KR20160020457A - 네오아가로올리고당을 포함하는 면역 증강용 또는 항암용 조성물 - Google Patents
네오아가로올리고당을 포함하는 면역 증강용 또는 항암용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 일 예는 네오아가로올리고당 또는 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물 또는 항암용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 네오아가로올리고당은 면역기능 증강 효과 및 항암 효과가 매우 우수하다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 면역력을 높이거나 암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 약품 또는 기능성 식품으로 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 다른 조성물의 유효성분은 쉽게 구할 수 있는 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)와 같은 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응을 통해 수득할 수 있기 때문에 비교적 저렴한 비용으로 생산할 수 있고, 부작용이 없어서 누구나 쉽게 섭취가 가능하다.
Description
본 발명은 네오아가로올리고당 또는 네오아가로올리고당 혼합물의 신규 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 네오아가로올리고당 또는 네오아가로올리고당 혼합물의 면역 기능 증강 용도 또는 항암 용도에 관한 것이다.
한천(Agar)은 오래전부터 식품첨가물, 의약품, 화장품, 가축사료 및 공업원료 등으로 널리 이용되고 있는 대표적인 해조류 유래 다당류로서, 국내의 경우 해마다 그 생산량이 약 2,000 ~ 5,000톤에 이르고 있는 비교적 풍부한 수산자원 중 하나이다. 그러나, 실제 이용 면에서는 전체 생산량의 일부만이 단순가공 처리되어 값싼 원료로 사용될 뿐이고, 그 나머지는 대부분 방치되고 있어 부존 자원량에 비해 부가가치가 매우 낮은 실정이다. 따라서 풍부한 국내 한천의 새로운 용도개발과 부가가치 향상에 관한 연구가 크게 요구되고 있는 실정이다.
한천은 소량의 단백질, 회분 및 지방을 제외하면 대부분 다당류로 이루어지는데, 상기 한천을 구성하는 다당류에는 중성 다당류인 아가로스(agarose)와 산성 다당류인 아가로펙틴(agaropectin)이 있다. 아가로스는 D-갈락토스(D-galactose)와 3,6-안하이드로-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose)가 β-1,4 형태로 결합한 아가로비오스(agarobiose)를 단위체로 가지며, 아가로비오스가 α-1,3 결합으로 반복되어 연결된 직쇄 구조로 되어있어서 겔(gel)화력이 강하다. 반면, 아가로펙틴은 아가로스와 마찬가지로 아가로비오스를 단위체로 가지나, 황산기 등과 같은 산성기를 함유하고 있어서, 겔화력이 약하다.
이중, 아가로스는 β-1,4 결합에 작용하는 베타-아가레이즈(β-agarase)에 의해 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)를 거쳐 네오아가로비오스(neoagarobiose)로 분해되고 계속해서 α-1,3 결합에 작용하는 알파-아가레이즈(α-agarase)에 의해서 갈락토스(D-galactose)와 3,6-안하이드로-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose)로 최종 분해된다. 또한, 아가로스는 묽은 산이나 알파-아가레이즈(α-agarase)에 의해 아가로비오스(neoagarobiose)로 분해된다. 일반적으로, 네오아가로올리고당은 한천 또는 아가로스를 베타-아가레이즈(β-agarase)로 가수분해하여 얻어지는 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose), 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose) 등과 같이 단당이 2-10개 정도 결합한 올리고당을 의미한다. 또한, 아가로올리고당은 한천 또는 아가로스를 묽은 산이나 알파-아가레이즈(α-agarase)로 가수분해하여 얻어지는 아가로비오스(Aeoagarobiose), 아가로테트라오스(Agarotetraose), 아가로헥사오스(Agarohexaose), 아가로옥타오스(Agarooctaose) 등과 같이 단당이 2-10개 정도 결합한 올리고당을 의미한다. 네오아가로올리고당은 3,6-안하이드로-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose)를 비환원 말단으로 가지는 반면, 아가로올리고당은 D-갈락토스(D-galactose)를 비환원 말단으로 가지며, 이러한 구조적 차이 때문에 생리학적 활성 측면에서 서로 다른 성질을 보이기도 한다.
한편, 방선균인 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) A3(2)는 한천을 분해하는 아가레이즈를 세포 외(세포 밖으로 분비되는) 단백질 형태로 생산한다고 알려져 있으며(Stanier et al., 1942, J. Bacteriol.; Hodgson and Chater, 1981, J. Gen. Microbiol.), 이 아가레이즈는 DagA 유전자로 코딩되어 있다. DagA 유전자는 방선균에서 그 기능이 유일하게 알려진 베타-아가레이즈(β-agarase) 유전자이기 때문에 방선균을 통한 아가레이즈 생산 연구에 있어서 중요한 위치를 갖는다. 특히, 스트렙토마이세스 시리칼라는 방선균의 분자생물학적 연구에 가장 널리 사용되는 균주로서 2002년 영국의 Sanger centre에 의해 염색체 DNA의 서열이 분석되었고 현재 공개되어 있다(Bantley et al.,2002, Nature).
네오아가로올리고당의 제조 또는 용도와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-0794593호에는 한천 분해능을 갖는 탈라소모나스 속 균주 SL-5(Thalassomonas sp. SL-5) KCCM 10790P와 상기 균주가 생산하는 베타-아가레이즈(β-agarase)를 이용하여 네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 네오아가로올리고당을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1072503호에는 한천 분해능을 갖는 글라시에콜라 속 균주 SL-12 KCCM 10945P(Glaciecola sp. SL-12 KCCM 10945P)와 상기 균주가 생산하는 베타-아가레이즈(β-agarase)를 이용하여 네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 네오아가로올리고당을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1303839호에는 슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp) 균주로부터 분리된 베타-아가레이즈 및 이를 이용하여 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 네오아가로올리고당을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1295659호에는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp.) 균주로부터 분리된 베타-아가레이즈 및 이를 이용하여 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 네오아가로올리고당을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1212106호에는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp.) 균주로부터 분리된 베타-아가레이즈를 한천, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 기질과 반응시켜 네오아가로비오스를 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1206006호에는 한천분해활성을 갖는 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주 KCCM 11151P (Flammeovirga sp. mbrc-1 KCCM 11151P) 및 상기 균주가 생산하는 베타-아가레이즈(β-agarase)를 한천과 반응시켜 네오아가로비오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 네오아가로올리고당을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1302655호에는 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 아가레이즈(agarase)와 아가로스(agarose) 또는 아가(agar)를 반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1190078호에는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 유래 트립신 유전자(sprT)의 프로모터와 시그널 펩타이드 코드부(coding region)를 포함하여 이루어지는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 DNA 단편; 및 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈 유전자(dagA)에서 시그널 펩타이드 코드부가 제거된 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 DNA 단편;을 포함하고, 원핵생물을 형질전환시킬 수 있는 베타-아가레이즈 재조합 발현 벡터와 이를 이용하여 베타-아가레이즈를 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0060045호에는 신규한 베타-아가레이즈 생산 유전자를 이용한 네오아가로바이오스 또는 네오아가로테트라오스의 효소적 생산방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0044987호에는 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)를 유효성분으로 포함하는 피부 미백 조성물이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0085017호에는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 피부 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 피부 미백 또는 보습용 화장료 조성물, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 등이 개시되어 있다. 이상에서 살펴본 바와 같이, 종래 기술은 주로 베타-아가레이즈를 유전자로 포함하는 신규 균주, 신규 균주나 재조합 균주를 통해 베타-아가레이즈를 생산하는 방법 또는 베타-아가레이즈를 이용하여 한천 등으로부터 네오아가로올리고당을 제조하는 방법에 집중되어 있고, 네오아가로올리고당, 특히 특정 베타-아가레이즈를 이용하여 제조한 네오아가로올리고당의 다양한 생리학적 기능에 대해서는 연구가 거의 이루어지지 않고 있다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 네오아가로올리고당 또는 네오아가로올리고당 혼합물의 다양한 생리학적 용도를 제공하는 데에 있다.
본 발명자는 풍부한 수산자원인 한천을 유용하게 활용할 수 있는 방법을 개발하고자 하였고, 한천이 다당류이므로 당 분해효소를 적절히 활용하면 한천의 분해과정에서 생리활성 효과를 나타내는 다양한 당 유래 화합물이 생성될 수 있다는 가능성에 주목하게 되었다. 그리고 방선균은 항생제 등 유용한 생리활성 물질을 생산하는 미생물이며, 이 생리활성 물질에는 다양한 당 관련 화합물이 포함되기 때문에, 방선균 중에는 한천을 분해하거나 변형시켜 유용한 당 화합물로 전환시킬 수 있는 효소를 보유한 균주가 있을 것이라 생각하였다. 이에, 본 발명자는 방선균으로부터 유용한 효소를 탐색하고 이를 한천의 효소반응에 적용하여 유용한 생리활성 물질의 생산을 시도하였다.
한편, 최근 들어 약용 식물 또는 식용 식물을 이용한 생리활성 연구가 활발하게 진행되고 있는데 특히 천연물에서 유래한 다당체는 다양한 생리활성을 나타내어, 기능성 식품 및 대체 의약 소재 분야에서 크게 주목받고 있다. 예를 들어, 버섯 유래 다당류에는 면역 기능의 부활 내지 증강에 의한 항종양 활성이 있는 것으로 알려져 있으며, 관련 연구도 다양하게 진행되고 있다. 면역 기능의 증강에 의한 항종양 활성은 종래의 세포독성을 나타내는 항암제와는 달리, 숙주의 저하된 면역 기능을 상당 수준 회복 또는 증강시키고 항암효과를 발휘하기 때문에 크게 각광받고 있다.
본 발명자는 방선균, 특히 스트렙토마이세스 시리칼라 유래 당 분해 효소의 효소반응을 통해 생산되는 당 화합물이 이러한 면역기능 증진 및 항종양 활성을 나타낼 가능성이 있다고 판단하였으며, 이에 대한 효능을 알아보기 위해 In vitro 및 In vivo 상에서 다양한 연구를 진행하였다. 그 결과, 방선균인 스트렙토마이세스 시리칼라의 DagA 효소와 한천 또는 아가로스의 반응을 통해 수득한 효소반응 산물이 면역기능 증강 및 항암 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 네오아가로올리고당 또는 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서, 상기 네오아가로올리고당은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물 또는 항암용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것이 바람직하고, 네오아가로올리고당 혼합물 총 중량을 기준으로 10 중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70 중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 20 내지 50 중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물일 수 있다.
본 발명의 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 다른 예는 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서, 상기 효소반응 산물 또는 정제물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 네오아가로올리고당을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물 또는 항암용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 효소반응 산물 또는 정제물 내 네오아가로올리고당의 함량은 효소반응 산물 또는 정제물 총 중량을 기준으로 45~85 중량%인 것이 바람직하다. 또한, 상기 효소반응 산물 또는 정제물은 네오아가로올리고당 총 중량을 기준으로 10 중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70 중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 20 내지 50 중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 효소반응은 35~45℃의 온도 및 6~8의 pH에서 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스 용액에 DagA를 2~250 unit/㎖의 농도로 첨가하여 이루어지는 것 바람직하다. 또한, 상기 DagA는 서열번호 2의 31번째부터 309번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 네오아가로올리고당은 면역기능 증강 효과 및 항암 효과가 매우 우수하다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 면역력을 높이거나 암을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 약품 또는 기능성 식품으로 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 다른 조성물의 유효성분은 쉽게 구할 수 있는 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)와 같은 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응을 통해 수득할 수 있기 때문에 비교적 저렴한 비용으로 생산할 수 있고, 부작용이 없어서 누구나 쉽게 섭취가 가능하다.
도 1은 본 발명에서 DagA 유전자를 클로닝하기 위해 사용된 pUWL201pw 벡터의 개열 지도이다.
도 2는 pUWL201pw 벡터에 DagA 유전자가 도입된 재조합 벡터의 개열 지도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 HPLC-ELSD로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p70)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 5는 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 TNF-α의 발현량을 DagA 효소반응 산물의 구성성분 처리군(DP2, DP4, DP6 처리), 대조군(LPS, AO 처리), 표준시료 처리군(β-glucan 처리)과 비교한 그래프이다.
도 6은 사람 단핵세포주인 THP-1 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 7은 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 8은 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70)의 발현량을 DagA 효소반응 산물의 구성성분 처리군(DP2, DP4, DP6 처리)과 비교한 그래프이다.
도 9는 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 수지상 세포 활성화 지표인 표면단백질인자(CD80, CD86, MHC class I, MHC class II)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 10은 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 세포사멸 여부를 Annexin V-FITC와 propidium iodide(PI)를 이용하여 분석하고, 이를 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 11은 WT 마우스, TLR2-/- 마우스, TLR4-/- 마우스, TLR9-/- 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-12p70, IL-1β, IL-10, IL-12p70)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 12는 WT 마우스, TLR2-/- 마우스, TLR4-/- 마우스, TLR9-/- 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 수지상 세포 활성화 지표인 표면단백질인자(CD80, CD86)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 13은 WT 마우스, TLR4-/- 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 소정의 시간별로 처리한 후 웨스턴 블롯(western blot) 방법으로 신호전달기구를 확인한 결과이다.
도 14는 Balb/c 마우스에 유방암 세포인 4T-1을 이종이식한 후 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 투여하였을 때 암 세포 성장 억제 효과를 대조군(생리식염수 투여)과 비교한 그래프이다.
도 15는 피부암 세포 동물모델(B16F1 melanoma tumor model)에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리하였을 때의 항암 효과를 대조군(PBS 처리) 또는 표준시료군(β-glucan 처리)과 비교한 그래프이다.
도 16은 Balb/c mouse에 salmonella를 주입하고 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 주사한 군에서의 생존율을 대조군(PBS 처리, AO 처리) 및 표준시료군(β-glucan 처리)과 비교한 그래프이다.
도 17은 C57bl/6 마우스의 복강에 실시예 5에서 정제하여 수득한 DP6을 주사하였을 때 복강 세포 중 활성화된 NK 세포의 발현량을 대조군(PBS 용액 주사)과 비교한 그래프이다.
도 18은 C57bl/6 마우스의 비장에서 분리된 NK 세포와 NK 세포 이외의 면역세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리하였을 때 활성화된 세포의 양을 나타낸 그래프이다.
도 19는 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리한 뒤 얻은 상등액을 C57bl/6 마우스의 비장에서 분리된 NK 세포와 NK 세포 이외의 면역세포에 처리하였을 때 활성화된 세포의 양을 나타낸 그래프이다.
도 4 내지 도 19에서 "NAO"는 본 발명의 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 나타내고, "LPS"는 lipopolysaccharide를 나타내고, "CON"은 무처리를 나타내고, "AO"는 아가로올리고당을 나타낸다.
도 2는 pUWL201pw 벡터에 DagA 유전자가 도입된 재조합 벡터의 개열 지도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 HPLC-ELSD로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p70)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 5는 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 TNF-α의 발현량을 DagA 효소반응 산물의 구성성분 처리군(DP2, DP4, DP6 처리), 대조군(LPS, AO 처리), 표준시료 처리군(β-glucan 처리)과 비교한 그래프이다.
도 6은 사람 단핵세포주인 THP-1 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 7은 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 8은 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70)의 발현량을 DagA 효소반응 산물의 구성성분 처리군(DP2, DP4, DP6 처리)과 비교한 그래프이다.
도 9는 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 수지상 세포 활성화 지표인 표면단백질인자(CD80, CD86, MHC class I, MHC class II)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 10은 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 세포사멸 여부를 Annexin V-FITC와 propidium iodide(PI)를 이용하여 분석하고, 이를 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 11은 WT 마우스, TLR2-/- 마우스, TLR4-/- 마우스, TLR9-/- 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-12p70, IL-1β, IL-10, IL-12p70)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 12는 WT 마우스, TLR2-/- 마우스, TLR4-/- 마우스, TLR9-/- 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 수지상 세포 활성화 지표인 표면단백질인자(CD80, CD86)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 13은 WT 마우스, TLR4-/- 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 소정의 시간별로 처리한 후 웨스턴 블롯(western blot) 방법으로 신호전달기구를 확인한 결과이다.
도 14는 Balb/c 마우스에 유방암 세포인 4T-1을 이종이식한 후 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 투여하였을 때 암 세포 성장 억제 효과를 대조군(생리식염수 투여)과 비교한 그래프이다.
도 15는 피부암 세포 동물모델(B16F1 melanoma tumor model)에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리하였을 때의 항암 효과를 대조군(PBS 처리) 또는 표준시료군(β-glucan 처리)과 비교한 그래프이다.
도 16은 Balb/c mouse에 salmonella를 주입하고 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 주사한 군에서의 생존율을 대조군(PBS 처리, AO 처리) 및 표준시료군(β-glucan 처리)과 비교한 그래프이다.
도 17은 C57bl/6 마우스의 복강에 실시예 5에서 정제하여 수득한 DP6을 주사하였을 때 복강 세포 중 활성화된 NK 세포의 발현량을 대조군(PBS 용액 주사)과 비교한 그래프이다.
도 18은 C57bl/6 마우스의 비장에서 분리된 NK 세포와 NK 세포 이외의 면역세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리하였을 때 활성화된 세포의 양을 나타낸 그래프이다.
도 19는 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리한 뒤 얻은 상등액을 C57bl/6 마우스의 비장에서 분리된 NK 세포와 NK 세포 이외의 면역세포에 처리하였을 때 활성화된 세포의 양을 나타낸 그래프이다.
도 4 내지 도 19에서 "NAO"는 본 발명의 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 나타내고, "LPS"는 lipopolysaccharide를 나타내고, "CON"은 무처리를 나타내고, "AO"는 아가로올리고당을 나타낸다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한" 및 "식품학적으로 허용 가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 예에 따른 면역 증강용 조성물 또는 항암용 조성물은 네오아가로올리고당 또는 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 포함한다. 이때, 상기 네오아가로올리고당은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)에서 선택되는 것이 더 바람직하나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상을 포함하는 것이라면 크게 제한되지 않으며, 구성성분들의 시너지 효과를 고려할 때 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 3종 이상인 것이 바람직하고, 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총 중량을 기준으로 10 중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70 중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 20 내지 50 중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것이 바람직하고, 1 내지 5 중량%의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70 중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 25 내지 45 중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물일 수 있다. 기질과 DagA와의 효소반응을 통해 네오아가로올리고당 혼합물을 수득하는 방법은 뒤에서 상세하게 설명한다.
본 발명의 다른 예에 따른 면역 증강용 조성물 또는 항암용 조성물은 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물을 유효성분으로 포함한다. 이때, 상기 효소반응 산물 또는 정제물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 네오아가로올리고당을 포함하는 것이라면 크게 제한되지 않으며, 구성성분들의 시너지 효과를 고려할 때 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상의 네오아가로올리고당을 포함하는 것이 바람직하고, 3종 이상을 포함하는 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 효소반응 산물 또는 정제물 내 네오아가로올리고당의 함량은 효소반응 산물 또는 정제물 총 중량을 기준으로 45~85 중량%인 것이 바람직하고, 50~80 중량%인 것이 더 바람직하나 여기에 반드시 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 효소반응 산물 또는 정제물은 네오아가로올리고당 총 중량을 기준으로 10 중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70 중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 20 냐자 50 중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것이 바람직하고, 1 내지 5 중량%의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70 중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 25 내지 45 중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 효소반응은 35~45℃의 온도 및 6~8의 pH에서 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스 용액에 DagA를 2~250 unit/㎖의 농도, 바람직하게는 10~150 unit/㎖의 농도, 더 바람직하게는 10~100 unit/㎖의 농도로 첨가하여 이루어지는 것 바람직하다. 이때, 효소의 활성을 나타내는 1 Unit은 0.2%(w/v)의 농도로 아가로스를 녹인 50mM PBS 용액(pH 7) 3.9㎖를 40℃에서 5분간 반응한 후(반응액 4㎖), 반응액과 동량의 DNS 시약(dinitrosalicylic acid 6.5g, 2M NaOH 325㎖ 및 glycerol 45㎖를 증류수 1ℓ에 용해시켜 제조함)을 넣고 10분간 끓인 다음 식히고, 흡광도를 540㎚에서 측정하였을 때 540㎚에서의 흡광도 0.001을 생성하는 효소의 양으로 정의된다.
이하, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분을 기질과 DagA와의 효소반응을 통해 수득하는 방법을 설명한다. 본 발명에서 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 DagA는 서열번호 2의 31 ~ 309번 사이의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미하며, 스트렙토마이세스 시리칼라로부터 생산되거나 이종 균주로부터 생산된 단백질 또는 기능이 전혀 다른 것으로 변경되거나 아가레이즈 활성을 잃지 않는 범위 내에서 통상적인 유전자 재조합 방법 즉, 정제를 유리하게하기 위해 표지 아미노산을 포함시키거나 이종 발현을 위해 아미노산 서열을 변경하는 등의 방법에 따라 재조합된 단백질을 모두 포함한다. DagA는 본래 스트렙토마이세스 시리칼라의 베타-아가레이즈 유전자로부터 번역될 때 서열번호 2의 309개 아미노산을 갖고 분자량이 약 35 kDa인 상태로 생산되며, N-말단 30개의 아미노산 시그널 펩티드가 잘려져서 완성된 세포외형 단백질(약 32kDa)의 상태로 분비된다. 스트렙토마이세스 시리칼라의 DagA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있다. 서열번호 1은 스트렙토마이세스 시리칼라 A3(2)의 게놈에 존재하는 유전자의 염기서열로 NCBI(미국 국립생물정보센터) 데이터베이스 상에 "SCO3471"로 명명되어 있다. In vitro 실험을 통해 확인된 바에 따르면, DagA 유전자의 전사는 RNA 중합효소의 적어도 다른 3가지의 완전효소(holoenzyme)에 의해 인지되는 4가지 또는 5가지의 다른 프로모터(promoter)에 의해 조절된다. DagA 유전자의 전사단계 분석에 의하면, DagA의 전사는 암호화 서열의 상부 32, 77, 125 및 220번째 염기에서 개시되는 것으로 나타났다.
본래 DagA의 생산 균주인 스트렙토마이세스 시리칼라의 배양을 통해 본 발명에서 사용되는 DagA를 생산할 수 있으나, 생산 효율을 높이기 위해 이종 균주인 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans)의 발현 시스템을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 DagA 유전자를 방선균용 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조한 다음, 재조합 벡터로 스트렙토마이세스 리비던스를 형질전환하고, 형질전환체를 배양하는 방법을 사용하여 DagA를 생산할 수 있다. 이 경우 재조합 벡터는 DagA 유전자의 전사가 방선균 유래 프로모터에 의해 조절될 수 있도록 구성하는 것이 바람직하다. 방선균 유래 프로모터에는 sgtR 프로모터(sgtRp), ermE 프로모터(ermEp), tipA 프로모터(tipAp) 등 다양한 프로모터가 존재하므로 재조합 벡터를 제조할 때 이들을 선택하여 사용할 수 있다. 이들 프로모터에 의해 전사가 조절될 수 있도록 구성된 여러 종류의 벡터들이 개발되어 있고, 이 벡터에 SCO3471를 클로닝하면 방선균 유래 프로모터에 의해 전사가 조절되는 구조의 재조합 벡터를 제조할 수 있다. 형질전환체는 숙주 균주를 DagA 유전자가 클로닝된 재조합 벡터로 형질전환시켜 제조할 수 있는데, 숙주 균주에 따라 형질전환 방법이 다양하게 존재하므로, 적절한 방법을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 스트렙토마이세스 리비던스를 숙주 균주로 사용하는 경우 PEG(polyethylene glycol)를 매개로한 형질전환 방법을 사용할 수 있다. 형질전환체 등과 같은 DagA 생산 균주를 액체 배지에서 배양하면 DagA를 생산할 수 있으며, 배양액을 수득하여 한외 여과법과 같은 통상의 단백질 정제방법을 이용하면 고순도의 DagA를 생산할 수 있다. 이때 액체 배지에 한천 또는 아가로스를 포함시키면 보다 효율적으로 DagA를 생산할 수 있다.
이렇게 생산된 DagA를 한천 또는 아가로스와 같은 기질 용액에 첨가하고 특정 온도 및 pH 조건에서 반응시키면 본 발명에 따른 조성물에서 유효성분으로 사용되는 효소반응 산물을 수득할 수 있다. 또한, 상기 효소반응 산물을 한외 여과법으로 부분 정제하거나 겔여과 크로마토그래피에 통과시켜 분획하면 효소반응 산물의 정제물을 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 면역 증강용 조성물은 면역력이 떨어진 개체의 면역력을 증가시키거나 면역 밸런스가 떨어진 개체의 면역 밸런스를 개선시키는 데에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항암용 조성물은 개체의 암을 예방, 개선 또는 치료하는 데에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 식품 첨가제, 식품 조성물(특히 기능성 식품) 또는 사료 첨가제 등으로 구체화될 수 있고, 조성물 내에서의 유효성분의 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 면역 증강용 조성물 또는 항암용 조성물이 약학 조성물로 구체화되는 경우, 약학 조성물에서 유효성분의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.1~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 네오아가로올리고당 외에 면역 증강 또는 항암 효과를 갖는 공지의 유효 성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 유효성분인 복합 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이라면 크게 제한되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 유효성분인 복합 추출물을 기준으로 할 때 0.1 내지 1000 ㎎/㎏인 것이 바람직하고, 1 내지 500 ㎎/㎏인 것이 더 바람직하며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 면역 증강용 조성물 또는 항암용 조성물이 식품 조성물로 구체화되는 경우, 식품 조성물에서 유효성분의 함량은 크게 제한되지 않으며, 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~50 중량%, 바람직하게는 0.1~25 중량%, 더 바람직하게는 0.5~10 중량%일 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 구체적인 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 식품 조성물은 유효성분 외에 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제 등을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
1 :
DagA
효소의 생산
스트렙토마이세스 시리칼라 A3(2)의 염색체 DNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머 및 Ex-Taq(TAKARA) 중합효소를 이용하여 중합연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였고, 그 결과 증폭된 DagA 유전자 단편(DagA의 시그널 펩타이드 및 완성형 펩타이드가 암호화된 947bp 길이의 단편으로서, 서열번호 1의 염기서열 양 말단에 프라이머의 일부 서열이 연결된 상태에 해당함)을 수득하였다.
* DagA 유전자 단편의 증폭에 사용된 프라이머
Asm-F(Forward Primer) : 5′-GACATATGGTGGTCAACCGACGTGATC-3′(NdeI) (서열번호 3)
Asm-R(Reverse Primer) : 5′-GGTGGATCCCTACACGGCCTGATACG-3′(BamHI) (서열번호 4)
이후, 증폭된 DagA 유전자 단편의 제한효소 부위(NdeI/BamHI)를 이용하여 DagA 유전자를 도 1의 pUWL201pw 벡터에 클로닝하여 도 2의 재조합 벡터를 제작하였다. 도 2의 재조합 벡터에서는 DagA 유전자의 전사가 ermE 프로모터에 의해 조절된다. 이후, 도 2의 재조합 벡터로 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans) TK24 균주를 형질전환하여 재조합 균주를 제조하고, 상기 재조합 균주를 DagA의 생산을 위해 사용하였다.
구체적으로, 상기 재조합 균주를 0.3%(w/v)의 한천(agar)이 포함된 R2YE 액체 배지에 접종하고 28℃의 온도 및 120rpm의 교반 조건에서 약 60시간 동안 전 배양을 실시하였다. 전 배양 과정을 거친 다음 약 60시간 동안 본 배양을 실시하였다. 본 배양을 통해 수득한 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고, 상등액을 한외 여과막(5kDa cut-off membrane)으로 여과하여 분리 및 정제하였다. 여과막을 통과하지 못한 효소 농축액을 동결건조하여 고형화하고, 고형화된 DagA 효소를 보관하면서 이후의 실험에 사용하였다.
실시예
2 :
DagA
효소의
아가레이즈
활성 측정
상기 실시예 1에서 수득한 DagA 효소의 아가레이즈 활성을 환원당량 검정방법(DNS method)으로 측정하였다. 실시예 1에서 수득한 DagA 효소를 PBS(phosphate buffered saline) 용액에 10㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조한 DagA 효소액 100㎕와 0.2%(w/v)의 농도로 아가로스를 녹인 50mM PBS 용액(pH 7) 3.9㎖를 혼합하고 40℃에서 5분간 반응시킨 후, 여기에 DNS 시약(dinitrosalicylic acid 6.5g, 2M NaOH 325㎖ 및 glycerol 45㎖를 증류수 1ℓ에 용해시켜 제조함) 4㎖를 넣고 10분간 끓인 다음 식히고, 흡광도를 540㎚에서 측정하였다. 효소 1U(Unit)는 540㎚에서의 흡광도가 0.001인 활성으로 정의하였다.
실시예
3 :
DagA
효소반응 산물의 제조
1.5%(w/v)의 농도로 한천을 녹인 20mM Tris-HCl 용액 1ℓ를 제조하고, 100℃에서 약 10분간 가열한 다음 40℃로 온도를 떨어뜨리고, 여기에 125U/㎖ 농도의 DagA 효소 수용액을 전체 시료의 양을 기준으로 20,000U가 되도록 처리하고 약 24시간 동안 반응시켰다. 이후, 효소반응 산물을 원심분리하여 미분해된 한천을 제거하고, 상등액을 회수한 다음 TLC(thin layer chromatography)를 이용하여 효소반응 생성물을 확인하였다. 회수한 상등액을 한외 여과막(5KDa cut-off membrane)으로 여과하여 부분 정제하였다. 여과막을 통과한 DagA 효소반응 산물을 동결건조하여 고형화하였고, 고형화된 DagA 효소반응 산물을 보관하면서 이후의 실험에 사용하였다. 상기 과정을 반복하면서 4 배치(batch)에 해당하는 부분 정제된 효소반응 산물을 수득하였다.
실시예
4 :
HPLC
-
ELSD
분석을 통한
DagA
효소반응 산물의
네오아가로올리고
당 조성 확인
상기 실시예 3에서 수득한 효소반응 산물의 네오아가로올리고당 조성을 HPLC-ELSD 분석을 통해 확인하였다. HPLC-ELSD 분석 조건은 다음과 같다.
* 칼럼 : NH2 P-50 4E multimode column(250㎜×4.6㎜)
* 이동상 : 아세토니트릴(acetonitrile)과 물의 혼합용액(acetonitrile : water의 부피비는 65 : 35임
도 3은 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 HPLC-ELSD로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3에서 보이는 4개의 피크 그래프는 4 배치(batch)에서 각각 얻은 부분 정제된 효소반응 산물에 대응하는 것이다. 또한, 도 3에서 표 안의 면적(%)은 각각의 네오아가로올리고당에 해당하는 피크의 면적을 전체 피크 면적에 대해 백분율로 나타낸 것이며 당 업계에서 중량%와 동일한 의미로 해석될 수 있다. 도 3에서 보이는 바와 같이 DagA 효소반응 산물은 주성분이 네오아가로비오스(neoagarobiose, 이하 'DP2'라 한다), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, 이하 'DP4'라 한다) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, 이하 'DP6'라 한다) 등과 같은 네오아가로올리고당인 것으로 나타났다. DagA 효소반응 산물에서 네오아가로올리고당의 함량은 고형분(HPLC-ELSD 분석에서 검출되지 않은 성분을 포함한다)의 전체 중량을 기준으로 할 때 약 65±5 중량%인 것으로 나타났으나, 효소반응 조건에서 따라 상기 함량은 다양한 범위에서 선택될 수 있다. 예를 들어, agA 효소반응 산물에서 네오아가로올리고당의 함량은 고형분 전체 중량을 기준으로 65±20 중량%일 수 있다. 또한, DagA 효소반응 산물에서 DP2, DP4 및 DP6의 함량은 네오아가로올리고당 전체 중량을 기준으로 할 때 각각 2~4 중량%, 65~70 중량% 및 25~30 중량%인 것으로 나타났으나, 효소반응 조건에서 따라 상기 함량은 다양한 범위에서 선택될 수 있다. 예를 들어, DagA 효소반응 산물에서 DP2, DP4 및 DP6의 함량은 네오아가로올리고당 전체 중량을 기준으로 할 때 각각 0~10 중량%, 50~70 중량% 및 20~50 중량%일 수 있다.
실시예
5 :
겔여과
크로마토그래피를 이용한
DagA
효소반응 산물의 정제
상기 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 효소반응 산물을 겔여과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC; 제품명 : BioGel P-2 gel, Biorad, Cat. No.: 150-4115)를 통해 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, DP6), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, DP4) 및 네오아가로비오스(neoagarobiose, DP2)로 분리 및 정제하였다. 이후 정제한 산물들을 동결건조하여 고형화하였고, 고형화된 DagA 효소반응 정제 산물을 보관하면서 이후의 실험에 사용하였다. 정제한 산물들인 DP2, DP4 및 DP6의 순도를 TLC와 HPLC를 통해 확인한 결과 약 85%(w/w) 수준이었다.
실시예
6 :
DagA
효소반응 산물의 면역 활성 및 항암 효능 확인 시험
6-1. 면역세포에서의 사이토카인 발현량 확인
한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포 및 사람 단핵세포주인 THP-1 세포를 분양받아 실험에 사용하였다. 이들 세포의 배양 배지로는 RPMI 1640(HycloneLaboratoris Inc., Logan, UT, USA)에 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% streptomycin/penicillin(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)을 첨가한 것을 사용하였으며, 37℃의 온도 조건 및 5% CO2 조건을 가진 배양기에서 세포를 배양하였다.
Raw264.7 세포를 24 well culture plate에 약 5×104 cells/well로 분주하고 약 24시간 동안 배양한 다음, culture plate의 각 well에 상기 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물(이하, 'NAO'라 한다)을 0.005 ~ 12.5㎎/㎖의 다양한 농도로 첨가하고, 37℃의 온도 조건 및 5% CO2 조건을 가진 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이때, 양성대조군으로 DagA 효소반응 산물 대신 LPS(lipopolysaccharide)를 50ng/㎖의 농도로 첨가하고 동일한 조건에서 배양하였고, 음성대조군으로 대식세포에 아무것도 처리하지 않고 동일한 조건에서 배양하였다. 배양을 완료한 후 상등액을 취하여 분비된 TNF-α(tumor necrosis factor alpha), IL-1β(interleukin-1 beta), IL-6(interleukin-6), IL-12p70(interleukin-12p70)의 양을 효소면역분석법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)으로 측정하였다. 도 4는 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p70)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다. 도 4에서 보이는 바와 같이 처리한 NAO의 양이 증가할수록 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p70의 발현량이 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 NAO가 면역기능 증진 효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
또한, DagA 효소반응 산물의 구성성분인 DP2, DP4, DP6와 NAO를 각각 500㎍/㎖의 농도로 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포에 처리한 후 TNF-α의 발현량을 측정하였다. 이때, 대조군으로 LPS를 100ng/㎖의 농도로 처리하거나 아가로올리고당(Agarooligosaccharide, AO; Takara Bio Inc., JP)을 500㎍/㎖의 농도로 처리하고, 표준시료로 β-glucan을 500㎍/㎖의 농도로 처리한 후 TNF-α의 발현량을 비교하였다. 도 5는 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 TNF-α의 발현량을 DagA 효소반응 산물의 구성성분 처리군(DP2, DP4, DP6 처리), 대조군(LPS, AO 처리), 표준시료 처리군(β-glucan 처리)과 비교한 그래프이다. 도 5에서 보이는 바와 같이 NAO 처리군에서 TNF-α의 발현량이 가장 높게 나타났다. 특히, NAO 처리군은 동일한 양의 DP2, DP4, DP6를 처리한 군보다 TNF-α의 발현량이 높게 나타났으며, 이러한 결과는 다양한 네오아가로올리고당의 조합에 의한 시너지 효과인 것으로 판단된다.
또한, 다른 단핵세포주인 THP-1 세포를 96 well plate에 3×104 cells/well로 분주하고 PMA(phorbol myristate acetate)를 처리한 다음 24시간 동안 배양하여 대식세포로의 분화를 유도하였다. 분화된 THP-1 세포에 NAO를 각각 0.1㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 1㎎/㎖의 농도로 처리하고 37℃의 온도 조건 및 5% CO2 조건을 가진 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이때, 양성대조군으로 DagA 효소반응 산물 대신 LPS(lipopolysaccharide)를 100ng/㎖ 또는 500ng/㎖의 농도로 첨가하고 동일한 조건에서 배양하였다. 배양을 완료한 후 상등액을 취하여 분비된 TNF-α(tumor necrosis factor alpha), IL-6(interleukin-6)의 양을 효소면역분석법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)으로 측정하였다. 도 6은 사람 단핵세포주인 THP-1 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-6)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다. 도 6에서 보이는 바와 같이 THP-1 세포에서도 Raw264.7 세포의 경우와 마찬가지로 TNF-α 및 IL-6의 발현량이 처리한 NAO의 농도에 의존적으로 증가하였다. 이러한 결과로부터 NAO가 다양한 동물에서 면역기능 증진 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.
6-2. 수지상 세포에서의 면역활성 확인
6-2-1. 수지상 세포에서의 면역기능 증진 효과 확인
포유류의 면역체계를 담당하며 항원을 포획하고 이것을 표면에 제시하여 다른 면역세포의 활성을 돕는 능력이 가장 뛰어난 것으로 알려져 있는 수지상 세포를 이용하여 DagA 효소반응 산물의 면역기능 증진 효과를 확인하였다.
마우스 골수 단핵 세포로부터 얻은 수지상 세포를 약 6일간 배양한 후에 실험에 사용하였다. 배양 배지로는 RPMI 1640에 10% FBS, 1% streptomycin/penicillin 및 20ng/㎖ GM-CSF(granulocyte-macrophage stimulating factor)를 첨가한 것을 사용하였고, 37℃의 온도 조건 및 5% CO2 조건을 가진 배양기에서 세포를 배양하였다.
수지상 세포를 12 well culture plate에 약 2×105 cells/well로 분주하고, culture plate의 각 well에 NAO를 0.01㎎/㎖, 0.05㎎/㎖, 0.1㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 1, 2㎎/㎖의 농도로 처리하고, 37℃의 온도 조건 및 5% CO2 농도 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 표면단백질인자(surface molecule; CD80, CD86, MHC class I, MHC class II)의 발현량을 확인하였다.
또한, 수지상 세포에 NAO를 각각 0.025㎎/㎖, 0.1㎎/㎖, 0.25㎎/㎖, 1㎎/㎖, 2.5㎎/㎖의 농도로 처리하고 배양한 후, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70의 발현량을 확인하였다.
또한, 수지상 세포에 NAO와 NAO 구성성분인 DP2, DP4, DP6를 각각 2㎎/㎖의 농도로 처리하고 배양한 후, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70의 발현량을 비교하였다.
또한, NAO와의 비교를 위해, 양성대조군으로 NAO 대신 LPS(lipopolysaccharide)를 50ng/㎖의 농도로 첨가하고 동일한 조건에서 배양하였고, 음성대조군으로 수지상 세포에 아무것도 처리하지 않고 동일한 조건에서 배양하였다.
도 7은 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다. 또한, 도 8은 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70)의 발현량을 DagA 효소반응 산물의 구성성분 처리군(DP2, DP4, DP6 처리)과 비교한 그래프이다. 또한, 도 9는 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 수지상 세포 활성화 지표인 표면단백질인자(CD80, CD86, MHC class I, MHC class II)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다. 또한, 도 10은 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 세포사멸 여부를 Annexin V-FITC와 propidium iodide(PI)를 이용하여 분석하고, 이를 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다.
도 7에서 보이는 바와 같이 수지상 세포에 처리한 NAO의 농도가 증가할수록 사이토카인의 발현량이 증가하는 것으로 나타났고, 도 8에서 보이는 바와 같이 수지상 세포에 NAO 및 NAO의 구성성분인 DP2, DP4, DP6를 동일한 양으로 처리하는 경우 NAO 처리군에서 사이토카인 발현량이 가장 증가하였으며, 도 9에서 보이는 바와 같이 표면단백질인자의 발현량도 NAO의 처리 농도에 의존적으로 증가하였다. 이러한 결과는 NAO가 면역기능 증진 효과를 나타낸다는 것을 의미하며, 다양한 네오아가로올리고당의 조합에 의해 면역기능 증진 효과가 극대화되는 것으로 판단된다. 또한, 도 10에서 보이는 바와 같이 NAO를 2.5㎎/㎖의 농도로 수지상 세포에 처리하는 경우에도 세포사멸은 전혀 발생하지 않았다[도 10의 각 그래프에서 상부우측 구역이 세포사멸 구역에 해당하며, 그 구역에서 점(dot)의 분포가 많아질수록 세포사멸이 발생했다고 할 수 있다].
6-2-2. TLR2-/-, TLR4-/-, TLR9-/- 마우스 유래 수지상 세포에서의 면역기능 증진 효과 비교
WT(Wild Type) 마우스, TLR2-/- 마우스, TLR4-/- 마우스, TLR9-/- 마우스에서 얻은 수지상 세포 각각에 NAO를 2.5㎎/㎖의 농도로 처리하고 37℃의 온도 조건 및 5% CO2 농도 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 표면단백질인자(surface molecule; CD80, CD86)의 발현량을 확인하였다.
또한, 상기 수지상 세포 각각에 NAO를 0.5㎎/㎖, 2.5㎎/㎖의 농도로 처리하고 37℃의 온도 조건 및 5% CO2 농도 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, TNF-α, IL-1β, IL-10, IL-12p70의 발현량을 확인하였다.
또한, NAO와의 비교를 위해, 양성대조군으로 NAO 대신 LPS(lipopolysaccharide)를 50ng/㎖의 농도로 첨가하고 동일한 조건에서 배양하였고, 음성대조군으로 수지상 세포에 아무것도 처리하지 않고 동일한 조건에서 배양하였다.
도 11은 WT 마우스, TLR2-/- 마우스, TLR4-/- 마우스, TLR9-/- 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 사이토카인(TNF-α, IL-12p70, IL-1β, IL-10, IL-12p70)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다. 또한, 도 12는 WT 마우스, TLR2-/- 마우스, TLR4-/- 마우스, TLR9-/- 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리 시 수지상 세포 활성화 지표인 표면단백질인자(CD80, CD86)의 발현량을 대조군(LPS 처리)과 비교한 그래프이다. 도 11에서 보이는 바와 같이 WT 마우스, TLR2-/- 마우스, TLR9-/- 마우스 유래 수지상 세포에 NAO를 처리하였을 때 사이토카인의 발현량이 증가하나, TLR4-/- 마우스 유래 수지상 세포에 NAO를 처리한 경우에는 대조군(LPS 처리)과 비슷한 양상으로 사이토카인의 발현량이 줄어들었다. 또한, 도 12에서 보이는 바와 같이 WT 마우스, TLR2-/- 마우스, TLR9-/- 마우스 유래 수지상 세포에 NAO를 처리하였을 때 표면단백질인자의 발현량이 증가하나, TLR4-/- 마우스 유래 수지상 세포에 NAO를 처리한 경우에는 대조군(LPS 처리)와 비슷한 양상으로 표면단백질인자의 발현량이 줄어들었다. 이때, LPS는 TLR4(Toll-like receptor-4)를 경유하는 물질로 알려져 있다. 예를 들어, LPS가 TRL4에 결합하면 세포 내 신호체계를 촉진하고 다량의 사이토카인을 생성시킨다.
6-2-3. TLR4-/- 마우스 유래 수지상 세포에서의 면역증진 신호전달기구 확인
TLR4-/- 마우스로부터 얻은 수지상 세포에 NAO를 1㎎/㎖의 농도로 0분, 10분, 20분, 30분, 60분 처리하고 각각의 시료로부터 얻은 단백질에 대해 웨스턴 블롯(western blot)을 실시하여 ERK, JNK, p38, AKT, p65의 인산화 여부를 분석하였다.
도 13은 WT 마우스, TLR4-/- 마우스 유래 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 소정의 시간별로 처리한 후 웨스턴 블롯(western blot) 방법으로 신호전달기구를 확인한 결과이다. 도 13에서 보이는 바와 같이 WT 마우스 유래 수지상 세포에 NAO를 처리하면 TLR4의 하위신호전달기구인 ERK, p38, JNK, AKT가 인산화되고 세포 기질 내 p65의 양은 핵 내부로 들어가기 때문에 줄어든 것에 반해, TLR4 결손 수지상 세포의 경우 NAO 처리에 따른 인산화 정도에 차이가 없었다.
6-3. 유방암 세포 성장 억제효과 확인
6주령된 Balb/c female mouse의 지방체(fat pad)에 마우스 유방암 세포주 4T-1을 2×105 cell의 양으로 주사하였다. 유방암 세포주를 주사한 후 종양이 형성된 2일부터 대조군에는 생리식염수를, 실험군에는 NAO를 각각 500 ㎎/㎏ 또는 1000 ㎎/㎏의 용량으로 매일 경구 투여하였다. 유방암 세포주를 주사한 후 5일부터 매일 종양의 크기를 측정하였다. 도 14는 Balb/c 마우스에 유방암 세포인 4T-1을 이종이식한 후 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 투여하였을 때 암 세포 성장 억제 효과를 대조군(생리식염수 투여)과 비교한 그래프이다. 도 14에서 보이는 바와 같이 NAO는 농도 의존적으로 유방암 세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다.
6-4. 피부암 세포 성장 억제효과 확인
6주령된 C57bl/6 마우스를 군당 10마리로 나눈 후, 대조군에는 PBS(phosphate buffered saline) 용액을, 나머지 실험군에는 NAO 또는 표준시료인 β-glucan(큐젠바이오텍)을 처리한 후 암 세포를 이식하고 시간에 따른 종양의 크기를 관찰하였다. 구체적으로, 실험군에는 NAO를 500 ㎎/㎏의 용량으로 또는 β-glucan을 25 ㎎/㎏의 용량으로 이틀에 한번 씩 총 9회에 걸쳐 마우스의 복강에 주사하였으며, 약물을 마우스의 복강에 4회째 주사할 때 마우스의 피하에 B16F1 melanoma tumor cell을 4×104 cell의 양으로 이식하였다. 암 세포를 이식한 후 10일부터 종양의 크기를 측정하였다. 도 15는 피부암 세포 동물모델(B16F1 melanoma tumor model)에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리하였을 때의 항암 효과를 대조군(PBS 처리) 또는 표준시료군(β-glucan 처리)과 비교한 그래프이다. 도 15에서 보이는 바와 같이 NAO를 처리한 군에서 종양의 크기가 대조군(PBS 처리) 및 표준시료 처리군(β-glucan 처리)에 비해 크게 줄어들었다.
6-5.
이식편대
숙주치사
측정법(
Graft
-
versus
-
host
mortality
assay
)
Balb/c mouse를 각 군당 8마리씩 5개군으로 나누고 마우스에 salmonella 주입 및 약물 주사를 수행한 후 생존율을 계산하였다. 구체적으로 1군에는 PBS(phosphate buffered saline) 용액을 3일간 매일 아침 1회 복강 주사한 다음, salmonella를 주입하고, 다시 PBS 용액을 7일간 매일 아침 1회 복강 주사하였다. 2군에는 표준시료인 β-glucan(큐젠바이오텍)을 50 ㎎/㎏의 용량으로 3일간 매일 아침 1회 복강 주사한 다음, salmonella를 주입하고, 다시 β-glucan을 50 ㎎/㎏의 용량으로 7일간 매일 아침 1회 복강 주사하였다. 3군에는 아가로올리고당(Agarooligosaccharide, AO; Takara Bio Inc., JP)을 50 ㎎/㎏의 용량으로 3일간 매일 아침 1회 복강 주사한 다음, salmonella를 주입하고, 다시 아가로올리고당을 50 ㎎/㎏의 용량으로 7일간 매일 아침 1회 복강 주사하였다. 4군에는 NAO을 50 ㎎/㎏의 용량으로 3일간 매일 아침 1회 복강 주사한 다음, salmonella를 주입하고, 다시 NAO을 50 ㎎/㎏의 용량으로 7일간 매일 아침 1회 복강 주사하였다. 5군에는 NAO을 50 ㎎/㎏의 용량으로 5일간 매일 아침 1회 복강 주사한 다음, salmonella를 주입하고, 다시 NAO을 50 ㎎/㎏의 용량으로 7일간 매일 아침 1회 복강 주사하였다. 도 16은 Balb/c mouse에 salmonella를 주입하고 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 주사한 군에서의 생존율을 대조군(PBS 처리, AO 처리) 및 표준시료군(β-glucan 처리)과 비교한 그래프이다. 도 16에서 보이는 바와 같이 NAO를 처리한 군에서 다른 군에 비해 salmonella 숫자가 감소하였고, 특히 salmonella를 주입하기 전에 5일 동안 NAO를 주사한 군에서는 매우 높은 생존율을 보였다. 즉, NAO는 병원균이 감염된 실험동물의 수명을 연장하는 효과를 나타내었다.
6-6. 복강 세포 내
NK
세포 활성화 능력 확인
6-6-1. DP6의 복강 세포 내 NK 세포 활성화 능력 확인
6~8주령 C57bl/6 마우스를 군별로 3마리씩 나누고, 대조군의 마우스 복강에 PBS(phosphate buffered saline) 용액을 주사하고, 실험군의 마우스 복강에 실시예 5에서 정제하여 수득한 DP6을 500 ㎎/㎏의 용량으로 주사하였다. 약물 주사 후 24시간이 경과하였을 때 주사기로 PBS(phosphate buffered saline) 용액 10㎖를 대조군과 실험군의 마우스 복강에 주입하고 다시 꺼내는 방식으로 복강 세포를 얻었다. 이후, 2×106 cell에 해당하는 복강세포 시료를 NK1.1과 CD69로 형광염색한 후 유세포 분석(Flow cytometry) 기법을 이용하여 NK1.1+/CD69+ 세포의 수를 분석하였다.
도 17은 C57bl/6 마우스의 복강에 실시예 5에서 정제하여 수득한 DP6을 주사하였을 때 복강 세포 중 활성화된 NK 세포의 발현량을 대조군(PBS 용액 주사)과 비교한 그래프이다. 도 17에서 보이는 바와 같이 DP6 처리군의 경우 복강 세포 내 NK 세포 중에서 활성화 지표인 CD69+ 세포의 비율이 약 9.5%이었고 이는 대조군보다 약 4배 정도 높은 수치이다. 즉, DP6를 복강주사 하는 경우 암세포를 공격할 수 있는 활성화된 NK 세포 수가 증가하였다.
6-6-2. C57bl/6 마우스의 비장 유래 면역세포 활성화 능력 확인(직접적 면역증강 효능 확인)
C57bl/6 마우스의 비장으로부터 MACS bead를 이용하여 NK 세포와 NK 세포 이외의 면역세포(monocyte, macrophage, dendritic cell, helper T cell, cytotoxic T cell 등)만을 분리한 다음 2×105개의 NK 세포와 비 NK 세포 각각에 NAO를 0.1 ㎎/㎖, 0.5 ㎎/㎖, 2.5 ㎎/㎖의 농도로 처리하고, 37℃의 온도 조건 및 5% CO2 농도 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 모아 NK1.1과 CD69로 형광염색한 후 유세포 분석(Flow cytometry) 기법을 이용하여 CD69+ 세포의 수를 분석하였다. 도 18은 C57bl/6 마우스의 비장에서 분리된 NK 세포와 NK 세포 이외의 면역세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리하였을 때 활성화된 세포의 양을 나타낸 그래프이다. 도 18에서 보이는 바와 활성화된 NK 세포 수 및 활성화된 비 NK 세포 수는 NAO의 농도에 의존적으로 증가하였다.
6-6-3. 수지상 세포에 처리한 NAO의 면역세포 활성화 능력 확인 (간접적 면역증강 효능 확인)
마우스 골수 단핵세포로부터 얻은 수지상 세포를 6일간 배양한 후, 여기에 NAO를 각각 0.1 ㎎/㎖, 0.5 ㎎/㎖, 2.5 ㎎/㎖의 농도로 처리하고, 37℃의 온도 조건 및 5% CO2 농도 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. C57bl/6 마우스의 비장으로부터 MACS bead를 이용하여 NK 세포와 NK 세포 이외의 면역세포(monocyte, macrophage, dendritic cell, helper T cell, cytotoxic T cell 등)만을 분리한 다음 2×105개의 NK 세포와 비 NK 세포 각각에 수지상 세포 배양액으로부터 얻은 상등액을 처리하고, 37℃의 온도 조건 및 5% CO2 농도 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 모아 NK1.1과 CD69로 형광염색한 후 유세포 분석(Flow cytometry) 기법을 이용하여 CD69+ 세포의 수를 분석하였다. 도 19는 수지상 세포에 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 처리한 뒤 얻은 상등액을 C57bl/6 마우스의 비장에서 분리된 NK 세포와 NK 세포 이외의 면역세포에 처리하였을 때 활성화된 세포의 양을 나타낸 그래프이다. 도 19에서 보이는 바와 활성화된 NK 세포 수 및 활성화된 비 NK 세포 수는 수지상 세포에 처리한 NAO의 농도에 의존적으로 증가하였다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 특정 실시 형태로 국한되는 것이 아니며, 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> DyneBio Inc.
<120> Composition for enhancing immune function or anticancer effect
comrising neoagarooligosaccharide
<130> DP-16-164
<150> KR 10-2013-0112706
<151> 2013-09-23
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 930
<212> DNA
<213> DagA gene derived from Streptomyces coelicolor A3(2)
<400> 1
gtggtcaacc gacgtgatct catcaagtgg agtgccgtcg cactcggagc gggtgcgggg 60
ctcgcgggtc ccgcacccgc cgctcatgcc gcagacctcg aatgggaaca gtaccccgtg 120
ccggccgccc ctggcggaaa caggtcctgg cagcttctcc ccagccattc ggacgacttc 180
aactacaccg gcaagcctca aaccttcagg ggcagatggc tggaccagca caaggatggc 240
tggtcgggcc cggccaacag cctctacagt gcgcgccatt cctgggtggc tgacggaaat 300
ctcatcgtcg agggccgcag ggcgccggac gggagggtct actgcggcta cgtgacctcc 360
cgcaccccag tcgagtaccc tctctatacc gaagtactca tgcgtgtgag cgggctgaag 420
ctctcatcga atttctggct cctgagcaga gacgacgtca acgagattga cgtgatcgaa 480
tgctacggca acgagtcatt gcacggaaag cacatgaaca ccgcctacca catattccag 540
cggaacccct tcactgaact ggcgagaagc cagaaggggt atttcgcaga tgggagctac 600
gggtacaatg gtgagactgg gcaggtgttt ggggacggcg ccgggcaacc tcttcttcgg 660
aatggattcc accgctacgg cgtgcactgg ataagcgcca ccgaattcga tttctacttc 720
aacggcaggt tggtgcgccg gctgaaccgg tcgaacgacc tcagggaccc ccggagccgg 780
ttcttcgacc agccaatgca tctgatcctc aacaccgaga gtcatcagtg gcgcgtcgac 840
cgaggtatcg aacccacgga cgcggaactc gcagacccca gcatcaacaa catctactac 900
cgctgggtca ggacgtatca ggccgtgtag 930
<210> 2
<211> 309
<212> PRT
<213> DagA enzyme derived from Streptomyces coelicolor A3(2)
<400> 2
Met Val Asn Arg Arg Asp Leu Ile Lys Trp Ser Ala Val Ala Leu Gly
1 5 10 15
Ala Gly Ala Gly Leu Ala Gly Pro Ala Pro Ala Ala His Ala Ala Asp
20 25 30
Leu Glu Trp Glu Gln Tyr Pro Val Pro Ala Ala Pro Gly Gly Asn Arg
35 40 45
Ser Trp Gln Leu Leu Pro Ser His Ser Asp Asp Phe Asn Tyr Thr Gly
50 55 60
Lys Pro Gln Thr Phe Arg Gly Arg Trp Leu Asp Gln His Lys Asp Gly
65 70 75 80
Trp Ser Gly Pro Ala Asn Ser Leu Tyr Ser Ala Arg His Ser Trp Val
85 90 95
Ala Asp Gly Asn Leu Ile Val Glu Gly Arg Arg Ala Pro Asp Gly Arg
100 105 110
Val Tyr Cys Gly Tyr Val Thr Ser Arg Thr Pro Val Glu Tyr Pro Leu
115 120 125
Tyr Thr Glu Val Leu Met Arg Val Ser Gly Leu Lys Leu Ser Ser Asn
130 135 140
Phe Trp Leu Leu Ser Arg Asp Asp Val Asn Glu Ile Asp Val Ile Glu
145 150 155 160
Cys Tyr Gly Asn Glu Ser Leu His Gly Lys His Met Asn Thr Ala Tyr
165 170 175
His Ile Phe Gln Arg Asn Pro Phe Thr Glu Leu Ala Arg Ser Gln Lys
180 185 190
Gly Tyr Phe Ala Asp Gly Ser Tyr Gly Tyr Asn Gly Glu Thr Gly Gln
195 200 205
Val Phe Gly Asp Gly Ala Gly Gln Pro Leu Leu Arg Asn Gly Phe His
210 215 220
Arg Tyr Gly Val His Trp Ile Ser Ala Thr Glu Phe Asp Phe Tyr Phe
225 230 235 240
Asn Gly Arg Leu Val Arg Arg Leu Asn Arg Ser Asn Asp Leu Arg Asp
245 250 255
Pro Arg Ser Arg Phe Phe Asp Gln Pro Met His Leu Ile Leu Asn Thr
260 265 270
Glu Ser His Gln Trp Arg Val Asp Arg Gly Ile Glu Pro Thr Asp Ala
275 280 285
Glu Leu Ala Asp Pro Ser Ile Asn Asn Ile Tyr Tyr Arg Trp Val Arg
290 295 300
Thr Tyr Gln Ala Val
305
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for cloning DagA(Asm-F)
<400> 3
gacatatggt ggtcaaccga cgtgatc 27
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for cloning DagA(Asm-R)
<400> 4
ggtggatccc tacacggcct gatacg 26
Claims (20)
- 네오아가로올리고당 또는 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
상기 네오아가로올리고당은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고,
상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
- 제 1항에서 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총 중량을 기준으로 10 중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70 중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 20 내지 50 중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
- 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
상기 효소반응 산물 또는 이의 정제물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 네오아가로올리고당을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 효소반응 산물 또는 이의 정제물 내 네오아가로올리고당의 함량은 효소반응 산물 또는 이의 정제물 총 중량을 기준으로 45~85 중량%인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 효소반응 산물 또는 이의 정제물은 네오아가로올리고당 총 중량을 기준으로 10 중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70 중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 20 내지 50 중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 효소반응은 35~45℃의 온도 및 6~8의 pH에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스 용액에 DagA를 2~250 unit/㎖의 농도로 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 DagA는 서열번호 2의 31번째부터 309번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
- 네오아가로올리고당 또는 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
상기 네오아가로올리고당은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고,
상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
- 제 11항에서 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
- 제 13항에 있어서, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총 중량을 기준으로 10 중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70 중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 20 내지 50 중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
- 제 11항에 있어서, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
- 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물을 또는 이의 정제물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
상기 효소반응 산물 또는 이의 정제물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 및 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 네오아가로올리고당을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
- 제 15항에 있어서, 상기 효소반응 산물 또는 이의 정제물 내 네오아가로올리고당의 함량은 효소반응 산물 또는 이의 정제물 총 중량을 기준으로 45~85 중량%인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
- 제 15항에 있어서, 상기 효소반응 산물 또는 이의 정제물은 네오아가로올리고당 총 중량을 기준으로 10 중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70 중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 20 내지 50 중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
- 제 15항에 있어서, 상기 효소반응은 35~45℃의 온도 및 6~8의 pH에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
- 제 15항에 있어서, 상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스 용액에 DagA를 2~250 unit/㎖의 농도로 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 DagA는 서열번호 2의 31번째부터 309번째까지의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
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