KR101771695B1 - 스피루리나 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스피루리나 추출물 및 이의 성분인 알로피코시아닌(Allophycocyanin, APC), 알-피코에리스린(R-phycoerythrin, R-PE), 씨-피코시아닌(C-phycocyanin, C-PC)은 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로써, 구체적으로 본 발명의 스피루리나 추출물 및 이의 성분인 알로피코시아닌, 알-피코에리스린, 씨-피코시아닌은 세포에 대한 독성이 없고 지방분해 효과가 뛰어나며 지방축적억제 효과를 나타내므로, 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물, 및 개선용 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

스피루리나 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of obesity comprising Spirulina maxima as an active ingredient}

본 발명은 스피루리나(Spirulina maxima) 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

식생활 환경의 향상과 더불어 영양섭취가 양호해지면서 사람들의 평균수명이 연장되고 있으나, 식생활의 서구화, 음식의 과다 섭취, 육체적 운동 부족 등으로 말미암아 비만 환자가 매년 급속히 증가되고 있다.

비만은 주요 성인병들의 위험요소(risk factor)로서, 고혈압, 당뇨병, 동맥경화증, 뇌졸증, 심장마비 및 각종 종양 등과 같은 성인병의 발생에 관여하고(Wilson et al., 2005, Circulation 112: 3066-3072), 병의 진행을 촉진시키기도 하는데, 비만으로 인해 성인병에 걸릴 위험은 정상인보다 3∼6배 높다고 알려져 있다. 따라서, 비만은 단순히 외모상의 문제만이 아니라, 건강에 직결되는 중대한 문제가 아닐 수 없다. 이러한 비만의 예방은 현 상태의 식사량은 유지하면서 운동량을 늘리는 것이 중요하며, 비만이 되었을 경우에는 원인을 파악하고 거기에 맞는 적절한 식이요법을 통하여 적정 체중을 유지하면서, 신체가 정상적인 신진대사를 할 수 있도록 하는 것이 바람직하다.

비만이 현대사회의 문제로 대두되면서, 다이어트란 말은 현대를 살아가는 많은 사람들에게 관심을 끌고 있다. 비만자들이 체중감량에 기울이는 관심과 노력이 높다는 점을 이용하여 지금까지 소개된 수 많은 다이어트 방법들이 있는데, 단식 및 금식, 야채효소, 지방 흡인술, 설사약, 이뇨제, 사과 다이어트, 포도 다이어트, 황제 다이어트, 식이섬유 섭취, 뜸, 원적외선 사우나복, 토닝 시스템 등이 있다. 그러나, 다이어트에 대한 정확하고 과학적인 원인 파악 및 인체 신진대사의 기전과 영양 생리학적으로의 접근은 등한시 한 채, 무분별하게 체중감량의 효과에만 치중함으로써, 영양소 섭취의 불균형을 초래하게 되어 신진대사가 정상적으로 이루어지지 못한 문제점이 있다.

한편, 체중감량을 위한 방법으로 암페타민 유도체 등 식욕 억제제를 이용한 약물요법이 있는데, 이러한 약물요법은 식욕억제 능력이 지속되지 못하고 일시적인 작용으로 두통, 불면증, 혈압상승, 불면증, 초조, 긴장감, 환각증세, 현기증, 시력 저하등의 부작용을 유발시키는 문제점이 있다. 또한, 이뇨제를 사용하여 체중을 감량 및 조절하는 경우도 있지만, 이 방법 또한 신장에 대한 중독성과 심장마비, 구토등을 수반하는 부작용을 일으키는 문제점이 있다. 이 외에도, 뇌의 중추에 작용하여 식욕을 억제하게 하는 중추성 식욕 억제제 가 있는데, 이는 감량효과는 뛰어나지만 어느 정도 시간이 지나면 약에 대한 내성이 생겨서 이 후에는 몸무게가 거의 줄지 않으며, 두통, 불면증, 어지러움 등의 부작용을 초래하는 경우가 많다.

따라서, 인위적인 방법으로 합성된 치료제의 형태가 아닌 종래에 우리가 섭취하고 있는 생약재 등의 형태로 공급할 수 있는 다이어트 조성물이 개발될 필요가 있다고 할 수 있다.

지방(adipose) 조직은 지방세포(adipocyte)로 이루어진 소성결합조직(loose connective tissue)으로 구성되어있으며, 에너지 항상성을 조절하는 중요한 대사 기관이다(Rosen et al., 2000, Genes Dev . 14: 1293-307). 구체적으로, 지방세포는 아디포킨(adipokine)을 분비하여 글루코스(glucose) 대사, 노화, 염증성(inflammatory) 반응 및 생식 기능 등과 같은 생리적 과정을 조절한다. 지방세포의 분화는 에너지 소비보다 섭취가 많은 에너지 취득(positive energy balance)을 통하여 비만으로 발전하도록 기여한다(Hausman et al., 2001, Obes . Rev . 2: 239-254).

지방세포에서 지방산(fatty acid)은 트리글리세라이드(triglyceride)로 저장되어 에너지 균형을 유지한다. 지질분해(lipolysis)는 지방세포에 축적된 지방을 베타산화 (beta-oxidation)을 통해 에너지로 생산하는 과정이다. 지방세포에는 중성지방 (triglyceride)이 글리세롤에 세 개의 지방산이 결합된 형태로 존재하다가 베타산화가 필요하다는 신호(예를 들어 에피네프린)를 세포막에서 받아들이면 일련의 과정을 통해 유리지방산과 글리세롤을 생성한다. 따라서 유리지방산과 글리세롤은 지질분해의 중요한 지표가 된다.

스피루리나(Spirulina maxima)는 염분과 알카리성이 높은 열대지방, 예를 들면, 아프리카의 챠드 호수 및 멕시코의 텍스코코 호수에서 번식하는 미세조류의 일종이며, 그 세포 속에는 다량의 클로로필과 피코시아닌이 들어있어서 태양광선을 흡수하여 탄소동화작용을 활발하게 수행하여 자라고 있다. 이러한 색소들이 들어있어서 청남색을 띠고 있으므로 옛날부터 남조류(blue-green algae)로 분류했었다.

전자현미경의 발달로 미생물의 세포구조가 자세히 밝혀지면서 녹조류나 갈조류의 구조는 고등 식물의 구조와 다른 점을 발견하였다. 즉 녹조류의 구조는 고등식물의 구조와 동일하게 진핵 세포(eukaryote)구조를 가지고 있는 반면에, 남조류는 세균의 구조와 비슷한 원핵세포(prokaryote)구조를 가진 것이 밝혀짐에 따라, 1960년대 초부터 일부 미생물학자들이 남조류는 조류보다는 세균에 가까우므로, 세균류에 포함시켜야 한다는 주장이 나오게 되었다. 현재는 이 주장을 받아들여 청 남세 균류(blue-green bacteria)로 분류하고 있다. 그러나 산업계에서는 옛날 관행대로 미세조류(micro-algae)라 부르고 있다.

스피루리나는 형상이 스프링처럼 나선(Spiral)모양을 하고 있는데서 붙여진 이름으로 DNA가 2중 나선형인 점을 고려할 때 그 형태가 원시적이고 식물과 동물의 중간 성질을 가지고 있는 시아노박테리아(cyanobacteria)에 속하는 나선형의 세균이다. 스피루리나는 사람이 먹을 수 있는 미생물로 단백질이 55-70%, 지방이 6-9%, 탄수화물이 15-20% 함유되어 있고 다량의 무기질, 비타민, 섬유질 및 색소 성분을 함유하고 있다. 스피루리나는 단백질의 함량이 높을 뿐 아니라 8가지 필수아미노산을 포함하고 있으며 지방성분 중에는 지방산(free-fatty acid) 가 70-80%에 달하고 리놀레산(linoleic acid), γ-리놀렌산(γ-linolenic acid)등의 지방산이 큰 비중을 차지하고 있다. 스피루리나의 탄수화물 함유량은 적지만 주로 람노스와 글리코겐으로 구성되어 있어 인슐린의 도움없이 흡수되어 당뇨환자의 에너지원으로 이용될 수 있다. 현지인들은 오랫동안 이 미세조류를 채취하여, 식용으로 사용해 왔고 영양학적 연구결과 그 단백질의 높은 함량과 아미노산을 비롯한 각종 영양소 성분조성이 인체의 건강에 매우 유익한 성분들로 되어있음을 알았다. 따라서, 스피루리나는 콜레스테롤 수치 저하 효과가 있으며, 당뇨와 빈형, 스트레스, 위염, 위궤양, 암 등에 대한 예방 효과 및 개선 효과가 있음을 알게 되었다.

이에, 본 발명자들은 비만 예방 및 치료를 위한 조성물을 개발하기 위해 노력한 결과, 스피루리나가 중성지방 분해를 촉진하고 지방 축적을 억제하는 효과를 나타냄을 확인함으로써, 상기 스피루리나 추출물을 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 스피루리나(Spirulina maxima) 추출물 및 스피루리나 추출물로부터 분리된 알로피코시아닌(Allophycocyanin, APC), 알-피코에리스린(R-phycoerythrin, R-PE), 또는 씨-피코시아닌(C-phycocyanin, C-PC)을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물, 및 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스피루리나 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 스피루리나 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 알로피코시아닌, 알-피코에리스린 또는 씨-피코시아닌을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 알로피코시아닌, 알-피코에리스린 또는 씨-피코시아닌을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 스피루리나(Spirulina maxima) 추출물 및 스피루리나 추출물로부터 분리된 알로피코시아닌(Allophycocyanin, APC), 알-피코에리스린(R-phycoerythrin, R-PE), 또는 씨-피코시아닌(C-phycocyanin, C-PC)은 중성지방 분해를 촉진하고 지방 축적을 억제하는 효과를 나타내므로, 비만 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 MTT 분석을 통하여 스피루리나 추출물의 농도에 따른 세포생존율(Cell Viability)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 완전히 분화시킨 후 스피루리나 추출물을 농도별로 처리하여 세포 내 중성지방 양을 측정하여 단백질 양으로 나누어 준 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 완전히 분화시킨 후 스피루리나 추출물의 농도별로 처리하여 세포 내 중성지방의 분해에 의한 글리세롤의 양을 나타낸 도이다.
도 4는 알로피코시아닌(Allophycocyanin, APC), 알-피코에리스린(R-phycoerythrin, R-PE), 씨-피코시아닌(C-phycocyanin, C-PC)의 농도에 따른 세포생존율(Cell Viability)을 MTT 분석을 통하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 알로피코시아닌, 알-피코에리스린, 씨-피코시아닌의 농도에 따른 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화 및 지방 축적에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 6은 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 완전히 분화시킨 후 알로피코시아닌 및 씨-피코시아닌의 농도에 따른 세포생존율을 MTT 분석을 통하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 완전히 분화시킨 후 알로피코시아닌, 및 씨-피코시아닌의 농도에 따른 세포 내 중성지방 양을 측정하여 단백질 양으로 나누어 준 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 완전히 분화시킨 후 알로피코시아닌, 씨-피코시아닌의 농도에 따른 세포 내 중성지방의 분해에 의한 글리세롤 양을 배지에서 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 스피루리나(Spirulina maxima) 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 스피루리나 추출물은 알로피코시아닌(allophycocyanin; APC), 알-피코에리스린(R-phycoerythrin; R-PE) 및 씨-피코시아닌(C-phycocyanin; C-PC)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 스피루리나 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다:

1) 스피루리나에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압농축한 후 건조하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 스피루리나는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한없이 사용할 수 있다.

상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C₁ 내지 C₂ 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 감압고온추출, 열탕추출, 환류추출, 열수추출, 냉침추출, 상온추출, 초음파추출 또는 증기추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 스피루리나 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 30 내지 100℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 2 내지 48시간인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 2 내지 5회인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 스피루리나 추출물을 이용하여 3T3-L1 지방전구 세포에서 MTT 분석을 통하여 세포에 대한 독성을 측정한 결과, 스피루리나 추출물 최고농도인 1000 ㎍/㎖에서도 세포독성이 관찰되지 않음을 확인하였다(도 1 참조). 또한, 스피루리나 추출물에 의한 지방분해 효과를 조사한 결과, 중성지방인 트리글리세리드(triglyceride) 양을 감소시키는 것을 확인하였고(도 2 참조), 배지 내 글리세롤의 양을 증가시키는 것을 확인하였다(도 3 참조).

따라서, 스피루리나 추출물은 세포에 대한 독성이 없고 지방분해 효과가 뛰어나므로, 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 약학적 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 본 발명의 추출물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비만 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 스피루리나 추출물로부터 분리된 알로피코시아닌, 알-피코에리스린 및 씨-피코시아닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 알로피코시아닌, 알-피코에리스린 또는 씨-피코시아닌은 중성지방 분해를 촉진하고 지방 축적을 억제한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 스피루리나 추출물의 성분인 알로피코시아닌(Allophycocyanin), 알-피코에리스린(R-phycoerythrin) 및 씨-피코시아닌(C-phycocyanin)의 농도에 따른 세포생존율을 측정한 결과, 세포독성이 관찰되지 않음을 확인하였다(도 4 참조). 알로피코시아닌, 알-피코에리스린 및 씨-피코시아닌의 농도에 따른 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화 억제 효과를 측정한 결과, 동일 농도(5nM)에서 알-피코에리스린, 씨-피코시아닌, 알로피코시아닌의 순서로 지방축적억제 효과를 나타냄을 확인하였다(도 5 참조).

또한, 분화가 끝난 지방세포에서 스피루리나 추출물인 알로피코시아닌 및 씨-피코시아닌의 농도에 따른 세포생존율을 측정한 결과, 세포독성이 관찰되지 않음을 확인하였다(도 6 참조). 지방분해 효과를 조사한 결과, 세포 내 중성지방의 양을 감소시켰고(도 7 참조), 방출된 배지 내 글리세롤의 양을 증가시킴으로써 지방분해 효과가 우수함을 확인하였다(도 8 참조).

따라서, 스피루리나 추출물의 성분인 알로피코시아닌, 알-피코에리스린 및 씨-피코시아닌은 세포에 대한 독성이 없고 지방분해 효과가 뛰어나며 지방축적억제 효과를 나타내므로, 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 스피루리나 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 스피루리나 추출물은 물, C₁ 내지 C₂의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출하는 것이 바람직하다.

상기 스피루리나 추출물은 중성지방 분해를 촉진하고 지방 축적을 억제한다.

따라서, 스피루리나 추출물은 세포에 대한 독성이 없고 지방분해 효과가 뛰어나므로, 비만 예방 및 개선용 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 알로피코시아닌, 알-피코에리스린 및 씨-피코시아닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 알로피코시아닌, 알-피코에리스린 또는 씨-피코시아닌은 중성지방 분해를 촉진하고 지방 축적을 억제한다.

따라서, 본 발명의 알로피코시아닌, 알-피코에리스린 또는 씨-피코시아닌은 세포에 대한 독성이 없고 지방분해 효과가 뛰어나며 지방축적억제 효과를 나타내므로, 비만 예방 및 개선용 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 스피루리나 ( Spirulina maxima ) 추출물의 제조

스피루리나(Spirulina maxima, 한국해양미세조류은행 등록번호:KMMCC-1057)는 부경대학교 해양바이오신소재학과 한국해양 미세조류은행에서 분양받아 사용하였다.

구체적으로, 배양된 스피루리나를 다량 냉장 원심분리기(Multi-tube carrier Refrigerated Centrifuge)(Vision Scientific CO. Ltd)로 3,000 rpm에서 25분간 원심분리하고 분리된 균체에 1.0% NaCl 용액으로 간단하게 세척한 다음 다시 원심분리하여 균체를 얻었고, 얻어진 균체는 동결건조하여 피코시아닌 추출용 시료로 하였다. 추출방법은 동결건조한 시료 40 ㎎에 0.1M 인산염 버퍼(phosphate buffer(pH 7.0))를 10 ㎖가한 다음 15분간 볼텍스(vortex)하고 원심분리(3,500 rpm, 5 분)한 다음 상층액을 취하여 스피루리나 추출물을 제조하였다.

< 실시예 2> 알로피코시아닌 , 알- 피코에리스린 또는 씨-피코시아닌의 준비

알로피코시아닌(A7472), 알-피코에리스린(P6161), 및 씨-피코시아닌(P2172)은 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였으며 각각의 농도는 4 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 및 1 ㎎/㎖였다.

< 실시예 3> 세포배양 방법 및 스피루리나 추출물 처리 방법

실험에 사용된 지방전구세포(3T3-L1)는 American Type Culture Collection(ATCC) 미국에서 분양받아 사용하였다. 배양을 위한 배지는 Dulbeccos modified Eagles medium high glucose(DMEM)에 10％ 송아지 혈청(calf serum) 및 1% 항생제(antibiotics)를 첨가하였고, 분화를 위한 배지는 Dulbeccos modified Eagles medium high glucose(DMEM)에 10％ 소태아 혈청(fetal bovine serum) 및 1% 항생제(antibiotics)를 첨가하여 5％ CO₂, 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 세포가 밀집(confluent)상태가 되면, 트립신(Trypsin)을 처리하여 세포를 원심분리(1000rpm, 4℃, 5min)하여 세포를 1 x 10⁵/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 분주한 후 100％ 밀집(confluent)된 상태에서 48시간 후(분화 0일째) DMEM에 10％ FBS, 0.5 mM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine), 10 ㎍/㎖ 인슐린 및 1μM 덱사메타존(dexamethasone)이 첨가된 배지(MDI)를 4일 동안(분화 0-4일) 처리하여 분화를 유도하고, 그 후 2일(4-6 일)은 10％ FBS DMEM 배지에 10㎍/㎖ 인슐린이 첨가된 배지로 교체하였다. 그 후 2일(6-8 일)은 10％ FBS DMEM 배지로만 배양시켰다. 지방전구세포의 지방세포로의 분화억제 효과 실험에서는 알로피코시아닌(Allophycocyanin, APC), 알-피코에리스린(R-phycoerythrin, R-PE), 씨-피코시아닌(C-phycocyanin, C-PC)을 분화유도 배지에 첨가하여 동시처리하였다.

< 실험예 1> 스피루리나 ( Spirulina maxim a ) 추출물의 세포 증식 및 독성 효과 확인

본 발명의 스피루리나 추출물의 농도에 따른 세포증식 활성 및 독성 여부를 측정하기 위하여, 상기 <실시예 2>에서와 동일한 방법으로 스피루리나 추출물을 분화가 끝난 지방세포에 농도별로 처리하여 세포생존율을 측정하였다.

구체적으로, 세포를 72시간 동안 배양한 후, MTT[3-(3,4-dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 분석을 실시하였다. MTT 분석은 미토콘드리아의 탈수소효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT가 불용성의 보라색 formazan으로 환원되는 원리를 이용한 방법으로, 생성된 포르마진(formazan)의 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. MTT 시약이 포함된 배지를 각 웰에 가하고 4시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 상층액을 제거하고 각 웰에 1㎖의 DMSO를 첨가하여 생성된 포르마잔 결정을 용해시켜 ELISA 리더(BIO-Tek 기구 : Powerwave XS microplate spectrophotometer) 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 용매만 처리한 군(대조군)의 세포생존율을 100%로 하여 이와 비교한 값으로서, 스피루리나 추출물 처리군을 농도별(500, 750 및 1000 ㎍/㎖)로 처리하여 세포생존율을 %로 나타냈을 때, 스피루리나 추출물 최고농도인 1000 ㎍/㎖에서도 세포독성이 관찰되지 않음을 확인하였다(도 1).

<실험예 2> 스피루리나 추출물의 지방분해 효과 확인

본 발명의 스피루리나 추출물의 지방분해 효과를 조사하기 위하여, 상기 <실시예 2>에서와 동일한 방법으로 스피루리나 추출물을 분화가 끝난 지방세포에 농도별로 처리하여 세포 내 중성지방 양을 측정하였다.

구체적으로, 3T3-L1 지방전구세포를 8일 동안 분화시킨 후 스피루리나 추출물을 농도별로 처리하여 72시간 동안 배양시켰다. 다음 실험을 위하여 배지를 1.7㎖ 에펜돌프 튜브(EP-tube)에 담아 -30℃에 보관하였다. 플레이트는 cold PBS로 2회 세척한 후 용해버퍼로 용해시켜 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 중간층에서 10 ㎕를 취해 단백질을 정량화하는데 사용하고, 그 후 folch법을 사용하여 클로로포름 층을 질소가스로 날린 후 메탄올 100㎕를 넣고, 그 중에서 0.01 ㎖를 취해 조제한 반응시약((주)아산제약 중성지방 측정용 키트)을 1.5 ㎖씩 첨가하여 혼합하고, 37℃에서 10분간 반응시켜 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 스피루리나 추출물의 흡광도 값을 중성지방량을 구하는 식에 대입하여 중성지방 농도를 계산하였다. 세포 내 중성지방 양을 세포 내 단백질 양으로 나눠 단백질 1㎎ 당 중성지방이 몇 ㎎ 포함되어 있는지를 나타냈다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 용매만 처리한 군(대조군)을 100%로 하여 비교한 결과 스피루리나 추출물군은 500, 750 및 1000 ㎍/㎖ 농도에서 각각 17.8, 26.9 및 31.7% 중성지방 양을 감소시킴을 확인하였다(도 2).

< 실험예 3> 스피루리나 추출물의 중성지방 분해 효과 확인

본 발명의 스피루리나 추출물의 지방분해 효과를 비교하기 위하여, 상기 <실시예 2>에서와 동일한 방법에 따라 스피루리나 추출물에 의한 지방분해(Lipolysis) 효과 중 세포 내 중성지방의 분해에 의한 글리세롤 양을 측정하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 2>에서 -30℃에 보관중인 배지를 녹인 후 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액 5 ㎕를 취해 효소시약(Free Glycerol Colorimetric/Fluorometric Assay Kit(BioVision #K630-100))을 50 ㎕씩 첨가하여 혼합하고, 빛을 차단한 상태로 상온에서 30분간 반응시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정한 후, 시료의 흡광도 값을 표준 곡선에 대응시켜 글리세롤(glycerol)의 농도를 계산하였다. 이는 세포 내 중성지방이 스피루리나 추출물에 의해 분해되어 세포 내 글리세롤이 배지로 방출하게 되는데, 배지 내 글리세롤의 양을 효소방법에 의해 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 용매만 처리한 군(대조군)과 비교했을 때(약 0.6 nmol/㎕의 글리세롤 농도), 스피루리나 추출물 500, 750 및 1000 ㎍/㎖ 농도에서 각각 1.5, 1.6, 및 1.7 배씩 글리세롤 농도가 증가함을 확인하였다(도 3).

< 실험예 4> 알로피코시아닌 ( Allophycocyanin , APC ), 알- 피코에리스린 (R- phycoerythrin , R- PE ), 씨-피코시아닌(C-phycocyanin, C- PC )의 농도에 따른 세포생존율( Cell Viability ) 측정

본 발명의 스피루리나 추출물로부터 분리한 APC, R-PE 및 C-PC의 농도에 따른 세포생존율을 측정하기 위하여, 상기 <실험예 1>의 동일한 방법으로 PC, R-PE 및 C-PC을 3T3-L1 지방전구세포에 각각 농도별로 처리하여 4일 동안 배양 시킨 후 MTT 분석법에 의해 세포생존율을 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 용매만 처리한 군(대조군)을 100%로 하여 APC, R-PE 및 C-PC 처리군 각각의 세포 생존율을 %로 나타냈을 때, APC는 10 nM(도 4A), R-PE는 5 nM(도 4B) 및 C-PC(도 4C)는 5 nM 농도까지 세포독성이 관찰되지 않음을 확인하였다(도 4).

< 실험예 5> 알로피코시아닌 ( APC ), 알- 피코에리스린 (R- PE ) 및 씨-피코시아닌( C-PC)의 농도에 따른 3 T3 - L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화 및 지방축적 억제 효과

본 발명의 APC, R-PE 및 C-PC의 농도에 따른 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화 억제 효과를 측정하기 위하여, 상기 <실험예 4>에서와 동일한 방법에 따라 APC, R-PE 및 C-PC을 분화유도기간 중에 농도별로 처리하여 오일-레드-오 염색(Oil-Red -O Staining)을 통해 확인하였다.

구체적으로, 3T3-L1 지방전구세포를 8일 동안 분화시킨 후 APC, R-PE 및 C-PC를 농도별로 처리하여 72시간 동안 배양시켰다. PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척한 후 10％ 포름알데히드 용액으로 세포를 1시간 동안 고정시켰다. 1시간 후 증류수로 2회 세척한 후, Oil-Red-O 용액을 첨가하여 1시간 실온에서 염색하고, Oil-Red-O용액을 제거 후 증류수로 2회 세척하여 건조시켜서 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 또한, 지방구를 염색시킨 각각의 플레이트에 100％ 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol) 1㎖을 첨가하여 용해시킨 후 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 용매만 처리한 군(대조군)의 염색된 세포(100%)와 비교하였을 때, APC 5 nM, 10 nM 농도에서 염색된 세포가 각각 11.5 및 32.6% 감소하였고, R-PE를 3 nM, 5 nM 처리하였을 때 각각 17.3 및 31.3% 감소하였고, C-PC를 3 nM, 5nM 처리하였을때 각각 14.3 및 19.4% 감소함을 확인하였다. 따라서, 동일 농도(5nM)에서 R-PE, C-PC, APC순서로 지방축적억제 효과가 뛰어남을 확인하였다(도 5).

< 실험예 6> 알로피코시아닌 ( APC ) 및 씨-피코시아닌(C- PC )의 농도에 따른 세포생존율 측정

본 발명의 APC 및 C-PC의 농도에 따른 세포생존율을 측정하기 위하여, 상기 <실험예 1>의 동일한 방법에 따라 APC 및 C-PC을 분화가 끝난 지방세포에 농도별로 처리하여 72시간 동안 배양시킨 후 MTT 분석법에 의해 세포생존율을 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 용매만 처리한 군(대조군)을 100%로 하여 비교하였을 때, APC 및 C-PC의 세포 생존율(%)은 APC는 50 nM, C-PC는 30 nM 농도까지 세포독성이 관찰되지 않음을 확인하였다(도 6).

< 실험예 7> 알로피코시아닌 ( APC ) 및 씨-피코시아닌(C- PC )의 농도에 따른 세포 내 중성지방 농도 측정

본 발명의 APC 및 C-PC의 지방분해 효과를 비교하기 위하여, 상기 <실험예 2>의 동일한 방법에 따라 APC 및 C-PC을 분화가 끝난 지방세포에 알로피코시아닌(APC) 및 씨-피코시아닌(C-PC)을 농도별로 처리하여 72시간 동안 배양시킨 후 세포 내 중성지방 양을 세포 내 단백질 양으로 나눠 단백질 1㎎ 당 중성지방이 몇 ㎎ 포함되어 있는지를 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 용매 처리군(대조군)의 중성지방 양을 100%로 하였을 때, C-PC는 10, 20 및 30 nM 농도에서 중성지방 양이 각각 13.5, 14.9 및 29.7% 감소하였고, APC 20, 30, 40 및 50 nM 농도에서 중성지방 양이 각각 16.2, 18.9, 21.6 및 24.3% 감소함으로써, 지방분해에 대한 효과에 있어서 C-PC가 APC보다 약 2배 정도 우수함을 확인하였다(도 7).

< 실험예 8> 알로피코시아닌 ( APC ) 및 씨-피코시아닌(C- PC )의 농도에 따른 세포 내 중성지방의 분해에 의한 글리세롤 양 측정

본 발명의 APC 및 C-PC의 지방분해 효과를 비교하기 위하여, 상기 <실험예 3>의 동일한 방법에 따라 APC 및 C-PC을 분화가 끝난 지방세포에 농도별로 처리하여 72시간 동안 배양시킨 후 세포 내 중성지방이 APC 및 C-PC에 의해 분해되어 방출된 배지 내 글리세롤의 양을 효소방법에 의해 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 용매처리군(대조군)에 의한 배지 내 글리세롤 농도(약 0.25 nmol/㎕)와 비교했을 때 C-PC 10, 20 및 30 nM 농도에서 각각 2.7, 4.7 및 6.2배 증가하였고, APC 20, 30, 40 및 50 nM 농도에서 각각 3.0, 3.6, 4.7 및 5.7배 증가함으로써, C-PC가 APC에 비해 지방분해 효과가 약 2배 정도 우수함을 확인하였다(도 8).

Claims (11)

1. 알로피코시아닌(allophycocyanin; APC), 알-피코에리스린(R-phycoerythrin; R-PE), 및 씨-피코시아닌(C-phycocyanin; C-PC)을 포함하고 중성지방 분해를 촉진하고 지방 축적을 억제하는, 스피루리나 막시마(Spirulina maxima) 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 알코올의 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 알로피코시아닌(allophycocyanin; APC), 알-피코에리스린(R-phycoerythrin; R-PE), 및 씨-피코시아닌(C-phycocyanin; C-PC)을 포함하고 중성지방 분해를 촉진하고 지방 축적을 억제하는, 스피루리나 막시마 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 알코올의 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는 비만 예방 및 개선용 건강기능식품.
   
   
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