CN104826087B

CN104826087B - 复合辣木多肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104826087B
Application number: CN201510191565.7A
Authority: CN
Inventors: 李延平; 宁慧坚
Original assignee: Zhanjiang Tongling Medical And Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Zhanjiang Tongling Medical And Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2015-04-21
Filing date: 2015-04-21
Publication date: 2017-12-05
Anticipated expiration: 2035-04-21
Also published as: CN104826087A

Abstract

本发明公开了复合辣木多肽及其制备方法和用途，从辣木原材料中通过酶解法提取出辣木多肽，并添加丹参、人参、枸杞提取物等中药制备成复方制剂，进一步在药物、食品等领域将其应用，使得辣木内的有效成分得到充分的利用。本发明采用生物工程技术方法将辣木蛋白在受控蛋白酶作用下，低温酶解，所得到的小分子多肽，分子量为1～10KD，得到的复合辣木多肽原料，有抗氧化、保护心脑细胞抗超氧自由基损伤，防治心脑血管疾病，缓解疲劳，调解人体的代谢平衡的作用，不仅可以用于药品，制成医药制剂(片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等剂型)，还能用于保健食品、食品及化妆品。

Description

复合辣木多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及复合辣木多肽及其制备方法和应用。

背景技术

辣木为辣木科辣木属植物，起源于印度西北部的喜马拉雅山南麓。研究发现，辣木除了具备丰富的营养外，还用作治疗糖尿病、高血压、皮肤病、免疫力低下、贫血、骨骼疾病、抗忧郁、关节炎、消化器官肿瘤等疾病。辣木作为一种功能性植物，有着广阔的的开发前景。辣木全株都可利用，营养物质种类多，辣木含粗蛋白为23.0％～43.5％，富含V_A、V_B、V_C、V_E及钙、钾、铁等矿质营养元素，此外还含有人体必需的各种氨基酸和微量元素等，其营养价值与现代营养学家称为“人类营养的微型宝库”。我国广东的韶关和湛江、云南、海南和贵州等地现有引种。

目前，人们对于辣木的开发利用还处于比较粗放的阶段，主要采用将其种子、叶子等粉碎后直接添加到食物或保健品中的方式，这种方法的缺点在于对于营养成分的有效利用不够，且产品内的有效成分也不太明确。因此人们也开始尝试利用酶解等方法将辣木中的有效成分、特别是蛋白质进行分离，如中国发明专利CN 102669423 A《一种辣木提取物及其制备方法和辣木饲料添加剂》，其借助特定的蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的酶解作用，将辣木叶本身大块的、分子结构复杂的成分充分地水解成较小、易溶于水、生物利用度高的小分子活性物质，然后通过水提醇沉方法获得高收率和高质量的辣木提取物。该方法用辣木叶为起始原料，因酶解温度低、时间短，所得沉淀得到的酶解物分子量仍然较大，主要为蛋白质，作为动物饲料添加剂使用。而中国发明专利CN 103652930 A《一种辣木钙全营养素及其制备方法》是采用生物质酶酶解和纳米双重破壁以及全程低温萃取辣木中的有效成分，然而该方法制备的仍然是100～200毫微米的超微辣木粉末而不是多肽。

辣木中含有粗蛋白为23.0％～43.5％，比奶粉蛋白含量(21％)还高，不含胆固醇，这部分蛋白质经酶解后得到的小分子多肽具有较高的生物活性，促进人体的新陈代谢，抗氧化、保护心脑细胞的抗超氧自由基损伤，防治心脑血管疾病，缓解疲劳。多种植物中的多肽是生物体内重要的低分子物质，具有许多生理功能，除作为RNA、DNA的前体外，也作为生物化学过程的调节物质参与体内代谢，在细胞结构、代谢和调节功能方面起着重要作用，因此多肽的研究利用已成为生物制品研究的方向。而传统中药材丹参含有丹参酮、原儿茶醛、原儿茶酸、丹参素、维生素E等；人参为五加科植物人参的干燥根，有人参皂甙、单糖、人参酸、多钟维生素、多种氨基酸等；枸杞为茄科植物枸杞的成熟果实，含有枸杞多糖，酸浆红素、隐黄质、东莨菪素、胡萝卜素、核黄素、烟酸、维生素B1、B2及C.种子含氨基酸等。目前，以辣木为原材料进行深加工获得小分子多肽，并结合传统中医制备复方产品的相关研究尚未见到记载。

因此，有必要在这一方向展开进一步的研究。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了复合辣木多肽及其制备方法和用途，通过从辣木原材料中通过酶解法提取出辣木肽，并添加中药制备成复方制剂，进一步在药物、食品等领域将其应用，使得辣木内的有效成分得到充分的利用。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

复合辣木多肽的制备方法，以辣木为主要原料，在受控蛋白酶作用下，低温酶解制备为分子量为1～10KD的小分子多肽，按比例添加丹参、人参、枸杞提取物，混匀后喷雾干燥，得到复合辣木多肽原料；具体制备过程包括以下步骤：

(1)取辣木原料，筛选、清洗、50～60℃干燥、粉碎成10目以下颗粒；

(2)将辣木颗粒加入其重量5～10倍的纯净水或蒸馏水，加热至40～60℃，搅拌下，调节pH值为5.5～6.5，加入蛋白酶，按重量份计辣木与酶的比例为100：0.1～1，酶解4～6小时，分离上清液；

(3)将上一步所得的剩余残渣加入3～5倍的纯净水或蒸馏水，按照第(2)步方法对其进行2次酶解，分离上清液；

(4)合并(2)和(3)两步酶解所得的上清液，70～80℃灭酶30～50分钟，低温真空浓缩，得到辣木多肽浓缩液；

(5)按照重量份计以1:0.2:0.5的比例取丹参、人参、枸杞，清洗、浸泡、水煎、过滤、浓缩至比重为1.12～1.20的浓缩液；

(5)将辣木多肽浓缩液与丹参、人参、枸杞浓缩液按30～60％：40～70％的重量百分比混合均匀，喷雾干燥，得到固体粉末或颗粒状的复合辣木多肽。

其中，所述辣木原料为按照1:5:6:1重量比的辣木根、茎、叶、花。

其中，所述蛋白酶为选自枯草杆菌蛋白酶、糜蛋白酶和磷酸二酯酶中的一种或多种。

本发明还包括按照上述复合辣木多肽的制备方法制备所得的复合辣木多肽。

上述复合辣木多肽应用于包括片剂、胶囊、颗粒剂、口服液剂型的医药制剂、保健食品及化妆品中。

本发明采用生物工程技术方法将辣木中含有的辣木蛋白在受控蛋白酶作用下，低温酶解，得到分子量为1～10KD的小分子多肽，具有生物活性高，用量小，人体容易吸收、安全、有效、质量可控的特点。本发明所提供的复合辣木多肽经缓解体力疲劳和过氧化物诱发超氧自由基损伤心肌细胞实验证明：本发明得到的复合辣木多肽对小鼠有较强的缓解体力疲劳作用、能提高缺氧耐受力。复合辣木多肽可明显延长小鼠负重游泳时间,乳酸值下降，血清尿素氮降低,肝糖原升高；心肌组织超氧化歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性增强、丙二醛含量降低。实验证明复合辣木多肽有缓解体力疲劳的作用，对过氧化物诱发超氧自由基损伤心肌细胞具有保护作用。制得的医药制剂有促进人体的新陈代谢，抗氧化、缓解体力疲劳的作用，对人体疾病衰老过程中抗氧化能力减弱产生的超氧自由基过多损伤心、脑组织细胞均有保护作用，能防治心、脑血管系统疾病。

本发明的有益效果在于：1)本发明采用酶对辣木进行选择性受控水解，其生产工艺简单、成本低。2)本发明提供的产品为分子量较小的多肽，便于人体的吸收利用；3)本发明取材自辣木植株的各个部分，材料获取容易，而非限定于对辣木的种子等特定部分进行取材。4)本发明得到的复合植物多肽来源于纯植物配方，通过急性毒性实验结果表明，产品无毒副作用，安全可靠。

附图说明

附图通过照片说明复合辣木多肽对过氧化物产生的超氧自由基损伤心肌细胞的保护作用。图1-4为各组培养心肌细胞在倒置显微镜下观察图片；图5-8为各组培养心肌细胞钙离子荧光探针AM-Fluo-3光染料钙超载图片。

图1-正常组心肌细胞照片；

图2-过氧化物产生超氧自由基损伤心肌细胞组照片；

图3-复合辣木多肽中剂量预保护后，再用过氧化物产生超氧自由基损伤心肌细胞组照片；

图4-复合辣木多肽高剂量预保护后，再用过氧化物产生超氧自由基损伤心肌细胞组照片。

图5.正常组心肌细胞光染料钙超载图片；

图6.过氧化物产生超氧自由基损伤心肌细胞组光染料钙超载图片；

图7.复合辣木多肽中剂量预保护后产生超氧自由基损伤心肌细胞组光染料钙超载图片；

图8.复合辣木多肽高剂量预保护后产生超氧自由基损伤心肌细胞组光染料钙超载图片。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明，实施例是为了便于更好地理解本发明及其应用，而不应该看做对本发明保护范围的限制，本发明的保护范围以权利要求书记载的内容为准。

实施例一复合辣木多肽的制备

1)原料前处理：按照1:5:6:1重量比取辣木根、茎、叶、花，筛选、清洗、50～60℃恒温干燥，粉碎成10目以下颗粒。

2)酶解反应：将前处理原料放入酶解罐中加入其重量5～10倍的纯净水，加热至40～60℃，搅拌下，调解pH值为5.5～6.5，按辣木：酶以100：0.1～1的重量比添加蛋白酶，搅拌下酶解4～6小时，分离上清液；所述蛋白酶为选自枯草杆菌蛋白酶、糜蛋白酶和磷酸二酯酶中的一种或多种。

3)二次酶解：将剩余残渣加入3～5倍的40～60℃蒸馏水，进行2次酶解，取上清液，方法同前一步的酶解方法；

4)浓缩：合并二次所得酶解液，70～80℃灭酶30～50分钟，低温真空浓缩，得到辣木多肽浓缩液；

5)丹参、人参、枸杞浓缩液的制备：按照1:0.2:0.5重量比取中药材制丹参、人参、枸杞，清洗，浸泡，水煎，过滤，浓缩至比重为1.12～1.20的中药浓缩液；

6)复合辣木多肽产品的获得：将上述辣木多肽浓缩液与丹参、人参、枸杞浓缩液按重量百分30～60％：40～70％，充分混匀，喷雾干燥，得到复合辣木多肽固体粉末或颗粒原料。

将上述复合辣木多肽粉末或颗粒制成医药制剂(片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等剂型)，还可以其为原料生产保健食品、食品及化妆品。

实施例2：复合辣木多肽片剂

按重量份计，复合辣木多肽颗粒50-80份，加入微晶纤维素5—20份、硬脂酸镁1—3份，混匀，压片，0.3g/片，包装：30片/瓶。用法用量：早晚各一次，每次3片。实施例3复合辣木多肽胶囊

按重量份计，复合辣木多肽粉50—80份，加入糊精5—20份、硬脂酸镁1—2份，混匀，充填胶囊，0.3g/粒，铝箔板包装，10粒/版。用法用量：早晚各一次，每次3粒。

实施例4复合辣木多肽口服液

按重量份计，复合辣木多肽粉10—40份，加入蔗糖5—10份，纯净水80—90份，搅拌混匀，除菌、过滤，灌装，20ml/瓶，灭菌121℃,30min，包装：10瓶/盒。用法用量：早晚各一次，每次1瓶。

实施例5复合辣木多肽饼干

按重量份计，复合辣木多肽粉5—30份，加入面粉70—95份，加入水、糖、小苏打，搅拌，入模具，加热、烘烤、冷却，制得复合辣木多肽饼干。

实施例6复合辣木多肽护肤霜

按重量份计，取硬脂酸5％、十六醇4％、单甘脂3％、硅油2％、棕榈酸异丙酯9％、甘油12％以及无菌水65％，以上原料放入容器中，加热下缓慢搅拌，当温度升至60—80℃时原料完全融合，用高压均质机10000r/min，均质，3min，将容器放入60—80℃水浴中消泡。常温下搅拌，温度低于45℃时，加入20％—30％的复合辣木多肽浓缩液，继续搅拌将至室温，放置一天，即可使用。

下面是对本发明所提供的复合辣木多肽应用于小鼠的实验情况记录。

1)复合辣木多肽对小鼠缓解体力缓解体力疲劳实验(负重游泳)。

试验分组：选用的SPF级KM健康小鼠(5-6周)60只，体重18－22g，雄性。随机分为6组，每组10只，分为正常对照组、疲劳组、阳性对照组、复合辣木多肽低、中、高剂量组。其中，正常对照组不负重正常游泳；疲劳组不给药负重游泳；阳性对照组给洋参口服液负重游泳；复合辣木多肽组给予不同剂量药物负重游泳。所有受试动物均在室温22—27℃,相对湿度为60％—70％的实验室内饲养,光照时间随同自然变化,以基础饲料和凉开水正常喂养,自由饮食。复合辣木多肽给药剂量：0.03g/kg(低剂量)、0.33g/kg(中剂量)、0.99g/kg(高剂量)。给药方法：复合辣木多肽粉末以1％的灭菌的阿拉伯胶制成(高、中、低)三种混悬液，灌胃给药；阳性对照组：采用洋参口服液，20ml/kg；正常对照组以15ml/kg无菌水灌胃。每天给药一次，连续灌胃30天。

负重游泳方法：第二周30min/d负重游泳(正常对照除外)，周日休息一天，第三、四周，每周递增10min/d，最后休息三天后进行负重游泳试验。

检测指标及实验方法：测定血清尿素氮、肝糖原、乳酸，分离心肌组织，天平称重，以0.9％的生理盐水制备匀浆液测定心肌组织超氧SOD和GSH-Px活性及MDA含量。

实验结果如下表所示。

表1：复合辣木多肽对小鼠负重游泳时间、尿素氮、肝糖原、含量的变化n＝10

注：*与洋参口服液组比较P<0.05；▲与疲劳组比较P<0.05；

实验说明，复合辣木多肽可明显延长小鼠负重游泳时间,使高剂量组小鼠运动后乳酸升高值下降。血清尿素氮降低,肝糖原升高；复合辣木多肽对高、中剂量组小鼠延长负重游泳时间,小鼠运动后血乳酸量、肝糖原消耗量、血清尿素氮与对照组相比均有明显减少；说明复合辣木多肽有较好缓解体力疲劳的作用。

表2：复合辣木多肽对小鼠负重游泳心肌组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响n＝10

▲与疲劳组比较P<0.05

实验表明心肌组织超氧化歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性增强、丙二醛含量降低，说明复合辣木多肽对机体具有提高缓解体力疲劳的作用。

2)过氧化物诱发超氧自由基损伤心肌细胞实验：

分离、培养心肌细胞：取新生SD大鼠的乳鼠,在无菌条件下取出心脏,剪碎,加入0.125％胰蛋白酶消化液消化30min,上清液吸出,用Hank.s液清洗、离心3次。清洗后的细胞用1640培养液制成混悬液,加入15％小牛血清,分装于6孔培养板内,每孔细胞计数按10⁶计算，每组一板。随机分成6组：1.正常对照组；2.过氧化物损伤心肌组；3.阳性对照药；4.过氧化物损伤心肌细胞+复合辣木多肽低剂量组(2mg.L^-1)；5.过氧化物损伤心肌细胞+复合辣木多肽中剂量组(10mg.L^-1)；6.过氧化物损伤心肌细胞+复合辣木多肽高剂量组(50mg.L^-1)。置于37℃、5％C0₂培养箱中，培养36h的细胞放在倒置显微镜下观察,视野清晰,细胞生长良好,大部分细胞有搏动。实验3、4、5、6组分别加入阳性对照药40mg/L，复合辣木多肽2、10、50mg/L剂量，预保护心肌细胞，定期换液，继续培养72h，加入终浓度68μmol/L H₂0₂，反应3h，镜下观察心肌细胞形态学变化，加入钙离子荧光探针AM-Fluo-3光染料观察荧光强度钙超载的变化。

复合辣木多肽对超氧自由基损伤心肌细胞的保护作用：将培养好心肌细胞分组后保留正常对照组，其它各组，过氧化物损伤心肌细胞后，产生超氧自由基越多，损伤心肌细胞越严重，加入终浓度过氧化物68μmol/L H₂0₂，反应3h，镜下观察心肌细胞形态学变化，加入钙离子荧光探针AM-Fluo-3光染料观察钙超载变化，其原理是钙离子荧光探针负载细胞时,可穿透细胞膜,细胞内的脂酶将其水解,释放出Fluo-3,与细胞内钙离子结合,产生荧光。

实验结果

复合辣木多肽对过氧化物产生的超氧自由基损伤心肌细胞保护作用的效果演示，见图1-8，图1-4为各组培养心肌细胞在倒置显微镜下观察图片；图5-8为各组培养心肌细胞钙离子荧光探针AM-Fluo-3光染料钙超载图片。

如图1所示：正常组心肌细胞；细胞伸出伪足相互接触交织成网，形成细胞簇，呈放射状排列，搏动频率73±5次/min。

如图2所示：过氧化物产生超氧自由基损伤心肌细胞组，心肌细胞搏动频率降低，40±7次/min，胞质出现空泡和粗大颗粒样物质，损伤严重。

如图3所示：复合辣木多肽中剂量预保护后再用过氧化物产生超氧自由基损伤心肌细胞组，心肌细胞搏动频率比损伤组有所增加，43±8次/min，可见伸出伪足相互接触交织成网结构。

如图4所示：复合辣木多肽高剂量预保护后再用过氧化物产生超氧自由基损伤心肌细胞组，心肌细胞搏动频率仅次于正常组，70±6次/min，可见伸出伪足相互接触交织成网结构，有细胞簇，呈放射状排列。

如图5所示：正常组，可以见荧光均匀分布于细胞内,细胞核内荧光稍强于细胞质胞浆；

如图6所示：过氧化物产生超氧自由基损伤心肌细胞组，细胞荧光强度增强、面积增大，表明心肌细胞内钙超载严重；

如图7所示：复合辣木多肽中剂量预保护后产生超氧自由基损伤心肌细胞组，与损伤组比较细胞荧光强度减弱、面积缩小，说明心肌细胞内钙超载有抑制作用；

如图8所示：复合辣木多肽高剂量预保护后产生超氧自由基损伤心肌细胞组，与正常组比较细胞荧光强度相近，说明心肌细胞内钙超载有明显的抑制作用。

根据上述小鼠缓解体力疲劳和过氧化物诱发超氧自由基损伤心肌细胞实验结果证明：复合辣木多肽能抗氧化、保护心脑细胞抗超氧自由基损伤，防治心脑血管疾病，缓解疲劳、调解人体的代谢平衡的作用。这为将其应用到防治人类心脑血管疾病提供了可能。

Claims

1.复合辣木多肽的制备方法，以辣木为主要原料，在受控蛋白酶作用下，低温酶解制备为分子量为1～10KD的小分子多肽，按比例添加丹参、人参、枸杞三种的提取物，混匀后喷雾干燥，得到复合辣木多肽原料；具体制备过程包括以下步骤：

(6)将辣木多肽浓缩液与丹参、人参、枸杞三种的浓缩液按30～60％：40～70％的重量百分比混合均匀，喷雾干燥，得到固体粉末或颗粒状的复合辣木多肽。

其中，所述辣木原料为按照1:5:6:1重量比的辣木根、茎、叶、花；所述蛋白酶为选自枯草杆菌蛋白酶、糜蛋白酶和磷酸二酯酶中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述复合辣木多肽的制备方法制备所得的复合辣木多肽。

3.根据权利要求2所述的复合辣木多肽的应用，其特征在于，将所述复合辣木多肽应用于包括片剂、胶囊、颗粒剂、口服液剂型的医药制剂、保健食品及化妆品中。