CN110325195A - 脂肪细胞分化抑制剂、用于抑制脂肪细胞分化的食品组合物及脂肪细胞分化抑制剂的制造方法 - Google Patents
脂肪细胞分化抑制剂、用于抑制脂肪细胞分化的食品组合物及脂肪细胞分化抑制剂的制造方法 Download PDFInfo
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Abstract
提供作为裸藻提取物新使用方法的新的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、用于抑制脂肪细胞分化的食品组合物以及用于抑制脂肪细胞的化妆材料组合物。新的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、用于抑制脂肪细胞分化的食品组合物以及用于抑制脂肪细胞分化的化妆材料组合物含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分。裸藻水性溶剂提取物可以是例如裸藻水提取物或热水提取物。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪细胞分化抑制剂,PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、用于抑制脂肪细胞分化的食品组合物、用于抑制脂肪细胞分化的化妆材料组合物、以及脂肪细胞分化抑制剂的制备方法。
背景技术
称为生活方式相关疾病的疾病包括例如肥胖症、高血压、糖尿病、高脂血症、心肌梗死、脑卒中等。近年来,已发现这些疾病不是由于个体原因而发病,而是由各种原因的共同影响引起的,这种复杂的生活方式相关疾病也称为代谢综合征。
“代谢综合征”是指基于胰岛素抗性的2型糖尿病、高脂血症、高血压、内脏脂肪型肥胖、脂肪肝等一系列病症组合导致的状态。
代谢综合征是脂肪细胞,特别是内脏中的脂肪细胞(内脏脂肪)的蓄积导致胰岛素功能降低,并且高血糖、脂质代谢异常、高血压等动脉硬化危险因素积累导致的病症。
已知脂肪细胞的蓄积与肥胖症、高血压症、糖尿病、高脂血症、心肌梗死、脑卒中等相关连,为了预防和治疗这些疾病,极为重视防止脂肪细胞的蓄积。
此处,“肥胖症”是指具有肥胖引起或与肥胖相关的健康障碍,或者由该健康障碍所预测的内脏脂肪过量蓄积时,需要进行减量治疗的状态。
此外,由于最近人们对健康和美容的关注日益高涨,不论男女老少,希望维持健康苗条的身体的人也在增加,即使不是肥胖症的人群中,对局部脂肪的蓄积也非常关注。
目前,作为用于治疗或预防肥胖症的抗肥胖剂,大多通过对蓄积的脂肪进行分解,显示出抑制脂肪蓄积的效果。
肥胖症是由于前体脂肪细胞分化成脂肪细胞(成熟脂肪细胞),其数量和大小增加而产生的。此外,作为脂肪细胞分化过程中的脂肪细胞分化的主要调节子,已知PPARγ及C/EBPα等转录因子。在预防和治疗肥胖症中,抑制前体脂肪细胞分化为脂肪细胞是有效的。
作为脂肪细胞分化抑制剂,已知啤酒花组织的水提取物(专利文献1),酸性粘多糖类(专利文献2)、植物提取物(专利文献3)等。其中,专利文献1中公开了啤酒花组织的水提取物抑制PPARγ的表达,由此抑制脂肪细胞的分化。
另一方面,裸藻(属:Euglena,日本名称:ミドリムシ)作为有望用作食品、饲料、燃料等生物资源而受到关注。
裸藻作为多种营养素均衡摄入的补充剂而使用,其具有59种营养素,这59种营养素属于维生素、矿物质、氨基酸、不饱和脂肪酸等人类生存所需的大部分必需营养素,并且提出其可以用作不能摄取必需营养素的贫困地区的食品供给源。
裸藻是食物链的初级生产者,由于它被捕食者捕食,以及光、温度条件、搅拌速度等培养条件高于其他微生物等原因,因此裸藻难以大规模的培养。近年来,本发明的发明人进行了深入的研究,由此已经建立了大规模培养的技术,并开辟了大规模供应裸藻及从裸藻中提出裸藻淀粉等大量供给来源于裸藻的物质的途径。
裸藻是一种独特的生物,其具有进行鞭毛运动的动物特性,同时具有作为植物的叶绿体植物并进行光合作用,可以期待裸藻本身和来源于裸藻的物质具有许多功能。
因此,期望开发一种可以大量供给的裸藻和来源裸藻的物质的利用方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利申请公开2010-173942号
专利文献2:日本专利申请公开2014-9161号
专利文献3:日本专利申请公开2011-6347号
发明概述
发明要解决的问题
本发明是鉴于上述问题而完成的,其目的在于提供一种新的脂肪细胞分化抑制剂,PPARγ表达抑制剂,C/EBPα表达抑制剂,用于抑制脂肪细胞分化的食品组合物,用于抑制脂肪细胞分化的化妆材料组合物。
本发明的另一个目的在于提供一种作为裸藻水性溶剂提取物的新的利用方法的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、用于抑制脂肪细胞分化的食品组合物、用于抑制脂肪细胞分化的化妆材料组合物。
解决问题的手段
本发明的发明人进行深入研究,结果发现:裸藻水性溶剂提取物具有抑制由前体脂肪细胞分化为脂肪细胞的作用。
更具体而言,明确了:在前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程中,作为关键的转录因子组中,PPARγ和C/EBPα的表达受到抑制,并且由前体脂肪细胞向脂肪细胞进行分化受到抑制,从而完成了本发明。
因此,根据本发明,所述问题是通过特征在于含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、用于抑制脂肪细胞分化的食品组合物、用于抑制脂肪细胞分化的化妆材料组合物来解决的。
在此,所述裸藻水性溶剂提取物可以是裸藻水提取物或裸藻热水提取物。
本发明具有符合食品卫生法的安全性水平的裸藻的水性溶剂提取物作为活性成分,至今没有任何副作用报告,因此可以长期连续给药和连续摄入。
根据本发明,所述问题是通过脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂的制造方法而解决的,所述制造方法的特征在于包括下述工序:分散液制备工序,其向裸藻中加入水性溶剂、振荡,获得分散液;和提取工序,通过对所述分散液进行离心分离,获得上清液作为裸藻的水性溶剂提取物。
在此,可以在所述分散液制备工序之后,所述提取工序之前进行加热所述分散液的加热工序。
发明的效果
根据本发明,可以提供新的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、用于抑制脂肪细胞分化的食品组合物以及用于抑制脂肪细胞分化的化妆材料组合物。
本发明使用具有符合食品卫生法的安全水平的裸藻的水性溶剂提取物作为活性成分,至今没有任何副作用报告,因此可以长期连续给药及连续摄入。
附图简要说明
图1是显示脂肪细胞的生命周期和作为转录因子的蛋白质表达量的示意性说明图。
图2是显示脂肪分化抑制试验步骤的说明图,其验证了根据本发明的一个实施例的实施例1和实施例2~6的裸藻水提取物或热水提取物的脂肪分化抑制效果。
图3是显示在试验例1中验证的本发明的实施例1的裸藻热水提取物的脂肪分化抑制试验的结果的图。
图4是显示在试验例1中验证的本发明实施例1的裸藻热水提取物的脂肪分化抑制试验后脂肪滴染色结果的照片。
图5是显示在试验例2中验证的本发明的实施例2~6的裸藻水提取物或热水提取物的脂肪分化抑制试验的结果的图。
图6是显示在试验例2中验证的本发明的实施例2~6的裸藻水提取物或热水提取物的脂肪分化抑制试验后的脂滴染色结果的照片。
图7是显示在试验例3中验证的本发明的实施例1的裸藻热水提取物和比较例1的EPA的脂肪分化抑制试验的结果的图。
图8是显示在试验例3中验证的比较例1的EPA的脂肪分化抑制试验后的脂滴染色结果的照片。
图9是显示在试验例4中验证的添加本发明的实施例1的裸藻热水提取物的期间发生了变化时的脂肪分化抑制试验的步骤的说明图,以及显示脂肪分化抑制试验结果的图。
图10是显示在试验例4中验证的添加本发明的实施例1的裸藻热水提取物的期间发生了变化时的脂肪分化抑制试验后的脂肪滴染色的结果的照片。
图11是显示当在试验例5中验证的添加本发明的实施例1的裸藻热水提取物时PPARγ基因表达量的比较结果的图。
图12是显示当在试验例5中验证的添加本发明的实施例1的裸藻热水提取物时C/EBPα基因表达量的比较结果的图。
发明的实施方式
在下文中,将参照图1~图12对本发明的实施方式进行说明。
本实施方式涉及以裸藻水性溶剂提取物作为活性成分的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂,抗肥胖剂以及抗代谢综合征剂。
在本说明书中,“肥胖”是指,体重高于正常状态或体脂过度蓄积的状态。使用BMI(Body Mass Index,体重指数)作为肥胖的判定基准。根据WHO(世界卫生组织)的肥胖判定基准,将BMI 30以上设为肥胖,而在日本将BMI 25以上设为肥胖。日本的判定基准基于日本肥胖学会定义的基准,即BMI超过25时,日本人具有耐糖性能障碍、脂质异常和高血压这样的并发症的发病率较高。
在本说明书中,“肥胖症”是指具有肥胖引起或与肥胖相关的健康障碍,或者由该健康障碍所预测的内脏脂肪过量蓄积时,需要进行减量治疗的状态。肥胖症是由脂肪细胞数增加和脂肪细胞肥大引起的,并且与前体脂肪细胞的增殖和分化,肥大,或脂肪细胞死亡和从体内消除的脂肪细胞的生命周期相关。
在本说明书中,“抗肥胖”意指预防或治疗上述肥胖症。
在本说明书中,“代谢综合征”是指,基于胰岛素抗性的2型糖尿病、高脂血症、高血压、内脏脂肪型肥胖、脂肪肝等一系列病态组的组合状态,也被称为X综合征、胰岛素抵抗综合征、内脏脂肪综合征、多重危险因素综合征等。
在本说明书中,“抗代谢综合征”意指,预防或治疗选自上述病症的至少一种以上的病症。
<脂肪细胞概述>
脂肪细胞是在细胞质中具有脂滴的细胞,并且被分类为单胞性脂肪细胞(白色脂肪细胞)和多胞性脂肪细胞(棕色脂肪细胞)。
摄入过量的白色脂肪细胞,将未消耗的多余能量转化为中性脂肪,并作为能源蓄积。白色脂肪细胞广泛存在于人体内,特别是在下腹部、臀部、大腿、背部、上臂、内脏周围等较多,作为皮下脂肪或内脏脂肪蓄积。
认为,白色脂肪细胞的数量仅在有限的时间内增加,例如婴幼儿和青春期,此时确定了生命中白色脂肪细胞的数量。然而,在最近的研究中,当已经存在的白色脂肪细胞由于过多的能量摄入和运动不足等被中性脂肪充满时,即使在青春期过后,脂肪细胞的数量也会增加,并且进一步摄取脂肪。当脂肪细胞的大小达到上限并且不再能够继续储存脂肪时,通过PPARγ等刺激周围的前体脂肪细胞成为成熟的脂肪细胞,并依次肥大,成熟的脂肪细胞也进一步进行分裂,脂肪细胞的数量增加。
虽然20岁左右的成年人的白色脂肪细胞的数量约为400亿个,肥胖人群中白色脂肪细胞的数量高达400-600亿个。
白色脂肪细胞在需要能量时,对蓄积的脂肪进行分解,并以游离脂肪酸和甘油的形式进行全身供应。此时,释放出脂肪的白色脂肪细胞返回到前体脂肪细胞,再次变成能量过剩的状态时,变成成熟脂肪细胞并摄取脂肪。
另一方面,棕色脂肪细胞通过分解多余脂肪而产生热量进行作用,并存在于例如颈部后、肩胛骨周围、腋下、心脏和肾脏周围等人体的特定部位。棕色脂肪细胞的数量在出生后立即变为最大,随着成年人的生长而逐渐降低,特别是在40岁及以后会显著减少。据报道,棕色脂肪细胞数量的减少是中年肥胖的主要原因。
<脂肪细胞生命周期和转录因子级联、以及脂肪细胞分化抑制作用>
如图1所示,脂肪细胞的生命周期认为可以分为:(1)决定间充质干细胞分化为前体脂肪细胞的过程,(2)前体脂肪细胞的增殖和分化为成熟脂肪细胞的过程,(3)肥大的脂肪细胞的凋亡和从生物体中消除的过程。
通过使用培养细胞及基因修饰个体的系统等阐明了与脂肪细胞分化过程密切相关的转录因子。
PPAR(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor,过氧化物酶体增殖物活化受体),C/EBP(CCAAT/Enhancer-Binding Protein,CCAAT/增强子结合蛋白)和SREBP-1/ADD1(Sterol Regulatory Element Binding Protein 1或Adipocyte Determination andDifferentiation-dependent Factor 1,固醇调节元件结合蛋白-1或脂肪细胞确定与分化依赖因子1)被认为是脂肪细胞分化的最重要的转录因子。
就PPAR而言,已知PPARα、PPARγ、PPAR8等家族,其中PPARγ对脂肪细胞分化特别重要。在成脂样细胞和前体脂肪细胞中,强制表达PPARγ从而分化成脂肪细胞。
就C/EBP而言,已知C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ、C/EBPγ、C/EBPε、C/EBPζ等家族,C/EBPα与PPARγ相同均作为脂肪细胞分化中的主调节子而发挥作用。此外,C/EBPβ和C/EBPδ均在分化早期进行表达,并控制C/EBPα和PPARγ的表达。
已知SREBP1/ADD1促进脂肪细胞分化,另一方面,它也参与脂肪细胞分化过程中的PPARγ配体产生。
这三种转录因子组(PPAR、C/EBP、SREBP1/ADD1)之间进行交互应答促进脂肪细胞的分化过程。
<裸藻>
在本实施方式中,“裸藻”包括在分类学上分类为裸藻属(Euglena)的微生物、其变种、其变异种及裸藻科(Euglenaceae)近源物种。
在此,裸藻属(Euglena)是指,真核生物中属于古虫界(Excavata)、眼虫门(Euglenozoa)、裸藻纲(Euglenophyceae)、裸藻目、裸藻科的一组生物。
作为裸藻属中所含的物种的具体实例,可列举:Euglena chadefaudii、Euglenadeses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena mutabilis、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridis等。
作为裸藻,可以使用E.gracilis,特别是可以使用E.gracilis Z株,但是,除此以外,还可以使用E.gracilis Z株的变异株SM-ZK株(叶绿体缺陷株)、和变种E.gracilisvar.Bacillaris、这些物种的叶绿体变异株等基因变异株、Astaia longa等其他裸藻类和由其衍生的β-1,3-葡聚糖酶等物质。
裸藻类广泛分布在池塘和沼泽等淡水、微咸水以及海水中,可以从这些水中分离使用,此外,可以使用已经分离的任意裸藻类。
裸藻类包括其所有变异株。此外,在这些变异株中,还包括通过遗传方法如重组、转导、转化等获得的变异株。
在裸藻细胞的培养中,可以使用例如,添加了氮源、磷源、矿物质等营养盐类的培养液作为培养液,例如,改变的Cramer-Myers培养基((NH4)2HPO4 1.0g/L,KH2PO4 1.0g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,CaCl2·2H2O 0.02g/L,Fe2(SO2)3·7H2O 3mg/L,MnCl2·4H2O 1.8mg/L,CoSO4·7H2O 1.5mg/L,ZnSO4·7H2O 0.4mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.2mg/L,CuSO4·5H2O0.02g/L,盐酸硫胺素(维生素B1)0.1mg/L,氰钴胺素(维生素B12)、(pH3.5))。(NH4)2HPO4可以转化为(NH4)2SO4或NH3aq。此外,可以使用基于裸藻生理学和生物化学(北冈正三郎编,株式会社学会出版中心)的记载来制备的公知的Hunter培养基和Koren-Hunter培养基。
培养液的pH优选为2以上,并且其上限优选为6以下,更优选为4.5以下。通过将pH设定为酸性,光合微生物可以比其他微生物的生长更具有优势,从而可以抑制污染。
裸藻细胞的培养可以通过直接利用太阳光的开放池塘方式进行;也可以利用集光方式进行,其通过光纤等对由光收集装置收集的太阳光进行输送,并照射培养槽进行光合作用。
此外,裸藻细胞的培养可以使用例如补料分批法进行,但也可以通过使用烧瓶培养或发酵罐的培养、分批培养法、半分批培养法(流加培养法)、连续培养法(灌流培养法)等任意的液体培养法进行。
培养可以使用例如开放池型、跑道池型或管池型等公知的培养装置、或坂口烧瓶、锥形瓶或试剂瓶等实验用培养容器进行。由于裸藻同化CO2,因此当使用作为独立营养培养基的Cramer-Myers培养基进行培养时,优选使含有1~5%CO2的空气通过培养基。此外,每升培养基可加入约1~5g磷酸铵以充分发育叶绿体。培养温度通常为20~34℃,优选28~30℃。此外,根据培养条件,裸藻通常在培养开始后2-3天进入对数生长期,并在约4~5天内达到静止期。
裸藻可以在光照射下培养(光培养),也可以在没有照射的情况下培养(暗培养)。
例如,通过营养液的离心分离或单纯沉降、膜过滤等分离裸藻细胞。
通过对分离得到的裸藻细胞进行清洗,以已知方式进行真空冻干来制备裸藻的藻体干燥物。然而,藻体干燥物的制备也可以通过喷雾干燥、加热真空干燥等进行。
本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂可以使用通过离心、沉降、膜过滤等从培养液中分离出的裸藻的藻体作为裸藻,也可以使用藻体干燥物作为裸藻。此外,可以使用已知粉碎机对藻体干燥物进行粉碎得到的裸藻的干粉。
<裸藻水性溶剂提取物>
在本实施方式中,“裸藻水性溶剂提取物”是指,使用水性溶剂从裸藻提取出的提取物,优选特别是使用水作为水性溶剂,在5℃~600℃下,进行几秒~几十小时的提取而得到的裸藻水提取物或裸藻热水提取物。
用于提取的水未必一定是蒸馏水、纯水或超纯水,可以是例如自来水或含有杂质的水,但优选不含有阻碍活性成分提取的成分。
在本实施方式中,“水提取物”是指通过0~50℃(不包括0℃)的水得到的提取物。
此处,“水”是指0~50℃(不包括0℃)的水。
水的温度没有特别限制,只要不影响活性成分,且可以充分提取活性成分即可,但优选1~40℃,更优选5~35℃,特别优选是10~30℃。
在本实施方式中,“热水提取物”是指通过水温高于50℃的水得到的提取物,也可以称为“温水提取物”。
此处,“热水”是指温度高于50℃的水,并且是包括“开水”的概念,包括沸腾状态的水。此外,它不限于液态的热水,还包括气态和超临界状态的热水。
热水的温度没有特别限制,只要不影响活性成分,且可以充分提取活性成分即可,但优选高于50℃且为120℃以下,更优选高于50℃且为100℃以下。
用于提取的水的pH没有特别限制,只要不影响活性成分,且可以充分提取活性成分即可,但优选为pH4~10,更优选为pH5~9,特别优选为pH6~8。
在本实施方式中,单独使用水作为水性溶剂,但是,在不影响活性成分,并可以充分提取活性成分的溶剂的情况下,可以选择使用一种或两种以上通常可以用于提取的溶剂。例如,可以列举:水、醇、二醇等,但不限于此。作为醇类,可列举:乙醇、甲醇、正丙醇和异丙醇等。作为二醇类可列举:丁二醇和丙二醇等。作为其他水性溶剂,可列举丙酮等。这些溶剂可以单独使用或作为水溶液使用,可以制成任意两种以上或三种以上的混合溶剂使用。
用于提取的水性溶剂的温度为例如0℃以上,只要不影响活性成分即可,不受特别限制。可以使用沸腾状态或超临界状态的水性溶剂,但优选使用5℃~600℃的水性溶剂,并且更优选使用10℃~200℃的水性溶剂。
因此,用于提取的水性溶剂是指,包括沸腾状态或超临界状态的水性溶剂。用于提取的水性溶剂的量,优选是能够充分溶解裸藻中含有的水溶性活性成分的量。
提取方法没有特别限制,例如,可以通过下述方法进行提取,但不限于此,可以自由选择使用常用的提取方法。例如,以指定的时间将裸藻的藻体干燥粉末浸入水性溶剂中,然后进行离心或过滤;或者将裸藻的藻体干燥粉末加入水性溶剂中进行振荡并使其均匀分散,然后进行离心或过滤的方法等。
另外,可以对加入裸藻后的水性溶剂进行加热来促进提取。
裸藻的水提取可以通过如下所示的常用方法进行,但不限于此。例如,将裸藻组织和水放入容器中,并在一边进行适当搅拌或振动,一边静置指定的时间,得到的提取液可以直接用作水提取物。此外,例如,通过对如上所述的提取液进行离心,获得的上清液可以用作水提取物。此外,可以对如上所述的提取液或上清液进行浓缩,干燥以除去水分用作水提取物。为了提高提取效率并缩短提取时间,水提取可以通过向水中添加少量例如10质量%以下的醇,优选添加乙醇来进行。
进行水提取时的提取时间只要是提取活性成分的时间即可,没有特别限定,可以根据提取温度在几秒钟~几十小时的范围适当设定。
用热水进行的提取可以通过如下所示的常用方法进行,但不限于此。通过在将裸藻与水一起导入至常用的提取器中,然后加热来进行提取。在使用沸水或超临界状态的水进行提取的情况下,需要使用能够承受水蒸气压力的提取器。提取时的压力可以设定为1~5000气压,优选60~400气压。
在高温高压下进行提取的情况下,如果提取时间过长,则活性成分可能分解或可能发生化学反应。因此,当在高温高压下进行提取时,提取时间优选较短,例如为3分钟以内,更优选1分钟以内,特别优选30秒以内。
提取的裸藻提取物可以直接用作本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和代谢综合征预防或治疗剂的活性成分,但该提取物可以进一步通过适当的分离方法(例如,分配提取、凝胶过滤、硅胶层析、反相或正相高效液相层析等)从活性较高的级分中进一步分级而使用。
此外,可以将裸藻提取物或其级分浓缩、干燥以除去水性溶剂,其可以用作水性溶剂提取物。
<脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂>
本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂和C/EBPα表达抑制剂使用裸藻水性溶剂提取物作为活性成分。
本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂在脂肪细胞分化过程中抑制作为脂肪细胞分化的主要调节子的PPARγ和C/EBPα的表达,并且由抑制前体脂肪细胞向脂肪细胞的分化。
<抗肥胖剂和抗代谢综合征剂>
本实施方式的抗肥胖剂和抗代谢综合征剂含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分。
裸藻水性溶剂提取物抑制作为脂肪细胞分化的主要调节子的PPARγ和C/EBPα的表达,通过抑制前体脂肪细胞向脂肪细胞的分化来抑制脂肪细胞的蓄积,结果,发挥抗肥胖及预防或治疗代谢综合症的作用。
<用途>
本实施方式的含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂对明确诊断为肥胖症和/或代谢综合征的患者进行给药。
此外,本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂作为药物组合物、健康食品等而构成,并对出现肥胖症和/或代谢综合征症状的自觉症状的人、有BMI增加倾向的人、考虑遗传或生活环境等可能患有肥胖症和/或代谢综合征的人等肥胖症及代谢综合征的潜在患者预防性地进行给药。
由于裸藻水性溶剂提取物可以作为食品摄取并且没有副作用,因此甚至可以在确诊为肥胖症和/或代谢综合征之前进行给药。此外,在确诊之前起,直到确诊后的任意时刻,例如,当BMI水平降至低于25的时刻、认为脂肪细胞分化失去活性的时刻、或替换为其他抗肥胖剂的时刻等,可以连续给药。
此外,由于完成肥胖症和/或代谢综合征治疗的人容易复发肥胖症和/或代谢综合征,本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂,C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂,对于肥胖和/或代谢综合征患者通过治疗将BMI值降至低于25后,对BMI值降至低于25的患者,为了抑制症状复发的目的,可以作为肥胖症和/或代谢综合征复发的预防、抑制药而连续给药。
通常,已知肥胖症和/或代谢综合征是由压力、饮食、遗传因素等各种因素引起的。
因此,对容易造成心理压力·社会压力的环境中的人,例如,易造成心理压力的职场、居住环境中的人、或准备考试的人,可以将本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂长时间地连续给药。
此外,处于由于饮食生活、遗传因素而罹患肥胖症和/或代谢综合征可能性较高的环境中的人,例如那些饮食紊乱的家庭中的人,父母等家族中存在罹患肥胖症和/或代谢综合症的家庭的人,可以将本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂长时间地连续给药。
此外,本实施方式中的含有以裸藻水性溶剂提取物作为活性成分的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂的给药对象,不限于具有上述症状或状态的人或人以外的动物。
例如,可以对白色脂肪细胞特别增加的婴幼儿期和青春期的中BMI 25以上的肥胖状态的人给药或使其摄取:以裸藻水性溶剂提取物作为活性成分的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂。
处于婴幼儿期和青春期的人白色脂肪细胞容易增加,但是,通过裸藻水性溶剂提取物具有的脂肪细胞分化抑制效果、PPARγ表达抑制效果、C/EBPα表达抑制效果,白色脂肪细胞的增加能够得到抑制。
此处,“婴儿期”是出生后不到1岁的时期,“幼儿期”是指1岁以上至小于6岁的时期。
此外,“青春期”是指第二性征出现、成熟、直到最后身高发育停止的时期。关于男性,一般为12至17岁期间,但关女性,若根据日本妇产科学会的定义,定义为“性功能的发育(乳房发育、阴毛发育等)开始、经过初次月经到第二性征完成和月经周期基本顺利之间的期间,就现在的日本人的情况而言,平均从8、9岁开始到17、18岁之间”。根据WHO(世界卫生组织)的定义,定义为在10~19岁之间,根据性别和个人差异,有浮动的概念,定义为8~19岁之间。
此外,40岁以下的人,可以给药含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂。
40岁以上的人通过分解多余的脂肪而产生热量的能力衰退,脂肪容易蓄积,容易成为中年肥胖,但是,由于裸藻水性溶剂提取物具备脂肪细胞分化抑制效果、PPARγ表达抑制效果、C/EBPα表达抑制效果,可以抑制脂肪细胞的蓄积及中年肥胖。
另外,本实施方式的含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂,可以添加在药理学上可接受的添加剂,制成药物组合物、化妆材料组合物、食品组合物等组合物使用。
(药物组合物)
本实施方式的含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂,利用优异的脂肪细胞分化抑制效果、PPARγ表达抑制效果、C/EBPα表达抑制效果、抗肥胖作用和抗代谢综合征效果,优选用于药物组合物。
该药物组合物可以适用于任何剂型的药品或准药品。例如,适用于散剂、细粒剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳胶剂、糖浆剂、提取剂、丸剂等口服剂;外用液剂、外用凝胶剂、乳霜、软膏剂、喷雾剂、点鼻液剂、搽剂、洗剂、贴剂、硬膏剂、喷雾剂、气溶胶剂等外用剂,或注射剂。
本实施方式的药物组合物中,可以自由选择含有一种或两种以上药学上可接受的添加剂。
例如,本实施方式的药物组合物适用于口服剂的情况下,可以含有例如,赋形剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、保存剂、着色剂、调味剂、香料、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂等可以在医药制剂领域通常使用的所有添加剂。另外,也可以利用药物递送系统(DDS),制成缓释制剂等。
此外,当将本实施方式的药物组合物适用于外用制剂时,可以含有例如,基质、表面活性剂、保存剂、乳化剂、着色剂、调味剂、香料、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂等可以在医药制剂领域通常使用的所有添加剂。
此外,当本实施方式的药物组合物适用于注射剂时,可以含有例如,溶剂、稳定剂、增溶剂、悬浮剂、保存剂、等渗剂、防腐剂、抗氧化剂等可以在医药制剂领域通常使用的所有添加剂。
本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂,可以是口服给药、经皮给药、皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药等在全身或局部发挥作用,或在给药部位局部地发挥作用。
本实施方式的药物组合物中,脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂的含量没有特别限制,可以根据目的自由设定。
(食品组合物)
本实施方式的含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂,利用优异的脂肪细胞分化抑制效果、PPARγ表达抑制效果、C/EBPα表达抑制效果、抗肥胖效果和代谢综合征预防或治疗效果,将其配合到各种食品中,可以提供具有该作用的食品组合物。
可以用于例如,饮料(清凉饮料、酒精饮料、碳酸饮料、乳饮料、果汁饮料、茶、咖啡、营养饮料等)、酱油等调味料、汤类、奶油类、各种乳制品、加工肉制品、农产品制品、冰激凌等冷冻甜点、各种粉末食品(包括饮料)、浓缩饮料、保存用食品、冷冻食品、面包类、谷物、点心(糖果(喉糖))、曲奇、饼干、口香糖、软糖、巧克力等)任意食品组合物中。
或者,它还可以用于保健功能食品(特定保健功能食品、营养功能食品、功能标识食品)、所谓的健康食品(包括饮料)、浓缩营养品、流食、婴儿·幼儿食品。
此处,特定保健食品是指,含有影响生理功能等的保健功能成分的食品,是得到日本消费者厅厅长的许可并可以对适合于特定的保健用途的目的进行标识的食品。在该实施方式中,标识“预防体脂附着”,预防或改善脂肪蓄积、抑制脂肪细胞增殖、预防或改善肥胖等作为特定的保健用途而销售的食品。
此外,营养功能食品是指,用于补充营养成分(维生素、矿物质)的食品,是标识营养成分的功能的食品。为了将其作为营养功能食品进行出售,每日摄入标准量中含有的营养成分的量必须在限定的上限值和下限值内,并且不仅要标识出营养功能而且还要提示注意事项等。
此外,功能标识食品是指,在经营者的责任下标识了基于科学依据的功能性的食品。功能标识食品在销售前已经将相关的安全性和功能性等依据信息发送给日本消费者厅厅长。
就上述的实施方式而言,可以用作含有作为活性成分的裸藻水性溶剂提取物的、将肥胖病患者作为对象的、预防脂肪蓄积的特定保健食品/抑制脂肪细胞分化的特定保健食品、预防脂肪蓄积的营养功能食品/抑制脂肪细胞分化的营养功能食品、预防脂肪蓄积的功能标识食品/预防脂肪细胞分化的功能标识食品。
此外,就该实施方式而言,可以用作含有作为活性成分的裸藻水性溶剂提取物的、将生物体例如发生脂肪蓄积前的人、脂肪蓄积引起的代谢综合征潜伏者作为对象的、预防脂肪蓄积的特定保健食品/预防脂肪细胞分化的特定保健食品、预防脂肪蓄积的营养功能食品/预防脂肪细胞分化的营养功能食品、预防脂肪蓄积的功能标识食品/预防脂肪细胞分化的功能标识食品。
本实施方式的食品组合物含有本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂,并可以自由选择配合一种或两种以上的通常的食品组合物中能够使用的成分。例如,可以含有各种调味料、保存剂、乳化剂、稳定剂、香料、着色剂、防腐剂、pH调节剂等通常可以在食品领域中使用的所有添加剂。
食品组合物中的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂的含量没有特别限制,可以根据目的自由设定。
(化妆材料组合物)
本实施方式的含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂,利用优异的脂肪细胞分化抑制效果、PPARγ表达抑制效果、C/EBPα表达抑制效果、抗肥胖效果和代谢综合征预防或改善效果,可以优选用于化妆材料组合物。
该化妆材料组合物可以适用于任何形式的化妆材料。例如,可以适用于如化妆水、乳液、乳霜、美容液等的护肤化妆材料、粉底、遮瑕膏、粉底基础、唇膏、腮红、眼影,眼线等装扮化妆材料、防晒化妆材料等。
本实施方式的化妆材料组合物中,除了本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂之外,可以自由选择配合一种或两种以上的通常的化妆材料中可以使用的成分。
可以含有例如,基质、保存剂、乳化剂、着色剂、防腐剂、表面活性剂、紫外线吸收剂、抗氧化剂、保湿剂、紫外线吸收剂、香料、防腐防霉剂、体质颜料、着色颜料、醇、水等通常可以用于化妆品领域的所有添加剂。
在本实施方式的化妆材料组合物中,脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂的含量没有特别限制,可以根据目的自由设定。
<脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂的制造方法>
本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂通过以下方法制备。
首先,进行分散液制备工序,其通过向裸藻中加入水性溶剂并搅拌和/或振荡来获得分散液。在这种分散液制备过程中,可以使用裸藻粉作为裸藻。
接着,进行提取工序,其对分散液进离心分离,得到上清液作为裸藻的水性溶剂提取物。
另外,可以在分散液制备工序之后,在提取工序之前进行加热工序,其使用高压蒸汽灭菌器等加热装置,对分散液进行加热。
具体而言,首先进行分散液制备工序,其通过向裸藻中加入水性溶剂并搅拌和/或振荡来获得分散液。
接下来,进行加热工序,其使用加热装置加热分散液,并进行加热提取。
此外,进行提取工序,其对分散液进行离心分离,得到上清液作为裸藻的水性溶剂提取物。
在加热工序中,加热装置的设定温度可以设置为室温以上,例如,20℃以上且50℃以下、50℃以上且80℃以下、80℃以上且100℃以下、100℃以上且120℃以下、120℃以上且150℃以下、150℃以上且200℃以下。
在加热工序中,当裸藻水性溶剂分散液添加到密闭容器中时,加热装置的设定温度与裸藻水性溶剂分散液的温度一致。
另外,在加热工序中,当将裸藻水性溶剂分散液放入开放容器中时,裸藻水性溶剂分散液的温度根据开放容器周围的环境气压而确定,但在大气压的情况下,温度最高约为100℃。
在加热工序中,当将裸藻水性溶剂分散液放入开放容器中时,同时进行加热工序和裸藻水性溶剂提取物的浓缩工序。
裸藻的水性溶剂提取物可以通过一般分离方法代替对分散液进行离心分离来获得。例如,对分散液进行过滤而获得的滤液可用于获得裸藻的水性溶剂提取物。
此外,还可以添加水性溶剂进行振荡,直接将获得的分散液作为裸藻水性溶剂提取物,不进行离心分离或过滤等。
可以进行进一步分级工序,其通过适当的分离手段(例如,分配提取、凝胶过滤、硅胶层析、反相或正相高效液相层析等),将获得的裸藻水性溶剂提取物进一步分级为活性更高的级分。
另外,可以进行对获得的裸藻水性溶剂提取物或级分进行浓缩的浓缩工序和/或使水性溶剂蒸发进行干燥的干燥工序。
如上所述,得到的裸藻的水性溶剂提取物用作本实施方式的脂肪细胞分化抑制剂、PPARγ表达抑制剂、C/EBPα表达抑制剂、抗肥胖剂和抗代谢综合征剂。
实施例
在下文中,将基于具体实例具体对本发明进行说明,但是本发明不限于这些。
在以下试验例中,确认了:裸藻的热水提取物(实施例1)、裸藻在室温和不同的温度(25℃,50℃,75℃,95℃,120℃)下进行提取得到的裸藻水提取物或热水提取物(实施例2~6),对于使用了人皮下脂肪来源干细胞的向脂肪细胞分化产生的影响,由此,研究了向脂肪细胞的分化抑制效果高的裸藻的提取方法。
此外,通过确认裸藻热水提取物对作为脂肪细胞分化的主要调节子的PPARγ基因和C/EBPα基因的表达水平产生的影响,研究脂肪细胞分化抑制的机制。
<实施例1>
向0.5g的裸藻粉末(Euglena Gracilis,EU-1593,由Euglena(股份公司)制造)中加入20ml超纯水并振荡,使其均匀地分散,然后,使用干热灭菌器进行加热提取(95℃,2小时)。通过离心分离(4000rpm、3分钟、25℃)对获得的上清液进行分离,并用0.45μm无菌过滤器过滤,制备裸藻热水提取物(裸藻热水提取液、原液)。将该提取液用作脂肪细胞分化抑制剂。
<实施例2>
向0.5g的裸藻粉末(Euglena Gracilis,EU-1593,由Euglena(股份公司)制造)中加入20ml超纯水并振荡,使其均匀地分散,然后,在室温(25℃)下提取2小时。通过离心分离(4000rpm、3分钟、25℃)对获得的上清液进行分离,并用0.45μm无菌过滤器过滤,制备裸藻水提取物(裸藻水提取液、原液)。将该提取液用作脂肪细胞分化抑制剂。
<实施例3~5>
向0.5g的裸藻粉末(Euglena Gracilis,EU-1593,由Euglena(股份公司)制造)中加入20ml超纯水并振荡,使其均匀地分散,然后,使用干热灭菌器,在各温度下(实施例3:50℃、实施例4:75℃、实施例5:95℃)下进行热水提取2小时。通过离心分离(4000rpm、3分钟、25℃)对获得的上清液进行分离,并用0.45μm无菌过滤器过滤,制备裸藻热水提取物(裸藻热水提取液、原液)。将该提取液用作脂肪细胞分化抑制剂。
<实施例6>
向0.5g的裸藻粉末(Euglena Gracilis,EU-1593,由Euglena(股份公司)制造)中加入20ml超纯水并振荡,使其均匀地分散,然后,使用高压蒸汽灭菌器进行加热提取(120℃、20分钟)。通过离心分离(4000rpm、3分钟、25℃)对获得的上清液进行分离,并用0.45μm无菌过滤器过滤,制备裸藻热水提取物(裸藻热水提取液、原液)。将该提取液用作脂肪细胞分化抑制剂。
<试验例1使用脂肪来源干细胞的裸藻热水提取物的脂肪分化抑制试验>
作为脂肪来源干细胞增殖培养基(增殖培养基),使用含有DMEM、αMEM、1%FBS、ITS-X、10ng/mL b-FGF和氢化可的松的培养基。
作为脂肪细胞分化诱导培养基,使用含有DMEM、10%FBS、1μM地塞米松、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.2mM吲哚美辛、10μg/mL胰岛素、33μM生物素的培养基。
作为脂肪细胞分化维持培养基,使用含有DMEM、10%FBS、10μg/mL胰岛素、33μM生物素的培养基。
(细胞的制备)
1)将9ml增殖培养基添加于15ml管中。
2)从液氮中取出人皮下脂肪来源的干细胞(Lonza公司、PT-5006;下文称为ASC)的冷冻安瓿。
3)置于37℃水浴中1~2分钟,使其融化直到冰块变为指尖左右大小。
4)用酒精擦拭取样并放入干净的工作台。
5)将冰块溶解在1)中的培养基中,并全部回收于1)的15ml管中。
6)以1200rpm离心3分钟。
7)用吸气器除去上清液,加入500μl~1ml曾殖培养基并使细胞悬浮。
8)将台盼蓝和细胞悬浮液各10μl混合并置于单室计数器中。
9)使用显微镜计数细胞数。
10)将细胞以3-5×105个细胞/皿接种在培养皿中。
11)在CO2培养箱(37℃,5体积%CO2)中培养细胞3天。
使用根据上述步骤制备的人皮下脂肪来源干细胞,按照图2所示的步骤进行裸藻热水提取物的脂肪分化抑制试验。试验步骤具体如下所示。
(3天前:细胞播种)
1)通过显微镜确认细胞。
2)用吸气器除去细胞上清液,加入5ml PBS(-)。
3)用吸气器除去PBS(-),滴加1ml胰蛋白酶溶液(0.25%(w/v)胰蛋白酶-1mM EDTA(和光纯药株式会社制造)。
4)将其在CO2培养箱(37℃、5体积%CO2)中静置2分钟。
5)用显微镜观察细胞,确认细胞变圆并分散。
6)加入2ml 10%FBS、DMEM,将细胞回收在15ml管中。
7)以1200rpm离心3分钟进行分离。
8)除去上清液,再次使其悬浮于增殖培养基中,用血细胞计数器计数细胞数。
9)用增殖培养基进行调节使得成为25000个细胞/孔,并在24孔板的各孔中接种500μl。
10)静置于CO2培养箱中。
11)将细胞在CO2培养箱(37℃、5体积%CO2)中培养3天。
(第0天:诱导脂肪分化/添加裸藻提取物)
1)在脂肪细胞分化诱导培养基中,添加各实施例的裸藻提取物,制备添加裸藻提取物的培养基溶液,其中,含有指定浓度的裸藻提取物。
2)用吸气器除去培养上清液,各加入500μl的1)中制备的添加裸藻提取物的培养基溶液。
3)将脂肪细胞分化诱导培养基加入对照中。
4)将细胞在CO2培养箱(37℃、5体积%CO2)中培养7天。
5)间隔2~3天更换一次培养基。
(第7天:诱导脂肪分化/添加裸藻提取物)
1)在脂肪细胞分化维持培养基中,添加各实施例的裸藻提取物,制备添加裸藻提取物的培养基溶液,其中,含有指定浓度的裸藻提取物。
2)用吸气器除去培养上清液,各加入500μl的1)中制备的添加裸藻提取物的培养基溶液。
3)将脂肪细胞分化维持培养基加入对照中。
4)将细胞在CO2培养箱(37℃、5体积%CO2)中培养7天。
5)间隔2~3更换一次培养基。
(第14天:细胞测量和细胞固定)
1)用显微镜确认细胞。
2)以DMEM、P/S培养基∶细胞计数试剂盒-8=24∶1的比例制备需要量的CCK-8溶液。此处,细胞计数试剂盒-8是使用水溶性四唑鎓盐WST-8作为显色试剂的活细胞数测量试剂盒(由株式会社同仁化学研究所制造)。
3)用吸气器除去培养上清液,各加入500μl的2)中制备的CCK-8溶液。
4)将其静置于CO2培养箱(37℃、5体积%CO2)中1小时。
5)将每种上清液以100μ×2孔转移至96孔板。
6)使用酶标仪对波长450nm和650nm各自波长下的吸光度进行测量。
7)用吸气器除去5)中残留的上清液,并各加入500μl的PBS(-)。
8)7)共进行两次。
9)除去PBS(-),并且各添加500μl/孔的4%多聚甲醛(PFA)来固定细胞。
10)用铝箔遮光,并在4℃下保存24小时以上。
11)根据以下方法进行油红O(Oil Red O)染色对脂肪蓄积率进行定量。
(染色和脂肪分化的定量)
油红O储备溶液在50ml管中以油红O∶异丙醇=120mg∶40ml的比例配制并在室温下储存。
将油红O染色溶液以油红O储备溶液∶超纯水=3∶2的比例混合,过滤,并立即用于下面的细胞染色。
1)除去板中的固定液。
2)用PBS(-)500μl/孔洗涤两次。
3)加入500μl/孔的60%异丙醇水溶液,使其在室温下溶解约2分钟。
4)除去60%异丙醇水溶液,并加入250μl/孔油红O染色溶液。
5)在室温下静置15分钟。
6)除去油红O染色溶液,加入500μl/孔的60%异丙醇水溶液,轻轻搅拌并洗涤。
7)除去60%异丙醇水溶液,加入500μl/孔PBS(-),拍照。
8)除去PBS(-)并加入500μl/孔的100%异丙醇以提取油红O。
9)当完成所有提取后,以各200μl/孔转移至96孔板。
10)使用酶标仪在520nm下测量吸光度。
11)将吸光度值作为脂肪蓄积量。通过转换脂肪蓄积量(油红O)/细胞数(CCK-8)计算单位细胞的脂肪蓄积量。
12)以使用脂肪细胞分化诱导培养基进行培养的对照中的脂肪蓄积率为100%,计算脂肪蓄积率。
(试验例1的结果)
通过使用实施例1的裸藻热水提取物对进行上述试验的结果进行分析,对基于裸藻热水提取物的各浓度(5体积%、10体积%、20体积%)的脂肪蓄积率进行比较的图表示于图3。
以对照中的脂肪蓄积率为100%,各浓度下的脂肪蓄积率依次为56.4%、32.5%和7.05%。
随着裸藻热水提取物浓度的增加,脂肪蓄积率降低。
这些试验进行了多次,并且获得了同样的重现性。
如图4所示,发现随着裸藻热水提取物的浓度增加,脂肪滴(被油红O染色的部分)的数量减少。
<试验2在不同温度下提取的裸藻水提取物的脂肪分化抑制试验>
使用实施例2~6的水提取物或热水提取物(实施例2:25℃、实施例3:50℃、实施例4:75℃、实施例5:95℃、实施例6:120℃)代替实施例1的裸藻热水提取物,除此以外,进行与试验例1中相同的试验。
(试验例2的结果)
对使用实施例2~6的裸藻水提取物或热水提取物的测试结果进行分析,并且对不同温度下提取的裸藻提取物或热水提取物的各浓度(5体积%、10体积%、20体积%)的脂肪蓄积率进行比较得到的图示于图5。
各温度下裸藻水提取物或热水提取物中的脂肪蓄积率随着裸藻水提取物或热水提取物的浓度增加而降低。
这些试验进行了多次,并且获得了相同的重现性。
另一方面,即使提取温度升高,脂肪蓄积率也不会大幅降低。由上述结果可知:提取物的浓度与提取温度相比对脂肪蓄积率的降低产生影响。这表明即使是50℃左右温度较低的热水提取物,也有降低脂肪蓄积率的效果。
如图6所示,可知:在各温度的水提取物或热水提取物中,随着裸藻水提取物或热水提取物的浓度增加,脂肪滴减少。
<试验例3裸藻热水提取物和EPA的脂肪分化抑制试验>
使用实施例1的裸藻热水提取物和已知具有脂肪分化抑制功能的二十碳五烯酸(EPA)作为比较例1,进行与试验例1相同的试验。
(试验例3的结果)
对使用实施例1的裸藻热水提取物的试验结果和使用了比较例1的EPA的试验结果进行分析,对裸藻热水提取物(10体积%浓度、20体积%浓度)与EPA(10μM、50μM、100μM)的脂肪蓄积率进行比较得到的图示于图7中。
本试验的EPA添加量设定为比裸藻热水提取物中含有的EPA的量多至6倍以上。
比较例1中的脂肪蓄积率为80%以上,与实施例1的裸藻热水提取物的脂肪蓄积率相比更高。
另外,如图8所示,可知:与对照相比,脂肪滴(被油红O染色的部分)仅略微减少。
从该结果可知,在裸藻热水提取物中含有的成分中,EPA以外的活性成分,特别是未确定的活性成分,具有抑制脂肪细胞分化的作用。
<试验例4改变裸藻热水提取物的添加时间的脂肪分化抑制试验>
使用实施例1的裸藻热水提取物,并改变将裸藻热水提取物添加到培养基中的时间,除此以外,进行与试验例1相同的试验。
具体而言,当使用脂肪细胞分化诱导培养基进行培养0~7天设为前半部分,使用脂肪细胞分化维持培养基进行培养7至14天设为后半部分时,i)前半部分和后半部分中均添加了裸藻热水提取物,(ii)仅在前半部分中添加了裸藻热水提取物,以及(iii)仅在后半部分中添加了裸藻热水提取物,在上述情况下比较脂肪蓄积率。
(试验例4的结果)
分析实验4的结果,对改变添加裸藻热水提取物的时间的情况下对脂肪蓄积率进行比较得到的图示于图9中。
可知:裸藻热水提取物添加时间为(i)前半部分和后半部分的情况下,以及(ii)仅前半部分的情况下,脂肪蓄积率相同。另一方面,可知:当添加时间为(iii)仅后半部分时,脂肪蓄积率高。该结果表明,裸藻热水提取物的脂肪分化抑制作用在脂肪分化诱导的前半部分发挥其效果。
如图10所示,可知:裸藻热水提取物的添加时间为(i)前半部分和后半部分和(ii)仅前半部分,与(iii)添加时间为仅为后半部分的情况相比,添加脂肪滴减少。
<试验例5通过实时PCR(real time PCR)进行的基因表达分析>
为了对作为脂肪细胞分化的主要调节子的PPARγ基因和C/EBPα基因的表达进行研究,使用实施例1的裸藻热水提取物进行与试验例1中相同的试验。具体而言,在第0天添加裸藻热水提取物,使用分化诱导培养基进行培养,在培养的第1、2、3、6和13天,从细胞中提取总RNA,并使用通过逆转录反应获得的cDNA,使用实时PCR,对PPARγ基因和C/EBPα基因的表达水平进行测定。
(RNA回收和提取)
1)除去培养基并用PBS(-)洗涤两次。
2)除去PBS(-)后,加入0.5ml总RNA提取试剂(RNAiso Plus,Takara Bio株式会社制造),转移至1.5ml微量管(可以在-80℃保存)。
3)加入100μl氯仿(0.2倍量的总RNA提取试剂),用涡旋混合器搅拌15秒钟,然后在室温下静置5分钟。
4)在12000g,4℃下进行离心分离15分钟。
5)在离心过程中,在新的1.5ml微量管中制备500μl异丙醇。
6)离心后,将透明层转移到1.5ml微量管中,用涡旋混合器搅拌10秒钟,并在室温下静置10分钟。
7)在12000g、4℃下离心分离15分钟。
8)在离心分离过程中,制备75%乙醇水溶液并置于冰上。
9)离心分离后,除去上清液,加入500μl的75%乙醇,用涡旋混合器稍微搅拌混合物。
10)在7500g,4℃下离心分离5分钟。
11)尽可能不吸沉淀、去除上清液。
12)将其在室温下干燥10~30分钟。
13)加入20μl无菌水,通过移液几次使沉淀溶解,并储存在-20℃。
(cDNA合成)
1)用分光光度计(NanoDrop ND-2000C,Thermo公司制造)测量浓度。
2)将5×PrimeScript RT Master Mix和2μl总RNA加入到微量管中,加入10μl无菌水并混合。
3)通过将样品置于热循环仪(TP600,由TaKaRa公司制造)中,在37℃下保持15分钟,在85℃下保持5秒钟,并将温度降低至25℃来进行逆转录反应。
4)加入90μl灭菌水进行10倍稀释并储存在-20℃。
(通过实时PCR进行基因表达分析)
1)使用的孔数+1孔容量的引物SYBR mix通过以下列比例混合试剂来制备。
PowerUp SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems公司制造):5μl×孔数
引物:0.6μl×孔数
无菌水:1.4μl×孔数
2)将各样品以3μl/孔加入96孔板中,将灭菌水添加到阴性对照(NC)中。
3)以7μl/孔添加引物SYBR mix,并使用平板离心机(PS-020,由TOMY公司制造)进行旋转下降。
4)使用实时PCR装置(Step One Plus,Applied Biosystems公司制造)进行实时PCR。
作为引物,使用以下引物。
.PPARγ基因表达分析中使用的引物
PPARG-F:5’-GAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAAT-3’(SEQ ID NO:1)
PPARG-R:5’-TCTTTATTCATCAAGGAGGCCAGCATT-3’(SEQ ID NO:2)
·C/EBPα基因表达分析中使用的引物
CEBPA-F:5’-GGGTCTGAGACTCCCTTTCCTT-3’(SEQ ID NO:3)
CEBPA-R:5’-CTCATTGGTCCCCCAGGAT-3’(SEQ ID NO:4)
作为内标,对作为管家基因的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA同样地进行扩增。
·管家基因(GAPDH)的表达分析中使用的引物
GAPDH-F:5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’(SEQ ID NO:5)
GAPDH-R:5’-TCTTCTGGGTGGCAGTGATG-3’(SEQ ID NO:6)
(试验例5的结果)
培养第0天PPARγ基因的表达水平设为1时,对第1天、第2天、第3天、第6天和第13天的PPARγ基因表达水平进行比较得到的结果示于图11。
可知:当加入10体积%和20体积%的裸藻热水提取物时,第1天、第2天、第3天、第6天和第13天的PPARγ基因表达水平相对于各天数的对照,PPARγ基因的表达水平显著降低。
此外,可知:随着裸藻热水提取物的浓度增加,PPARγ基因的表达受到抑制。
培养的第0天的C/EBPα基因的表达水平设为1时,对第1天、第2天、第3天、第6天和第13天的C/EBPα基因表达水平进行比较的结果示于图12。
可知:当热水提取物添加量为10体积%和20体积%时的C/EBPα基因表达水平,相对于在诱导脂肪细胞分化的培养基中进行培养的对照,C/EBPα基因表达水平显著降低。
此外,可知:随着裸藻热水提取物浓度的增加,C/EBPα基因的表达受到抑制。
从试验例5的结果可知,通过抑制PPARγ基因和C/EBPα基因的表达,抑制向脂肪细胞的分化,导致脂肪蓄积量减少。
Claims (9)
1.一种脂肪细胞分化抑制剂,其特征在于含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分。
2.根据权利要求1所述的脂肪细胞分化抑制剂,其特征在于所述裸藻水性溶剂提取物是裸藻水提取物。
3.根据权利要求2所述的脂肪细胞分化抑制剂,其特征在于所述裸藻水提取物是裸藻热水提取物。
4.一种PPARγ表达抑制剂,其特征在于含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分。
5.一种C/EBPα表达抑制剂,其特征在于含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分。
6.一种用于抑制脂肪细胞分化的食品组合物,其特征在于含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分,用于抑制脂肪细胞的分化。
7.一种用于抑制脂肪细胞分化的化妆材料组合物,其特征在于含有裸藻水性溶剂提取物作为活性成分,用于抑制脂肪细胞的分化。
8.一种脂肪细胞分化抑制剂的制造方法,其特征在于包括:
向裸藻中加入水性溶剂、振荡,获得分散液的分散液制备工序;
通过对所述分散液进行离心分离,获得上清液作为裸藻的水性溶剂提取物的提取工序。
9.根据权利要求8所述的脂肪细胞分化抑制剂的制造方法,其特征在于在所述分散液制备工序之后、所述提取工序之前,进行加热所述分散液的加热工序。
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