KR101982223B1 - 류코노스톡 락티스 cck940을 이용한 올리고당의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수크로스 및 말토스가 첨가된 효모 추출액을 포함하는 배지에서 Leu. lactis CCK940(기탁번호:KFCC11724P)을 배양한 후 배양상등액을 수득하는 방법으로 수행되는 올리고당의 제조방법에 관한 것이다. 이에 의하여, 면역 질환 개선 또는 치료에 효과적인 올리고당을 제조할 수 있다.

Description

류코노스톡 락티스 CCK940을 이용한 올리고당의 제조방법{METHOD FOR PREPARING OLIGOSACCHARIDES USING Leuconostoc lactis CCK940}

본 발명은 류코노스톡 락티스 CCK940(Leuconostoc lactis CCK940)(기탁번호:KFCC11724P)을 이용한 올리고당의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 Leu. lactis CCK940을 배양함으로써 수크로스와 말토스를 기질로 글루칸수크라제 효소의 활성으로 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근 설탕의 과잉 섭취와 기존의 당류의 다량 섭취로 생기는 충치, 비만, 당뇨병, 성인병 등의 문제점을 보완하기 위해서 생물공학 기술을 통해 천연식품 소재의 올리고당이라는 새로운 종류의 대체 당질이 개발되고 있다. 올리고당은 감미료 이외에도 안정제, 응집제 및 소장 내 유용균주의 생장촉진 제로서 식품산업에 유용하게 사용 되고 있다. 일반적으로 올리고당은 구성당의 종류에 관계없이 단당이 글리코사이드 결합에 의해 탈수축합된 중합도 210개(분자량으로는 3002,000)의 소당류를 의미한다. 현재 상업적으로 생산되는 올리고당은 프락토올리고당, 이소말토올리고당, 말토올리고당, 갈락토올리고당 등이 있으며, 대두올리고당과 자일로올리고당에 대한 연구가 진행중에 있다. 올리고당을 산업적 규모로 생산하기 위해 식물에서의 추출방법 및 식물성이나 미생물성 탄수화물 고분자의 산 또는 효소의 가수분해방법이 이용되고 있다.

한편, 면역 반응이란 각종 이물질, 세균 또는 바이러스 등의 자신이 아닌 것으로부터 자신을 보호하는 과정으로, 자신은 공격하지 않도록 정교하게 설계되어 있다. 그러나 이러한 면역 반응이 오히려 자신을 공격하여 자신에게 해를 미치는 경우가 있는데, 대표적인 예가 장기 또는 조직 이식 후와 자가면역이다. 장기 또는 조직 이식에 의한 질병 치료에 있어서, 가장 큰 문제점은 수령자가 공여자로부터 조직 또는 장기를 이식받은 후에 심각한 장기이식 합병증을 보인다는 것이다. 장기이식 합병증은 이식편의 공여자와 수령자간의 유전적 배경이 상이함에 따라 서로를 이물질로 인식하여 배제하려는 면역반응을 의미한다. 이러한 장기이식 합병증은 T 림프구에 의한 세포성 면역과 항체에 의한 체액성 면역이 복잡하게 제휴된 형태로 일어나지만, 주로 T 림프구에 의한 세포성 면역이다. 장기이식 합병증을 치료하기 위한 하나의 방법으로 T 림프구의 활성을 억제하는 화합물들이 이용되고 있다.

이와 같은 면역질환에 유용한 올리고당을 미생물을 이용하여 용이하게 생산하는 기술이 연구되고 있다.

한국공개특허공보 제2012-0109119호 한국공개특허공보 제2016-0020457호

본 발명의 목적은 감기, 천식, 폐렴, 알러지성 비염, 알러지성 결막염, 아토피성 피부염, 알러지, 류마티스 관절염, 알츠하이머병, 자가면역성 갑상선 질환, 염증성 장질환, 재생불량성 빈혈, 홍반성 루푸스, 건선 등의 면역질환에 유용한 올리고당을 유산균을 배양함으로써 용이하게 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면,

수크로스 및 말토스가 첨가된 효모 추출액을 포함하는 배지에서 류코노스톡 락티스 CCK940(Leuconostoc lactis CCK940)(기탁번호:KFCC11724P)을 배양한 후 배양상등액을 수득하는 방법으로 수행되는 올리고당의 제조방법이 제공된다.

상기 배지의 pH는 5.5 내지 6.5일 수 있다.

상기 배지에서 상기 수크로스 및 말토스의 농도는 3 내지 15wt%일 수 있다.

상기 배지에 배양 후 2 내지 4시간 사이에 수크로스 및 말토스를 3 내지 7wt% 함량으로 추가 투입할 수 있다.

상기 Leu . lactis CCK940는 배지에 0.5 내지 2%(v/v) 농도로 접종할 수 있다.

상기 배양은 25 내지 35에서 수행될 수 있다.

상기 수크로스:말토스의 농도비는 1:0.3 내지 1:2.5일 수 있다.

상기 배지는 효모추출액, 펩톤(peptone), MgSO₄7H₂O, FeSO₄7H₂O, NaCl, MnSO₄H₂O, CaCl₂2H₂O, 및 K₂HPO₄를 포함할 수 있다.

상기 배양상등액을 수득한 후 에탄올을 사용하여 분획하는 과정을 추가로 수행할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

상기 방법에 제조된 올리고당이 제공된다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

상기 올리고당을 유효성분으로 포함하는 조성물이 제공된다.

상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

상기 약학 조성물 또는 식품 조성물은 면역 질환 개선 또는 치료용일 수 있다.

상기 면역 질환은 감기, 천식, 폐렴, 알러지성 비염, 알러지성 결막염, 아토피성 피부염, 알러지, 류마티스 관절염, 알츠하이머병, 자가면역성 갑상선 질환, 염증성 장질환, 재생불량성 빈혈, 홍반성 루푸스 및 건선 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 올리고당의 제조방법은 유산균의 배양을 이용함으로써 감기, 천식, 폐렴, 알러지성 비염, 알러지성 결막염, 아토피성 피부염, 알러지, 류마티스 관절염, 알츠하이머병, 자가면역성 갑상선 질환, 염증성 장질환, 재생불량성 빈혈, 홍반성 루푸스, 건선 등의 면역질환에 효과적인 올리고당을 제조할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 배양상등액의 Bio-LC 크로마토그램이다.
도 2는 시험예 1에 따른 글루칸수크라제 효소활성으로 인한 올리고당 생성 확인 결과이다.
도 3은 시험예 2에 따른 최적의 수크로스 및 말토스 농도를 분석한 결과이다.
도 4는 시험예 3에 따른 도너와 억셉터 비율을 달리하여 배양한 Bio-LC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 시험예 4에 따른 TLC에 의한 올리고당 성분 분석 결과이다.
도 6은 시험예 5의 억셉터 종류에 따른 시료의 크로마토그램이다.
도 7 내지 도 10은 시험예 6에 따른 TLC와 Bio-LC로 저분자 당류 제거를 확인한 결과이다.
도 11은 시험예 7에 따라 분리된 RNA의 전기영동 결과와 그에 해당하는 RNA 농도를 나타낸 것이다.
도 12는 면역증강 cytokine의 발현을 전사체 수준에서 real-time PCR에 의해 확인한 결과이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하, 본 발명의 올리고당의 제조방법에 대해 설명하도록 한다.

본 발명의 올리고당의 제조방법은 수크로스 및 말토스가 첨가된 효모 추출액을 포함하는 배지에서 Leu. lactis CCK940(기탁번호:KFCC11724P)을 배양한 후 배양상등액을 수득하는 방법으로 수행될 수 있다.

상기 배지의 pH는 5.5 내지 6.5인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 pH 6.0일 수 있다.

상기 배지에서 상기 수크로스 및 말토스의 농도는 3 내지 15wt%일 수 있고, 더욱 바람직하게는 5 내지 10wt%일 수 있다.

상기 배지에 배양 후 2 내지 4시간 사이에 수크로스 및 말토스를 3 내지 7wt% 함량으로 추가 투입하는 것이 바람직하다.

상기 Leu . lactis CCK940는 배지에 0.5 내지 2%(v/v) 농도로 접종하는 것이 바람직하다.

상기 배양은 25 내지 35에서 수행되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 27 내지 32에서 수행할 수 있다.

상기 수크로스:말토스의 농도비는 1:0.3 내지 1:2.5인 것이 바람직하다.

상기 배지는 효모추출액, 펩톤(peptone), MgSO₄7H₂O, FeSO₄7H₂O, NaCl, MnSO₄H₂O, CaCl₂2H₂O, 및 K₂HPO₄를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 올리고당을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 올리고당을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 상기 올리고당을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

상기 약학 조성물 또는 식품 조성물은 면역 질환 개선 또는 치료용일 수 있다.

상기 면역 질환은 감기, 천식, 폐렴, 알러지성 비염, 알러지성 결막염, 아토피성 피부염, 알러지, 류마티스 관절염, 알츠하이머병, 자가면역성 갑상선 질환, 염증성 장질환, 재생불량성 빈혈, 홍반성 루푸스, 건선 등일 수 있다.

한편, 본 명세서에서 용어 유효성분으로 포함하는이란 상기 올리고당의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 조성물 내에서 상기 올리고당은 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250 mg/kg 이상, 가장 바람직하게는 0.1 g/kg 이상 포함된다. 상기 올리고당은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 올리고당의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약학으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약학으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 처치 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/이다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 올리고당을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물에서 상기 올리고당에 대한 설명은 상기 약학 조성물에서 설명한 바와 동일하므로 상세한 내용은 상술한 내용을 참조하기로 한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 빵류 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 상기 올리고당 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 상기 올리고당 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명은 상기 올리고당을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 상기 올리고당을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 상기 올리고당의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

[실시예]

실시예 1: Leu. lactis CCK940을 이용한 올리고당 제조

LM 배지를 이용하여 donor로서 sucrose를 선정하였고, acceptor로서는 가장 많이 이용되는 maltose를 첨가하여 올리고당 생성능을 확인하였다. LM 배지의 조성은 1 liter당 yeast extract 4 g, peptone 2 g, MgSO₄7H₂O 0.2 g, FeSO₄7H₂O 0.01 g, NaCl 0.01 g, MnSO₄H₂O 0.01 g, CaCl₂2H₂O 0.015 g, K₂HPO₄ 2 g로 구성되어 있다. LM 배지에 20%(w/v)의 sucrose와 20%(w/v)의 maltose를 각각 donor 및 acceptor로 적용하여 제조한 뒤, MRS broth에 배양한 유산균주 Leu. lactis CCK940의 배양액 1%(v/v)를 접종하여 130 rpm, 30에서 배양하였다. 접종 후, 5-12시간동안 매 시간 pH 6.00.1이 되도록 1 N NaOH로 조정하여 배양하고 배양상등액을 수득하였다.

12시간에 배양을 종료하면서 이를 Bio-LC로 확인하여 그 결과를 배양하지 않은 대조군과 비교하여 도 1에 나타내었다.

실시예 2: 에탄올을 이용한 정제올리고당 제조

활성탄은 2.520 cm의 column에 충전하였고, 유속은 2 mL/min으로 진행하였다. 활성탄에 배양상등액 150 mL을 주입하고, 에탄올은 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40%(v/v)로 제조하여 step wise 방법으로 진행하였다. 에탄올 주입부터 분획을 5 mL씩 회수하였다.

비교예 1: Leu. Lactis SBC001를 이용한 올리고당 제조

Leu. lactis CCK940 대신에 Leu. Lactis SBC001를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 올리고당을 제조하였다.

비교예 2: 초미세여과(ultrafiltration)에 의한 정제올리고당

실시예 1에 따라 Leu. lactis CCK940을 이용하여 lactis-올리고당 생성 후 배양 상등액에 존재하는 저분자 당의 제거를 위하여 상등액을 초미세여과(ultrafilteration)를 진행하였다. 먼저 배양상등액을 30K 카트리지를 통과하여 얻어진 투과물(penetrate)과 농축물(retentate)을 각기 따로 회수하고, 투과물을 다시 5K 카트리지를 통과시켜 투과물과 농축물을 회수하여 TLC와 Bio-LC로 저분자 당이 제거되었는지 확인하였다.

비교예 3: 활성탄에 의한 정제올리고당 제조

실시예 1에 따라 Leu. lactis CCK940을 이용하여 lactis-올리고당 생성 후 배양 상등액에 존재하는 저분자 당의 제거를 위하여 상등액을 활성탄에 적용하였다. 활성탄은 2.520 cm의 column에 충전하여 사용하였고, 유속은 1 mL/min로 진행하였다. 또한 에탄올에 의하여 분획이 될 수 있을 것이라 추정하고 step wise 방법으로 분획을 얻었다. Step wise 방법은 0-50%의 에탄올을 이용하였고, 10, 20, 30, 40, 50%의 에탄올을 40 mL씩 주입하여 각 분획이 40 mL이 되도록하여 회수하였다.

[시험예]

시험예 1: 최적 배지의 pH

올리고당을 생성할 수 있는 최적 배지의 pH를 설정하기 위해서 LM 배지에 20%(w/v) sucrose와 20%(w/v) maltose를 첨가한 후 종배양액 1%(v/v)을 접종하여 glucansucrase 효소활성으로 인한 올리고당의 생성을 확인하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 배지의 pH는 조정하지 않은 control (검정색 peak), pH 6 (파란색 peak), pH 7 (분홍색 peak), pH 8 (갈색 peak)로 나타내었고, pH 6-8에 해당하는 배지는 접종 후 배양액의 pH가 0.1로 매 시간 조정해주었다. 배양온도는 30로 설정하였고, 예비실험 결과 발효 후 12시간이면 sucrose와 maltose가 모두 소모되었기에 발효 9시간째에 배양을 종료하였다.

Leu . lactis CCK940을 접종하였을 때, retention time 4.0분에 나타나는 fructose peak에서 pH 6으로 조정한 것이 가장 농도가 높은 것으로 보아 glucansucrase 활성으로 인하여 sucrose로부터 생성되는 fructose의 양아 가장 많은 것으로 확인되었고, DP 3과 DP 4 사이의 10.5분 peak를 pH 별로 그 면적을 확인한 결과, pH 6은 23.78, pH 7은 17.7, pH 8은 17.76으로 pH 6으로 조정한 배지에서 Leu . lactis CCK940 균주의 올리고당의 생성능이 가장 좋은 것으로 판단하였다.

시험예 2: 수크로스 및 말토스의 최적 농도

최적 pH를 선정하였고, 도너(donor)와 억셉터(acceptor)인 수크로스(sucrose)와 말토스(maltose)의 농도비는 동량 (1:1)으로 하여 최적 올리고당 생성 농도를 선정하였다. 먼저 균주는 LM glucose (2%, w/v)에 먼저 배양하여 배종양액으로 사용하였고, LM 배지에 sucrose와 maltose의 농도는 2.5, 5.0, 10.0, 20.0%(w/v)로 첨가하여 30, 130 rpm으로 배양하면서 시간대별로 최적 pH를 조정하였으며, 배양은 당이 거의 소비되는 9시간에 종료하였다. 또한 샘플을 취하여 Bio-LC로 분석하여 sucrose, maltose, DP 3-4 사이의 peak의 area로 정량하였다. Leu . lactis CCK940을 이용하여 배양하였을 때, 소모되는 sucrose와 maltose, 합성되는 DP 3-4 사이의 peak를 분석한 결과를 도 3에 나타내었다.

Sucrose와 maltose의 농도에 따라서 확연한 차이를 보였는데, 먼저 2.5%의 당을 첨가한 결과에서 적은 양의 당은 배양 4시간 이내에 거의 다 소모가 되는 것으로 나타났고, maltose보다 sucrose의 소비 속도가 빠른 것을 확인할 수 있었다. 이로 인하여 배양 후 4시간에 올리고당의 생성이 종료되었다.

반대로 당의 농도가 가장 높은 20%를 첨가해주고 배양을 진행하였을 때, 고농도의 당으로 인하여 균주의 생장속도가 현저히 감소되었고, 이로 인하여 균주가 당을 어느 정도 소모하기 시작한 배양 5시간부터 올리고당의 생성이 진행되었다.

당의 농도를 5, 10%로 각각 첨가하였을 때, DP 3-4의 peak의 정량 slope를 보면 균주가 2-4시간 사이에 정지상(tationary phase)에 진입하는 부분에서 5%를 첨가해 준 경우가 더 빨리 정지상에 진입하였다. 그러나 Leu . lactis CCK940은 5%의 당을 배양 4시간 이내에 sucrose를 모두 소진하는 것으로 보여 배양 3시간에 당을 첨가해주면 더 많은 올리고당의 생성이 이루어질 것으로 판단하였다.

시험예 3: 도너와 억셉터의 비율

상기 결과를 기반으로 sucrose의 농도는 5%(w/v)으로 고정하였고, maltose의 농도를 달리하여 donor와 acceptor의 비율을 선정하고자 하였다. 먼저 균주는 LM glucose (2%, w/v)에 배양하여 종배양액으로 사용하였고, LM 배지에 sucrose는 5%(w/v)으로 고정하고, maltose의 농도를 2.5, 5.0, 10.0%(w/v)로 첨가하여 30에서 130 rpm으로 배양하면서 시간대별로 최적 pH를 조정하였으며, 배양 4, 8시간에는 소모되는 sucrose를 고려하여 최종농도가 5%가 되도록 feeding 해주었다. 또한 샘플을 취하여 Bio-LC로 분석하여 sucrose, maltose, DP 3-4 사이의 peak의 area로 정량하였다. Leu . lactis CCK940을 maltose 농도를 달리한 배지에 접종하여 배양한 결과는 도 4에 나타내었다.

2.5%의 maltose는 8시간 내에 모두 소비되는 것을 확인할 수 있었고, DP 3-4 peak area가 배양 8시간까지 증가되었으나, feeding 이후로는 올리고당의 농도가 감소하는 것으로 보아 분해되는 것으로 추정할 수 있었다. 5%의 maltose를 첨가하였을 때도, 배양 8시간 내에 maltose가 거의 모두 소비되었고, sucrose의 feeding에도 더 이상 올리고당이 생성되지 않았다. 10%의 maltose를 첨가한 배지에서는 maltose가 배양 12시간에도 잔존해있는 것을 확인할 수 있었는데, donor와 acceptor가 잔존해 있어서 올리고당의 생성이 계속적으로 지속되었다.

이러한 결과로 봤을 때, 10%의 maltose를 첨가해준 배지가 가장 최적으로 보일 수 있으나 정량 값을 측정했을 때, 2.5%의 maltose를 첨가해준 배지에서 배양 4시간째에 sucrose를 feeding하기 전 DP 3-4의 peak area가 7.6, 10%의 maltose를 첨가해준 배지에서는 peak area가 2.49로 측정되었다. 이는 5%의 sucrose와 2.5%의 maltose를 첨가해준 배지에서 올리고당 생성능이 다른 비율의 당을 첨가한 배지보다 빠르게 생성되었다.

시험예 4: 올리고당 성분 확인

올리고당을 형성하고 있는 구성성분을 확인하기 위해서 thin layer chromatography (TLC)를 수행하였다. TLC 전개는 TLC silica gel 60 F254 (Merck, Germany)에 시료를 점적하였고, nitromethane : n-propyl alcohol : water를 2 : 5 : 1.5 (v/v/v)로 전개용매를 제조하여 2번 전개하였다. 점적된 시료는 0.3%(w/v) N-(1-naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride와 5%(v/v) sulfuric acid를 methanol에 첨가하여 제조한 뒤, TLC plate를 dipping하여 121, 7분간 발색시켜 자주색 spot을 분석하였다. 표준물질로는 0.5%(w/v)의 glucose, fructose, maltose, sucrose, maltotriose를 이용하였다.

도 5에 상기 결과에 따른 TLC 결과를 나타내었다. 왼쪽의 TLC 결과에서 표준물질의 Rf 값은 0.59-0.78로 나타났고, glucose와 fructose의 차이는 얼마 없었고, maltotriose의 Rf 값이 0.59로 나타나 가장 낮은 전개율을 보였다. 오른쪽의 TLC 결과에서는 Leu . lactis CCK940과 SBC001로 배양하였을 때, 생성되는 올리고당의 구성을 확인할 수 있었다. 1, 4번 lane은 균주 배양 전의 spot으로 sucrose와 maltose만 존재하는 것이 관찰되었고, 2, 3번 lane은 각각 Leu . lactis CCK940과 SBC001을 접종하여 12시간 후 점적하였을 때 8개 정도의 spot이 나타났다. 8시간에 feeding을 해주었기 때문에 sucrose와 maltose가 잔존해있는 것으로 보이고, 생성된 올리고당은 Rf 값으로 0.04-0.46에 존재하는 spot으로 관찰되었다.

상기 결과에 기반하여 Leu . lactis SBC001과 CCK940을 비교하였을 때, glucansucrase의 활성이 CCK940이 더 높았고, 플라스크 수준에서 올리고당의 생성 함량 또한 배양 8시간이 경과하고 올리고당이 가수분해되는 SBC001에 비해 CCK940은 가수분해되는 정도가 작은 것으로 확인되었다.

시험예 5: 억셉터의 종류 확인

Glucansucrase에 이용되는 acceptor에는 maltose가 가장 많이 이용되지만 여러 종류의 acceptor가 존재한다. Maltose, melibiose, mannose, panose, isomaltose, fruntose, raffinose, leucrose, galactose 등이 acceptor 분자로 이용될 수 있다

그 중 Leu . lactis CCK940이 지니고 있는 glucansucrase가 어떠한 acceptor를 이용하여 올리고당을 합성할 수 있는지 알아보기 위하여, maltose, melibiose, fructose를 이용하여 생산수율을 측정하였다. Donor 분자로는 5%(w/v)의 sucrose, acceptor 분자로는 3%(w/v)의 maltose, melibiose, fructose를 각각 첨가하여 배지로 이용하였다. Leu . lactis CCK940의 배양액은 1%(v/v)로 접종하였고, 30, 100 rpm으로 매시간 pH 6.0±0.2로 조정하면서, 8시간에 시료를 취하여 Bio-LC로 올리고당 생성여부를 판단하였다.

도 6에 3%의 maltose, melibiose, fructose를 첨가하여 8시간 시료의 chromatogram을 나타내었다. Maltose를 첨가한 배지에서는 올리고당이 형성되는 peak가 retention time 9.0분부터 4개 이상이 확인되었으나, melibiose나 fructose를 첨가한 배지에서는 7.2분 이후에 peak를 확인할 수 없었다. 이로써 Leu. lactis CCK940은 maltose를 acceptor 분자로 이용할 수 있는 균주로 확인되었다.

시험예 6: 저분자 당류 제거 확인

비교예 2에 따라 제조된 투과물과 농축물을 회수하여 TLC와 Bio-LC로 저분자 당이 제거되었는지 확인하여 도 7에 나타내었다. 이에 따르면, ultrafilteration 처리를 하지 않은 배양상등액과 30K와 5K 카트리지를 통과한 시료는 큰 차이가 없는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 Leu . lactis CCK940에 의하여 생성된 저분자 당류와 lactis-올리고당이 5K의 분자량보다 큰 것을 의미하였다.

비교예 3에 따라 배양 상등액을 활성탄에 주입하고, 시료를 회수한 결과를 도 8에 나타내었으며, 저분자 당이 그대로 잔존해 있음을 확인하였다.

잔존한 당을 제거하기 위해서 에탄올을 이용하여 step wise 방법으로 단계적으로 에탄올 용출을 진행하였다. 그 결과 총 다섯 개의 분획을 얻을 수 있었고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 1, 2번 분획에는 저분자 당이 계속 남아있었고, 3번 분획부터 저분자 당의 농도가 감소하는 것이 확인되었다. 그러나 retention time 1.5분에 에탄올 peak가 나타나기 시작하였고, 5번 분획에서는 저분자 당뿐만 아니라 lactis-올리고당까지 그 농도가 감소하고, 에탄올 peak만 남아있었다.

회수한 분획은 감압농축기를 이용하여 에탄올을 완전히 제거한 후, 3 mL의 증류수에 용해시켰다. 용해한 시료는 Bio-gel P2 colume chromatograpy를 수행하면서 1 mL씩 분획을 회수하였다(bed volume 38 mL, 150 cm). 회수한 분획은 TLC와 Bio-LC로 저분자 당이 제거되었는지 확인하였다.

도 10에 상기 TLC 결과 중 103-160번 분획을 회수하여 감압농축으로 에탄올을 제거한 후 시료를 제조한 다음 이 시료의 Bio-LC chromatogram을 도 10에 나타내었다. 저분자 당은 초기 배양 상등액보다 월등하게 제거된 것을 관찰할 수 있었다.

시험예 7: 면역증강 효과 확인

면역증강에 기여하는 여러 cytokine들의 발현량을 측정하기 위하여 RAW264.7 세포의 RNA를 분리하였다. RAW264.7 세포를 6-well plate에 2106 cells/well의 농도로 배양하고, lactis-올리고당의 농도로 0.1, 1.0, 10.0 mg/mL으로 처리하거나 올리고당과 LPS를 함께 처리하여 37, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양한 세포는 QIAGEN RNeasy RNA isolation kit를 이용하여 RNA를 분리하였다. RNA 분리 후, DNase(Sigma, USA)을 처리하여 잔존하는 DNA를 제거하였다. RNA 분리는 1% agarose gel에서 70 V로 전기영동하여 확인하였다. 또한 RNA의 농도는 Epoch Take3 Micro-volume plates(BioTek)의 장비를 사용하여 측정하였다.

도 11에 분리된 RNA의 전기영동 결과와 그에 해당하는 RNA 농도를 나타내었다. 분리된 RNA는 cytokine의 발현량을 측정하기 위하여 cDNA합성에 이용되었다. cDNA 합성에는 1 g의 RNA를 사용하였고, Roche사의 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit의 실험방법에 따라 cDNA를 합성하였다.

합성된 cDNA는 각 cytokine primer를 이용하여 real time PCR로 유전자의 발현량을 측정하였다. Real time PCR은 Roche사의 FastStart Essential DNA Green Master kit를 이용하였고, real time PCR기기는 LightCycler 96을 구동하였다.

아래의 표 1에는 cytokine 유전자 별로 primer 염기서열을 나타내었다. 각 primer는 500 nmole되도록 희석하여 사용하였고, cDNA는 18-25의 Cq값을 나타내도록 50배 희석하여 적용하였다. preincubation: 95, 600 s; 3 steps amplification: 95, 10 s, 58, 15 s, 72, 15 s; melting: 95, 10 s, 65, 60 s, 97, 1 s의 조건으로 real time PCR을 구동하였다.

Leu . lactis CCK940에서 유래된 lactis-올리고당이 대식세포를 자극하여 cytokine의 분비에 관여하는지 확인하기 위하여 TNF-, IL-1, IL-6, IL-10와 inducible nitric oxide (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2) 유전자를 증폭시켰다. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 endogenous control로 사용하여 GAPDH 대비 유전자 mRNA의 발현량을 ddCT method를 통해 상대정량 분석하였다.

Gene		Sequence
GAPDH	Forward	5' ATC CCA TCA CCA TCT TCC AG 3'
	Reverse	5' CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG 3'
TNF-	Forward	5 ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC CG 3
	Reverse	5 CCA AAG TAG ACC TGC CCG GAC TC 3
IL-1	Forward	5 ATG GCA ACT GTT CCT GAA CTC AAC T 3
	Reverse	5 CAG GAC AGG TAT AGA TTC TTT CCT T 3
IL-6	Forward	5 CAA GAG ACT TCC ATC CAG TTG C 3
	Reverse	5 TTG CCG AGT TCT CAA AGT GAC 3
IL-10	Forward	5 TGC TAT GCT GCC TGC TCT TA 3
	Reverse	5 GGC AAC CCA AGT AAC CCA TA 3
COX-2	Forward	5 GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT 3
	Reverse	5 ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA 3
iNOS	Forward	5 AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT 3
	Reverse	5 GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC 3

TNF-의 경우, 대표적인 multifunctional cytokine으로 IL-1과 함께 작용하여 면역세포들을 염증 부위로 모이게 하고, T 세포의 분화와 증식에 관여하는 역할을 하고, 염증성 cytokine 중 IL-6는 염증을 유발하여 대식세포를 포함하는 식세포(phagocytes)의 탐식작용 및 보체 생산을 증가시키는 역할을 한다. IL-10은 단핵구, 대식세포, T 및 B 세포, NK cell, mast cell을 표적세포로 하며 특히 T 세포와 대식세포에 직접적으로 작용하여 세포의 활성화를 억제하는 항염증성 cytokine이다.

Leu. lactis CCK940이 생성한 lactis-올리고당의 면역증강 효능을 분석하기 위하여 RAW264.7 세포에 lactis-올리고당을 처리하거나 lactis-올리고당과 LPS를 같이 처리하고 면역증강 cytokine의 발현을 전사체 수준에서 real-time PCR에 의해 확인하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.

TNF-의 경우 LPS만을 처리시 LPS 무처리군에 비해 13.5배 발현량이 증가하였다. LPS를 처리하지 않고, lactis-올리고당을 농도별로 처리하였을시 농도의존적으로 발현량이 증가하는 것이 확인되었는데, 10 mg/mL의 농도에서 무처리군에 비해 13.9배 발현량이 증가하여 LPS 단독처리군에 비해 높은 TNF- 발현량을 보였다. 반면에 LPS와 lactis-올리고당을 함께 처리한 군은 농도 의존적으로 TNF-의 발현량이 감소한 것으로 확인되었으나, 큰 차이는 볼 수 없었다.

IL-1의 발현량은 LPS 무처리군에 비해 lactis-올리고당만 처리한 군이 농도의존적으로 발현량이 상승하는 것을 확인할 수 있었는데, lactis-올리고당 10 mg/mL의 농도에서 4,359.7배 높은 것으로 측정되었다. LPS 단독처리군은 4,196.6배의 발현량은 보였고, LPS와 lactis-올리고당을 같이 처리한 군은 LPS 단독처리군보다 낮은 발현량을 보였다. 10 mg/mL의 lactis-올리고당은 LPS 단독처리군과 유사한 IL-1 발현량을 관찰할 수 있었다.

IL-6의 경우 IL-1의 발현과 유사한 경향을 보였다. LPS 단독처리군은 무처리군에 비해 596,019.5배의 발현량을 보였고, lactis-올리고당만 처리한 군에서 농도의존적으로 발현량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. Lactis-올리고당의 농도가 1, 10 mg/mL일 때 발현량은 각각 21,693.9배, 124,864.2배 증가한 것으로 나타났다. 또한 농도 의존적이지 않지만 LPS와 1 mg/mL의 lactis-올리고당을 함께 처리하였을 때 발현량이 437,826.6배로 높게 발현되었다.

항염증성 cytokine인 IL-10의 경우 LPS 단독처리군은 301.3배의 발현량을 보였고, lactis-올리고당만을 처리한 군에서는 낮은 수치를 나타내었다. 또한 농도 의존적이지 않지만 LPS와 1 mg/mL의 lactis-올리고당을 함께 처리하였을 때 발현량이 145.0배로 높게 발현되었다. 이는 올리고당이 항염증 효능은 지니고 있지 않았다.

따라서 본 시험예를 통해 Leu . lactis CCK940이 생성한 lactis-올리고당은 면역반응의 개시단계인 대식세포와 같은 선천면역계를 직접 활성화시켜 TNF-, IL-6, IL-1와 같은 cytokine의 생산을 증가시켰다.

이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims (14)

1. 수크로스 및 말토스가 첨가된 효모 추출액을 포함하는 배지에서 기탁번호 KFCC11724P로 기탁된 류코노스톡 락티스 CCK940(Leuconostoc lactis CCK940)을 배양한 후 배양상등액을 수득하는 방법으로 수행되고,
   상기 배지는 pH 6 내지 8로 조정하고,
   상기 배지에 배양 후 2 내지 4시간 사이에 수크로스 및 말토스를 3 내지 7wt% 함량으로 추가 투입하는 것을 특징으로 하는 올리고당의 제조방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 배지에서 상기 수크로스 및 말토스의 농도는 3 내지 15wt%인 것을 특징으로 하는 올리고당의 제조방법.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 류코노스톡 락티스 CCK940은 배지에 0.5 내지 2%(v/v) 농도로 접종하는 것을 특징으로 하는 올리고당의 제조방법.
6. 삭제
7. 제1항에 있어서,
   상기 배지에 포함되는 상기 수크로스:말토스의 중량비는 1:0.3 내지 1:2.5인 것을 특징으로 하는 올리고당의 제조방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 배지는 효모추출액, 펩톤(peptone), MgSO₄7H₂O, FeSO₄7H₂O, NaCl, MnSO₄H₂O, CaCl₂2H₂O, 및 K₂HPO₄를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고당의 제조방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 배양상등액을 수득한 후 에탄올을 사용하여 분획하는 과정을 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 올리고당의 제조방법.
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제

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