KR20160090936A - 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 발효물 - Google Patents
홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 발효물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 발효물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 홍삼농축분말과 복분자완숙과추출물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 멸균한 후, 유산균을 접종하는 단계; 및 상기 유산균이 접종된 혼합물을 발효하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 발효물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물은 미량 진세노사이드의 함량을 증진시키고, DPPH 자유 라디칼 소거, α-아밀레이스 활성 증가, α-글루코시다아제 활성 억제, NO 생성 억제 및 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-12의 발현을 억제하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물은 미량 진세노사이드의 함량을 증진시키고, DPPH 자유 라디칼 소거, α-아밀레이스 활성 증가, α-글루코시다아제 활성 억제, NO 생성 억제 및 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-12의 발현을 억제하는 효능을 보유하고 있다.
Description
본 발명은 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 발효물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 홍삼농축분말과 복분자완숙과추출물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 멸균한 후, 유산균을 접종하는 단계; 및 상기 유산균이 접종된 혼합물을 발효하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 발효물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물은 미량 진세노사이드의 함량을 증진시키고, DPPH 자유 라디칼 소거, α-아밀레이스 활성 증가, α-글루코시다아제 활성 억제, NO 생성 억제 및 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-12의 발현을 억제하는 효능을 보유하고 있다.
발효란 미생물이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물을 분해시키는 과정을 말한다. 따라서 발효는 사용되는 미생물 즉, 발효균의 영향을 크게 받으며, 사용되는 균주의 종류와, 발효시간, 온도 및 기간 등 조건에 따라 맛, 성분 등이 상이해진다고 할 수 있다.
발효에 주로 사용되는 균주로는 누룩균, 황곡균, 고초균, 젖산균(유산균), 효모균 및 방선균 등이 있다.
이중 젖산균은 유산균이라고도 하며, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균을 총칭한다.
유산균의 정의에 적합한 것은 Lactobacillus , Lactococcus , Leuconostoc , Pediococcus, Bifidobacterium 등의 균속이다. 형태적으로는 구균(Lactococcus , Pediococcus, Leuconostoc)과 간균(Lactobacillus , Bifidobacterim)으로 나누어지고 그람(Gram) 염색성은 양성이다.
어느 것이나 산소가 적은 환경에서 잘 발육하여 각종 당으로부터 락트산을 생성한다. 산에 내성을 나타내는 것이 많고 영양요구성은 매우 복잡하여 당류 이외에 많은 종류의 아미노산이나 비타민을 요구하며 균종, 균주에 따라 미량 영양소를 가하지 않으면 생육할 수 없는 것도 있다.
Lactobacillus는 정상발효와 이상발효를 하는 2종류로 대별되는데 생육온도, 당분해, 성장, 생성 유산의 선광성 등에 따라 55균종 11아균종으로 분류되어 있다. 또한 장관 상재 균총으로서 사람이나 동물의 건강과 중요한 관계가 있다고 알려져 있다.
한편, 홍삼은 수삼을 쪄서 말린 붉은 인삼으로, 증숙과 건조를 반복하여 수행함으로써, 새로운 생리활성물질이 생성되고 약리작용이 증대된 효능이 있다.
인삼에는 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, Rh, Re, Rf, Rg1 및 Rg2 등 다양한 약리작용을 하는 진세노사이드 성분이 함유되어 있다.
홍삼의 제조 과정에서 이러한 진세노사이드의 화학구조가 변하게 되는데, 이때 항암 성분, 항당뇨 성분, 항염증 성분, 항산화 성분, 간 기능 해독 성분, 중금속 해독 성분 등 수삼에는 없거나 미량으로 함유되어있던 진세노사이드 성분 10여 가지가 새로 생겨나거나 함유량이 몇 배로 커진다.
미량 진세노사이드 중 하나인 Rg3(s)는 자연계에 존재하는 인삼에는 거의 존재하지 않고, 인삼을 유기산으로 가수분해하거나, 고온고압에서 가열하는 방법 등에 의하여 생성된다. Rg3(s)는 암세포 전이 억제작용, 혈소판 응집 억제작용, 항혈전 작용, 간 장해 억제작용, 혈관 이완작용, 항암작용 등의 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.
또한 컴파운드 K(compound K; 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올)는 진세노사이드의 장내 세균에 의한 대사 산물로 생성되며, 면역 증강작용, 암세포 증식 억제 작용, 종양 증식 억제 작용 및 항암제의 항암 활성 증대 작용 등의 약리적 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
최근에는 인삼을 홍삼으로 제조하는 공정 이외에, 추가로 홍삼을 발효함으로써 유용성분의 증대 및 흡수율을 증대하기 위한 방법이 사용되고 있다.
발효를 거친 홍삼은 발효 미생물의 효소에 의해 분해된 진세노사이드(compound K)를 함유하게 되므로, 발효 홍삼을 섭취하면 장에서 진세노사이드의 흡수율이 증가하게 된다.
이에 본 발명자들은 홍삼을 발효하여 효능이 강화된 발효물을 제조하는 방법을 안출하여, 본 발명을 완성하였다.
또한 본원 발명은 홍삼에 추가로 복분자를 혼합하여 발효함으로써, 약리작용이 강화되는 것을 특징으로 하는바, 복분자에 대해 간략히 살펴보면 다음과 같다.
복분자는 장미과의 복분자딸기(Rubus coreanus)의 채 익지 않은 열매로 만든 약재로, 결분자(缺盆子), 복분(覆盆), 오표자라고도 한다.
생김새는 작은 단과가 여러 개 모여서 덩어리를 이룬 것으로 원추형이나 눌려진 구형을 이루고 있다. 바깥면은 황록색 또는 엷은 갈색을 띠고 끝쪽은 둥근 원형을 이루고 꽃받침의 중심부는 함몰되어 있다.
이 약은 냄새가 없고 맛은 시고 달며 성질은 따듯하다. 신(腎)기능을 북돋아 유정(遺精), 몽정(夢精), 유뇨(遺尿) 등에 사용하며 시력약화를 방지하고, 몸을 가볍게 하며 머리를 검게한다. 또한 살결을 부드럽고 아름답게 하기도 한다. 약리작용으로 항염작용, 항산화작용, 항 헬리코박터 파이로리작용이 보고되었다.
복분자는 5~6월경에 개화하여 7~8월에 열매가 붉게 익은 후 검게 변한다. 미숙과와 완숙과로 분류되어 완숙과는 주로 식용으로, 미숙과는 한방 약재로 사용되고 있다. 복분자 열매에는 탄수화물, 유기산, 비타민, 안토시아닌계 색소 성분, 페놀성 물질 등 다양한 기능성 물질이 함유되어 있다.
성숙시기별 복분자의 생리활성물질을 분석한 결과, 총 폴리페놀 화합물 함량은 미숙과에 비해 완숙과가 더 높았으며, DPPH 라디칼 소거능 및 SOD 유사활성도 성숙할수록 높은 활성을 나타내었다. 또한 플라보노이드 함량 역시 미숙과에 비해 완숙과에서 높게 검출되었으며, 여러 기능적 역할을 수행하는 안토시아닌은 미숙과일 때에 비하여 완숙과일 때의 함량이 약 50배로 크게 증가하였다.(비특허문헌 1)
한편, 본 발명과 관련된 선행기술로 등록특허공보 제10-1370386호에 유익균을 이용한 발효홍삼의 제조방법이 기재되어 있다.
상기 선행기술은 유산균을 정제수 및 당밀과 혼합하여 발효함으로써 유익균 발효액을 제조하는 단계; 상기 유익균 발효액을 효모 및 김치유산균과 혼합하여 설탕 또는 당밀과 함께 발효함으로써, 2단 발효 혼합액을 제조하는 단계 가압 살균처리된 홍삼 분말을 제공하는 단계; 및 상기 가압살균 처리한 홍삼분말과 상기 2단 발효 혼합액을 혼합하여 설탕 또는 당밀과 함께 발효기에 넣고 교반하여 3차 발효하는 단계;를 포함하는 발효 홍삼액의 제조방법에 관한 것으로, 상기 선행기술에 의해 얻어지는 발효 홍삼액은 생리활성물질 중 진세노사이드의 함량을 매우 향상시킬 수 있으며, 발효홍삼의 체내 흡수율을 향상시켜 면역력 향상에 도움이 되는 유익균 발효홍삼을 제공하고 있다.
그러나, 상기 선행기술에는 홍삼과 복분자를 혼합하여 발효함으로써 발생하는 상승효과에 대해서는 알 수 없는 문제점이 있다.
차환수 외, 복분자딸기의 성숙 단계별 생리활성 비교, 한국식품영양과학회지 제36권 제6호, 2007.6, 683-688
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 홍삼농축분말과 복분자완숙과추출물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 멸균한 후, 유산균을 접종하는 단계; 및 상기 유산균이 접종된 혼합물을 발효하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 발효물을 제공하는 데에 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 미량 진세노사이드의 함량을 증진시키고, DPPH 자유 라디칼 소거, α-아밀레이스 활성 증가, α-글루코시다아제 활성 억제, NO 생성 억제 및 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-12의 발현을 억제하는 효능을 보유하는 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 발효물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 홍삼농축분말과 복분자완숙과추출물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 멸균한 후, 유산균을 접종하는 단계; 및 상기 유산균이 접종된 혼합물을 발효하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 발효물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 미량 진세노사이드의 함량을 증진시키고, DPPH 자유 라디칼 소거, α-아밀레이스 활성 증가, α-글루코시다아제 활성 억제, NO 생성 억제 및 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-12의 발현을 억제하는 효능을 보유하는 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 발효물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물은 미량 진세노사이드, 특히 Rg3(s) 및 컴파운드 K(compound K)의 함량이 증진된 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물은 DPPH 자유 라디칼 소거능에 따른 항산화 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물은 α-아밀레이스의 활성을 증가시키고, α-글루코시다아제(glucosidase) 활성을 억제하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물은 NO의 생성을 억제하며, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-12의 발현을 억제하는 효능을 보유하고 있다.
도 1은 발효시간에 따른 홍삼농축분말 발효물의 진세노사이드 함량을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 발효시간에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 진세노사이드 함량을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물의 발효물을 농도별로 처리한 후 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 DPPH 자유 라디칼 소거능을 측정한 그래프이다.
도 5는 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 α-아밀레이스 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 α-글루코시다아제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 농도 및 발효시간에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 nitrite 분비량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 TNF-α 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 IL-1β 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 IL-6 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 IL-12 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 발효시간에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 진세노사이드 함량을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물의 발효물을 농도별로 처리한 후 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 DPPH 자유 라디칼 소거능을 측정한 그래프이다.
도 5는 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 α-아밀레이스 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 α-글루코시다아제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 농도 및 발효시간에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 nitrite 분비량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 TNF-α 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 IL-1β 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 IL-6 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 IL-12 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실험예와 참고예는 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과한 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예
1. 홍삼농축분말과
복분자완숙과추출물
발효물의
제조
1-1. 홍삼농축분말의 제조
1) 홍삼을 추출한다.
추출 방법에는 열수 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 이산화탄소 초임계 추출법, 마이크로웨이브 공정 추출법 및 퍼콜레이션 추출법 등 다양한 추출방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 에탄올(주정)을 이용한 용매 추출법이 사용될 수 있다.
또한 추출시, 용매의 농도에 따라 추출온도, 추출시간, 용매의 양 및 잔류 성분 처리 방식 등을 달리하여 처리할 수 있으며, 추출은 2회 이상 반복되어 수행될 수도 있다.
2) 홍삼 추출물을 여과한 후 농축한다.
여과 방법에는 침강법, 막 분리법, 원심분리법, 분별증류법 및 분배법 등이 있으며, 다양한 방법이 혼합되어 사용될 수도 있다.
농축 방법에는 증발 농축법, 냉동 농축법, 막 농축법, 건조 농축법 및 감압 농축법 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 감압 농축법을 사용하여 홍삼 추출물을 농축할 수 있다.
농축 시간 및 온도 역시 조건에 따라 다르게 설계될 수 있으며, 바람직하게는 20~50℃ 저온에서 농축될 수 있다.
3) 홍삼 농축물을 분말화한다.
위 단계를 통해 얻어진 홍삼 농축물을 건조하여 홍삼농축분말을 얻는다.
건조 방법에는 동결 건조방법, 분무 건조방법 등이 사용될 수 있다.
1-2.
복분자완숙과추출물의
제조
1) 복분자완숙과를 추출한다.
추출 방법에는 열수 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 이산화탄소 초임계 추출법, 마이크로웨이브 공정 추출법 및 퍼콜레이션 추출법 등 다양한 추출방법이 사용될 수 있으며, 압착을 통하여 복분자완숙과추출물을 제조할 수도 있다.
추출된 복분자완숙과추출물은 추가로 여과, 농축 등의 과정이 더 수행될 수 있다.
1-3. 홍삼농축분말 및
복분자완숙과추출물의
발효물
제조
1) 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 혼합하여, 혼합물을 제조한다.
홍삼농축분말과 복분자완숙과추출물은 홍삼농축분말 1 중량부 기준으로, 복분자완숙과추출물이 0.5~1.5 중량부 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 동량으로 혼합될 수 있다.
홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물은 증류수와 함께 혼합될 수 있으며, 증류수 기준으로 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물이 2~8 중량%가 되도록 혼합될 수 있다.
2) 혼합물을 멸균 후, 발효균을 접종한다.
발효균 접종 전, 혼합물을 멸균함으로써 발효균 이외의 균으로부터 영향을 받지 않도록 할 수 있다.
혼합물을 멸균하는 방법에는 화염멸균법, 건열멸균법, 자비멸균볍, 저온살균법, 고압증기멸균법, 간헐멸균법, 여과멸균법, 방사선멸균법 및 가스멸균법 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 고압멸균법을 이용하여 멸균할 수 있다.
혼합물 멸균한 후, 발효를 위한 균을 접종한다.
이때 발효균은 누룩균, 황곡균, 고초균, 젖산균(유산균), 효모균 및 방선균 등이 사용될 수 있다.
바람직하게는 유산균이 사용될 수 있으며, 구체적으로는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)이 사용될 수 있다.
락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)은 1×108 CFU/mL 농도로 접종될 수 있다.
3) 혼합물을 발효하여, 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물을 제조한다.
발효시간 및 발효온도는 설계조건에 따라 다르게 설정될 수 있으며, 바람직하게는 30~40℃에서 20~25시간 동안 발효될 수 있다.
비교예
1. 홍삼농축분말
발효물의
제조
1-1. 홍삼농축분말의 제조
실시예 1의 홍삼농축분말의 제조와 동일한 과정으로 제조될 수 있다.
1-2. 홍삼농축분말의
발효물
제조
1) 홍삼농축분말을 증류수와 혼합하여, 혼합물을 제조한다.
홍삼농축분말은 증류수 기준으로 2~8 중량%가 되도록 혼합될 수 있다.
2) 혼합물을 멸균 후, 발효균을 접종한다.
발효균 접종 전, 혼합물을 멸균함으로써 발효균 이외의 균으로부터 영향을 받지 않도록 할 수 있다.
혼합물을 멸균하는 방법에는 화염멸균법, 건열멸균법, 자비멸균볍, 저온살균법, 고압증기멸균법, 간헐멸균법, 여과멸균법, 방사선멸균법 및 가스멸균법 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 고압멸균법을 이용하여 멸균할 수 있다.
혼합물 멸균한 후, 발효를 위한 균을 접종한다.
이때 발효균은 누룩균, 황곡균, 고초균, 젖산균(유산균), 효모균 및 방선균 등이 사용될 수 있다.
바람직하게는 유산균이 사용될 수 있으며, 구체적으로는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)이 사용될 수 있다.
락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)은 1×108 CFU/mL 농도로 접종될 수 있다.
3) 혼합물을 발효하여, 홍삼농축분말 발효물을 제조한다.
발효시간 및 발효온도는 설계조건에 따라 다르게 설정될 수 있으며, 바람직하게는 30~40℃에서 20~25시간 동안 발효될 수 있다.
실험예
1.
진세노사이드
분석
1-1. 실험 과정
진세노이드 함량은 HPLC 분석을 통해 이루어졌으며, HPLC 분석을 위해 진세노사이드 표준물질을 사용하였다. 각 발효물 샘플에 5 ml 3차 증류수를 넣고 초음파세척기로 용해한 후, HPLC/UV법으로 분석하였다. (Agilent 1260, Agilent)
1-2. 실험 결과
도 1은 발효시간에 따른 홍삼농축분말 발효물의 진세노사이드 함량을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 발효시간에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 진세노사이드 함량을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
실험 결과, 발효시간이 증가할수록 기존에 높은 함량으로 존재했던 Rb1, Rc, Rb2, Rd 및 Re 등의 진세노사이드 함량이 감소하고, Rg3(s) 및 compound K와 같이 미량으로 존재하였던 진세노사이드의 함량이 증가한 것을 확인하였다.
특히 홍삼농축분말 발효물에 비해 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물에서 Rg3(s) 및 compound K의 함량이 크게 증가하는 것을 확인하였다.
실험예
2. 세포독성
2-1. 실험 과정
홍삼농축분말을 발효한 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물의 혼합물을 발효한 발효물의 세포독성은 RAW 264.7 세포주에 각 발효물을 농도별로 처리한 후, MTT 분석 방법을 이용하여 확인하였다.
마우스의 대식세포주(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포주는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 100 units/ml 페니실린, 100 ug/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 함유한 Dulbecco's modified eagles medium(Gibco, USA) 완전배지를 사용하여 37℃ CO2 배양기에서 배양하여 사용하였다.
Well당 MTT 용액(2 mg/ml)을 50 ㎕씩 넣어 37℃, 5% CO2 항온기에서 2시간 반응시킨 후 배지는 제거하고 DMSO를 well당 100 ㎕씩 넣어 5분간 plate shaker에서 blue formazan 결정을 용해시킨 다음 ELISA reader(Techan, Germany) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2-2. 실험 결과
도 3은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물의 발효물을 농도별로 처리한 후 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
실험 결과, 홍삼농축분말 발효물은 0.25 mg/mL의 농도까지 세포 독성이 나타나지 않았으며, 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물 역시 0.25 mg/mL의 농도까지 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다.
실험예
3. 항산화 활성 분석
3-1. 실험 과정
발효물의 항산화 활성은 DPPH 자유 라디칼에 대한 환원력을 측정하여 분석하였다.
발효물을 phosphate buffer에 녹여 다양한 농도 (0.1, 1, 10, 100 ㎍/㎕)로 처리한 후, 발효물 100 ㎕에 200 mM의 DPPH 900 ㎕를 섞은 후에 상온에서 10분간 반응시켰다. 이후 96-well plate의 각 well에 분주하여 OD 517 mm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화 활성은 다음과 같이 계산하였다.
EDA(%)=(1-absorbance value of sample/absorbance value of control)100
3-2. 실험 결과
도 4는 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 DPPH 자유 라디칼 소거능을 측정한 그래프이다.
실험 결과, 홍삼농축분말 발효물에 비해 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 DPPH 자유 라디칼 소거능이 높은 것을 확인하였다. 즉, 홍삼농축분말을 단독으로 발효한 발효물에 비해 홍삼농축분말과 복분자완숙과추출물을 혼합하여 발효한 발효물의 항산화능이 더 뛰어남을 알 수 있다.
실험예
4.
아밀레이스
(
amylase
) 활성 분석
4-1. 실험 과정
1.5 ml tube에 시료 10 μL와 기질(substrate) 190 μL를 넣고 잘 섞은 후 5분간 실온에서 반응시켰다. 그 후 stop 시약을 80 μL를 넣어 잘 섞은 후 14,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액 200 μL를 옮겨서 595 nm에서 흡광도를 확인하였으며, 다음의 식을 이용하여 분석하였다.
Activity = ODsample - ODblank/ODcal-ODH2O × n × 550 (U/L)
4-2. 실험 결과
도 5는 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 α-아밀레이스 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
실험 결과, 홍삼농축분말을 단독으로 발효한 발효물에 비해 홍삼농축분말과 복분자완숙과추출물을 혼합하여 발효한 발효물의 α-아밀레이스 활성이 더 높은 것을 확인하였다.
실험예
5.
글루코시다아제
(
gludosidase
) 활성 분석
5-1. 실험 과정
각 tube에 시료 20 μL씩 넣은 후 working 시약을 200 μL을 넣고 잘 섞어준다. 405 nm의 파장에서 0 분과 20 분 후의 흡광도를 측정하였다.
α-glucosidase activity = OD20 분-OD0 분/ODcalibrator-ODH2O × 250 (U/L)
5-2. 실험 결과
도 6은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 α-글루코시다아제 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
실험 결과, 홍삼농축분말을 단독으로 발효한 발효물에 비해 홍삼농축분말과 복분자완숙과추출물을 혼합하여 발효한 발효물의 α-글루코시다아제 활성이 더 낮은 것을 확인하였다.
실험예
6.
nitric
oxide
생성억제
6-1. 실험 과정
각 RAW 264.7 대식세포를 2×105 세포/ml의 농도로 분취하고 37℃ CO2 배양기에서 4시간 동안 배양한 후, LPS와 발효물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 배양 상등액 중의 아질산염(nitrite, NO의 안정한 수화합물)의 농도를 Griess assay 방법(Griess. P., Chem. Ber. 12:426-428, 1897)으로 측정하였다.
즉 NaNO2를 표준물질로 하고 그리스 시약(Griess reagent, 0.5% sulfanilyamide, 0.05% N-(1-naphthyl) ethylene diamine dihydrochloride/2.5% H3PO4)을 이용하여 540 nm에서 시료의 흡광도를 측정하였다.
6-2. 실험 결과
도 7은 농도 및 발효시간에 따른 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 nitrite 분비량을 나타낸 그래프이다.
실험 결과, 발효물의 농도가 증가할수록 nitrite 분비량은 감소하였으며, 20일과 25일 동안 발효시킨 발효물에서 nitrite 생성이 급격하게 감소하는 것을 확인하였다.
실험예
7. 염증성 사이토카인(
TNF
-α,
IL
-1β,
IL
-6 및
IL
-12) 발현 분석
7-1. 실험 과정
RAW 264.7 세포 1.5×105 cells/㎖를 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2 항온기에서 18시간 전 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 LPS와 발효물을 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 분)하여 얻어진 상층액의 염증성 사이토카인의 생성함량을 측정하였다. 염증성 사이토카인은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였다.
7-2. 실험 결과
도 8 내지 11은 홍삼농축분말 발효물과 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물 발효물의 염증성 사이토카인 분비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
TNF-α(도 8), IL-1β(도 9), IL-6(도 10) 및 IL-12(도 11)의 발현을 분석한 결과, 홍삼농축분말을 단독으로 발효한 발효물에 비해 홍삼농축분말과 복분자완숙과추출물을 혼합하여 발효한 발효물에서 염증성 사이토카인의 분비가 억제되는 것을 알 수 있다.
Claims (5)
- 홍삼농축분말과 복분자완숙과추출물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
상기 혼합물을 멸균한 후, 유산균을 접종하는 단계; 및
상기 유산균이 접종된 혼합물을 발효하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 혼합물을 제조하는 단계에서, 홍삼농축분말과 복분자완숙과추출물은 동량으로 혼합되는 것을 특징으로 하는 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)이며, 상기 접종하는 단계에서 유산균은 1×108 CFU/mL로 접종되는 것을 특징으로 하는 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 발효하는 단계는 30~40℃ 온도에서 20~25일간 수행되는 것을 특징으로 하는 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물의 제조방법.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 홍삼농축분말 및 복분자완숙과추출물을 함유하는 발효물.
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