CN114631604A - 植物发酵液改善睡眠质量及/或抗老化的用途 - Google Patents
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Abstract
一种植物发酵液用以制备用于改善睡眠质量及/或抗老化的组合物的用途，其中植物发酵液是由茯苓酸枣仁浸提液经多个菌种发酵后所制得，多个菌种包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
Description
技术领域
本发明关于一种植物发酵液饮品，特别是涉及一种以植物发酵液制备具有提升睡眠质量及/或抗老化的组合物的用途。
背景技术
由微生物发酵的食品具有更易于消化、香味增加、储藏时间提升等优势。例如：泡菜、纳豆、水果醋等等都是广受欢迎的发酵类食品。
在饮品界中，发酵饮品也愈来愈受到消费者的喜爱。发酵饮品常以乳品、蔬菜、水果、豆类等为原料基底，再经由不同种类的微生物作用而制得。
发明内容
在一些实施例中，一种植物发酵液用以制备用于改善睡眠质量的组合物的用途，其中植物发酵液是由茯苓酸枣仁浸提液经多个菌种发酵后所制得，且多个菌种包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
在一些实施例中，植物发酵液具有提升以下基因中至少一基因的表现量的能力：GAD1基因、GABRA1基因、GABRA4基因及GABRA6基因。
在一些实施例中，植物发酵液具有促进GABA蛋白质分泌的能力。
在一些实施例中，植物发酵液具有促进多巴脱羧酶(Dopa decarboxylase；DDC)基因的表现量的能力。
在一些实施例中，一种植物发酵液用以制备用于抗老化的组合物的用途，其中植物发酵液是由茯苓酸枣仁浸提液经多个菌种发酵后所制得，且多个菌种包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
在一些实施例中，植物发酵液具有促进胶原蛋白分泌的能力。
在一些实施例中，植物发酵液具有提升以下至少一基因的表现量的能力：CCT2基因及CCT6A基因。
在一些实施例中，植物发酵液具有提升以下至少一基因的表现量的能力：Pink1基因、Atg1基因、Ubl-5基因及NADSYN1基因。
在一些实施例中，植物发酵液的皂苷含量至少为20906μg/ml。
在一些实施例中，茯苓酸枣仁浸提液是由茯苓酸枣仁基液在50℃-100℃下静置0.5小时-1.5小时所制得。
在一些实施例中，茯苓酸枣仁基液包括茯苓酸枣仁溶液及相对茯苓酸枣仁溶液总重10％的葡萄糖，茯苓酸枣仁溶液包括1重量份的茯苓、1重量份的酸枣仁及50重量份的水。
在一些实施例中，茯苓酸枣仁浸提液是由一茯苓酸枣仁溶液在50℃-100℃下静置0.5小时-1.5小时后加入相对该茯苓酸枣仁溶液总重10％的葡萄糖所制得，该茯苓酸枣仁溶液包括1重量份的茯苓、1重量份的酸枣仁及50重量份的水。
综上所述，根据任一实施例的植物发酵液，其可用以制备用于改善睡眠质量及/或抗老化的组合物。其中，植物发酵液是将茯苓酸枣仁浸提液以多个菌种发酵所得之。在一些实施例中，植物发酵液的皂苷含量至少为20906μg/ml。在一些实施例中，植物发酵液可藉由提高GABA相关基因的表现量及提高GABA蛋白质分泌量，以促进受体进入深层睡眠，进而改善受体的睡眠质量。在一些实施例中，植物发酵液可藉由提高褪黑激素合成相关基因(如血清素合成基因，DDC基因)的表现量，以促进受体的褪黑激素生成，进而改善受体的睡眠质量。在一些实施例中，植物发酵液可藉由提高抗老化相关基因及/或提高促进胶原蛋白分泌量，以改善受体肌肤及预防受体老化现象。
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。
附图说明
图1是植物发酵液中的总皂苷含量的数据图；
图2是GABA相关基因的表现量的实验结果图；
图3是GABA蛋白质分泌量的实验结果图；
图4是血清素合成基因的表现量的实验结果图；
图5是胶原蛋白相对分泌量的实验结果图；
图6是抗老化相关基因的表现量的实验结果图；以及
图7是抗老化相关基因的表现量的实验结果图。
具体实施方式
于下列实施方式的说明中，除非另有相关说明，则「％」符号是指重量百分比。
在一些实施例中，植物发酵液是由茯苓酸枣仁浸提液经过多个菌种发酵所制得。举例来说，多个菌种包括酵母菌(Yeast)、乳酸杆菌(Lactobacillus)及醋酸菌(Acetobacter aceti)。
在一些实施例中，茯苓酸枣仁浸提液可以以茯苓(Poria cocos，学名：Wolfiporiacocos)、酸枣仁(Semen Ziziphi Spinosae)、水及葡萄糖来制备。举例来说，茯苓系采用干燥的茯苓菌核内部的白色部位，而酸枣仁系采用干燥酸枣(Ziziphus jujubaMill.var.spinosa)果实的种子。举例来说，茯苓酸枣仁浸提液是以由茯苓、酸枣仁、水及葡萄糖组成的茯苓酸枣仁基液，经浸提程序所得；或者，茯苓酸枣仁浸提液是以由茯苓、酸枣仁及水组成的茯苓酸枣仁溶液经浸提程序后，再加入葡萄糖所得。在一些实施例中，茯苓酸枣仁溶液包括1重量份的茯苓、1重量份的酸枣仁及50重量份的水，而茯苓酸枣仁基液包括茯苓酸枣仁溶液及相对茯苓酸枣仁溶液总重10％的葡萄糖。
在一些实施例中，将茯苓、酸枣仁及水混合以形成茯苓酸枣仁溶液。接着，于茯苓酸枣仁溶液中加入相对茯苓酸枣仁溶液总重10％的葡萄糖，以得到茯苓酸枣仁基液。并且，将茯苓酸枣仁基液进行浸提程序以得到茯苓酸枣仁浸提液。于此，由于进行浸提程序前，茯苓酸枣仁基液中的葡萄糖为完全溶解或未完全溶解。因此，透过浸提程序有助于将茯苓酸枣仁基液内的葡萄糖完全溶解并且还可避免污染。
在一些实施例中，将茯苓、酸枣仁及水混合以形成茯苓酸枣仁溶液后进行浸提程序，并于浸提程序后加入葡萄糖以形成茯苓酸枣仁浸提液。于此，先将茯苓酸枣仁溶液先行进行浸提程序，有助于茯苓酸枣仁溶液中的茯苓及/或酸枣仁内的有效成分的确实地释出。
在一些实施例中，浸提程序为于50℃-100℃下静置0.5小时-1.5小时。举例来说，浸提程序系指将茯苓酸枣仁基液或茯苓酸枣仁溶液维持在95℃并静置1小时。
在一些实施例中，茯苓酸枣仁浸提液的糖度为9°Bx～10°Bx。于此，足够的糖度可以确保后续发酵的顺利进行，并使菌种有足够的养分生长。
接着，加入多个菌种至茯苓酸枣仁浸提液中进行发酵4～15.5日以得到植物发酵液。其中，多个菌种包括0.01％～0.5％的酵母菌、0.01％～0.25％的乳酸菌及3～10％的醋酸菌(Acetobacter aceti)。在一些实施例中，于发酵前不滤除茯苓酸枣仁浸提液中的固形物(即，进行浸提程序后的茯苓和/或酸枣仁)。换言之，是直接将菌种加入茯苓酸枣仁浸提液进行发酵，藉以利用菌种进一步提取固形物中的活性成分。
在一些实施例中，酵母菌可以是市售的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。举例而言，向财团法人食品工作发展研究所所采购寄存编号BCRC20271(国际寄存ATCC26602)菌株的啤酒酵母。
在一些实施例中，乳酸菌可以为市售的胚芽乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)、市售的嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)或植物乳杆菌。举例而言，采用寄存编号BCRC910805(国际寄存DSM33108)菌株的胚芽乳酸杆菌TCI028或寄存编号BCRT910760(国际寄存DSM32451)菌株的胚芽乳酸杆菌TCI378。再举例而言，采用寄存编号BCRC910636(国际寄存DSM28121)菌株的嗜热链球菌TCI633。
在一些实施例中，醋酸菌可以为向美国菌种中心(American Type CultureCollection,ATCC)采购寄存编号ATCC15973(国内寄存编号BCRC11688)的醋酸菌。
在一些实施例中，于茯苓酸枣仁浸提液中加入酵母菌后进行发酵1日～2.5日后形成第一初发酵液。基此，透过先添加酵母菌至茯苓酸枣仁浸提液中，可于酵母菌发酵过程中产生酒精，并有利于提取出茯苓与酸枣仁内不同的有效成份。在一些实施例中，第一初发酵液的酸碱值(pH值)小于4，且其糖度约为9°Bx。
加入乳酸菌至第一初发酵液后进行发酵1日～3日后形成第二初发酵液。基此，透过添加乳酸菌至第一初发酵液中可使其内的葡萄糖被进一步消耗而降低糖度，并产生乳酸以降低第一初发酵液的pH值。并且，降低pH值有利于进一步提取出茯苓与酸枣仁内其他不同的有效成分。在一些实施例中，第二初发酵液的pH值小于3.5，且其糖度约为6°Bx。
加入醋酸菌至第二初发酵液后进行发酵3日～10日后形成第三初发酵液。基此，透过添加醋酸菌至第二初发酵液可使其内的酒精被消耗，并一步降低葡萄糖的含量。在一些实施例中，第三初发酵液的pH值小于3.5，且其糖度为约为3°Bx。
在一些实施例中，将第三初发酵液过滤并浓缩以得到植物发酵液。举例来说，过滤方式可以是以200mesh过滤，且浓缩方式可以采取在60℃下的减压浓缩。于此，植物发酵液的pH值小于3.5。
在一些实施例中，添加寡糖至植物发酵液以使其糖度达到40°Bx以形成植物发酵饮品。于此，寡糖系指由3个～10个单醣分子聚合而成的低聚糖。其中，寡糖可为果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、异麦芽寡糖等。在一些实施例中，所添加的寡糖可为含40％～70％异麦芽寡糖的寡糖溶液。
在一些实施例中，植物发酵液的皂苷(Saponin)含量至少为20906μg/ml。
在一些实施例中，植物发酵液具有提升以下基因中至少一基因的表现量的能力：GAD1基因(Gene ID:2571)、GABRA1基因(Gene ID:2554)、GABRA4基因(Gene ID:2557)及GABRA6基因(Gene ID:2559)。在一些实施例中，植物发酵液具有促进GABA蛋白质分泌的能力。
在一些实施例中，植物发酵液具有促进多巴脱羧酶(Dopa decarboxylase,DDC；又称芳香族L-胺基酸脱羧酶(aromatic amino acid decarboxylase))基因(Gene ID:1644)的表现量的能力。其中，DDC基因为一种血清素合成基因，亦为褪黑激素合成相关基因。血清素(Seratonin)是大脑中松果体(pineal gland)生成褪黑激素(Melatonin)的重要前驱物，且褪黑激素为调节人体生理时钟与睡眠关键的激素。并且，血清素是由大脑合成分泌，其主要原料为色胺酸(Tryptophan)，而色胺酸为人体不能合成的九大必需胺基酸之一，其须从食物中汲取而获得。当人体摄取的色氨酸经色氨酸羟化酶(Tryptophan hydroxylase,TPH)转化为5-羟色氨酸(5-HTP)后，再藉由多巴脱羧酶(DDC)转换为血清素。再由芳烃基烷基胺乙酰基转移酶(Aralkylamine N-acetyltransferase,AANAT)与乙酰复合胺O-甲基转移酶(Acetylserotonin O-Methyltransferase,ASMT)将血清素转化成褪黑激素。于此，植物发酵液可用以改善睡眠质量。
在一些实施例中，植物发酵液具有促进胶原蛋白分泌的能力。在一些实施例中，植物发酵液具有提升以下至少一基因的表现量的能力：CCT2基因(Gene ID:10576)及CCT6A基因(Gene ID:908)。其中，CCT2基因及CCT6A基因为细胞回春相关基因。发酵液具有提升以下至少一粒线体相关基因的表现量的能力：Pink1基因(Gene ID:65018)、Atg1基因(Gene ID:8408)、Ubl-5基因(Gene ID:59286)及NADSYN1基因(Gene ID:55191)。其中，Pink1基因及Atg1基因为粒线体回春相关基因；Ubl-5基因及NADSYN1基因为粒线体活化相关基因。于此，植物发酵液具有抗老化的效果并可用来预防老化。
基此，植物发酵液可用以制备用以改善睡眠质量及/或抗老化的组合物。
在一些实施例中，组合物可以为液态(如，植物发酵饮品等)或固态(如，植物发酵液粉末、植物发酵液锭等)。在一些实施例中，液态的组合物的使用剂量为6毫升/天，而固态组合物的使用量为0.65克/天。
在一些实施例中，前述之任一组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有效含量的植物发酵液。
在一些实施例中，前述之医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于经肠地道、非经肠地道(parenterally)、口服的、或局部地(topically)投药剂型。
在一些实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似之物。在一些实施例中，非经肠地道或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(externalpreparation)或类似之物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)或病灶内注射(intralesional injection)。
在一些实施例中，前述之医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术之医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。关于选用之载剂的种类与数量是落在熟习此项技术之人士的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solutioncontaining alcohol)。
在一些实施例中，前述之任一组合物可为食用产品。换言之，食用产品包含特定含量的植物发酵液。在一些实施例中，食用产品可为一般食品、保健食品或膳食补充品。
在一些实施例中，前述之食用产品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于口服的剂型。在一些实施例中，前述之一般食品可为食用产品本身。在一些实施例中，一般食品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)或调味料。
在一些实施例中，所得的植物发酵液可进一步作为食品添加物(food additive)，以制得含有植物发酵液的食品组合物。于此，能藉由习知方法于原料制备时添加任一实施例的植物发酵液，或是于食品的制作过程中添加任一实施例的植物发酵液，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食用产品(即食品组合物)。
例1：植物发酵液的制备
首先，准备1重量份的茯苓、1重量份的酸枣仁及50重量份的水，并将其混合均匀以形成茯苓酸枣仁溶液。接着，加入相对于茯苓酸枣仁溶液10％总重的葡萄糖，以形成茯苓酸枣仁基液。并且，将茯苓酸枣仁基液于95℃下静置1小时，以形成植物浸提液。
于静置后，待植物浸提液冷却后加入0.01％的BCRC20271菌株之啤酒酵母，并于30℃下进行发酵1天以形成第一初发酵液。再加入0.05％的BCRC910805菌株之胚芽乳酸杆菌至第一初发酵液中，并于30℃下进行发酵1天以形成第二初发酵液。接着，加入5％的BCRC11688菌株之醋酸菌至第二初发酵液中，并于30℃下进行发酵5天以形成第三初发酵液。于此，第三初发酵液的pH值小于3.5，且其糖度为约为3°Bx。
接着，以200mesh过滤第三初发酵液后，于60℃下减压浓缩，以得到植物发酵液。
例2：皂苷含量测试
于此，所使用作为标准品的溶液为1000ppm的齐墩果酸(Oleanolic acid，品牌：Sigma，编号：O5504-100MG)溶液，其系以甲醇(Methanol，品牌：JT Baker)溶解配置，并以甲醇序列稀释为0ppm、100ppm、200ppm、400ppm、600ppm、800ppm等浓度。
将各浓度的齐墩果酸溶液分别取100μL至微量离心管中，并于70℃～85℃烘箱中烘干各浓度的齐墩果酸溶液使其完全干燥。接着，于各微量离心管加入100μL的5％香草醛(vanillin，品牌：Sigma，编号：A11169)，并加入400μL的高氯酸(Perchloric acid，品牌：Sigma，编号：30755-1L)混合均匀后，置于65℃水浴中反应15分钟，以形成混合溶液。于此，所使用的5％香草醛是以乙酸(Acetic acid，品牌：JT Baker，编号：9508-03)配置。
接着，取40μL的混合溶液至96孔盘并于每孔加入200μL的乙酸混合均匀以形成测试溶液，并测量其在531nm下之吸光值。于此，依照所量测的吸光值对应齐墩果酸溶液的浓度绘制标准曲线。
于此，将例1得到的植物浸提液作为控制组的测试样品，且将例1所制备得到的植物发酵液作为实验组的测试样品。
取100μL的测试样品至微量离心管中，并于70℃～85℃烘箱中烘干测试样品使其完全干燥。接着，于各微量离心管加入100μL的5％香草醛，并加入400μL的高氯酸混合均匀后，置于65℃水浴中反应15分钟，以形成混合溶液。
取40μL的混合溶液至96孔盘并于每孔加入200μL的乙酸混合均匀以形成测试溶液，并测量其在531nm下之吸光值。接着将依据标准曲线以内插法的方式计算控制组及实验组的总皂苷含量，如图1所示。
请参阅图1。控制组的总皂苷含量为2194.3mg/mL，而实验组的总皂苷含量为20906mg/mL。换言之，实验组的总皂苷含量为控制组的总皂苷含量9.53倍。由此可知，透过多个菌种发酵后可显著提高植物发酵液的总皂苷含量。因此，相较于服用植物浸提液，当受体服用植物发酵液或以其制备的组合物时，有助于受体助眠作用及提高受体抗老化的能力。
例3：GABA相关基因表现测试
于此，GABA相关基因包括GAD1基因(Gene ID:2571)、GABRA1基因(Gene ID:2554)、GABRA4基因(Gene ID:2557)及GABRA6基因(Gene ID:2559)。
于此，所使用的细胞培养基为添加有10％的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，编号10437-028)、1％的抗生素-抗霉菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，Cat.15240-062)的DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium；Gibco公司，编号11965-092)。
首先，取1.5x105个小鼠神经母细胞瘤细胞(ATCC CCL-131；以下称Neuro2a细胞)至每孔含有2毫升细胞培养基的六孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。
将Neuro2a细胞分为实验组及空白组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔2mL实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养6小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.025mg/mL的例1中所得到的植物发酵液的细胞培养基。空白组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含植物发酵液)。并且，各组别进行四重复。
收集各组的Neuro2a细胞，并以RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)萃取出各组的RNA。接着，各组取1000奈克(ng)的RNA作为模板，透过
III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)将RNA反转录为相应之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM实时PCR系统(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCRsystem(Thermo Fisher Scientific公司，美国))、KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)及表1的引子(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8)对各组的cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerasechain reaction)以观察Neuro2a细胞内GABA相关基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用2-ΔCt方法进行基因定量，如图2所示。于此，藉由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量基因的mRNA表现量，进而推断基因编码的蛋白质的表现量。
需要特别说明的是，图2中的基因表现是以相对表现倍率呈现，其中使用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。在图2中，「*」代表在与空白组比较下其p值小于0.05、「**」代表在与空白组比较下其p值小于0.01及「***」代表在与空白组比较下其p值小于0.001。
表1
于表1中，F为顺向引子(Forward primer)，而R为反向引子(Reverse primer)。
请参阅图2。将空白组的各组GABA相关基因的相对表现量视为1.00(即空白组的各组基因的表现量为100％)。相较于空白组，实验组的GAD1基因的相对表现量为1.35、实验组的GABRA1基因的相对表现量为1.22、实验组的GABRA4基因的相对表现量为1.96、实验组的GABRA6基因的相对表现量为2.08。于此，实验组的GABA相关基因的表现量显著的提升，代表植物发酵液能有效地提高GABA合成酶基因及GABA受体相关基因。换言之，当受体服用植物发酵液时，能提高GABA相关基因的表现量，进而改善睡眠质量。
例4：GABA蛋白质的分泌量实验
于此，所使用的细胞培养基为添加有10％的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，编号10437-028)、1％的抗生素-抗霉菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，Cat.15240-062)的DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium；Gibco公司，编号11965-092)。
首先，取5x103个SHSY-5Y细胞(
CRL-2266TM)至每孔含有0.1毫升细胞培养基的96孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。
将SHSY-5Y细胞分为实验组、控制组及空白组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔0.1mL实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.25％的例1中所得到的植物发酵液的细胞培养基。控制组的实验培养基为含有0.25％的例1中所得到的植物浸提液的细胞培养基。空白组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含植物发酵液或植物浸提液)。
分别收集各组的上清液及SHSY-5Y细胞。并依照gABA ELISA套组(品牌：USCN，编号：CEA900Ge)内所附之操作手册，使细胞SHSY-5Y呈色后，再以ELISA分光亮度计于450nm的波长下测量各孔吸光值。并且，依据所测得之吸光值推算各组(除空白组外)的GABA蛋白质的分泌量，如图3所示。
请参阅图3。将空白组的数值视为100％。相较于空白组，实验组的GABA蛋白质的相对分泌量为136％，而控制组的GABA蛋白质的相对分泌量为110.81％。换言之，相较于植物浸提液，植物发酵液显著地提高SHSY-5Y细胞的GABA蛋白质的分泌量。由此可知，当受体服用植物发酵液时，其神经细胞能有效地分泌GABA蛋白质，进而抑制神经冲动，并提供手体安神助眠的效果，故而具有改善受体睡眠质量之功效。
例5：褪黑激素相关基因的表现量测试
于此，褪黑激素相关基因为巴脱羧酶(Dopa decarboxylase；DDC)基因(GeneID1644)，其系一种血清素合成基因。
于此，所使用的细胞培养基为添加有10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，编号10437-028)、1％抗生素-抗霉菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，Cat.15240-062)的DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium；Gibco公司，编号11965-092)。
首先，取1x105个人类神经母细胞瘤细胞(
CRL-2266TM；以下称SHSY-5Y细胞)至每孔含有2毫升细胞培养基的六孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。
将SHSY-5Y细胞分为实验组、控制组及空白组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔0.1mL实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.25％的例1中所得到的植物发酵液的细胞培养基。控制组的实验培养基为含有0.25％的例1中所得到的植物浸提液的细胞培养基。空白组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含植物发酵液或植物浸提液)。
收集各组的SHSY-5Y细胞，并以RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)萃取出各组的RNA。接着，各组取1000奈克(ng)的RNA作为模板，透过
III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)将RNA反转录为相应之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM实时PCR系统(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCRsystem(Thermo Fisher Scientific公司，美国))、KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)及表2的引子(SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:10)对各组的cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction)以观察SHSY-5Y细胞内DCC基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用2-ΔCt方法进行基因定量，如图4所示。于此，藉由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量基因的mRNA表现量，进而推断基因编码的蛋白质的表现量。
需要特别说明的是，图4中的基因表现是以相对表现倍率呈现，其中使用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。在图4中，「*」代表在与空白组比较下其p值小于0.05。
表2
于表2中，F为顺向引子(Forward primer)，而R为反向引子(Reverse primer)。
请参阅图4。将空白组的各组DCC相关基因的相对表现量视为1.00(即空白组的各组基因的表现量为100％)。相较于空白组，实验组的DCC基因的相对表现量为1.17，而控制组的DCC基因的相对表现量为0.95。由此可知，实验组的DCC基因的表现量显著的被提升，代表植物发酵液能有效地提高血清素合成基因。换言之，当受体服用植物发酵液时，能提高DCC基因的表现量，进而促进血清素及褪黑激素生成，以改善受体的睡眠质量。
例6：胶原蛋白的相对分泌量实验
于此，所使用的细胞培养基为添加有10％的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，编号10437-028)、1％的抗生素-抗霉菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，Cat.15240-062)及1mM的丙酮酸钠(sodium pyruvate，Gibco公司，编号11360-070)的最低限度必需培养基(Minimum essential medium，简称MEM，以下称MEM培养基)(Gibco公司，编号11095080)。
首先，取2x104个人类纤维母细胞(CCD-966Sk cell，品牌：
CRL-1881；以下称CCD-966Sk细胞)至每孔含有0.5毫升细胞培养基的24孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。待CCD-966Sk细胞贴附于细胞培养盘的底部后，以1XDPBS(Gibco公司，Cat.14200-075)清洗一次。
将CCD-966Sk细胞分为实验组、控制组及空白组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔0.5mL实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养48小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.25％的例1中所得到的植物发酵液的细胞培养基。控制组的实验培养基为含有0.25％的例1中所得到的植物浸提液的细胞培养基。空白组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含植物发酵液)。
收集1mL的各组的实验培养基，并以可溶性胶原蛋白检测套组(品牌：Biocolor；编号：S1000)处理以形成各组的待测溶液，接着以分光亮度计测量其在555nm下之各组吸光值，并使用Excel软件中的student t-test进行统计分析，如图5所示。
请参阅图5。将空白组的数值视为100％。相较于空白组，实验组的胶原蛋白的相对分泌量为117.15％，而控制组的胶原蛋白的相对分泌量为94.69％。换言之，实验组能显著促进CCD-966Sk细胞分泌胶原蛋白，并显著的提高17.15％。由此可知，当受体服用植物发酵液时，其肌肤细胞能有效地分泌胶原蛋白，进而改善受体肌肤，使受体的肌肤具有弹性及保持湿度，并使受体的肌肤光滑透亮。
例7：抗老化相关基因的表现量测试
于此，抗老化相关基因包括细胞回春相关基、粒线体回春相关基因及粒线体活化相关基因。其中，细胞回春相关基为CCT2基因(Gene ID:10576)及CCT6A基因(Gene ID:908)；粒线体回春相关基因为Pink1基因(Gene ID:65018)及Atg1基因(Gene ID:8408)；粒线体活化相关基因为Ubl-5基因(Gene ID:59286)及NADSYN1基因(Gene ID:55191)。
于此，所使用的细胞培养基为添加有10％的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，编号10437-028)、1％的抗生素-抗霉菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，Cat.15240-062)及1mM的丙酮酸钠(sodium pyruvate，Gibco公司，编号11360-070)的最低限度必需培养基(Minimum essential medium，简称MEM，以下称MEM培养基)(Gibco公司，编号11095080)。
首先，取1.5x105个人类纤维母细胞(以下称CCD-966Sk细胞，ATCC CRL-1881)至每孔含有2毫升细胞培养基的24孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。
将CCD-966Sk细胞分为实验组及空白组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔2mL实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.025mg/mL的例1中所得到的植物发酵液的细胞培养基。空白组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含植物发酵液)。
收集各组的CCD-966Sk细胞，并以RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)萃取出各组的RNA。接着，各组取1000奈克(ng)的RNA作为模板，透过
III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)将RNA反转录为相应之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM实时PCR系统(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCRsystem(Thermo Fisher Scientific公司，美国))、KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)及表3的引子(SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:22)对各组的cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction)以观察CCD-966Sk细胞内抗老化相关基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环，并使用2-ΔCt方法进行基因定量，如图6及图7所示。于此，藉由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量基因的mRNA表现量，进而推断基因编码的蛋白质的表现量。
需要特别说明的是，图6及图7中的基因表现是以相对表现倍率呈现，其中使用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。在图6及图7中，「*」代表在与空白组比较下其p值小于0.05及「**」代表在与空白组比较下其p值小于0.01。
表3
于表3中，F为顺向引子(Forward primer)，而R为反向引子(Reverse primer)。
请参阅图6。将空白组的各组细胞回春相关基因的相对表现量视为1.00(即空白组的各组基因的表现量为100％)。相较于空白组，实验组的CCT2基因的相对表现量为1.18且实验组的CCT6A基因的相对表现量为1.17。于此，实验组的细胞回春相关基因的表现量显著的提升，代表植物发酵液具有将成熟老化的细胞回春为年轻细胞的能力。因此，当受体服用植物发酵液时，能提高CCT2基因及/或CCT6A基因的表现量，进而使受体具有抗老化的能力并有助于受体预防老化。
请参阅图7。将空白组的各组粒线体相关基因的相对表现量视为1.00(即空白组的各组基因的表现量为100％)。相较于空白组，实验组的Pink1基因的相对表现量为1.37、实验组的Atg1基因的相对表现量为1.39、实验组的Ubl-5基因的相对表现量为1.29，以及实验组的NADSYN1基因的相对表现量为1.40。于此，实验组的粒线体相关基因的表现量显著的提升，代表植物发酵液具有将回春老化粒线体及恢复粒线体活性的能力。因此，当受体服用植物发酵液时，能提高Pink1基因、Atg1基因、Ubl-5基因、NADSYN1基因或其组合的表现量，进而使受体具有抗老化的能力并有助于受体预防老化。
综上所述，根据本发明任一实施例的植物发酵液可用以制备用于改善睡眠质量及/或抗老化的组合物。经多个菌种发酵的植物发酵液具有较高含量的皂苷含量，且具有下列一种或多种的功能：提高GAD1基因、GABRA1基因、GABRA4基因、GABRA6基因或其组合的表现量、提高GABA蛋白质的分泌量、提高DDC基因的表现量、提高胶原蛋白的分泌量、提高CCT2基因、CCT6A基因或其组合的表现量、提高Pink1基因、Atg1基因、Ubl-5基因、NADSYN1基因或其组合的表现量。
虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神所作些许之更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
【序列表】
<110> 百岳特生物技术（上海）有限公司
<120> 植物发酵液改善睡眠质量及/或抗老化的用途
<130> NA
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NADSYN1-R
<400> 22
gcactggagc agtcgtactt 20
Claims (16)
1.一种植物发酵液用以制备用于改善睡眠质量的组合物的用途，其特征在于，该植物发酵液是由茯苓酸枣仁浸提液经多个菌种发酵后所制得，该多个菌种包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该植物发酵液具有提升以下基因中至少一基因的表现量的能力：GAD1基因、GABRA1基因、GABRA4基因及GABRA6基因。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该植物发酵液具有促进GABA蛋白质分泌的能力。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该植物发酵液具有促进多巴脱羧酶基因的表现量的能力。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该植物发酵液的皂苷含量至少为20906μg/ml。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该茯苓酸枣仁浸提液是由一茯苓酸枣仁基液在50℃-100℃下静置0.5小时-1.5小时所制得。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，该茯苓酸枣仁基液包括一茯苓酸枣仁溶液及相对该茯苓酸枣仁溶液总重10％的葡萄糖，该茯苓酸枣仁溶液包括1重量份的茯苓、1重量份的酸枣仁及50重量份的水。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该茯苓酸枣仁浸提液是由一茯苓酸枣仁溶液在50℃-100℃下静置0.5小时-1.5小时后加入相对该茯苓酸枣仁溶液总重10％的葡萄糖所制得，该茯苓酸枣仁溶液包括1重量份的茯苓、1重量份的酸枣仁及50重量份的水。
9.一种植物发酵液用以制备用于抗老化的组合物的用途，其特征在于，植物发酵液是由一茯苓酸枣仁浸提液经多个菌种发酵后所制得，该多个菌种包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该植物发酵液具有促进胶原蛋白分泌的能力。
11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该植物发酵液具有提升以下基因中至少一基因的表现量的能力：CCT2基因及CCT6A基因。
12.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该植物发酵液具有提升以下基因中至少一基因的表现量的能力：Pink1基因、Atg1基因、Ubl-5基因及NADSYN1基因。
13.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该植物发酵液的皂苷含量至少为20906μg/ml。
14.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该茯苓酸枣仁浸提液是由一茯苓酸枣仁基液在50℃-100℃下静置0.5小时-1.5小时所制得。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，该茯苓酸枣仁基液包括一茯苓酸枣仁溶液及相对该茯苓酸枣仁溶液总重10％的葡萄糖，该茯苓酸枣仁溶液包括1重量份的茯苓、1重量份的酸枣仁及50重量份的水。
16.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，该茯苓酸枣仁浸提液是由一茯苓酸枣仁溶液在50℃-100℃下静置0.5小时-1.5小时后加入相对该茯苓酸枣仁溶液总重10％的葡萄糖所制得，该茯苓酸枣仁溶液包括1重量份的茯苓、1重量份的酸枣仁及50重量份的水。
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