蒸馏水定容至1L。取磷酸二氢钾33.0ml和磷酸氢二钾67.0ml配制成PH＝7.1的磷酸缓冲液。在2-10℃下保存。
酪氨酸酶溶液：称取酪氨酸酶粉末适量，精密称定，用PH7.1的磷酸盐缓冲液配制成134U/ml的酶溶液，临用前配制。
L-DOPA溶液：称取L-DOPA粉末适量，精密称定，用PH7.1的磷酸盐缓冲液配制成2.2mM/L的L-DOPA溶液，临用前配制。
L-酪氨酸溶液：称取L-酪氨酸粉末适量，精密称定，用PH7.1的磷酸盐缓冲液配制成2.2×10-3mM的L-酪氨酸溶液，临用前配制。
样品溶液：称取曲酸粉末适量，精密称定，用95％乙醇配制成0.028mg/ml的曲酸溶液，在2-10℃下保存。
点样：点上述样品溶液，每块板上点3个点，每个点点样量8μL。
利用酪氨酸酶—薄层色谱生物自显影技术对上述样品的活性进行测定。
以L-酪氨酸为底物的反应：将每块硅胶板(3cm×4cm)先喷240ul的137U/ml的酪氨酸酶溶液，再喷2400ul的2.2×10-3mM的酪氨酸溶液。将硅胶板置于23℃水浴的条件下反应10分钟可见抑制效果，20-25分钟反应才稳定可以进行峰面积扫描。
以L-DOPA为底物的反应：将硅胶板在137U/ml的酪氨酸酶溶液中浸渍，拭去硅胶板表面多余液滴，再在2.2mM/L的L-DOPA中浸渍，将硅胶板置于23℃水浴的条件下反应5分钟可见抑制效果，10-15分钟反应稳定可以进行峰面积扫描。
具有抑制酪氨酸酶活性的物质抑制了反应的发生，在硅胶板上表现为灰黑色背景下的白色斑点。用波层色谱扫描仪在475nm下扫描，不同时间扫描峰面积结果见附图7和表2。
表2不同方法测定曲酸抑制酪氨酸酶活性的薄层扫描峰面积
从附图8和表2可见，以曲酸样品为例，本发明的方法不仅更快速地显示出抑制效果(本方法5min有峰面积，文献方法10min有峰面积)，而且本发明的方法在10-15分钟达到稳定，文献方法在20-25分钟才达到稳定。可见本发明的方法高效、灵敏。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。
Claims (8)
1.一种酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将供试品溶解于有机溶剂中，然后将供试品溶液点样于薄层板上，挥干溶剂，备用；
(2)将步骤(1)得到的薄层板浸渍于酪氨酸酶溶液中，挥干溶剂后再浸渍于1～20mmol/L的左旋多巴磷酸缓冲盐溶液中，取出薄层板后在20℃～40℃下进行酶促反应；
(3)根据酶促反应后薄层板上的斑点颜色筛选供试品。
2.如权利要求1所述的酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中还包括将点样于薄层板上的供试品在展开剂中展开的步骤。
3.如权利要求2所述的酪氨酸酶抑制或促进剂的筛选方法，其特征在于，所述展开剂选自石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸、氨水和醋酸铵中的一种或一种以上。
4.如权利要求1或2或3所述的酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，其特征在于，所述供试品溶液的浓度为0.001mg/ml～200mg/ml，所述供试品溶液的点样量为1～20μL。
5.如权利要求1或2或3所述的酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，其特征在于，所述薄层板为硅胶板。
6.如权利要求1或2或3所述的酪氨酸酶抑制或促进剂的筛选方法，其特征在于，所述酪氨酸酶溶液可由如下方法制得：
将酪氨酸酶直接溶于pH值为6.0～8.0的20mmol/L的磷酸盐缓冲液，配制成酪氨酸酶浓度为50～300U/mL的酪氨酸酶溶液。
7.如权利要求1或2或3所述的酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，其特征在于，所述酶促反应的时间为5～40分钟。
8.如权利要求1或2或3所述的酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：酶促反应后，若在所述薄层板的灰黑色背景下出现白色斑点，则所述供试品为酪氨酸酶抑制剂；若在所述薄层板的灰黑色背景下出现深黑色斑点，则所述供试品为酪氨酸酶促进剂。
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