TWI784357B - 植物發酵液改善睡眠品質及/或抗老化的用途 - Google Patents

Abstract

一種植物發酵液用以製備用於改善睡眠品質及/或抗老化的組合物之用途，其中植物發酵液是由一茯苓酸棗仁浸提液經複數菌種發酵後所製得，複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。

Description

植物發酵液改善睡眠品質及/或抗老化的用途

本發明關於一種植物發酵液飲品，特別是涉及一種以植物發酵液製備具有提升睡眠品質及/或抗老化的組合物的用途。

由微生物發酵的食品具有更易於消化、香味增加、儲藏時間提升等優勢。例如：泡菜、納豆、水果醋等等都是廣受歡迎的發酵類食品。

在飲品界中，發酵飲品也愈來愈受到消費者的喜愛。發酵飲品常以乳品、蔬菜、水果、豆類等為原料基底，再經由不同種類的微生物作用而製得。

在一些實施例中，一種植物發酵液用以製備用於改善睡眠品質的組合物之用途，其中植物發酵液是由茯苓酸棗仁浸提液經複數菌種發酵後所製得，且複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。

在一些實施例中，植物發酵液具有提升以下基因中至少一基因的表現量的能力： GAD1基因、 GABRA1基因、 GABRA4基因及 GABRA6基因。

在一些實施例中，植物發酵液具有促進GABA蛋白質分泌的能力。

在一些實施例中，植物發酵液具有促進多巴脫羧酶（Dopa decarboxylase; DDC）基因的表現量的能力。

在一些實施例中，一種植物發酵液用以製備用於抗老化的組合物之用途，其中植物發酵液是由茯苓酸棗仁浸提液經複數菌種發酵後所製得，且複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。

在一些實施例中，植物發酵液具有促進膠原蛋白分泌的能力。

在一些實施例中，植物發酵液具有提升以下至少一基因的表現量的能力： CCT2基因及 CCT6A基因。

在一些實施例中，植物發酵液具有提升以下至少一基因的表現量的能力： Pink1基因、 Atg1基因、 Ubl-5基因及 NADSYN1基因。

在一些實施例中，植物發酵液的皂苷含量至少為20906 µg/ml。

在一些實施例中，茯苓酸棗仁浸提液是由茯苓酸棗仁基液在50℃-100℃下靜置0.5小時-1.5小時所製得。

在一些實施例中，茯苓酸棗仁基液包括茯苓酸棗仁溶液及相對茯苓酸棗仁溶液總重10%的葡萄糖，茯苓酸棗仁溶液包括1重量份的茯苓、1重量份的酸棗仁及50重量份的水。

在一些實施例中，茯苓酸棗仁浸提液是由一茯苓酸棗仁溶液在50℃-100℃下靜置0.5小時-1.5小時後加入相對該茯苓酸棗仁溶液總重10%的葡萄糖所製得，該茯苓酸棗仁溶液包括1重量份的茯苓、1重量份的酸棗仁及50重量份的水。

綜上所述，根據任一實施例的植物發酵液，其可用以製備用於改善睡眠品質及/或抗老化的組合物。其中，植物發酵液是將茯苓酸棗仁浸提液以複數菌種發酵所得之。在一些實施例中，植物發酵液的皂苷含量至少為20906 µg/ml。在一些實施例中，植物發酵液可藉由提高GABA相關基因的表現量及提高GABA蛋白質分泌量，以促進受體進入深層睡眠，進而改善受體的睡眠品質。在一些實施例中，植物發酵液可藉由提高褪黑激素合成相關基因（如血清素合成基因， DDC基因）的表現量，以促進受體的褪黑激素生成，進而改善受體的睡眠品質。在一些實施例中，植物發酵液可藉由提高抗老化相關基因及/或提高促進膠原蛋白分泌量，以改善受體肌膚及預防受體老化現象。

於下列實施方式的說明中，除非另有相關說明，則「%」符號是指重量百分比。

在一些實施例中，植物發酵液是由茯苓酸棗仁浸提液經過複數菌種發酵所製得。舉例來說，複數菌種包括酵母菌（Yeast）、乳酸桿菌（ Lactobacillus）及醋酸菌（ Acetobacter aceti）。

在一些實施例中，茯苓酸棗仁浸提液可以以茯苓（Poria cocos，學名： Wolfiporia cocos）、酸棗仁（Semen Ziziphi Spinosae）、水及葡萄糖來製備。舉例來說，茯苓係採用乾燥的茯苓菌核內部的白色部位，而酸棗仁係採用乾燥酸棗（Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa）果實的種子。舉例來說，茯苓酸棗仁浸提液是以由茯苓、酸棗仁、水及葡萄糖組成的茯苓酸棗仁基液，經浸提程序所得；或者，茯苓酸棗仁浸提液是以由茯苓、酸棗仁及水組成的茯苓酸棗仁溶液經浸提程序後，再加入葡萄糖所得。在一些實施例中，茯苓酸棗仁溶液包括1重量份的茯苓、1重量份的酸棗仁及50重量份的水，而茯苓酸棗仁基液包括茯苓酸棗仁溶液及相對茯苓酸棗仁溶液總重10%的葡萄糖。

在一些實施例中，將茯苓、酸棗仁及水混合以形成茯苓酸棗仁溶液。接著，於茯苓酸棗仁溶液中加入相對茯苓酸棗仁溶液總重10%的葡萄糖，以得到茯苓酸棗仁基液。並且，將茯苓酸棗仁基液進行浸提程序以得到茯苓酸棗仁浸提液。於此，由於進行浸提程序前，茯苓酸棗仁基液中的葡萄糖為完全溶解或未完全溶解。因此，透過浸提程序有助於將茯苓酸棗仁基液內的葡萄糖完全溶解並且還可避免污染。

在一些實施例中，將茯苓、酸棗仁及水混合以形成茯苓酸棗仁溶液後進行浸提程序，並於浸提程序後加入葡萄糖以形成茯苓酸棗仁浸提液。於此，先將茯苓酸棗仁溶液先行進行浸提程序，有助於茯苓酸棗仁溶液中的茯苓及/或酸棗仁內的有效成分的確實地釋出。

在一些實施例中，浸提程序為於50℃-100℃下靜置0.5小時-1.5小時。舉例來說，浸提程序係指將茯苓酸棗仁基液或茯苓酸棗仁溶液維持在95℃並靜置1小時。

在一些實施例中，茯苓酸棗仁浸提液的糖度為9°Bx~10°Bx。於此，足夠的糖度可以確保後續發酵的順利進行，並使菌種有足夠的養分生長。

接著，加入複數菌種至茯苓酸棗仁浸提液中進行發酵4~15.5日以得到植物發酵液。其中，複數菌種包括0.01%~0.5%的酵母菌、0.01%~0.25%的乳酸菌及3~10%的醋酸菌（ Acetobacter aceti）。在一些實施例中，於發酵前不濾除茯苓酸棗仁浸提液中的固形物（即，進行浸提程序後的茯苓和/或酸棗仁）。換言之，是直接將菌種加入茯苓酸棗仁浸提液進行發酵，藉以利用菌種進一步提取固形物中的活性成分。

在一些實施例中，酵母菌可以是市售的啤酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）。舉例而言，向財團法人食品工作發展研究所所採購寄存編號BCRC20271（國際寄存ATCC26602）菌株的啤酒酵母。

在一些實施例中，乳酸菌可以為市售的胚芽乳酸桿菌（ Lactobacillus plantarum）、市售的嗜熱鏈球菌（ Streptococcus thermophiles）或植物乳桿菌。舉例而言，採用寄存編號BCRC910805（國際寄存DSM33108）菌株的胚芽乳酸桿菌TCI028或寄存編號BCRT910760（國際寄存DSM32451）菌株的胚芽乳酸桿菌TCI378。再舉例而言，採用寄存編號BCRC910636（國際寄存DSM28121）菌株的嗜熱鏈球菌TCI633。

在一些實施例中，醋酸菌可以為向美國菌種中心（American Type Culture Collection, ATCC）採購寄存編號ATCC15973（國內寄存編號BCRC11688）的醋酸菌。

在一些實施例中，於茯苓酸棗仁浸提液中加入酵母菌後進行發酵1日~2.5日後形成第一初發酵液。基此，透過先添加酵母菌至茯苓酸棗仁浸提液中，可於酵母菌發酵過程中產生酒精，並有利於提取出茯苓與酸棗仁內不同的有效成份。在一些實施例中，第一初發酵液的酸鹼值（pH值）小於4，且其糖度約為9°Bx。

加入乳酸菌至第一初發酵液後進行發酵1日~3日後形成第二初發酵液。基此，透過添加乳酸菌至第一初發酵液中可使其內的葡萄糖被進一步消耗而降低糖度，並產生乳酸以降低第一初發酵液的pH值。並且，降低pH值有利於進一步提取出茯苓與酸棗仁內其他不同的有效成分。在一些實施例中，第二初發酵液的pH值小於3.5，且其糖度約為6°Bx。

加入醋酸菌至第二初發酵液後進行發酵3日~10日後形成第三初發酵液。基此，透過添加醋酸菌至第二初發酵液可使其內的酒精被消耗，並一步降低葡萄糖的含量。在一些實施例中，第三初發酵液的pH值小於3.5，且其糖度為約為3°Bx。

在一些實施例中，將第三初發酵液過濾並濃縮以得到植物發酵液。舉例來說，過濾方式可以是以200mesh過濾，且濃縮方式可以採取在60℃下的減壓濃縮。於此，植物發酵液的pH值小於3.5。

在一些實施例中，添加寡糖至植物發酵液以使其糖度達到40°Bx以形成植物發酵飲品。於此，寡糖係指由3個~10個單醣分子聚合而成的低聚糖。其中，寡糖可為果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、異麥芽寡糖等。在一些實施例中，所添加的寡糖可為含40%~70%異麥芽寡糖的寡糖溶液。

在一些實施例中，植物發酵液的皂苷（Saponin）含量至少為20906 µg/ml。

在一些實施例中，植物發酵液具有提升以下基因中至少一基因的表現量的能力： GAD1基因（Gene ID:2571）、 GABRA1基因（Gene ID:2554）、 GABRA4基因（Gene ID:2557）及 GABRA6基因（Gene ID:2559）。在一些實施例中，植物發酵液具有促進GABA蛋白質分泌的能力。

在一些實施例中，植物發酵液具有促進多巴脫羧酶（Dopa decarboxylase, DDC；又稱芳香族L-胺基酸脫羧酶（aromatic amino acid decarboxylase））基因（Gene ID:1644）的表現量的能力。其中， DDC基因為一種血清素合成基因，亦為褪黑激素合成相關基因。血清素（Seratonin）是大腦中松果體（pineal gland）生成褪黑激素（Melatonin）的重要前驅物，且褪黑激素為調節人體生理時鐘與睡眠關鍵的激素。並且，血清素是由大腦合成分泌，其主要原料為色胺酸（Tryptophan），而色胺酸為人體不能合成的九大必需胺基酸之一，其須從食物中汲取而獲得。當人體攝取的色氨酸經色氨酸羥化酶（Tryptophan hydroxylase, TPH）轉化為5-羥色氨酸（5-HTP）後，再藉由多巴脫羧酶（DDC）轉換為血清素。再由芳烴基烷基胺乙醯基轉移酶（Aralkylamine N-acetyltransferase, AANAT）與乙醯複合胺O-甲基轉移酶（Acetylserotonin O-Methyltransferase, ASMT）將血清素轉化成褪黑激素。於此，植物發酵液可用以改善睡眠品質。

在一些實施例中，植物發酵液具有促進膠原蛋白分泌的能力。在一些實施例中，植物發酵液具有提升以下至少一基因的表現量的能力： CCT2基因（Gene ID:10576）及 CCT6A基因（Gene ID:908）。其中， CCT2基因及 CCT6A基因為細胞回春相關基因。發酵液具有提升以下至少一粒線體相關基因的表現量的能力： Pink1基因（Gene ID: 65018）、 Atg1基因（Gene ID:8408）、 Ubl-5基因（Gene ID:59286）及 NADSYN1基因（Gene ID:55191）。其中， Pink1基因及 Atg1基因為粒線體回春相關基因； Ubl-5基因及 NADSYN1基因為粒線體活化相關基因。於此，植物發酵液具有抗老化的效果並可用來預防老化。

基此，植物發酵液可用以製備用以改善睡眠品質及/或抗老化的組合物。

在一些實施例中，組合物可以為液態（如，植物發酵飲品等）或固態（如，植物發酵液粉末、植物發酵液錠等）。在一些實施例中，液態的組合物的使用劑量為6毫升/天，而固態組合物的使用量為0.65克/天。

在一些實施例中，前述之任一組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的植物發酵液。

在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服的、或局部地（topically）投藥劑型。

在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation） 或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。

在一些實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、或含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。

在一些實施例中，前述之任一組合物可為食用產品。換言之，食用產品包含特定含量的植物發酵液。在一些實施例中，食用產品可為一般食品、保健食品或膳食補充品。

在一些實施例中，前述之食用產品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於口服的劑型。在一些實施例中，前述之一般食品可為食用產品本身。在一些實施例中，一般食品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）或調味料。

在一些實施例中，所得的植物發酵液可進一步作為食品添加物（food additive），以製得含有植物發酵液的食品組合物。於此，能藉由習知方法於原料製備時添加任一實施例的植物發酵液，或是於食品的製作過程中添加任一實施例的植物發酵液，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食用產品（即食品組合物）。

例 1 ：植物發酵液的製備

首先，準備1重量份的茯苓、1重量份的酸棗仁及50重量份的水，並將其混合均勻以形成茯苓酸棗仁溶液。接著，加入相對於茯苓酸棗仁溶液10%總重的葡萄糖，以形成茯苓酸棗仁基液。並且，將茯苓酸棗仁基液於95℃下靜置1小時，以形成植物浸提液。

於靜置後，待植物浸提液冷卻後加入0.01%的BCRC20271菌株之啤酒酵母，並於30℃下進行發酵1天以形成第一初發酵液。再加入0.05%的BCRC910805菌株之胚芽乳酸桿菌至第一初發酵液中，並於30℃下進行發酵1天以形成第二初發酵液。接著，加入5%的BCRC11688菌株之醋酸菌至第二初發酵液中，並於30℃下進行發酵5天以形成第三初發酵液。於此，第三初發酵液的pH值小於3.5，且其糖度為約為3°Bx。

接著，以200mesh過濾第三初發酵液後，於60℃下減壓濃縮，以得到植物發酵液。

例 2 ： 皂苷含量測試

於此，所使用作為標準品的溶液為1000ppm的齊墩果酸（Oleanolic acid，品牌：Sigma，編號：O5504-100MG）溶液，其係以甲醇（Methanol，品牌：JT Baker）溶解配置，並以甲醇序列稀釋為0ppm、100ppm、200ppm、400ppm、600ppm、800ppm等濃度。

將各濃度的齊墩果酸溶液分別取100μL至微量離心管中，並於70℃~85℃烘箱中烘乾各濃度的齊墩果酸溶液使其完全乾燥。接著，於各微量離心管加入100μL的5%香草醛（vanillin，品牌：Sigma，編號：A11169），並加入400μL的高氯酸（Perchloric acid，品牌：Sigma，編號：30755-1L）混合均勻後，置於65℃水浴中反應15分鐘，以形成混合溶液。於此，所使用的5%香草醛是以乙酸（Acetic acid，品牌：JT Baker，編號：9508-03）配置。

接著，取40μL的混合溶液至96孔盤並於每孔加入200μL的乙酸混合均勻以形成測試溶液，並測量其在531nm下之吸光值。於此，依照所量測的吸光值對應齊墩果酸溶液的濃度繪製標準曲線。

於此，將例1得到的植物浸提液作為控制組的測試樣品，且將例1所製備得到的植物發酵液作為實驗組的測試樣品。

取100μL的測試樣品至微量離心管中，並於70℃~85℃烘箱中烘乾測試樣品使其完全乾燥。接著，於各微量離心管加入100μL的5%香草醛，並加入400μL的高氯酸混合均勻後，置於65℃水浴中反應15分鐘，以形成混合溶液。

取40μL的混合溶液至96孔盤並於每孔加入200μL的乙酸混合均勻以形成測試溶液，並測量其在531nm下之吸光值。接著將依據標準曲線以內插法的方式計算控制組及實驗組的總皂苷含量，如圖1所示。

請參閱圖1。控制組的總皂苷含量為2194.3mg/mL，而實驗組的總皂苷含量為20906 mg/mL。換言之，實驗組的總皂苷含量為控制組的總皂苷含量9.53倍。由此可知，透過複數菌種發酵後可顯著提高植物發酵液的總皂苷含量。因此，相較於服用植物浸提液，當受體服用植物發酵液或以其製備的組合物時，有助於受體助眠作用及提高受體抗老化的能力。

例 3 ： GABA 相關基因表現測試

於此， GABA相關基因包括 GAD1基因（Gene ID:2571）、 GABRA1基因（Gene ID:2554）、 GABRA4基因（Gene ID:2557）及 GABRA6基因（Gene ID:2559）。

於此，所使用的細胞培養基為添加有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，編號10437-028）、1%的抗生素-抗黴菌素（Antibiotic-Antimycotic）（Gibco公司，Cat.15240-062）的DMEM培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium；Gibco公司，編號11965-092）。

首先，取1.5x10 ⁵個小鼠神經母細胞瘤細胞（ATCC CCL-131；以下稱Neuro2a細胞）至每孔含有2毫升細胞培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。

將Neuro2a細胞分為實驗組及空白組。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔2mL實驗培養基，然後置於37℃下分別接續培養6小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.025mg/mL的例1中所得到的植物發酵液的細胞培養基。空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含植物發酵液）。並且，各組別進行四重複。

收集各組的Neuro2a細胞，並以RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）萃取出各組的RNA。接著，各組取1000奈克（ng）的RNA作為模板，透過SuperScript ^®III反轉錄酶（購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051）將RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlus ^TM即時PCR系統（ABI StepOnePlus ^TMReal-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））、KAPA SYBR FAST（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）及表1的引子（SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8）對各組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction）以觀察Neuro2a細胞內 GABA相關基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95℃反應20秒，接著95℃反應3秒，60℃反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量，如圖2所示。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量基因的mRNA表現量，進而推斷基因編碼的蛋白質的表現量。

需要特別說明的是，圖2中的基因表現是以相對表現倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。在圖2中，「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。

表1

目標基因	引子名稱	序列編號	序列
GAD1	GAD1-F	SEQ ID NO:1	CTAGCGAGAACGAGGAAGCA
GAD1-R	SEQ ID NO:2	TAGTGGTATTGGGGTCCGCT
GABRA1	GABRA1-F	SEQ ID NO:3	TGATGGAGCTCGAGGCAAA
GABRA1-R	SEQ ID NO:4	CTGGGTTCCTGGACGAAGAAT
GABRA4	GABRA4-F	SEQ ID NO:5	AACGAAAGTGTGGACCCCTG
GABRA4-R	SEQ ID NO:6	TGGGACACTCCGCACTTATG
GABRA6	GABRA6-F	SEQ ID NO:7	ATCAACACCTGTCACACCCC
GABRA6-R	SEQ ID NO:8	CTGGCCGCAAGCTATTCAAC

於表1中，F為順向引子（Forward primer），而R為反向引子（Reverse primer）。

請參閱圖2。將空白組的各組 GABA相關基因的相對表現量視為1.00（即空白組的各組基因的表現量為100%）。相較於空白組，實驗組的 GAD1基因的相對表現量為1.35、實驗組的 GABRA1基因的相對表現量為1.22、實驗組的 GABRA4基因的相對表現量為1.96、實驗組的 GABRA6基因的相對表現量為2.08。於此，實驗組的 GABA相關基因的表現量顯著的提升，代表植物發酵液能有效地提高GABA合成酶基因及GABA受體相關基因。換言之，當受體服用植物發酵液時，能提高 GABA相關基因的表現量，進而改善睡眠品質。

例 4 ： GABA 蛋白質的分泌量實驗

於此，所使用的細胞培養基為添加有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，編號10437-028）、1%的抗生素-抗黴菌素（Antibiotic-Antimycotic）（Gibco公司，Cat.15240-062）的DMEM培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium；Gibco公司，編號11965-092）。

首先，取5x10 ³個SHSY-5Y細胞（ATCC® CRL-2266™）至每孔含有0.1毫升細胞培養基的96孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。

將SHSY-5Y細胞分為實驗組、控制組及空白組。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔0.1mL實驗培養基，然後置於37℃下分別接續培養24小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.25%的例1中所得到的植物發酵液的細胞培養基。控制組的實驗培養基為含有0.25%的例1中所得到的植物浸提液的細胞培養基。空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含植物發酵液或植物浸提液）。

分別收集各組的上清液及SHSY-5Y細胞。並依照gABA ELISA套組（品牌：USCN，編號：CEA900Ge）內所附之操作手冊，使細胞SHSY-5Y呈色後，再以ELISA分光光度計於450nm的波長下測量各孔吸光值。並且，依據所測得之吸光值推算各組（除空白組外）的GABA蛋白質的分泌量，如圖3所示。

請參閱圖3。將空白組的數值視為100%。相較於空白組，實驗組的GABA蛋白質的相對分泌量為136%，而控制組的GABA蛋白質的相對分泌量為110.81%。換言之，相較於植物浸提液，植物發酵液顯著地提高SHSY-5Y細胞的GABA蛋白質的分泌量。由此可知，當受體服用植物發酵液時，其神經細胞能有效地分泌GABA蛋白質，進而抑制神經衝動，並提供手體安神助眠的效果，故而具有改善受體睡眠品質之功效。

例 5 ： 褪黑激素相關基因的表現量測試

於此，褪黑激素相關基因為巴脫羧酶（Dopa decarboxylase; DDC）基因（Gene ID1644），其係一種血清素合成基因。

於此，所使用的細胞培養基為添加有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，編號10437-028）、1%抗生素-抗黴菌素（Antibiotic-Antimycotic）（Gibco公司，Cat.15240-062）的DMEM培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium；Gibco公司，編號11965-092）。

首先，取1x10 ⁵個人類神經母細胞瘤細胞（ATCC® CRL-2266™；以下稱SHSY-5Y細胞）至每孔含有2毫升細胞培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。

將SHSY-5Y細胞分為實驗組、控制組及空白組。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔0.1mL實驗培養基，然後置於37℃下分別接續培養24小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.25%的例1中所得到的植物發酵液的細胞培養基。控制組的實驗培養基為含有0.25%的例1中所得到的植物浸提液的細胞培養基。空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含植物發酵液或植物浸提液）。

收集各組的SHSY-5Y細胞，並以RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）萃取出各組的RNA。接著，各組取1000奈克（ng）的RNA作為模板，透過SuperScript ^®III反轉錄酶（購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051）將RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlus ^TM即時PCR系統（ABI StepOnePlus ^TMReal-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））、KAPA SYBR FAST（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）及表2的引子（SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:10）對各組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction）以觀察SHSY-5Y細胞內 DCC基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95℃反應20秒，接著95℃反應3秒，60℃反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量，如圖4所示。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量基因的mRNA表現量，進而推斷基因編碼的蛋白質的表現量。

需要特別說明的是，圖4中的基因表現是以相對表現倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。在圖4中，「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05。

表2

目標基因	引子名稱	序列編號	序列
DCC	DCC-F	SEQ ID NO:9	ACCACAACATGCTGCTCCTTT
DCC-R	SEQ ID NO:10	ATCAACGTGCAGCCATATGTCT

於表2中，F為順向引子（Forward primer），而R為反向引子（Reverse primer）。

請參閱圖4。將空白組的各組 DCC相關基因的相對表現量視為1.00（即空白組的各組基因的表現量為100%）。相較於空白組，實驗組的 DCC基因的相對表現量為1.17，而控制組的 DCC基因的相對表現量為0.95。由此可知，實驗組的 DCC基因的表現量顯著的被提升，代表植物發酵液能有效地提高血清素合成基因。換言之，當受體服用植物發酵液時，能提高 DCC基因的表現量，進而促進血清素及褪黑激素生成，以改善受體的睡眠品質。

例 6 ： 膠原蛋白的相對分泌量實驗

於此，所使用的細胞培養基為添加有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，編號10437-028）、1%的抗生素-抗黴菌素（Antibiotic-Antimycotic）（Gibco公司，Cat.15240-062）及1mM的丙酮酸鈉（sodium pyruvate，Gibco公司，編號11360-070）的最低限度必需培養基（Minimum essential medium，簡稱MEM，以下稱MEM培養基）（Gibco公司，編號11095080）。

首先，取2x10 ⁴個人類纖維母細胞（CCD-966Sk cell，品牌：ATCC®，CRL-1881；以下稱CCD-966Sk細胞）至每孔含有0.5毫升細胞培養基的24孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。待CCD-966Sk細胞貼附於細胞培養盤的底部後，以1XDPBS（Gibco公司，Cat. 14200-075）清洗一次。

將CCD-966Sk細胞分為實驗組、控制組及空白組。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔0.5mL實驗培養基，然後置於37℃下分別接續培養48小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.25%的例1中所得到的植物發酵液的細胞培養基。控制組的實驗培養基為含有0.25%的例1中所得到的植物浸提液的細胞培養基。空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含植物發酵液）。

收集1mL的各組的實驗培養基，並以可溶性膠原蛋白檢測套組（品牌：Biocolor；編號： S1000）處理以形成各組的待測溶液，接著以分光光度計測量其在555nm下之各組吸光值，並使用 Excel 軟體中的 student t-test 進行統計分析，如圖5所示。

請參閱圖5。將空白組的數值視為100%。相較於空白組，實驗組的膠原蛋白的相對分泌量為117.15%，而控制組的膠原蛋白的相對分泌量為94.69%。換言之，實驗組能顯著促進CCD-966Sk細胞分泌膠原蛋白，並顯著的提高17.15%。由此可知，當受體服用植物發酵液時，其肌膚細胞能有效地分泌膠原蛋白，進而改善受體肌膚，使受體的肌膚具有彈性及保持濕度，並使受體的肌膚光滑透亮。

例 7 ： 抗老化相關基因的表現量測試

於此，抗老化相關基因包括細胞回春相關基、粒線體回春相關基因及粒線體活化相關基因。其中，細胞回春相關基為 CCT2基因（Gene ID:10576）及 CCT6A基因（Gene ID:908）；粒線體回春相關基因為 Pink1基因（Gene ID:65018）及 Atg1基因（Gene ID:8408）；粒線體活化相關基因為 Ubl-5基因（Gene ID:59286）及 NADSYN1基因（Gene ID: 55191）。

於此，所使用的細胞培養基為添加有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，編號10437-028）、1%的抗生素-抗黴菌素（Antibiotic-Antimycotic）（Gibco公司，Cat.15240-062）及1mM的丙酮酸鈉（sodium pyruvate，Gibco公司，編號11360-070）的最低限度必需培養基（Minimum essential medium，簡稱MEM，以下稱MEM培養基）（Gibco公司，編號11095080）。

首先，取1.5x10 ⁵個人類纖維母細胞（以下稱CCD-966Sk細胞，ATCC CRL-1881）至每孔含有2毫升細胞培養基的24孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。

將CCD-966Sk細胞分為實驗組及空白組 。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔2mL實驗培養基，然後置於37℃下分別接續培養24小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.025mg/mL的例1中所得到的植物發酵液的細胞培養基。空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含植物發酵液）。

收集各組的CCD-966Sk細胞，並以RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）萃取出各組的RNA。接著，各組取1000奈克（ng）的RNA作為模板，透過SuperScript ^®III反轉錄酶（購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051）將RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlus ^TM即時PCR系統（ABI StepOnePlus ^TMReal-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））、KAPA SYBR FAST（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）及表3的引子（SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:22）對各組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction）以觀察CCD-966Sk細胞內抗老化相關基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95℃反應20秒，接著95℃反應3秒，60℃反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量，如圖6及圖7所示。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量基因的mRNA表現量，進而推斷基因編碼的蛋白質的表現量。

需要特別說明的是，圖6及圖7中的基因表現是以相對表現倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。在圖6及圖7中，「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05及「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01。

表3

目標基因	引子名稱	序列編號	引子序列
CCT2	CCT2-F	SEQ ID NO:11	CACTGGTGCGATTATTTG
CCT2-R	SEQ ID NO:12	CCCAGCAAATATCAGAAG
CCT6A	CCT6A-F	SEQ ID NO:13	TGTGTATCTTAATCCAGACTC
CCT6A-R	SEQ ID NO:14	CGTTTCACCTAAGAGTTGTC
Pink1	Pink1-F	SEQ ID NO:15	CTGTGGTGGCTAGTGCTCCT
Pink1-R	SEQ ID NO:16	TCCAGACGTGAGACAGTTGG
Atg1	Atg1-F	SEQ ID NO:17	CAGGAGGACGAGAACACGGTGTC
Atg1-R	SEQ ID NO:18	GGAAGGTTCTTTGGCACCAGCAC
Ubl-5	Ubl-5-F	SEQ ID NO:19	TCCTAGCGTTAACTGCGACC
Ubl-5-R	SEQ ID NO:20	CTAGCTGGAGCTCGAATCGC
NADSYN1	NADSYN1-F	SEQ ID NO:21	GCAAAATGTGCAGGCTCGAA
NADSYN1-R	SEQ ID NO:22	GCACTGGAGCAGTCGTACTT

於表3中，F為順向引子（Forward primer），而R為反向引子（Reverse primer）。

請參閱圖6。將空白組的各組細胞回春相關基因的相對表現量視為1.00（即空白組的各組基因的表現量為100%）。相較於空白組，實驗組的 CCT2基因的相對表現量為1.18且實驗組的 CCT6A基因的相對表現量為1.17。於此，實驗組的細胞回春相關基因的表現量顯著的提升，代表植物發酵液具有將成熟老化的細胞回春為年輕細胞的能力。因此，當受體服用植物發酵液時，能提高 CCT2基因及/或 CCT6A基因的表現量，進而使受體具有抗老化的能力並有助於受體預防老化。

請參閱圖7。將空白組的各組粒線體相關基因的相對表現量視為1.00（即空白組的各組基因的表現量為100%）。相較於空白組，實驗組的 Pink1基因的相對表現量為1.37、實驗組的 Atg1基因的相對表現量為1.39、實驗組的 Ubl-5基因的相對表現量為1.29，以及實驗組的 NADSYN1基因的相對表現量為1.40。於此，實驗組的粒線體相關基因的表現量顯著的提升，代表植物發酵液具有將回春老化粒線體及恢復粒線體活性的能力。因此，當受體服用植物發酵液時，能提高 Pink1基因、 Atg1基因、 Ubl-5基因、 NADSYN1基因或其組合的表現量，進而使受體具有抗老化的能力並有助於受體預防老化。

綜上所述，根據本發明任一實施例的植物發酵液可用以製備用於改善睡眠品質及/或抗老化的組合物。經複數菌種發酵的植物發酵液具有較高含量的皂苷含量，且具有下列一種或多種的功能：提高 GAD1基因、 GABRA1基因、 GABRA4基因、 GABRA6基因或其組合的表現量、提高GABA蛋白質的分泌量、提高 DDC基因的表現量、提高膠原蛋白的分泌量、提高 CCT2基因、 CCT6A基因或其組合的表現量、提高 Pink1基因、 Atg1基因、 Ubl-5基因、 NADSYN1基因或其組合的表現量。

雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

無

圖1是植物發酵液中的總皂苷含量的數據圖； 圖2是GABA相關基因的表現量的實驗結果圖； 圖3是GABA蛋白質分泌量的實驗結果圖； 圖4是血清素合成基因的表現量的實驗結果圖； 圖5是膠原蛋白相對分泌量的實驗結果圖； 圖6是抗老化相關基因的表現量的實驗結果圖；以及 圖7是抗老化相關基因的表現量的實驗結果圖。

Claims (12)

1. 一種植物發酵液用以製備用於改善睡眠品質的組合物之用途，其中植物發酵液是由一茯苓酸棗仁浸提液經複數菌種發酵後所製得，該複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌，且該複數菌種的添加順序依序為該酵母菌、該乳酸菌及該醋酸菌。
2. 如請求項1所述之用途，其中該植物發酵液具有提升以下基因中至少一基因的表現量的能力：GAD1基因、GABRA1基因、GABRA4基因及GABRA6基因。
3. 如請求項1所述之用途，其中該植物發酵液具有促進GABA蛋白質分泌的能力。
4. 如請求項1所述之用途，其中該植物發酵液具有促進多巴脫羧酶(Dopa decarboxylase；DDC)基因的表現量的能力。
5. 一種植物發酵液用以製備用於抗老化的組合物之用途，其中植物發酵液是由一茯苓酸棗仁浸提液經複數菌種發酵後所製得，該複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌，且該複數菌種的添加順序依序為該酵母菌、該乳酸菌及該醋酸菌。
6. 如請求項5所述之用途，其中該植物發酵液具有促進膠原蛋白分泌的能力。
7. 如請求項5所述之用途，其中該植物發酵液具有提升以下基因中至少一基因的表現量的能力：CCT2基因及CCT6A基因。
8. 如請求項5所述之用途，其中該植物發酵液具有提升以下基因中至少一基因的表現量的能力：Pink1基因、Atg1基因、Ubl-5基因及NADSYN1基因。
9. 如請求項1或5所述之用途，其中該植物發酵液的皂苷含量至少為20906μg/ml。
10. 如請求項1或5所述之用途，其中該茯苓酸棗仁浸提液是由一茯苓酸棗仁基液在50℃-100℃下靜置0.5小時-1.5小時所製得。
11. 如請求項10所述之用途，其中該茯苓酸棗仁基液包括一茯苓酸棗仁溶液及相對該茯苓酸棗仁溶液總重10%的葡萄糖，該茯苓酸棗仁溶液包括1重量份的茯苓、1重量份的酸棗仁及50重量份的水。
12. 如請求項1或5所述之用途，其中該茯苓酸棗仁浸提液是由一茯苓酸棗仁溶液在50℃-100℃下靜置0.5小時-1.5小時後加入相對該茯苓酸棗仁溶液總重10%的葡萄糖所製得，該茯苓酸棗仁溶液包括1重量份的茯苓、1重量份的酸棗仁及50重量份的水。

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