KR102259935B1 - 저분자 발효 홍삼 제조방법 - Google Patents

저분자 발효 홍삼 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발효 통홍삼 및 발효 복합추출물을 포함하는 식품조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 식품조성물은 통홍삼분말을 포함하여 포만감과 식감이 향상되고, 쓴맛이 저감되며, 진세노사이드 함량이 증가된 것을 특징으로 하고, 면역기능을 개선하는 효과가 우수하다. 따라서 본 발명의 식품조성물은 일반 기호성 식품 및 면역기능 개선용 식품으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

저분자 발효 홍삼 제조방법 {Method for preparing low molecular weight-fermented ginseng}
본 발명은 발효 통홍삼 분말 및 발효 생약추출물을 포함하는 식품조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
홍삼은 숙취제거, 노화방지, 항피로, 항스트레스효과, 혈액순환, 며역기능 개선, 골다공증 예방 등 알려진 효능이 다양한 한약성분으로, 시중에는 홍삼진액, 홍삼차, 홍삼절편 등 다양한 제조방법에 따른 여러가지 홍삼 제품들이 출시되어 있다. 그러나, 홍삼은 특유의 쓴맛으로 인하여 젊은 소비자에게는 선호도가 높지 않으며, 홍삼에서 유용성분을 추출하고 난 나머지 잔여물에도 유용성분이 다량 포함되어 있으므로 잔여물을 폐기처분하지 않고 홍삼 전체를 이용한 홍삼제품의 제조방법에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
또한, 여성뿐만 아니라 남성들도 갱년기가 되면, 면역조절기능이 저하되어 면역력 감소에 따른 감염성 질환에 취약해지거나, 또는 과도한 면역반응에 의한 건강 이상을 호소하는 경우가 많다. 따라서, 갱년기 환자들의 면역기능을 조절할 수 있는 식품조성물의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 홍삼을 추출하고 남은 잔여 홍삼을 통째로 분쇄하여, 자소엽, 형개, 치커리 추출물과 함께 유산균 발효를 수행하면, 홍삼의 쓴맛을 저감시키면서도 면역조절기능을 개선하는 효과가 우수한 식품이 제조됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허공보 제10-2008-0063049호 (2008.07.03. 공개)
본 발명자들은 홍삼을 통째로 활용하면서도, 홍삼의 쓴맛을 저감시키고, 갱년기 환자들의 면역조절기능을 개선할 수 있는 식품을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 홍삼을 추출하고 난 잔여물을 분쇄하여 제조한 분말 가루와 홍삼추출물, 자소엽, 형개, 및 치커리 추출물과 함께 유산균 발효를 수행하면 진세노사이드 성분의 함량이 증가되고, 쓴맛이 저감되며, 면역개선 기능이 우수한 식품조성물이 제조됨을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 발효 통홍삼 및 발효 복합추출물을 포함하는 식품조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 발효 통홍삼 및 발효 복합추출물을 포함하는 식품조성물의 제조방법을 제공한다:
(a) 홍삼을 60-85% 에탄올 수용액으로 3 내지 7시간 동안 환류 추출한 후 여액을 분리하여 감압건조하는 단계;
(b) 상기 에탄올 수용액 추출 및 여과 후 잔여 홍삼을 건조 및 분쇄하여 분말화하는 단계;
(c) 자소엽, 형개, 및 치커리의 혼합물을 70-100℃의 물로 2 내지 5시간 동안 환류추출한 후 여액을 분리하는 단계; 및
(d) 상기 (a) 단계에서 제조한 홍삼 추출물, (b) 단계에서 제조한 건조 홍삼분말, (c) 단계에서 제조한 자소엽, 형개, 및 치커리 혼합물의 추출 여액을 혼합하고, 유산균을 접종하고 발효하는 단계.
본 발명은 홍삼의 쓴맛을 저감시키고, 발효를 통해 사포닌(진세노사이드)의 함량은 높이며 자소엽, 형개, 및 치커리의 혼합추출물과 혼합 및 발효를 통해 면역조절기능을 향상시킨 홍삼 발효액을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 상기 홍삼은 인삼을 가공처리 하여 제조된 것으로, 상기 인삼은 고려삼(Panax ginseng) 또는 전칠삼(Panax notoginseng) 이다.
본 명세서에서 자소엽(Perillae Folium)은 꿀풀과(Labiatae)의 차즈기(Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo) 또는 주름소엽(Perilla frutescens Britton var. crispa Decaisne)의 잎 및 끝가지로, 높이는 30~60 ㎝이며 적소, 차조기 및 주름 차조기 등으로 불린다. 한국, 중국 등에서 생산되며 우리나라에서는 식용이나 약용으로 사용된다. 자소엽은 자색을 띠고 특이한 향미가 있으며 줄기는 모가 난 모양으로 곧고, 잎은 밑이 둥글거나 쐐기 모양이며 가장자리에는 톱니가 있다. 꽃은 담자색으로 8 ~ 9월경에 총상화서로 피고, 입과 줄기 등의 형태는 들깨와 비슷하다. 주요성분으로는 페릴라 알데히드(perilla aldehyde), 리모넨(d-limonene), 알파-피넨(α-pinene), 시아닌(cyanin), 스테린(sterin), 멘톨(menthol), 로즈마리 산(rosmarinic acid), 루테올린(luteolin) 등이 알려져 있어(Kim and Hwang, 2006), 육류나 생선에 참가하여 섭취할 경우 식중독을 예방하고 강한 항균력을 가진다는 연구 결과가 있다(Kim et al, 2000).
본 명세서에서 형개(Schizonepetae Spica)는 속씨식물문 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과(Labiatae) 형개(Schizonepeta Tenuifolia Briquet)의 꽃이삭(꽃대)이다. 형개는 지상부 전체에 부드러운 털이 덮여있고 8~9월에 담자홍색의 작은 꽃이 아래부분부터 피기 시작하여 위로 올라가는 것이 특징이다. 한편, 형개의 성미는 성온(性溫) 무독(無毒)하고 신미(辛味)하다고 알려져 있다. 주성분은 정유성분으로 d-멘톤(d-menthone), d1-멘톤(dl-menthone)과 소량의 d-리모넨(dlimonene)이 있으며, 그 밖에 헤페리딘(heperidine), 우르솔산(ursolic acid), 루테올린(luteolin), 다우세스테롤(daucesterol) 등이 보고되었다(Zhang YH, et al., Zhongguo Zhong Yao Za Zhi., 31(15), pp1247-57, 2006). 주성분인 필수지방산은 항충작용 및 항진균 작용을 나타낸다는 것이 보고된바 있다(Park IK. et al., J Econ Entomol., 99(5), pp1717-21, 2006).
본 명세서에서 치커리(Cichorium intybus)는 쌍떡잎식물로 국화과(菊花科 Asteraceae)에 속하는 다년생초식물이다. 뿌리는 다 육질이고 길며, 줄기는 높이가 50~150 cm이고 단단하며 가지가 갈라지고 털이 있다. 뿌리에서 나온 잎은 아래쪽 을 향하고 깃꼴로 갈라진다. 갈라진 조각은 밑 부분이 점차 좁아지고 날개와 같은 잎자루가 있으며, 끝에 달린 조각은 크고 옆에 달린 조각은 삼각형이다. 줄기에 달린 잎은 바소꼴의 달걀 모양 또는 바소꼴이고 가장자리가 밋밋하며 뒷면에 털이 있다. 꽃은 7~9월에 하늘색으로 피고 줄기 윗부분 잎겨드랑이와 줄기 끝에 설상화가 두상꽃차례를 이루며 달린다. 총 포는 원기둥 모양이고 총포 조각은 2개로 갈라진다. 품종에 따라 흰색 또는 엷은 붉은 색의 꽃도 있다. 치커리는 간장 개선과 시력 회복에 효과가 알려져 있어, 치커리 섭취를 늘릴 경우 장내세균 중 유익한 세균으로 알려진 비피더스균(Bifidobacteria)과 락토바실러스균(Lactobacillus)의 균수가 크게 증가한다고 보고되고 있다
이하 상기 방법을 각 단계별로 설명한다.
단계 (a): 홍삼 추출단계
상기 단계는 홍삼을 60-85% 에탄올 수용액으로 3 내지 7시간 동안 환류 추출한 후 여액을 분리하여 감압건조하는 단계이다.
상기 홍삼은 추출 전 세척, 세절 후 건조시킨 것이다. 상기 에탄올 수용액은 60-85% 농도이고, 60-80%, 65-75%, 또는 70%의 농도를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 에탄올 수용액을 이용한 환류 추출시간은 3 내지 7시간 동안 이루어질 수 있고, 5 내지 7시간, 5 내지 6시간, 또는 5시간 동일 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 환류 추출의 온도는 40-60℃, 45-55℃, 45-50℃, 또는 50℃에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 식품조성물의 사포닌 함량은 열수추출물보다 에탄올 추출물에서 더 높게 나타난다.
단계 (b): 잔여 홍삼의 분말화 단계 - 통홍삼 분말의 제조
상기 단계는 상기 (a) 단계에서 에탄올 수용액 추출 및 여과 후 남은 잔여 홍삼을 건조 및 분쇄하여 분말화하는 단계이다.
에탄올 수용액 추출 후 남은 잔여 홍삼을 건조 및 분쇄한다. 상기 분쇄는 분쇄기를 이용하여 이루어질 수 있고, 분말화 정도는 특별히 한정되지 않으나 입자 크기가 30-150 mesh 정도가 되도록 할 수 있다.
상기 홍삼 분말은 쓴맛이 강하고 식감이 텁텁하나, 후술되는 (d) 단계에서 유산균 발효를 거친 후에는 쓴맛이 저감되고, 식감(텁텁함)이 개선되는 특징이 있다.
상기 단계에서 제조된 홍삼 분말을 발효 홍삼액에 첨가하면 발효 홍삼액을 음용한 후에 포만감이 있고, 홍삼 분말을 첨가하지 않은 발효 홍삼액과 비교하여 발효 홍삼액에 대한 기호도가 상승하여 소비자 만족도가 높다.
단계 (c): 자소엽 , 형개 및 치커리의 혼합추출액 제조 단계
상기 단계는 발효 홍삼액의 추가성분으로 첨가되는 자소엽, 형개, 및 치커리의 혼합추출액을 제조하는 단계이다.
상기 자소엽, 형개, 및 치커리의 혼합추출액은 자소엽, 형개 및 치커리의 혼합물을 70-100℃의 물로 2 내지 5시간 동안 환류추출하여 제조된다.
상기 자소엽, 형개, 및 치커리의 혼합물과 추출용매인 물의 혼합비는 약 1:1~1.5(w/w)인 것이 바람직하다. 본 단계에서 제조된 추출액은 감압증류없이 다음 단계에서 그대로 사용되므로, 상기 자소엽, 형개, 및 치커리의 혼합물과 물의 혼합비가 1:1.5(w/w)를 초과하면 추출액이 너무 희석되어 유산균 발효의 효율이 저하되고, 감압증류과정이 추가적으로 수행되어야 하므로 제조공정상 추가적인 시간과 비용이 들어 비경제적이다.
상기 혼합추출액은 자소엽, 형개, 및 치커리를 각각 추출한 후 각각의 추출액을 혼합하여 제조될 수도 있다.
상기 자소엽, 형개, 및 치커리 혼합물은 자소엽 100 중량부를 기준으로 형개 50-100중량부, 치커리 50-100중량부를 혼합하여 제조된다. 치커리는 잎과 뿌리에서 쓴맛이 나는 식물로, 홍삼추출물 또는 홍삼 분말과 함께 발효시키면 텁텁한 맛을 감소시키나, 자소엽과 동량 이상 첨가가 되면 최종 생산된 식품 조성물에서 더 쓴맛이 나는 단점이 있다.
상기 추출 온도는 70-100℃, 80-100℃, 90-100℃, 90-95℃, 80, 85, 90, 또는 95℃에서 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 추출의 시간은 2시간 내지 5시간 동안 이루어질 수 있고, 3시간 내지 5시간, 3시간 내지 4시간, 3시간, 4시간, 또는 5시간 동안 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계에서 제조된 자소엽, 형개, 및 치커리의 혼합추출액은 감압건조시키지 않고 실온까지 냉각한 후 여과한 여액을 다음 단계인 유산균 발효단계에서 그대로 사용한다.
본 발명의 구체적인 구현예에서 입증된 바와 같이, 상기 자소엽, 형개, 및 치커리의 혼합추출액을 첨가하고, 하기 유산균 발효 단계를 거치면, 혼합추출액을 첨가하지 않은 조성물과 비교하여 맛과 면역기능 개선 효과의 면에서 상승효과가 나타난다.
단계 (d): 유산균 발효 단계
상기 단계는 상기 (a) 단계에서 제조한 홍삼 추출물, (b) 단계에서 제조한 건조 홍삼분말, (c) 단계에서 제조한 자소엽, 형개, 및 치커리 혼합물의 추출 여액을 혼합하고, 유산균을 접종하고 발효하는 단계이다.
상기 발효 단계에 의해 본 발명의 홍삼 추출물 및 홍삼 분말의 쓴맛이 저감되고, 사포닌의 함량이 증가된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 속 균, 비피도박테리움 속 균, 락토코커스 속 균이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균은 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 아시도필러스, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 류테리, 락토바실러스 퍼멘텀, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 앨리멘터리우스, 락토바실러스 델브루키 불가리쿠스, 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균은 락토바실러스 앨리멘터리우스(Lactobacillus alementarius)이고, 보다 구체적으로는 락토바실러스 앨리멘터리우스 로이터 균주(Lactobacillus alementarius Reuter, ATCC 29643)이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 비피도박테리움 속 균은 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 애니멀리스 락티스, 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 락토코커스 속 균은 락토코커스 락티스이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균의 접종 및 발효는 40-60℃에서 48시간 내지 120시간 동안 수행된다. 보다 구체적으로 상기 유산균의 접종 및 발효는 50-55℃에서 48시간 내지 96시간, 48시간 내지 72시간, 60시간 내지 72시간 동안 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 제조방법은 상기 유산균 발효단계가 종료된 이후, 제조된 발효 홍삼을 포함하는 식품조성물의 품질의 변화를 막기 위하여 살균 단계를 추가적으로 진행할 수 있다. 상기 살균은 80-120℃에서 30분 내지 2시간 동안 진행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 유산균 발효 단계를 거치면, 최종 조성물의 쓴맛이 저감되고, 식감이 개선되는 등 전체적인 맛이 개선되고, 진세노사이드의 함량이 증가되며, 면역기능 개선효과가 더 우수해지는 효과가 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 발효 통홍삼 및 발효 복합추출물을 포함하는 면역기능 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "면역기능 개선"은 면역기능 증진, 급성 염증반응 또는 과민면역반응의 완화를 의미한다.
상기 "면역"은 체내에 존재하는 자기방어체계로서 인체가 외부로부터 침입해 오는 각종 물질이나 생명체를 자기 자신에 대한 이물질로 인식하여 제거하고 대사시키는 과정이다. 외부 자극에 의한 손상이나 병원 미생물의 침입으로부터 자신을 방어하기도 하지만, 염증반응 등과 같이 자기 자신의 조직에 손상을 줄 수도 있다. 면역기능의 변화를 조절하여 정상으로 회복시키거나 변화의 폭을 줄여 주는 작용으로 면역기능 억제나 면역기능 증강으로 구분된다. 상기 "과민면역반응 완화"는 외부 물질에 대해 불리하게 반응하여 초래되는 알레르기 반응, 자기항원 또는 변형된 자기항원에 대한 반응 등 바람직하지 않게 증가된 면역반응을 억제시키는 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 급성 염증반응의 세포 모델인 LPS 자극에 의한 대식세포에서 IL-6, TNF-alpha의 발현을 농도의존적으로 저해시키는 바, 염증개선 효능이 있는 식품조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 비장세포에 처리시 선천성 면역능의 지표가 되는 NK 세포의 활성을 증가시키는 바, 선천성 면역능을 증가시켜 면역기능을 개선하는 효능이 있는 식품조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 복합추출물은 자소엽, 형개, 및 치커리의 복합추출물이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 발효는 유산균에 의한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 속 균, 비피도박테리움 속 균, 락토코커스 속 균이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균은 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 아시도필러스, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 류테리, 락토바실러스 퍼멘텀, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 앨리멘터리우스, 락토바실러스 델브루키 불가리쿠스, 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균은 락토바실러스 앨리멘터리우스(Lactobacillus alementarius)이고, 보다 구체적으로는 락토바실러스 앨리멘터리우스 로이터 균주(Lactobacillus alementarius Reuter, ATCC 29643)이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 비피도박테리움 속 균은 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 애니멀리스 락티스, 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 락토코커스 속 균은 락토코커스 락티스이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 발효 홍삼 분말은 조성물 총 중량을 기준으로 70 내지 95% 중량비로 포함되는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 홍삼 추출물은 에탄올 추출물이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 자소엽 추출물, 형개 추출물, 및 치커리 추출물은 열수추출물이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 식품조성물은 NO, IL-6 및 TNF-alpha의 발현을 감소시켜 염증반응을 감소시킨다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 식품조성물은 NK 세포의 활성을 증가시켜 면역기능을 개선시킨다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 식품조성물은 상술한 추출물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 첨가 성분은 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올이다. 향미제로서 천연향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 상기 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 발효 통홍삼 및 발효 복합추출물을 포함하는 식품조성물 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 식품조성물은 통홍삼분말을 포함하여 포만감과 식감이 향상되고, 쓴맛이 저감되며, 진세노사이드 함량이 증가된 것을 특징으로 하고, 면역기능을 개선하는 효과가 우수하다. 따라서 본 발명의 식품조성물은 면역기능 개선용 식품으로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 조성물의 LPS 자극에 대한 NO 생산량 감소 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 조성물의 LPS 자극에 대한 IL-6 생산량 감소 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 조성물의 LPS 자극에 대한 TNF-alpha 생산량 감소 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 조성물의 NK-세포 활성화 능력을 나타낸 도이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
제조예 1: 본 발명의 발효 통홍삼 분말 및 발효 복합추출물을 포함하는 식품조성물의 제조
1-1. 홍삼 에탄올 추출물의 제조
건조 홍삼을 구입하여 실험에 사용하였다. 건조한 홍삼 100 g에 500 ml의 70% 에탄올 수용액을 가하여 잘 교반한 후, 50℃에서 5시간 동안 환류 추출한 후 여액을 분리하였다. 상기 여액을 55~65℃로 감압농축한 후, 동결건조시켜 홍삼 에탄올추출물 분말을 10%의 수율로 얻었다.
1-2. 잔여 홍삼의 건조 및 분말화
상기 1-1에서 70% 에탄올 수용액으로 홍삼을 추출한 후 여액을 분리할 때 남은 잔여 홍삼을 건조하고 분쇄기로 분말화하였다. 분말의 입자 크기가 150 mesh 이하가 되도록 분쇄하였다. 수득한 홍삼 분말의 중량은 측정 결과, 80-90g 정도로 나타났다.
1-3. 자소엽, 형개 및 치커리 복합추출액의 제조
건조 자소엽 (Perillae Folium), 건조 형개 (Schizonepetae Spica) 및 건조 치커리 (Cichorium intybus)를 구입하여 실험에 사용하였다. 자소엽 100 g, 형개 100g, 치커리 100g을 450 mL의 증류수에 가하여 잘 교반한 다음 85~95
Figure 112020056853418-pat00001
를 유지하는 추출온도에서 3시간 동안 환류 추출한 후 여액을 분리하였다. 상기 여액은 감압증류하지 않고 그대로 실온까지 냉각한 후 유산균 발효에 사용하였다.
1-4. 유산균 발효
상기 1-1에서 제조한 홍삼 추출물, 1-2에서 제조한 잔여 홍삼의 건조 분말90 g, 및 1-3에서 제조한 자소엽, 형개 및 치커리의 복합추출액 약 400 mL을 혼합하고, 락토바실러스 앨리멘터리우스 로이터 균주(Lactobacillus alementarius Reuter, ATCC 29643)를 1%(v/v) (107~108 cfu에 해당)로 접종하고 50~55℃에서 72시간 동안 발효시켰다.
1-5. 살균 및 농축
발효가 완료된 통홍삼 발효액을 105℃에서 2시간 동안 가열하여 살균을 진행하고, 농축한 후 이하의 실험에 사용하였다.
실제 제품화 단계에서는 상기 농축액을 부원료와 배합하고, 2차 살균 및 포장용기에 충전한다. 상기 부원료는 프락토올리고당(액상) 26%, 덱스트린 7%, 비타민C 0.1%, 타우린 0.1%, L-아르기닌 0.1%, 혼합제제비타민B[(원료명:비타믹스) 비타민C 47%, 팔라티노스 40.3328%, 비타민E혼합분말(DL-α-토코페릴아세테이트 50%, 변성전분 24.5%, 덱스트린 24.5%, 이산화규소 1%)5.5%, 니코틴산아미드 2.8%, 비타민A혼합제제(옥수수전분 20%, 아라비아검 20%, 덱스트린 47%, 비타민E 1.5%, 비타민A아세테이트분말 11.5%)2%, 판토텐산칼슘 1.2%, 비타민B6 염산염 0.55%, 비타민B1 염산염 0.25%, 비타민B2 0.24%, 엽산 0.085%, 비타민D3혼합제제분말(아라비아검 38%, 설탕 38%, 옥수수전분 15.55%, PALM MCT OIL 7.5%,이산화규소 0.5%, 비타민D3 0.25%, 비타민E 0.2%)0.03%, 비오틴 0.012%, 비타민B12혼합분말(덱스트린 95.9%, 구연산삼나트륨 3%, 구연산 1%, 비타민B12 0.1%)0.0002%] 0.02%, 자몽종자추출물 0.02%, 글루콘산아연 0.01%, 정제수 7.86% 등을 포함한다.
비교예 1: 통홍삼 분말 및 복합추출물을 포함하는 식품조성물( 비발효 )의 제조
본 발명의 발효 단계 유무에 따른 효과를 비교하기 위하여, 상기 제조예 1에서 1-4의 유산균 발효 단계를 제외하고, 제조예 1과 동일한 방법으로 제조한 비발효 통홍삼 분말 및 비발효 복합추출물을 포함하는 식품조성물을 제조하였다.
비교예 2: 발효 통홍삼 분말 및 발효 홍삼추출물( 자소엽 , 형개 , 치커리 복합추출물 미포함)을 포함하는 식품조성물의 제조
본 발명의 발효 복합 추출물의 포함 여부에 따른 효과를 비교하기 위하여, 상기 제조예 1에서 1-3의 복합추출액 제조단계를 제외하고, 대신 동량의 물 400 mL를 혼합하고 살균 및 농축을 진행하였다.
비교예 3: 발효 홍삼추출물 및 발효 복합추출물을 포함하는 식품조성물(발효 통홍삼 분말 미포함)의 제조
본 발명의 발효 통홍삼 분말의 포함 여부에 따른 효과를 비교하기 위하여, 상기 제조예 1에서 1-2의 홍삼 추출 후의 건조 분말(통홍삼 분말)을 포함시키지 않은 점을 제외하고는 동일한 방법으로 유산균 발효 및 살균 농축을 진행하였다. 비교예 3에 대해서는 하기 실험예 2의 관능평가만을 진행하였다.
실험예 1: 사포닌 함량 측정
컬럼에 물로 팽윤시킨 HP-20(Diaion사, 일본)을 충진하고 여기에 상기 제조예 1, 비교예 1 및 2의 결과물을 로딩하여 HP-20에 흡착시켰다. 이어, 충진제의 2-3배의 물을 첨가하여 세척함으로써, 흡착된 사포닌 이외의 성분을 제거한 후 흡착된 사포닌을 주정으로 탈착하여 회수하였다. 회수한 추출물을 농축한 후 부탄올을 이용하여 층 분리를 하고 부탄올 층을 감압 농축하였다. 상기 부탄올 층을 HPLC로 분석하였다. HPLC 분석은, Jasco LC-2000Plus Series HPLC(Jasco, 일본)를 사용하여 실시하였고, 컬럼은 Merck Chromolith Performance RP-18e(4.6 x 100mm, 2 micron), 컬럼의 오븐 온도는 30℃ 샘플의 로딩양은 10 ㎕로 하였다. 이동상으로는 100% 물과 100% 아세트니트릴로 75분간 농도구배 하여 얻었다. 유속은 분당 2.5 ml로 하였으며, 203 nm에서 검출하였다. 실험 결과는 다음 표 1에 나타내었다.
성분명 제조예 1 비교예 1
(비발효, 복합추출물 포함)		 비교예 2
(발효, 복합추출물 미포함)
진세노사이드 Rb1 3.1 9.2 3.2
진세노사이드 Rb2 1.9 4.5 1.5
진세노사이드 Rc 0.9 1.5 1.0
진세노사이드 Rg1 1.6 4.1 2.2
진세노사이드 Re 1.4 6.1 1.9
진세노사이드 Rg3 15.3 4.2 13.6
진세노사이드 Rk1+Rg5 11.2 5.6 9.8
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rg1 및 Re는 발효 처리를 하지 않은 비교예 1(비발효 통홍삼 및 비발효 복합추출물을 포함)의 식품조성물과 비교하여, 발효 처리를 한 비교예 2 및 제조예 1(발효 통홍삼 및 발효 복합추출물 포함)의 식품조성물에서 모두 양이 감소하였으나, Rg3 및 Rk1+Rg5의 양은 크게 증가하였다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 앨리멘터리우스 균주에 의한 발효는 진세노사이드 Rg3 및 Rk1+Rg5의 함량을 크게 향상시키는 것을 확인하였다.
또한, 비교예 1과 비교하여, 본 발명의 제조예 1의 조성물의 진세노 사이드 함량이 증가한 것은, 자소엽, 형개 및 치커리의 복합추출물에 포함된 진세노사이드 성분이 함께 검출되었기 때문인 것으로 생각된다.
실험예 2: 관능 평가
2-1. 실험 과정
발효 처리 및 복합추출물의 유무가 홍삼의 관능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 상기 제조예 1 및 비교예 1, 2의 식품조성물을 건강한 남녀 10명을 대상으로 실시하였다. 5점 척도법을 이용하였고, 쓴맛(bitterness)은 1점으로 갈수록 쓴맛의 강도가 강해지는 것으로 측정하였으며, 식감과 전체적인 맛은 1점에서 5점으로 갈수록 좋은 것으로 측정하였다.
2-2. 실험 결과
결과는 표 2에 나타내었다.
구분 제조예 1
(발효, 통홍삼 분말 포함, 복합추출물 포함)		 비교예 1
(비발효, 통홍삼 분말 포함, 복합추출물 포함)		 비교예 2
(발효, 통홍삼 분말 포함, 복합추출물 미포함)		 비교예 3
(발효, 통홍삼 분말 미포함, 복합추출물 포함)
쓴맛 3.7±0.81 2.2±0.92 3.1±0.76 3.0±0.44
식감 3.3±0.78 2.4±1.1 2.9±0.84 1.9±0.73
포만감 2.8±1.2 2.7±0.82 2.8±1.1 1.3±0.51
전체적인 맛 3.9±0.86 2.3±1.0 2.7±0.77 2.4±0.58
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 발효 처리와 복합추출물(자소엽, 형개, 치커리 추출물)을 포함하는 제조예 1의 식품조성물의 경우 쓴맛이 크게 개선되었음을 확인하였다. 구체적으로는 발효 처리를 하지 않고 복합추출물을 포함하는 비교예 1(2.2±0.92)보다 발효 처리 및 복합추출물을 포함하는 제조예 1(3.7±0.81)의 쓴맛이 크게 개선되었다.
한편, 발효 처리는 하였으나, 복합추출물은 포함하지 않은 비교예 2(3.1±0.76)는 발효 처리를 한 제조예 1(3.7±0.81)쓴맛이 강하였으나, 발효 처리를 하지 않은 비교예 1(2.2±0.92)보다는 쓴맛이 약하여, 발효처리가 쓴맛에 미치는 영향이 가장 크고, 다음으로 복합추출물의 첨가로 인해 발효 홍삼액의 쓴맛이 일부 저감되는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 제조예 1과 비교예 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 홍삼 분말을 포함하는 조성물을 유산균과 함께 발효시키면 발효를 시키지 않은 비교예 1과 비교하여 식감이 크게 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로 제조예 1은 비교예 1 및 2와 비교하여 텁텁함이 크게 감소하였다는 평가를 받았으며, 비교예 1과 비교예 2에서도 발효 및 복합추출물의 식감에 관한 점수가 유사하여, 복합추출물의 포함 여부는 식감에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다. 그러나, 통홍삼 분말을 포함하지 않는 비교예 3과는 식감의 차이가 크게 나타났다.
또한, 본 발명의 제조예 1과 비교예 1 및 2 사이에는 포만감의 면에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았으나, 통홍삼 분말을 포함하지 않는 비교예 3과는 포만감의 차이가 매우 크게 나타났다.
실험예 3: 면역기능 개선 효과의 평가
3-1. RAW 265.7 세포 (Mouse macrophage cell)배양
Mouse macrophage cell인 RAW 264.78 cell은 한국세포주은행에서 분양 받아 연구실에 계대 배양 하여 사용하였다. RAW 264.7 mouse macrophage 세포를 세포 배양 접시에 부착시키고 penicillin 및 streptomycin이 함유된 1% 항생제와 10% FBS를 첨가한 DMEM을 사용하여 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. 배양액은 2~3일 간격으로 교체하였으며, Cell seeding 시에는 hemocytometer를 사용하여 세포를 계수하였다.
3-2. MTT assay
검증시료의 세포 독성 및 적정 비율을 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포를 이용하여 세포생존율을 확인하였다. RAW 264.7 세포를 96 well에 1x104으로 cell/well에 분주한 다음 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. 24시간 후 FBS-free DMEM으로 배지를 교환하고 24시간 후에 제조예 1, 비교예 1, 2의 시료를 각각 100배씩 희석한 농도로 처리하고 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 각 well 당 MTT (10 ul/well) 시약을 첨가하고 3 시간 동안 37℃에서 배양한 후 MTT가 formazan으로 분해되는 양을 ELISA reader를 이용하여 460 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료는 모두 세포독성을 갖지 않는 것으로 나타났다.
3-3. NO assay
RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1x104 으로 cell/well에 분주한 다음 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. 24시간 후 FBS-free DMEM으로 배지를 교환하고 24시간 후에 LPS 0.005 ug/ml와 제조예 1, 비교예 1, 2를 100배씩 희석한 시료를 농도별(100배, 200배, 400배)로 처리하고 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. 시료 처리 24시간 후에 세포배양 상등액 50ul와 Griess 시약 50 ul을 혼합하여 10분동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 NO2로 Standard curve를 작성하여 세포배양 상등액에 함유되어있는 NO의 값을 계산하였다.
결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이 본 발명의 제조예 1은 농도에 비례하여 NO의 생산량을 감소시키는 활성이 우수함을 확인할 수 있었다. 특히 복합추출물을 포함하는 비교예 1과, 발효처리를 하지 않은 비교예 2와 비교하여, 복합추출물을 포함하고, 발효처리를 한 본 발명의 제조예 1의 조성물의 NO 생산 감소 활성에 시너지 효과가 있음을 확인하였다.
3-4. Cytokine (IL-6, TNF-alpha) mRNA 발현 확인(Real time PCR)
RAW 264.7 세포를 6 well plate에 5x105으로 cell/well에 분주한 다음 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. 4시간 후 FBS-free DMEM으로 배지를 교환하고 24시간 후에 LPS 및 제조예 1, 비교예 1, 비교예 2의 각 시료를 농도별(100배, 200배, 400배 희석)처리하고 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다. 이후에 QUIGEN kit를 사용하여 RNA를 추출하였고, 이를 통하여 cDNA 합성을 실시하였다. TNF-alpha와 IL-6 primer를 이용하여 Real-time PCR을 통하여 Cytokine 발현량을 측정하였다.
결과는 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조예 1은 농도의존적으로 IL-6 발현을 저해하였으며, 비교예 1, 또는 비교예 2와 비교하여 염증과 관련된 사이토카인 IL-6를 저해하는 효과가 우수함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 발효 홍삼 및 발효 복합추출물을 포함하는 조성물은 IL-6와 관련을 갖는 초기 염증반응을 완화시킬 것으로 생각된다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조예 1은 TNF-alpha의 발현을 저해하였으며, 비교예 1과 비교예 2는 비슷한 정도로 TNF-alpha의 발현을 저해하는 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터 본 발명의 발효 홍삼 및 발효 복합추출물을 포함하는 조성물은 IL-6 및 TNF-alpha와 관련을 갖는 급성 염증반응을 완화시킬 것으로 생각된다. 특히 복합추출물을 포함하고 발효처리를 한 본 발명의 제조예 1의 조성물은 복합추출물을 포함하지 않거나, 발효처리를 하지 않은 비교예 1 또는 2와 비교하여 금성 염증반응의 완화의 면에서 시너지 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
3-5. NK cell activity assay
본 발명의 제조예의 조성물이 마우스의 선천성 면역에 관여하는 NK 세포의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 정상마우스에서 비장세포를 채취한 후, RPMI-1640 (10% FBS, 1% penicillin-streptomycin)배지로 희석하여 비장세포 부유액을 만들었다. lysing buffer (BD PharmLyseTM Lysis Buffer, BD Biosciences, USA)에 3분간 현탁 시켜 적혈구를 제거한 뒤 원심분리 한 후 PBS로 세척하였다. 이 후 96 well plate에 5ⅹ106 cells/ml농도가 되도록 RPMI-1640 (10% FBS, 1% penicillin & streptomycin) 배지로 희석하여 접종하였다(effector cell). 제조예 1의 각 시료를 농도별(100배, 200배, 400배, 800배, 1600배 희석)로 처리하고, 표적세포로는 YAC-1 세포 (Target cell)를 이용하여 비장세포(effector cell)과 YAC-1 세포(target cell)을 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. Effector/target cell ratio (E/T ratio)는 200：1로 하였다. 배양 후 면역세포 증식능을 알아보기 위해 WST-1을 각 well에 10 μl 처리하여 ELISA reader로 540 nm에서 측정하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 정상마우스의 비장세포에 존재하는 NK 세포에 본 발명의 제조예 1을 노출시켰을 때의 NK 세포의 활성은 비노출군인 PBS 처리군과 비교하여 NK 세포의 활성이 증강됨을 나타냈다. 즉, NK 세포 활성은 200/1의 E/T ratio에서 본 발명의 제조예 1의 조성물을 각각 100배, 200배, 400배, 800배 및 1600배로 희석시켰을 때, 농도가 높을수록 높은 NK 세포의 활성을 나타냄으로써, 모든 군에서 유의한 상승효과를 나타내었다.
따라서, 상기 결과로부터, 본 발명의 제조예 1의 발효 홍삼 분말 및 발효 복합추출물을 포함하는 조성물은 NK 세포의 활성을 증가시켜 선천성 면역을 증가에 기여하는 바가 큼을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 다음 단계를 포함하는 발효 통홍삼 및 발효 복합추출물을 포함하는 식품조성물의 제조방법:
    (a) 홍삼을 60-85% 에탄올 수용액으로 3 내지 7시간 동안 환류 추출한 후 여액을 분리하여 감압건조하는 단계;
    (b) 상기 에탄올 수용액 추출 및 여과 후 잔여 홍삼을 건조 및 분쇄하여 분말화하는 단계;
    (c) 자소엽, 형개, 및 치커리의 혼합물을 70-100℃의 물로 2 내지 5시간 동안 환류추출한 후 여액을 분리하는 단계; 및
    (d) 상기 (a) 단계에서 제조한 홍삼 추출물, (b) 단계에서 제조한 건조 홍삼분말, (c) 단계에서 제조한 자소엽, 형개, 및 치커리 혼합물의 추출 여액을 혼합하고, 유산균을 접종하고 발효하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유산균의 접종 및 발효는 40-60℃에서 48시간 내지 120시간 동안 수행되는 것인, 제조방법.
  3. 유산균 발효 홍삼 분말; 및
    홍삼 추출물, 자소엽 추출물, 형개 추출물, 및 치커리 추출물을 포함하는 혼합물을 유산균 발효한, 발효 복합추출물을 포함하는 식품조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 발효 홍삼 분말은 조성물 총 중량을 기준으로 70 내지 95% 중량비로 포함되는 것인, 식품조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 홍삼 추출물은 에탄올 추출물인 것인, 식품조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 자소엽 추출물, 형개 추출물, 및 치커리 추출물은 열수추출물인 것인, 식품조성물.
  7. 유산균 발효 홍삼 분말; 및
    홍삼 추출물, 자소엽 추출물, 형개 추출물, 및 치커리 추출물을 포함하는 혼합물을 유산균 발효한, 발효 복합추출물을 포함하는 면역기능 개선용 기능성 식품조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 식품조성물은 NO, IL-6 및 TNF-alpha의 발현을 감소시켜 염증반응을 감소시키는 것인, 식품조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 식품조성물은 NK 세포의 활성을 증가시켜 면역기능을 개선하는 것인, 식품조성물.

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