CN110734869B - 推迟老化的益生菌株及其组合物与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于微生物及其用途，尤其是关于推迟老化的益生菌株及其组合物与用途。本发明提供一种推迟老化的益生菌及其组合物与用途，该益生菌是植物乳杆菌DSM 33106，其具有提升粒线体活性、提升抗老化基因表现、提升与调控NAD+相关的基因表现、提升与调控粒线体活性相关的基因表现、改善认知功能的感知与执行能力、以及提高肠道菌相丰富度的功效。
Description
技术领域
本发明是关于微生物及其用途，尤其是关于推迟老化的益生菌及其组合物与用途。
背景技术
在生物学及医学上，老化(aging)是指一个生物体的生理状态随时间而恶化的现象，老化会造成身体各部分组织或器官机能衰退或功能减弱，使得生物体的健康功能变差，最后导致生物体死亡，现代人生活压力大，长期压力的累积会加速身体机能老化，也衍生出许多慢性疾病。
另外，随着保健意识的抬头及医疗技术的进步，人均寿命增长，但老化所造成的机能退化依然伴随年龄的增长而加剧，因此除了在疾病的治疗及预防外，老化的预防也是高龄社会的重要课题之一。
然而，虽然目前已研究出许多与老化相关的基因以及相关的机制，例如被称为长寿基因(longevity gene)的SIRT1基因，其所编译的蛋白质为哺乳动物中重要的NAD+依赖性去乙酰化酶，参与人体中许多重要的生理和病理过程；另外端粒的长度也被证实与一个体的寿命具有相关性。然而目前仍然没有能有效应用于推迟老化的药物或方法，大多只能建议从饮食上多摄取具抗氧化活性物质的食物，并维持适当运动与保持正常作息及心情愉悦。
综合上面所述，为了能方便又有效达到推迟老化的功效，开发一种能有效提升抗老化基因表现、调控NAD+相关的基因表现、调控粒线体活性相关的基因表现，以及改善认知功能的感知与执行能力的组合物，着实有其必要性。
发明内容
缘此，本发明的一目的在提供一种用于推迟老化的益生菌株，其中该益生菌株是为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，寄存编号是DSM 33106。
本发明的又一目的在提供一种如前述益生菌株的用途，是用于制备推迟老化的组合物。其中该益生菌株是为具有活性或去活性的菌株。
本发明的另一目的在提供一种用于推迟老化的组合物，是包含如前述的益生菌株，其中该组合物的形式为粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状的剂型，且该组合物进一步包含一医药上可接受的载体。
在本发明的一实施例中，该益生菌株是能够增加细胞粒线体活性；能够提升一肝脏细胞中的含TCP1的折迭蛋白(Chaperonin containing TCP1,CCT)基因、PTEN促进激酶(PTEN-induced putative kinase 1,Pink1)基因、帕金森氏症少年蛋白2(Parkinsonjuvenile disease protein 2,Parkin)基因、自噬作用相关基因(Autophagy-relatedgene,Atg)基因、抗衰老酶1(Sirtuin 1,SIRT1)基因、及叉头框O(Forkhead box O,FOXO)基因的表现。
在本发明的又一实施例中，该益生菌株是提升一骨骼肌细胞中的CCT基因、Pink1基因、Parkin基因、及Atg基因的表现；能够调控神经细胞中的Pink1基因、Parkin基因、及Atg基因的表现。
在本发明的又一实施例中，该益生菌株是调控人体中CCT基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg基因、SIRT1基因、叉头框O 3(Forkhead box O 3,FOXO3)基因、麸酰胺酸依赖性烟草酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(Glutamine-dependent NAD+synthetase,NADSYN)基因、粒线体核糖体蛋白5(mitochondrial ribosomal protein S5,MRPS5)基因、泛素样蛋白5(Ubiquitin-like protein 5,UBL-5)基因、超氧化物歧化酶3(Superoxide dismutase 3,SOD3)基因、端粒酶反转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)基因、端粒酶RNA模板(telomerase RNA component,TERC)基因及、端粒延伸解旋酶调节因子1(Regulatorof telomere elongation helicase 1,RTEL1)基因的表现，其中该植物乳杆菌是正调控CCT基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、UBL-5基因、SOD3基因、TERT基因、TERC基因、及RTEL1基因，且该植物乳杆菌是负调控SIRT1基因；又该植物乳杆菌是用于制备调控一个体的一细胞中的NAD+活性、及该个体的一染色体的端粒长度、减少一个体的感知功能测验反应时间、减少该个体的执行功能测验反应时间、以及提高肠道菌相丰富度的药物。
在本发明的又一实施例中，其中CCT基因包含选自于含TCP1第2次单元的折迭蛋白(Chaperonin containing TCP1 subunit 2,CCT2)基因、含TCP1第5次单元的折迭蛋白(Chaperonin containing TCP1 subunit 5,CCT5)基因、含TCP1第6A次单元的折迭蛋白(Chaperonin containing TCP1 subunit 6A,CCT6A)基因、含TCP1第7次单元的折迭蛋白(Chaperonin containing TCP1 subunit 7,CCT7)基因、含TCP1第8次单元的折迭蛋白(Chaperonin containing TCP1subunit 8,CCT8)基因及其任意组合所组成的群组；Atg基因包含选自于自噬作用相关基因1(Autophagy-related gene 1,Atg1)基因、自噬作用相关基因8(Autophagy-related gene 8,Atg8)基因及其任意组合所组成的群组。
本发明的益生菌株能有效提高肝脏细胞中粒线体的活性，以达到提升人体最大器官－肝脏的生理机能。还具有提升肝脏细胞CCT基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg基因、SIRT1基因、及FOXO基因的表现；调控骨骼肌细胞中CCT基因、Pink1基因、Parkin基因、及Atg基因的表现；调控神经细胞中Pink1基因、Parkin基因、及Atg基因的表现，以达到提升精力、肌力及记忆力的功效。还能有效增加人体中CCT基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg基因、与调节NAD+相关基因的SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、SIRT1基因、MRPS5基因、UBL-5基因及SOD3基因、与调节端粒相关基因的TERT基因、TERC基因及RTEL1基因的表现，并减少感知功能测验反应时间及执行功能测验反应时间，以提高抗老化基因表现量、提升调控NAD+相关基因以提高粒线体活性、提升调控端粒活性相关基因、改善认知功能的感知与执行能力的功效、以及提高肠道菌相丰富度。因此，本发明的植物乳杆菌DSM 33106可用于制备推迟老化的组合物的用途，且该组合物可为粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状，且可制成食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂，藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1为本发明实施例的植物乳杆菌于提升肝脏细胞中粒线体活性的直方图；**p<0.01(与控制组比较)；#p<0.05(与MRS组比较)；
图2A为本发明实施例的植物乳杆菌于提升肝脏细胞中CCTs基因表现量的直方图；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001(与控制组比较)；#p<0.05(与MRSD组比较)；
图2B为本发明实施例的植物乳杆菌于提升肝脏细胞中Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因表现量的直方图。*p<0.05、**p<0.01(与控制组比较)；#p<0.05(与MRSD组比较)；
图2C是为本发明实施例的植物乳杆菌于提升肝脏细胞中SIRT1基因及FOXO基因表现量的直方图。**p<0.01(与控制组比较)。
图3A为本发明实施例的植物乳杆菌于提升骨骼肌细胞中CCTs基因表现量的直方图；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001(与控制组比较)；#p<0.05(与MRSD组比较)；
图3B为本发明实施例的植物乳杆菌于提升骨骼肌细胞中Pink1基因、Parkin基因、及Atg1基因表现量的直方图；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001(与控制组比较)；#p<0.05(与MRSD组比较)；
图4A为本发明实施例的植物乳杆菌于提升神经细胞中CCTs基因表现量的直方图；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001(与控制组比较)；#p<0.05、##p<0.01(与MRSD组比较)；
图4B为本发明实施例的植物乳杆菌于提升神经细胞中Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因及Atg8基因表现量的直方图；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001(与控制组比较)；#p<0.05(与MRSD组比较)；
图5A为本发明实施例的植物乳杆菌于人体中调控CCTs基因表现量的直方图；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001；
图5B为本发明实施例的植物乳杆菌于人体中调控Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因表现量的直方图；*p<0.05、**p<0.01；
图6为本发明实施例的植物乳杆菌于人体中调控与NAD+相关基因的SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、SIRT1基因、MRPS5基因、UBL-5基因及SOD3基因表现量的直方图；*p<0.05、**p<0.01；
图7为本发明实施例的植物乳杆菌于人体中调控与端粒相关基因的TERT基因、TERC基因及RTEL1基因表现量的直方图；*p<0.05、**p<0.01；
图8A为本发明实施例的植物乳杆菌减少感知功能测验反应时间的直方图；*p<0.05；
图8B为本发明实施例的植物乳杆菌减少执行功能测验反应时间的直方图；*p<0.05；
图8C为本发明实施例的植物乳杆菌减少有外在干扰情况下的执行功能测验反应时间的直方图；*p＜0.05；
图9为本发明实施例的植物乳杆菌提升肠道菌相丰富度的圆饼图。
具体实施方式
本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是一种能推迟老化的益生菌株(Probiotic bacteria)。本发明是一新颖的植物乳杆菌，本文命名为TCI999(中文命名为古方菌)，于2019年5月2日寄存于DSMZ-德国微生物保藏中心，寄存编号是DSM 33106，本发明经由细胞实验与人体实验而证实植物乳酸杆菌TCI 999可增加肝脏细胞中粒线体的活性；提升肝脏细胞CCT基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg基因、SIRT1基因、及FOXO基因的表现；提升骨骼肌细胞中CCT基因、Pink1基因、Parkin基因、及Atg基因的表现；提升神经细胞中Pink1基因、Parkin基因、及Atg基因的表现，以推迟该三种细胞的老化作用，并达到提升精力、肌力及记忆力的功效。经由人体实验证实植物乳酸杆菌TCI 999可以增加人体中CCT基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg基因、与调节NAD+相关基因的SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、SIRT1基因、MRPS5基因、UBL-5基因及SOD3基因、与调节端粒相关基因的TERT基因、TERC基因及RTEL1基因的表现，并减少感知功能测验反应时间及执行功能测验反应时间，以提高人体内抗老化基因表现量、提升调控NAD+相关基因以提高人体细胞中粒线体活性、提升人体细胞中调控端粒活性相关基因、改善认知功能的感知与执行能力的功效、以及提高肠道菌相丰富度。显示本发明的植物乳杆菌TCI999可用于制备推迟老化的组合物的用途，且该组合物可为粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状，且可制成食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂，藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。
定义
益生菌株(probiotic或probiotic bacteria)是一微生物，其菌体、混合菌株、萃取物或代谢产物对于宿主本身是具有正面影响，通常源自于人体内、有益于肠道健康的活菌，亦可指外来补充、对身体可能有益的某些微生物，其中该益生菌株的代谢产物为该益生菌株的分泌物，包含培养该菌的培养液。
使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，个此之间的差异以学生t检验(student's t-test)分析。
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
实施例1本发明植物乳杆菌增加肝脏细胞中粒线体的活性的功效
本发明以人类肝癌细胞(Human hpatocellular carcinoma,HepG2)进行本发明植物乳杆菌DSM 33106对肝脏细胞中粒线体活性的测试。该人类肝癌细胞是购自美国典型培养物保藏中心(美国)，编号
HB-8065TM，细胞培养于购自Gibco(美国)含有10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum)以及90％的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，其中加入1％的青霉素-链霉素，并以MitoScreen套组(购自BDTM，美国，551302)检测粒线体的膜电位，并以Accuri C6 Plus流式细胞仪(Flow cytometry，BDTM，美国)进行侦测及分析。
将1×105个人类肝癌细胞培养于六孔培养盘的每孔中，并在37℃下培养16～18小时，再将培养本发明的植物乳杆菌DSM 33106的上清液加入细胞的培养液中处理24小时，接着去除原有的培养液，并以1mL磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline,PBS)冲洗细胞二次后，加入200μL胰蛋白酶(Trypsin)反应5分钟，使细胞由培养盘上脱落，加入适当的培养液终止反应，并将细胞连同培养液收集至15mL试管，并以300g离心5分钟后移除上清液，再于暗处以1mL磷酸盐缓冲溶液使细胞悬浮。接着使用以1:250比例混合的JC1染色溶液与JC1染色缓冲溶液将细胞染色，再以1mL磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞二次后，以流式细胞仪侦测细胞中激发波长为480nm且放射波长为510nm的荧光强度。
本发明的植物乳杆菌DSM 33106提升肝脏细胞中粒线体活性的结果如图1所示。粒线体为细胞能量制造的中心，其活性与细胞机能息息相关，研究已知粒线体活性提高能与改善细胞老化的现象。由实验结果可知，以培养本发明的植物乳杆菌DSM 33106的上清液处理过的肝脏细胞，其中粒线体活性显著地较控制组及MRS组(养菌的培养基的空白组)高约20％，此结果显示本发明的植物乳杆菌DSM 33106具有优异的提高肝脏细胞中粒线体活性的功效，能提升人体最大器官肝脏的生理机能。
实施例2本发明植物乳杆菌调控肝脏细胞中抗老基因表现的功效
为了测试本发明植物乳杆菌DSM 33106对肝脏细胞中抗老基因表现的调控，将上述人类肝癌细胞以每孔1×105个细胞量培养于含有2mL上述培养液的六孔培养盘中，并在37℃下培养16～18小时，再将细胞分成三组：(1)仅含培养液的控制组、(2)MRSD(养菌的培养基的空白组)以及(3)加入1.25％本发明的植物乳杆菌DSM 33106菌液的实验组分别处理细胞24小时后，将细胞以细胞裂解液回收细胞后，使用RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)分别收集三组人类肝癌细胞内的RNA，接着利用
III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取RNA为模板以表一中的引物黏合进行反转录作用产生相应的cDNA，接着利用ABIStepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，以及KAPASYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将三组反转录后产物分别以表一的组合引物进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reversetranscription polymerase chain reaction)试验，用以定量CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO3基因、之mRNA表现量，其中定量数值是取由阈值循环数(Ct)，而目标基因的mRNA相对量是推导自方程式2-△Ct，其中△Ct＝Ct目标基因-CtGAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，再利用Excel软件进行非成对单尾student t-test以决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。
表一、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物
CCT基因为折迭蛋白(Chaperonin)的一种，主要功能为矫正错误折迭的蛋白质，并将无法成功修复的蛋白质送进蛋白质水解酶复合体(Proteasome)中进行水解，先前研究已指若此蛋白质调控的重复使用系统发生故障，会导致错误折迭的蛋白质会聚集在细胞中，并造成细胞功能衰退及加速细胞的老化与死亡，因此被认为与个体的老化调节相关。
Pink1基因为一种位在粒线体的丝胺酸/苏胺酸蛋白激酶(Serine/threonineprotein kinase)，其功能为保护线粒体在细胞压力期间发生故障，已知该基因的突变与帕金森氏症有关，而先前研究更指出该基因的过量表现能够增加小鼠的寿命，因此也被认为与个体的老化调节有关。Parkin基因为一种存在于泛素-蛋白酶体系(Ubiquitin-proteasome system)中的酵素，并作为蛋白质分解的调节剂，已知该基因的突变与帕金森氏症有关，且先前研究亦指出增加该基因的表现量能够推迟细胞的老化作用，因此被认为与细胞的老化作用相关。Atg基因则为自噬作用相关基因，会参与细胞中废物降解和循环的自噬作用，先前研究指出该基因的过量表现，能够延长小鼠的寿命，因此被认为与细胞的老化作用相关。
SIRT1基因为哺乳动物中重要的NAD+依赖性去乙酰化酶，先前研究指出SIRT1基因的表现量下降，会倒是粒线体的生物合成功能降低，并导致产生老化的相关疾病，因此该基因已被公认为长寿基因，与老化作用的关系密不可分。FOXO基因为一种转录因子，先前研究已指出该基因为细胞老化和决定寿命长短的重要因素。
本发明的植物乳杆菌提升肝脏细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、及CCT8基因表现的结果如图2A所示；提升Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因及Atg8基因表现达的结果如图2B所示；提升SIRT1基因及FOXO基因表现的结果如图2C所示。人类肝癌细胞经本发明的植物乳杆菌DSM 33106处理后，CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、及CCT8基因的表现量分别约为控制组的1.5倍、1.2倍、1.8倍、2倍及1.8倍；而Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因及Atg8基因的表现量分别约为控制组的2.1倍、1.5倍、2倍及1.6倍；SIRT1基因及FOXO基因的表现量分别约为控制组的1.3倍及1.1倍。此结果显示本发明的植物乳杆菌DSM 33106具有优异地提高肝脏细胞中抗老化基因表现量的功效，能有效提高肝脏细胞推迟老化的效果。
实施例3本发明植物乳杆菌调控骨骼肌细胞中抗老基因表现的功效
为了测试本发明植物乳杆菌DSM 33106对骨骼肌细胞中抗老基因表现的调控，以小鼠肌肉纤维母细胞(C2C12)进行测试，其中该C2C12细胞是购自美国典型培养物保藏中心(美国)，编号
CRL-1772TM，细胞培养于如实施例1所述的培养液中。首先，将1×105个C2C12细胞培养于含有2mL上述培养液的六孔培养盘中，并在37℃下培养16～18小时，再将细胞分成三组：(1)仅含培养液的控制组、(2)MRSD以及(3)加入1.25％本发明的植物乳杆菌DSM 33106菌液的实验组分别处理细胞24小时，并以实施例2的方法及表一的引物分析各组C2C12细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT7基因、Pink1基因、及Parkin基因、Atg1基因的表现情形。
本发明的植物乳杆菌DSM 33106提升骨骼肌细胞中CCT2基因、CCT5基因及CCT7基因表现的结果如图3A所示；提升Pink1基因、Parkin基因及Atg1基因表现的结果如图3B所示。小鼠肌肉纤维母细胞经本发明的植物乳杆菌DSM 33106处理后，CCT2基因、CCT5基因及CCT7基因的表现量分别约为控制组的1.5倍、1.8倍及1.2倍；而Pink1基因、Parkin基因及Atg1基因的表现量分别约为控制组的1.9倍、1.4倍及1.2倍。此结果显示本发明的植物乳杆菌DSM 33106具有优异地提高骨骼肌细胞中抗老化基因表现量的功效，能有效提高骨骼肌细胞推迟老化的效果。
实施例4本发明植物乳杆菌调控神经细胞中抗老基因表现的功效
为了测试本发明植物乳杆菌DSM 33106对神经细胞中抗老基因表现的调控，以人类神经母细胞瘤细胞(SHSY-5Y)进行测试，其中该SHSY-5Y细胞是购自美国典型培养物保藏中心(美国)，编号
CRL-2266TM，细胞培养于如实施例1所述的培养液中。首先，将1×105个SHSY-5Y细胞培养于含有2mL上述培养液的六孔培养盘中，并在37℃下培养16～18小时，再将细胞分成四组：(1)仅含培养液的控制组、(2)MRSD以及(3)加入1.25％本发明的植物乳杆菌DSM 33106菌液的实验组分别处理细胞24小时，并以实施例2的方法及表一的引物分析各组C2C12细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、及Atg8基因的表现情形。
本发明的植物乳杆菌DSM 33106提升神经细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT7基因及CCT8基因表现的结果如图4A所示；提升Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因及Atg8基因表现的结果如图4B所示。人类神经母细胞瘤细胞经本发明的植物乳杆菌DSM 33106处理后，CCT2基因、CCT5基因、CCT7基因及CCT8基因的表现量分别约为控制组的1.2倍、1.1倍、1.4倍及1.1倍；而Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因及Atg8基因的表现量分别约为控制组的1.5倍、1.6倍、1.5倍及1.2倍。此结果显示本发明的植物乳杆菌DSM 33106具有优异地提高神经肌细胞中抗老化基因表现量的功效，能有效提高神经细胞推迟老化的效果。
实施例5本发明植物乳杆菌改善个体老化情况的功效
为证实本发明的植物乳杆菌DSM 33106于人体抗老化的效果，首先募集9位35岁以上的成人为受试者，每日服用一颗含有1010CFU剂量的本发明DSM 33106益生菌的胶囊(相当于一日服用100mg)，在给予该胶囊第0、4及8周时收集受试者的血液样本进行检测抗老基因、并测试其感知功能、执行功能和肠胃道的改善效果，其中抗老基因的分析是将受试者血液中的周边血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)以淋巴球分离液分离，再以实施例2的方法及表一、表二的引物分析各组PBMC细胞中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、SIRT1基因、FOXO基因、PARP1基因、PARP2基因、NADSYN基因、MRPS5基因、UBL-5基因、SOD3基因、TERT基因、TERC基因、及RTEL1基因的表现情形。感知功能是经由测试受试者的速认(subitizing)能力进行分析，其中速认为不以数算的方法快速判断出问题呈现的数量，例如一次出现4-8个球点于受试者眼前，而受试者辨识的反应时间即为感知能力的反应时间；执行功能则是以受试者正确判断字体颜色(例如蓝色二字的颜色为蓝色)的结果normal reaction time(ms)、以及错误判断字体颜色(例如蓝色二字的颜色为红色)的结果interfere reactiontime(ms)为执行功能的反应时间。肠胃道改善则以测定受试者的肠道菌相丰富度是否有上升为判断依据。
先前研究已指出和年老的小鼠相比，年轻的小鼠体内含有较多的NAD+；且增加年老小鼠体内的NAD+浓度，能使其生理状况更为年轻，因此NAD+被认为与推迟个体老化相关，而已知SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、SIRT1基因、MRPS5基因、UBL-5基因及SOD3基因与调节NAD+具有相关性。端粒是生物染色体末端的DNA重复序列，主要作用是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期，其中DNA每复制一次，端粒就会缩短一些，一旦端粒消耗殆尽，细胞则会走向凋亡，因此端粒的长度与细胞的年龄具有相关性，其中已知TERT基因、TERC基因及RTEL1基因与调节端粒的长短相关。而研究显示肠道菌相的高丰富度代表肠道的高复原力与稳定性，因此肠道菌相的丰富度提升能够维持肠道的正常机能，并推迟肠道老化的发生。
本发明的植物乳杆菌DSM 33106提升人体中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、及CCT8基因表现的结果如图5A所示；提升Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因及Atg8基因表现的结果如图5B所示；与调节NAD+相关基因的SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、SIRT1基因、MRPS5基因、UBL-5基因及SOD3基因表现的结果如图6所示；与调节端粒相关基因的TERT基因、TERC基因及RTEL1基因表现的结果如图7所示；于减少感知功能测验反应时间的结果如图8A所示；减少正常执行功能测验反应时间的结果则如8B所示；减少有外在干扰情况下的执行功能测验反应时间的结果则如8C所示；提升受试者肠道菌相丰富度的结果如图9所示。服用本发明的植物乳杆菌DSM 33106共4周或8周后，受试者体内CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、及CCT8基因表现量皆显著高于受试前约2-7倍不等；而Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因及Atg8基因表现量亦皆显著高于受试前约2-7倍不等；于与调节NAD+相关基因的FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、UBL-5基因及SOD3基因表现量皆显著高于受试前约2-3倍不等，其中SIRT1基因则较受试前低约0.5倍；而于与调节端粒相关基因的TERT基因、TERC基因及RTEL1基因表现量亦皆显著高于受试前约3-7倍不等；于服用本发明的植物乳杆菌DSM 33106共4周或8周后，皆能显著减少感知功能测验反应时间，及减少执行功能测验反应时间；而于服用本发明的植物乳杆菌DSM 33106后能提升75％的受试者的肠道菌相丰富度。综合以上，该些结果显示本发明的植物乳杆菌DSM 33106具有优异地提高抗老化基因表现量、提升调控NAD+相关基因以提高粒线体活性、提升调控端粒活性相关基因、改善认知功能的感知与执行能力的功效、及提高肠道菌相丰富度，能有效达到整体推迟老化的功效。
表二、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物
综上所述，本发明的益生菌株可为具有活性或去活性的菌株，且该益生菌株或其代谢产物能有效提高肝脏细胞中粒线体的活性，以达到提升人体最大器官－肝脏的生理机能。还具有提升肝脏细胞CCT基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg基因、SIRT1基因、及FOXO基因的表现；调控骨骼肌细胞中CCT基因、Pink1基因、Parkin基因、及Atg基因的表现；调控神经细胞中Pink1基因、Parkin基因、及Atg基因的表现，以达到提升精力、肌力及记忆力的功效。还能有效增加人体中CCT基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg基因、与调节NAD+相关基因的SIRT1基因、FOXO3基因、NADSYN基因、SIRT1基因、MRPS5基因、UBL-5基因及SOD3基因、与调节端粒相关基因的TERT基因、TERC基因及RTEL1基因的表现，并减少感知功能测验反应时间及执行功能测验反应时间，以提高抗老化基因表现量、提升调控NAD+相关基因以提高粒线体活性、提升调控端粒活性相关基因、改善认知功能的感知与执行能力、以及提高肠道菌相丰富度的功效。因此，本发明的益生菌株或其代谢产物可用于制备推迟老化的组合物的用途，且该组合物可为粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状，且可制成食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂，藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。
【生物材料寄存】
本案涉及的植物乳杆菌，于2019年5月2日寄存于DSMZ-德国微生物保藏中心，寄存编号为DSM33106，寄存地址为德国布伦瑞克市38124因霍芬大街7B。
Claims (16)
1.一种用于推迟老化的益生菌株，其中该益生菌株是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，寄存编号是DSM 33106。
2.一种权利要求1所述的益生菌株的用途，是用于制备推迟老化的组合物。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述益生菌株是具有活性或去活性的菌株。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述益生菌株可增加细胞粒线体活性。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述益生菌株可提升肝脏细胞中的含TCP1的折迭蛋白7(CCT7)基因、CCT8基因、PTEN促进激酶1(PTEN-induced putative kinase 1，Pink1)基因、或自噬作用相关基因1(Autophagy-related gene 1，Atg1)基因的表现。
6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述益生菌株是提升骨骼肌细胞中的CCT7基因、Pink1基因、Parkin基因、或Atg1基因的表现。
7.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述益生菌株是提升神经细胞中的CCT2基因、CCT5基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、或Atg1基因的表现。
8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述益生菌株是调控人体中CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、叉头框O 3(Forkhead box O 3，FOXO3)基因、麸酰胺酸依赖性烟草酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶(Glutamine-dependent NAD+ synthetase，NADSYN)基因、粒线体核糖体蛋白S5(mitochondrial ribosomal protein S5，MRPS5)基因、泛素样蛋白5(Ubiquitin-likeprotein 5，UBL-5)基因、超氧化物歧化酶3(Superoxide dismutase 3，SOD3)基因、端粒酶反转录酶(Telomerase reverse transcriptase，TERT)基因、端粒酶RNA模板(telomeraseRNA component，TERC)基因及、或端粒延伸解旋酶调节因子1(Regulator of telomereelongation helicase 1，RTEL1)基因的表现。
9.根据权利要求8所述的用途其特征在于，所述益生菌株是正调控CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT8基因、Pink1基因、Parkin基因、Atg1基因、Atg8基因、FOXO3基因、NADSYN基因、MRPS5基因、UBL-5基因、SOD3基因、TERT基因、TERC基因、或RTEL1基因。
10.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述益生菌株是用于制备调控个体的细胞中的NAD+活性或该个体的染色体的端粒长度的药物。
11.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述益生菌株是用于制备减少个体的感知功能测验反应时间的药物。
12.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述益生菌株是用于制备提高肠道菌相丰富度的药物。
13.根据权利要求2至12中任一项所述的用途，其中是将权利要求1项所述的益生菌株或其代谢产物，应用于制备推迟老化的医药组成物、保养品或食品。
14.一种用于推迟老化的组合物，是包含权利要求1项所述的益生菌株。
15.根据权利要求14中所述的组合物，其特征在于，所述组合物的形式为粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状的剂型。
16.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含医药上可接受的载体。
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