WO2018080077A1 - 네오아가로올리고당을 포함하는 관절염 또는 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

네오아가로올리고당을 포함하는 관절염 또는 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2018080077A1
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daga
neoagarotetraose
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이제현
김은주
김경운
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다인바이오 주식회사
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01081—Beta-agarase (3.2.1.81)

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing, improving or treating arthritis or osteoporosis, wherein the composition for preventing, improving or treating arthritis or osteoporosis of the present invention is characterized by effectively inhibiting differentiation of mononuclear cells into osteoclasts.
  • Agar is a representative seaweed-derived polysaccharide that has been widely used as food additives, medicines, cosmetics, livestock feed, and industrial raw materials for a long time.
  • Agar is a relatively abundant marine resource with annual output of 2,000 to 5,000 tons. Is one of. However, in actual use, only a part of the total output is simply processed and used as a cheap raw material, and the rest is mostly left, so the added value is very low compared to the amount of resources remaining. Therefore, there is a great demand for research on new application development and value-added improvement of abundant domestic agar.
  • Agar is mostly composed of polysaccharides except for a small amount of protein, ash and fat, and the polysaccharide constituting the agar includes agarose, which is a neutral polysaccharide, and agaropectin, an acidic polysaccharide.
  • Agarose is a unit of agarobiose in which D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose are bound to ⁇ -1,4. Since agarobiose has a linear structure connected repeatedly with ⁇ -1,3 bonds, the gel power is strong.
  • agalopectin like agarose, has agarobiose as a unit, but contains an acidic group such as a sulfate group, and thus has poor gelling power.
  • agarose is decomposed into neoagarobiose via neoagarotetraose by beta-agarase, which acts on ⁇ -1,4 binding, followed by ⁇ -1. It is finally decomposed into D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose by alpha-agarase, which acts on the 3 bond.
  • agarose is decomposed into agarose (neoagarobiose) by dilute acid or alpha-agarase.
  • neoagar oligosaccharides are obtained by hydrolysis of agar or agarose to beta-agarase (neoagarobiose), neoagarotetraose, neoagarohexaose ( It refers to oligosaccharides in which 2-10 monosaccharides are bound, such as neoagarohexaose) and neoagarooctaose.
  • agaro oligosaccharide is obtained by hydrolysis of agar or agarose with dilute acid or alpha-agarase, Aeoagarobiose, Agarotetraose, and Agarohexaose.
  • Agarooctaose (Agarooctaose) and the like refers to oligosaccharides that combine about 2-10 monosaccharides. Neoagaroligosaccharides have 3,6-anhydro-L-galactose as the non-reducing end, whereas agaroligosaccharides have D-galactose as the non-reducing end Due to these structural differences, they may have different properties in terms of physiological activity.
  • actinomycetes Streptomyces coelicolor ) A3 (2) is known to produce agarase that degrades agar in the form of extracellular (secreted out of the cell) protein (Stanier et al., 1942, J. Bacteriol .; Hodgson and Chater, 1981, J. Gen. Microbiol.), This agarase is encoded by the DagA gene. Since the DagA gene is a beta-agarase gene whose function is known only in actinomycetes, the DagA gene has an important position in the study of agarase production through actinomycetes. In particular, Streptomyces silica is the most widely used strain for molecular biological research of actinomycetes. In 2002, the sequence of chromosomal DNA was analyzed by Sanger center in the UK and is now published (Bantley et al., 2002, Nature).
  • Korean Patent No. 10-0794593 discloses Thalassomonas sp. SL-5 (Thalassomonas sp. SL-5) having agar resolution and beta produced by the strain.
  • a method for producing at least one neoagaroligosaccharide selected from the group consisting of neoagarobiose, neoagarotetraose and neoagarohexaose using ⁇ -agarase is disclosed.
  • Korean Patent Publication No. 10-1072503 discloses a genus Glaciecola strain SL-12 KCCM 10945P (Glaciecola sp.
  • SL-12 KCCM 10945P SL-12 KCCM 10945P
  • a beta-agarase ⁇ - produced by the strain.
  • a method for producing at least one neoagar oligosaccharide selected from the group consisting of neoagarobiose, neoagarotetraose and neoagarohexaose using agarase) is disclosed.
  • Korean Patent No. 10-1303839 discloses a beta-agarase isolated from Pseudoalteromonas sp strains and neo-agarotetraose and neo-agarohexaose using the same.
  • a method for producing at least one neoagar oligosaccharide selected from the group consisting of is disclosed.
  • Korean Patent Publication No. 10-1295659 discloses beta-agarase isolated from Saccharophagus sp. Strain and neoagarotetraose and neoagarohexaose using the same.
  • Korean Patent Publication No. 10-1212106 discloses a beta-agarase isolated from Saccharophagus sp.
  • a method of producing neoagarobiose by reacting with at least a substrate is disclosed.
  • Korean Patent Publication No. 10-1206006 discloses flameovirga sp. Mbrc-1 strain KCCM 11151P (Flammeovirga sp.mbrc-1 KCCM 11151P) having agar degrading activity and beta-agarase ( ⁇ ) produced by the strain.
  • a method of preparing at least one neoagar oligosaccharide selected from the group consisting of neoagarobiose, neoagarotetraose, and neoagarohexaose by reacting -agarase) with agar is disclosed.
  • Republic of Korea Patent Publication No. 10-1302655 neoagarotetraose, characterized in that the reaction of agarase (agarose) and agar (agagar) derived from Streptomyces coelicolor (Agarase) Methods of preparing neooagarotetraose and neoagarohexaose are disclosed.
  • 10-1190078 discloses a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 including a promoter of a tryptic gene (sprT) derived from Streptomyces griseus and a signal peptide coding region. DNA fragments shown; And a DNA fragment represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in which a signal peptide code portion is removed from a beta-agarase gene (dagA) derived from Streptomyces coelicolor, which can transform prokaryotes.
  • dagA beta-agarase gene
  • a beta-agarase recombinant expression vector and a method for producing beta-agarase using the same are disclosed.
  • 10-2014-0060045 discloses a method for enzymatic production of neoagarobiose or neoagarotetraose using a novel beta-agarase production gene.
  • Korean Patent Laid-Open No. 10-2009-0044987 discloses a skin lightening composition comprising neoagarotetraose as an active ingredient.
  • the prior art is neo-agar from agar or the like using a new strain mainly containing beta-agarase as a gene, a method for producing beta-agarase through a new strain or recombinant strain or beta-agarase
  • beta-agarase a method for producing beta-agarase through a new strain or recombinant strain or beta-agarase
  • the present invention has been derived under the conventional technical background, and an object of the present invention is to provide a novel food and pharmaceutical use of neoagar oligosaccharides.
  • one embodiment of the present invention is a composition comprising a neoagaro oligosaccharide mixture as an active ingredient, the neoagaro oligosaccharide mixture is neooagarobiose (neoagarobiose), neoagarotetraose (neoagarotetraose) And neoagarohexaose and provide a composition for use in preventing, ameliorating or treating arthritis or osteoporosis caused or advanced by the differentiation of monocytes into osteoclasts.
  • another example of the present invention is an enzyme reaction product of DagA which is a beta-agarase derived from Streptomyces coelicolor and a substrate selected from Agar or Agarose.
  • a composition comprising a purified product as an active ingredient, wherein the enzymatic reaction product or purified product thereof includes neoagarobiose, neoagarotetraose, and neoagarohexaose, and mononuclear
  • compositions for use in preventing, ameliorating or treating arthritis or osteoporosis caused or advanced by the differentiation of cells into osteoclasts are provided.
  • Neo-agaroligosaccharide mixtures and the like as an active ingredient of the composition according to the present invention can reduce the expression of osteoclast inducer RANKL and effectively inhibit the differentiation of monocytes into osteoclasts. Therefore, the composition according to the present invention can be used as a medicine or a functional food for preventing, ameliorating or treating arthritis (particularly rheumatoid arthritis) or osteoporosis.
  • the active ingredient of the composition according to the present invention is readily available substrates such as agar (Agar) or agarose (Agarose) and Streptomyces ( Streptomyces) coelicolor ) can be produced at a relatively low cost because it can be obtained through an enzyme reaction with DagA, a beta-agarase derived from coelicolor , and can be easily consumed by anyone since there are no side effects.
  • substrates such as agar (Agar) or agarose (Agarose) and Streptomyces ( Streptomyces) coelicolor
  • 1 is a cleavage map of the pUWL201pw vector used for cloning the DagA gene in the present invention.
  • FIG. 2 is a cleavage map of a recombinant vector having a DagA gene introduced into a pUWL201pw vector.
  • Figure 3 is a graph showing the results of the HPLC-ELSD analysis of the partially purified DagA enzyme reaction product obtained in Example 3 of the present invention.
  • Figure 4 shows the effect of neoagaro oligosaccharide mixture (NAO) on the expression of osteoclast inducer RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) in synovial cells of rheumatoid arthritis patients.
  • NAO neoagaro oligosaccharide mixture
  • Figure 5 shows the effect of neo-agaro oligosaccharide mixture (NAO) on the expression of the inflammatory cytokine IL-6 in synovial cells of patients with rheumatoid arthritis.
  • NAO neo-agaro oligosaccharide mixture
  • Figure 6 shows the effect of neoagar oligosaccharide mixture (NAO) on differentiation into osteoclasts under the conditions of inducing differentiation of peripheral blood mononuclear cells into osteoclasts.
  • NAO neoagar oligosaccharide mixture
  • Figure 7 shows the effect of neoagaroligosaccharide mixture (NAO) on the expression of osteoclast differentiation markers in the condition of inducing differentiation of peripheral blood mononuclear cells into osteoclasts.
  • NAO neoagaroligosaccharide mixture
  • the terms “pharmaceutically acceptable” and “food acceptable” mean that they do not significantly irritate the organism and do not inhibit the biological activity and properties of the administered active substance.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the progression of a particular disease by administration of a composition of the present invention.
  • improvement refers to any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, for example, the extent of symptoms.
  • treatment means any action that improves or beneficially alters the symptoms of a particular disease by administration of a composition of the present invention.
  • the term "administration" means providing a subject with a composition of the present invention in any suitable manner.
  • the subject refers to all animals, such as humans, monkeys, dogs, goats, pigs or mice having a disease that can improve the symptoms of a particular disease by administering the composition of the present invention.
  • the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit or risk ratio applicable to medical treatment, which means the type of disease, the severity, the activity of the drug, the drug Sensitivity to, time of administration, route of administration and rate of administration, duration of treatment, factors including drug used concurrently, and other factors well known in the medical arts.
  • a composition for preventing, improving or treating arthritis or osteoporosis includes a neoagar oligosaccharide mixture as an active ingredient.
  • the neoagar oligosaccharide mixture includes neoagarobiose, neoagarotetraose and neoagarohexaose.
  • the neoagaro oligosaccharide mixture is 1 to 10% by weight of neoagarobiose (neoagarobiose), neoagarotetraose (neoagarotetraose) 55 ⁇ based on the total weight of the neoagaro oligosaccharide mixture It is preferable to include 75% by weight and 20 to 40% by weight of neoagarohexaose, 2 to 4% by weight of neooagarobiose, 65 to 70% by weight of neoagarotetraose And it is more preferable to include 25 to 30% by weight of neoagarohexaose (neoagarohexaose).
  • the neoagar oligosaccharide mixture may be an enzymatic reaction product or purified product thereof of DagA, a beta-agarase derived from Streptomyces coelicolor , with a substrate selected from Agar or Agarose. .
  • the method for obtaining a neoagar oligosaccharide mixture through the enzymatic reaction between the substrate and DagA is described in detail later.
  • a composition for preventing, improving or treating arthritis or osteoporosis is a substrate selected from Agar or Agarose and DagA, a beta-agarase derived from Streptomyces coelicolor .
  • Enzyme reaction products or purified products thereof are included as an active ingredient.
  • the enzymatic reaction product or purified product includes neoagarobiose, neoagarotetraose, and neoagarohexaose.
  • the enzymatic reaction product or purified product is 1 to 10% by weight of neoagarobiose (neoagarobiose), 55 to 75% by weight of neoagarotetraose and neoagarohexa based on the total weight of neoagaroligosaccharides It is preferable to include 20 to 40% by weight of the (neoagarohexaose), 2 to 4% by weight of neooagarobiose, 65 to 70% by weight of neooagarotetraose and neoagarohexaose (neoagarohexaose) More preferably 25 to 30% by weight.
  • the enzyme reaction is preferably made at a temperature of 35 ⁇ 45 °C and 6 ⁇ 8 pH.
  • the enzyme reaction is a concentration of 2 ⁇ 250 unit / ml, preferably 10 ⁇ 150 unit / ml DagA in 0.5 to 5% (w / v) agar or agarose solution, more preferably 10 It is preferable to add at a concentration of ⁇ 100 unit / ml.
  • 1 unit representing the activity of the enzyme was reacted with 3.9 ml of 50 mM PBS solution (pH 7) in which agarose was dissolved at a concentration of 0.2% (w / v) at 40 ° C. for 5 minutes (reaction solution 4 ml).
  • DNS reagent prepared by dissolving 6.5 g of dinitrosalicylic acid, 325 ml of 2M NaOH and 45 ml of glycerol in 1 l of distilled water
  • Absorbance at 540 nm when absorbance was measured at 540 nm It is defined as the amount of enzyme that produces 0.001.
  • DagA derived from Streptomyces coelicolor in the present invention means a protein having an amino acid sequence of between 31 and 309 of SEQ ID NO: 2, a protein or function produced from a Streptomyces coelicolor or from a heterologous strain
  • the recombinant gene according to a conventional genetic recombination method, i.e., including a labeled amino acid to favor purification or altering an amino acid sequence for heterologous expression, to the extent that it is not changed to anything else or loses agarase activity.
  • DagA is originally produced with a 309 amino acids of SEQ ID NO: 2 and a molecular weight of about 35 kDa when translated from the beta-agarase gene of Streptomyces cyricolor, and the N-terminal 30 amino acid signal peptide is cut off. Secreted in the state of extracellular protein (about 32 kDa).
  • DagA of Streptomyces siricolor The gene may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 is a nucleotide sequence of a gene present in the genome of Streptomyces syphila A3 (2), and is named "SCO3471" on the NCBI database.
  • DagA As confirmed by in vitro experiments, transcription of the DagA gene is regulated by four or five different promoters recognized by at least three other homolozymes of RNA polymerase. DagA Transcriptional analysis of the gene showed that transcription of DagA was initiated at the top 32, 77, 125 and 220 bases of the coding sequence.
  • DagA used in the present invention through culturing of the original DagA producing strain of Streptomyces series of color
  • two kinds of strains of Streptomyces Libby residence in order to increase the production efficiency (Streptomyces lividans ) is preferably used.
  • a recombinant vector may be prepared, and then, DagA may be produced by transforming Streptomyces redundancy with the recombinant vector and culturing the transformant.
  • the recombinant vector is preferably configured so that transcription of the DagA gene can be regulated by a actinomycetes-derived promoter.
  • Actinomycetes-derived promoters include a variety of promoters, such as the sgtR promoter (sgtRp), the ermE promoter (ermEp), and the tipA promoter (tipAp), so that they can be selected and used when preparing recombinant vectors.
  • sgtRp sgtR promoter
  • ermEp ermE promoter
  • tipAp tipA promoter
  • DagA-producing strains such as transformants, can be cultured in a liquid medium to produce DagA, and a high-purity DagA can be produced using conventional protein purification methods such as ultrafiltration. At this time, if agar or agarose is included in the liquid medium, DagA can be more efficiently produced.
  • the produced DagA is added to a substrate solution such as agar or agarose and reacted at specific temperature and pH conditions to obtain an enzymatic reaction product used as an active ingredient in the composition according to the present invention.
  • the enzymatic reaction product may be partially purified by ultrafiltration or fractionated by gel filtration chromatography to obtain a purified product of the enzymatic reaction product.
  • Neo-agaroligosaccharide mixtures and the like as an active ingredient of the composition according to the present invention reduces the expression of osteoclast inducer RANKL or inflammatory cytokine IL-6 and effectively inhibits the differentiation of monocytes into osteoclasts.
  • Osteoclasts are multinucleated large cells having functions of destruction and absorption of bone tissue, and are known to be involved in arthritis or osteoporosis. Bone tissue is a dynamic organ in which bone formation by osteoblasts and bone resorption by osteoclasts are repeated and maintained.As the differentiation of monocytes into osteoclasts increases the absorption, rather than the production of bone. Arthritis) or osteoporosis develops or progresses.
  • the neoagaroligosaccharide mixture, etc. which is an active ingredient of the composition according to the present invention, may be used as a material for preventing, improving or treating arthritis (particularly, rheumatoid arthritis) or osteoporosis.
  • the composition according to the present invention may be embodied as a pharmaceutical composition, a food additive, a food composition (particularly a functional food) or a feed additive, etc. according to the purpose or aspect of use, and the content of the active ingredient in the composition may also be used in the specific form of the composition. It may be adjusted in various ranges according to the purpose or aspect.
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical composition is not greatly limited, for example, 0.1 to 99% by weight based on the total weight of the composition, Preferably it may be 0.5 to 50% by weight, more preferably 1 to 30% by weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an additive such as a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the active ingredient.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain one or more known active ingredients having the effect of preventing, improving or treating arthritis or osteoporosis in addition to neoagar oligosaccharides.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a formulation for oral administration or a parenteral administration by a conventional method, and when formulated, such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. Diluents or excipients may be used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may comprise at least one excipient such as starch, calcium carbonate, water Can be prepared by mixing cross (Lucose), lactose (Lactose) or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents, water and liquid paraffin. have.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally to mammals including humans according to a desired method, and parenteral administration methods include external skin, intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, muscle Intra-injection or intrathoracic injection;
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically effective amount, and the range thereof depends on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, excretion rate and severity of the disease. Varies.
  • Conventional daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not significantly limited, for example, it is preferably 0.1 to 1000 mg / kg, preferably 1 to 500 mg / kg based on the complex extract as an active ingredient More preferably, it may be administered once or several times a day.
  • the content of the active ingredient in the food composition is not particularly limited, and 0.01 to 50% by weight based on the total weight of the composition, preferably It may be 0.1 to 25% by weight, more preferably 0.5 to 10% by weight.
  • the food composition of the present invention includes the form of pills, powders, granules, acupuncture, tablets, capsules, or liquids, and examples of specific foods include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionary, pizza, ramen, Other noodles, gums, dairy products, including ice cream, various soups, beverages, tea, functional water, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all of the health food in the usual sense.
  • the food composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients.
  • the food composition of the present invention is a variety of nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols And carbonation agents used in carbonated beverages.
  • the food composition of the present invention may contain a flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. These components can be used independently or in combination.
  • the above-mentioned natural carbohydrates are glucose, monosaccharides such as fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • natural flavoring agents such as taumartin, stevia extract, synthetic flavoring agents such as saccharin, aspartame, etc. may be used.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for preventing, ameliorating or treating arthritis or osteoporosis by administering an effective amount of a neoagaroligosaccharide mixture to a subject in need.
  • the present invention also provides a method for preventing, ameliorating or treating arthritis or osteoporosis by administering an effective amount of a composition comprising a neoagar oligosaccharide mixture to a subject in need.
  • the present invention is an enzyme reaction product of DagA, a beta-agarase derived from Streptomyces coelicolor , with a substrate selected from Agar or Agarose in a subject in need thereof.
  • a method of preventing, ameliorating or treating arthritis or osteoporosis is provided by administering an effective amount of a tablet.
  • the present invention provides a subject selected from agar (Agar) or agarose (Agarose) and the enzymatic reaction product or purified product thereof with DagA, a beta-agarase derived from Streptomyces coelicolor
  • a composition comprising the composition.
  • the chromosomal DNA of Streptomyces Sicala A3 (2) was used as a template, and the polymerase chain reaction (PCR) was performed using the following primer and Ex-Taq (TAKARA) polymerase.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a gene fragment (a 947 bp long fragment encoding the signal peptide and the finished peptide of DagA, corresponding to a state in which a partial sequence of a primer was connected to both ends of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) was obtained.
  • the DagA gene was cloned into the pUWL201pw vector of FIG. 1 using the restriction enzyme site (NdeI / BamHI) of the amplified DagA gene fragment to prepare a recombinant vector of FIG. 2.
  • transcription of the DagA gene is regulated by the ermE promoter.
  • the recombinant strain producing the recombinant strain by transforming a Streptomyces Libby residence (Streptomyces lividans) TK24 strains, and a recombinant vector of Figure 2 was used for the production of DagA.
  • the recombinant strain was inoculated in R2YE liquid medium containing 0.3% (w / v) agar (agar) and pre-incubated for about 60 hours at a temperature of 28 °C and stirring conditions of 120rpm. After the entire incubation process, the culture was performed for about 60 hours. The culture solution obtained through the culture was centrifuged to remove the cells, and the supernatant was separated and purified by filtration with an ultrafiltration membrane (5kDa cut-off membrane). The enzyme concentrate that failed to pass through the filtration membrane was lyophilized to solidify and used for subsequent experiments while storing the solidified DagA enzyme.
  • the agarase activity of the DagA enzyme obtained in Example 1 was measured by the reduction equivalent assay method (DNS method).
  • DBS phosphate buffered saline
  • PBS phosphate buffered saline
  • PBS phosphate buffered saline
  • pH 7 After mixing 3.9 ml and reacting at 40 ° C.
  • DNS reagent prepared by dissolving 6.5 g of dinitrosalicylic acid, 325 ml of 2M NaOH and 45 ml of glycerol in 1 L of distilled water
  • Boil for minutes and let cool, and absorbance was measured at 540 nm.
  • Enzyme 1U (Unit) was defined as activity with an absorbance of 0.001 at 540 nm.
  • the DagA enzymatic reaction product which passed through the filtration membrane was lyophilized and solidified, and the solidified DagA enzymatic reaction product was stored and used in subsequent experiments. The procedure was repeated to obtain partially purified enzymatic products corresponding to four batches.
  • Example 4 HPLC - ELSD Through analysis DagA Of enzymatic reaction products Neo-Agaroligosaccharides Check composition
  • HPLC-ELSD analysis conditions are as follows.
  • Figure 3 is a graph showing the results of the HPLC-ELSD analysis of the partially purified DagA enzyme reaction product obtained in Example 3.
  • the four peak graphs shown in FIG. 3 correspond to the partially purified enzymatic products obtained in each of four batches.
  • the area (%) in the table in FIG. 3 represents the area of the peak corresponding to each neoagar oligosaccharide as a percentage of the total peak area and can be interpreted to mean the same as the weight% in the art. As shown in FIG.
  • the DagA enzymatic reaction products are mainly composed of neoagarobiose (neoagarobiose, hereinafter referred to as 'DP2'), neoagarotetraose (neoagarotetraose, hereinafter referred to as 'DP4') and neoagarohexaose ( neoagarohexaose, hereinafter referred to as 'DP6').
  • the content of neoagaroligosaccharide in the DagA enzymatic product was found to be about 65 ⁇ 5% by weight based on the total weight of solids (including components not detected in HPLC-ELSD analysis).
  • the content of neoagaroligosaccharides in the DagA enzymatic product may be 65 ⁇ 20% by weight based on the total weight of solids.
  • the contents of DP2, DP4 and DP6 in the DagA enzymatic reaction products were 2 to 4% by weight, 65 to 70% by weight and 25 to 30% by weight, respectively, based on the total weight of neoagaroligosaccharides in which DP2, DP4 and DP6 were combined
  • the content may be selected in various ranges depending on the enzyme reaction conditions.
  • the contents of DP2, DP4, and DP6 in the DagA enzymatic products are 1-10% by weight, 55-75% by weight, and 20-%, respectively, based on the total weight of neoagaroligosaccharides combined with DP2, DP4, and DP6. 40 weight percent.
  • the partially purified enzymatic reaction product obtained in Example 3 was subjected to neo-agar hexa through gel permeation chromatography (GPC; product name: BioGel P-2 gel, Biorad, Cat.No .: 150-4115). It was isolated and purified with oose (neoagarohexaose, DP6), neoagarotetraose (neoagarotetraose (DP4) and neoagarobiose (DP2). The purified products were then lyophilized to solidify, and the solidified DagA enzymatic purified product was used for later experiments. Purity of the purified products DP2, DP4 and DP6 was confirmed by TLC and HPLC was about 85% (w / w) level.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS Fetal bovine serum
  • Blood was mixed with PBS (Phosphate-Buffered Saline) solution in a volume ratio of 1: 1 to prepare a blood buffer. Then, Ficoll is slowly floated on the tube containing the blood buffer so that the Picol layer is not disturbed (the weight ratio of Picol to blood buffer is 1: 4), and then centrifuged at 2000 rpm for 30 minutes to provide a buffer coat. Only layers were collected. Thereafter, the collected buffer coat layer was placed in a new tube and washed with PBS to obtain peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Thereafter, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were inoculated in 48-well plates at an amount of 5 ⁇ 10 5 per well and incubated.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • M-CSF and IL-17 were stimulated to induce differentiation of peripheral blood mononuclear cells into osteoclasts and the partially purified DagA obtained in Example 3 was obtained from peripheral blood mononuclear cells in order to show the differentiation inhibitory effect of the neoagaroligosaccharide mixture. It was pretreated with the enzyme reaction product (hereinafter referred to as 'NAO').
  • 'NAO' enzyme reaction product
  • nucleic acid was labeled using SYBR Green I (Roche Diagnostic, Mannheim, Germany) during real-time PCR analysis, and fluorescence intensity was measured using a Light Cycler instrument (Roche Diagnostic).
  • Figure 4 shows the effect of neoagaro oligosaccharide mixture (NAO) on the expression of osteoclast inducer RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) in synovial cells of rheumatoid arthritis patients.
  • RANKL Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand
  • FIG. 4 treatment of inflammatory cytokine IL-17 with synovial cells of rheumatoid arthritis increased the activity of RANKL, an osteoclast inducer, but a neoagaroligosaccharide mixture (partially purified from Example 3).
  • Treatment with DagA enzymatic product (NAO) reduced RANKL expression in a concentration dependent manner.
  • Figure 5 shows the effect of neo-agaro oligosaccharide mixture (NAO) on the expression of the inflammatory cytokine IL-6 in synovial cells of patients with rheumatoid arthritis.
  • NAO neo-agaro oligosaccharide mixture
  • TRAP Temporal Reduction protein
  • Figure 6 shows the effect of neoagar oligosaccharide mixture (NAO) on differentiation into osteoclasts under the conditions of inducing differentiation of peripheral blood mononuclear cells into osteoclasts. As shown in FIG.
  • Figure 7 shows the effect of neoagaroligosaccharide mixture (NAO) on the expression of osteoclast differentiation markers in the condition of inducing differentiation of peripheral blood mononuclear cells into osteoclasts.
  • NAO neoagaroligosaccharide mixture

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Abstract

본 발명은 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 신규 용도의 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 네오아가로올리고당 혼합물 등은 파골세포 유도인자인 RANKL의 발현을 감소시키고 단핵세포의 파골세포로의 분화를 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 관절염(특히 류마티스 관절염) 또는 골다공증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 약품 또는 기능성 식품으로 사용될 수 있다.

Description

네오아가로올리고당을 포함하는 관절염 또는 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 관절염 또는 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 관절염 또는 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 단핵세포의 파골세포로의 분화를 효과적으로 억제하는 것을 특징으로 한다.
한천(Agar)은 오래전부터 식품첨가물, 의약품, 화장품, 가축사료 및 공업원료 등으로 널리 이용되고 있는 대표적인 해조류 유래 다당류로서, 국내의 경우 해마다 그 생산량이 약 2,000 ~ 5,000톤에 이르고 있는 비교적 풍부한 수산자원 중 하나이다. 그러나, 실제 이용 면에서는 전체 생산량의 일부만이 단순가공 처리되어 값싼 원료로 사용될 뿐이고, 그 나머지는 대부분 방치되고 있어 부존 자원량에 비해 부가가치가 매우 낮은 실정이다. 따라서 풍부한 국내 한천의 새로운 용도개발과 부가가치 향상에 관한 연구가 크게 요구되고 있는 실정이다.
한천은 소량의 단백질, 회분 및 지방을 제외하면 대부분 다당류로 이루어지는데, 상기 한천을 구성하는 다당류에는 중성 다당류인 아가로스(agarose)와 산성 다당류인 아가로펙틴(agaropectin)이 있다. 아가로스는 D-갈락토스(D-galactose)와 3,6-안하이드로-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose)가 β-1,4 형태로 결합한 아가로비오스(agarobiose)를 단위체로 가지며, 아가로비오스가 α-1,3 결합으로 반복되어 연결된 직쇄 구조로 되어있어서 겔(gel)화력이 강하다. 반면, 아가로펙틴은 아가로스와 마찬가지로 아가로비오스를 단위체로 가지나, 황산기 등과 같은 산성기를 함유하고 있어서, 겔화력이 약하다.
이중, 아가로스는 β-1,4 결합에 작용하는 베타-아가레이즈(β-agarase)에 의해 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)를 거쳐 네오아가로비오스(neoagarobiose)로 분해되고 계속해서 α-1,3 결합에 작용하는 알파-아가레이즈(α-agarase)에 의해서 갈락토스(D-galactose)와 3,6-안하이드로-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose)로 최종 분해된다. 또한, 아가로스는 묽은 산이나 알파-아가레이즈(α-agarase)에 의해 아가로비오스(neoagarobiose)로 분해된다. 일반적으로, 네오아가로올리고당은 한천 또는 아가로스를 베타-아가레이즈(β-agarase)로 가수분해하여 얻어지는 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose), 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose) 등과 같이 단당이 2-10개 정도 결합한 올리고당을 의미한다. 또한, 아가로올리고당은 한천 또는 아가로스를 묽은 산이나 알파-아가레이즈(α-agarase)로 가수분해하여 얻어지는 아가로비오스(Aeoagarobiose), 아가로테트라오스(Agarotetraose), 아가로헥사오스(Agarohexaose), 아가로옥타오스(Agarooctaose) 등과 같이 단당이 2-10개 정도 결합한 올리고당을 의미한다. 네오아가로올리고당은 3,6-안하이드로-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose)를 비환원 말단으로 가지는 반면, 아가로올리고당은 D-갈락토스(D-galactose)를 비환원 말단으로 가지며, 이러한 구조적 차이 때문에 생리학적 활성 측면에서 서로 다른 성질을 보이기도 한다.
한편, 방선균인 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) A3(2)는 한천을 분해하는 아가레이즈를 세포 외(세포 밖으로 분비되는) 단백질 형태로 생산한다고 알려져 있으며(Stanier et al., 1942, J. Bacteriol.; Hodgson and Chater, 1981, J. Gen. Microbiol.), 이 아가레이즈는 DagA 유전자로 코딩되어 있다. DagA 유전자는 방선균에서 그 기능이 유일하게 알려진 베타-아가레이즈(β-agarase) 유전자이기 때문에 방선균을 통한 아가레이즈 생산 연구에 있어서 중요한 위치를 갖는다. 특히, 스트렙토마이세스 시리칼라는 방선균의 분자생물학적 연구에 가장 널리 사용되는 균주로서 2002년 영국의 Sanger centre에 의해 염색체 DNA의 서열이 분석되었고 현재 공개되어 있다(Bantley et al.,2002, Nature).
네오아가로올리고당의 제조 또는 용도와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-0794593호에는 한천 분해능을 갖는 탈라소모나스 속 균주 SL-5(Thalassomonas sp. SL-5) KCCM 10790P와 상기 균주가 생산하는 베타-아가레이즈(β-agarase)를 이용하여 네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 네오아가로올리고당을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1072503호에는 한천 분해능을 갖는 글라시에콜라 속 균주 SL-12 KCCM 10945P(Glaciecola sp. SL-12 KCCM 10945P)와 상기 균주가 생산하는 베타-아가레이즈(β-agarase)를 이용하여 네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 네오아가로올리고당을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1303839호에는 슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp) 균주로부터 분리된 베타-아가레이즈 및 이를 이용하여 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 네오아가로올리고당을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1295659호에는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp.) 균주로부터 분리된 베타-아가레이즈 및 이를 이용하여 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 네오아가로올리고당을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1212106호에는 사카로파구스 속(Saccharophagus sp.) 균주로부터 분리된 베타-아가레이즈를 한천, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 기질과 반응시켜 네오아가로비오스를 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1206006호에는 한천분해활성을 갖는 플라메오비르가 속 mbrc-1 균주 KCCM 11151P (Flammeovirga sp. mbrc-1 KCCM 11151P) 및 상기 균주가 생산하는 베타-아가레이즈(β-agarase)를 한천과 반응시켜 네오아가로비오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 네오아가로올리고당을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1302655호에는 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 아가레이즈(agarase)와 아가로스(agarose) 또는 아가(agar)를 반응시키는 것을 특징으로 하는 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1190078호에는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 유래 트립신 유전자(sprT)의 프로모터와 시그널 펩타이드 코드부(coding region)를 포함하여 이루어지는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 DNA 단편; 및 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈 유전자(dagA)에서 시그널 펩타이드 코드부가 제거된 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 DNA 단편;을 포함하고, 원핵생물을 형질전환시킬 수 있는 베타-아가레이즈 재조합 발현 벡터와 이를 이용하여 베타-아가레이즈를 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0060045호에는 신규한 베타-아가레이즈 생산 유전자를 이용한 네오아가로바이오스 또는 네오아가로테트라오스의 효소적 생산방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0044987호에는 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)를 유효성분으로 포함하는 피부 미백 조성물이 개시되어 있다. 이상에서 살펴본 바와 같이, 종래 기술은 주로 베타-아가레이즈를 유전자로 포함하는 신규 균주, 신규 균주나 재조합 균주를 통해 베타-아가레이즈를 생산하는 방법 또는 베타-아가레이즈를 이용하여 한천 등으로부터 네오아가로올리고당을 제조하는 방법에 집중되어 있고, 네오아가로올리고당, 특히 특정 베타-아가레이즈를 이용하여 제조한 네오아가로올리고당의 다양한 생리학적 기능에 대해서는 연구가 거의 이루어지지 않고 있다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 네오아가로올리고당의 신규 식의약적 용도를 제공하는데에 있다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하고, 단핵세포의 파골세포로의 분화에 의해 발생하거나 진행되는 관절염 또는 골다공증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 용도의 조성물을 제공한다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 다른 예는 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서, 상기 효소반응 산물 또는 이의 정제물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하고, 단핵세포의 파골세포로의 분화에 의해 발생하거나 진행되는 관절염 또는 골다공증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 용도의 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 네오아가로올리고당 혼합물 등은 파골세포 유도인자인 RANKL의 발현을 감소시키고 단핵세포의 파골세포로의 분화를 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 관절염(특히 류마티스 관절염) 또는 골다공증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 약품 또는 기능성 식품으로 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분은 쉽게 구할 수 있는 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)와 같은 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응을 통해 수득할 수 있기 때문에 비교적 저렴한 비용으로 생산할 수 있고, 부작용이 없어서 누구나 쉽게 섭취가 가능하다.
도 1은 본 발명에서 DagA 유전자를 클로닝하기 위해 사용된 pUWL201pw 벡터의 개열 지도이다.
도 2는 pUWL201pw 벡터에 DagA 유전자가 도입된 재조합 벡터의 개열 지도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 HPLC-ELSD로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 네오아가로올리고당 혼합물(NAO)이 류마티스 관절염 환자의 활막세포에서 파골세포 유도인자인 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 네오아가로올리고당 혼합물(NAO)이 류마티스 관절염 환자의 활막세포에서 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 6은 네오아가로올리고당 혼합물(NAO)이 말초혈액 단핵세포의 파골세포로의 분화 유도 조건에서 파골세포로의 분화에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 7은 네오아가로올리고당 혼합물(NAO)이 말초혈액 단핵세포의 파골세포로의 분화 유도 조건에서 파골세포 분화 마커의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한" 및 "식품학적으로 허용 가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 예에 따른 관절염 또는 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 포함한다. 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함한다. 또한, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 구성성분들의 시너지 효과를 고려할 때 네오아가로올리고당 혼합물 총 중량을 기준으로 네오아가로비오스(neoagarobiose) 1~10 중량%, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 55~75 중량% 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 20~40 중량%를 포함하는 것이 바람직하고, 네오아가로비오스(neoagarobiose) 2~4 중량%, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 65~70 중량% 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 25~30 중량%를 포함하는 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물일 수 있다. 기질과 DagA와의 효소반응을 통해 네오아가로올리고당 혼합물을 수득하는 방법은 뒤에서 상세하게 설명한다.
본 발명의 다른 예에 따른 관절염 또는 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물을 유효성분으로 포함한다. 상기 효소반응 산물 또는 정제물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함한다. 또한, 상기 효소반응 산물 또는 정제물은 네오아가로올리고당 총 중량을 기준으로 네오아가로비오스(neoagarobiose) 1~10 중량%, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 55~75 중량% 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 20~40 중량%를 포함하는 것이 바람직하고, 네오아가로비오스(neoagarobiose) 2~4 중량%, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 65~70 중량% 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 25~30 중량%를 포함하는 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 효소반응은 35~45℃의 온도 및 6~8의 pH에서 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스 용액에 DagA를 2~250 unit/㎖의 농도, 바람직하게는 10~150 unit/㎖의 농도, 더 바람직하게는 10~100 unit/㎖의 농도로 첨가하여 이루어지는 것 바람직하다. 이때, 효소의 활성을 나타내는 1 Unit은 0.2%(w/v)의 농도로 아가로스를 녹인 50mM PBS 용액(pH 7) 3.9㎖를 40℃에서 5분간 반응한 후(반응액 4㎖), 반응액과 동량의 DNS 시약(dinitrosalicylic acid 6.5g, 2M NaOH 325㎖ 및 glycerol 45㎖를 증류수 1ℓ에 용해시켜 제조함)을 넣고 10분간 끓인 다음 식히고, 흡광도를 540㎚에서 측정하였을 때 540㎚에서의 흡광도 0.001을 생성하는 효소의 양으로 정의된다.
이하, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분을 기질과 DagA와의 효소반응을 통해 수득하는 방법을 설명한다. 본 발명에서 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 DagA는 서열번호 2의 31 ~ 309번 사이의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미하며, 스트렙토마이세스 시리칼라로부터 생산되거나 이종 균주로부터 생산된 단백질 또는 기능이 전혀 다른 것으로 변경되거나 아가레이즈 활성을 잃지 않는 범위 내에서 통상적인 유전자 재조합 방법 즉, 정제를 유리하게하기 위해 표지 아미노산을 포함시키거나 이종 발현을 위해 아미노산 서열을 변경하는 등의 방법에 따라 재조합된 단백질을 모두 포함한다. DagA는 본래 스트렙토마이세스 시리칼라의 베타-아가레이즈 유전자로부터 번역될 때 서열번호 2의 309개 아미노산을 갖고 분자량이 약 35 kDa인 상태로 생산되며, N-말단 30개의 아미노산 시그널 펩티드가 잘려져서 완성된 세포외형 단백질(약 32kDa)의 상태로 분비된다. 스트렙토마이세스 시리칼라의 DagA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있다. 서열번호 1은 스트렙토마이세스 시리칼라 A3(2)의 게놈에 존재하는 유전자의 염기서열로 NCBI(미국 국립생물정보센터) 데이터베이스 상에 "SCO3471"로 명명되어 있다. In vitro 실험을 통해 확인된 바에 따르면, DagA 유전자의 전사는 RNA 중합효소의 적어도 다른 3가지의 완전효소(holoenzyme)에 의해 인지되는 4가지 또는 5가지의 다른 프로모터(promoter)에 의해 조절된다. DagA 유전자의 전사단계 분석에 의하면, DagA의 전사는 암호화 서열의 상부 32, 77, 125 및 220번째 염기에서 개시되는 것으로 나타났다.
본래 DagA의 생산 균주인 스트렙토마이세스 시리칼라의 배양을 통해 본 발명에서 사용되는 DagA를 생산할 수 있으나, 생산 효율을 높이기 위해 이종 균주인 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans)의 발현 시스템을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 DagA 유전자를 방선균용 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조한 다음, 재조합 벡터로 스트렙토마이세스 리비던스를 형질전환하고, 형질전환체를 배양하는 방법을 사용하여 DagA를 생산할 수 있다. 이 경우 재조합 벡터는 DagA 유전자의 전사가 방선균 유래 프로모터에 의해 조절될 수 있도록 구성하는 것이 바람직하다. 방선균 유래 프로모터에는 sgtR 프로모터(sgtRp), ermE 프로모터(ermEp), tipA 프로모터(tipAp) 등 다양한 프로모터가 존재하므로 재조합 벡터를 제조할 때 이들을 선택하여 사용할 수 있다. 이들 프로모터에 의해 전사가 조절될 수 있도록 구성된 여러 종류의 벡터들이 개발되어 있고, 이 벡터에 SCO3471를 클로닝하면 방선균 유래 프로모터에 의해 전사가 조절되는 구조의 재조합 벡터를 제조할 수 있다. 형질전환체는 숙주 균주를 DagA 유전자가 클로닝된 재조합 벡터로 형질전환시켜 제조할 수 있는데, 숙주 균주에 따라 형질전환 방법이 다양하게 존재하므로, 적절한 방법을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 스트렙토마이세스 리비던스를 숙주 균주로 사용하는 경우 PEG(polyethylene glycol)를 매개로한 형질전환 방법을 사용할 수 있다. 형질전환체 등과 같은 DagA 생산 균주를 액체 배지에서 배양하면 DagA를 생산할 수 있으며, 배양액을 수득하여 한외 여과법과 같은 통상의 단백질 정제방법을 이용하면 고순도의 DagA를 생산할 수 있다. 이때 액체 배지에 한천 또는 아가로스를 포함시키면 보다 효율적으로 DagA를 생산할 수 있다.
이렇게 생산된 DagA를 한천 또는 아가로스와 같은 기질 용액에 첨가하고 특정 온도 및 pH 조건에서 반응시키면 본 발명에 따른 조성물에서 유효성분으로 사용되는 효소반응 산물을 수득할 수 있다. 또한, 상기 효소반응 산물을 한외 여과법으로 부분 정제하거나 겔여과 크로마토그래피에 통과시켜 분획하면 효소반응 산물의 정제물을 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 네오아가로올리고당 혼합물 등은 파골세포 유도인자인 RANKL 또는 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현을 감소시키고 단핵세포의 파골세포로의 분화를 효과적으로 억제한다. 파골세포(Osteoclast)는 골조직의 파괴, 흡수의 기능을 가지는 다핵 대형 세포로서, 관절염 또는 골다공증에 관여하는 것으로 알려져 있다. 골조직은 조골세포에 의한 골 형성과 파골세포에 의한 골 흡수 과정이 반복되어 유지되는 역동적인 기관으로서, 단핵세포의 파골세포로의 분화가 증가하면 뼈의 생성보다 흡수가 많아져 관절염(특히, 류마티스 관절염) 또는 골다공증이 발생하거나 진행된다. 이러한 이유 때문에 관절염(특히, 류마티스 관절염) 또는 골다공증 치료제 개발에 관한 연구가 파골세포의 형성을 억제하거나 파골세포의 활성화를 억제하는 소재의 탐색에 집중하고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 네오아가로올리고당 혼합물 등은 관절염(특히, 류마티스 관절염) 또는 골다공증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 소재로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 식품 첨가제, 식품 조성물(특히 기능성 식품) 또는 사료 첨가제 등으로 구체화될 수 있고, 조성물 내에서의 유효성분의 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 관절염 또는 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 약학 조성물로 구체화되는 경우, 약학 조성물에서 유효성분의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.1~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 네오아가로올리고당 외에 관절염 또는 골다공증 예방, 개선 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효 성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 유효성분인 복합 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이라면 크게 제한되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 유효성분인 복합 추출물을 기준으로 할 때 0.1 내지 1000 ㎎/㎏인 것이 바람직하고, 1 내지 500 ㎎/㎏인 것이 더 바람직하며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 관절염 또는 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 식품 조성물로 구체화되는 경우, 식품 조성물에서 유효성분의 함량은 크게 제한되지 않으며, 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~50 중량%, 바람직하게는 0.1~25 중량%, 더 바람직하게는 0.5~10 중량%일 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 구체적인 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 식품 조성물은 유효성분 외에 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 예는 필요로 하는 개체에 네오아가로올리고당 혼합물을 유효한 양으로 투여하여 관절염 또는 골다공증을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 필요로 하는 개체에 네오아가로올리고당 혼합물을 포함하는 조성물을 유효한 양으로 투여하여 관절염 또는 골다공증을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명은 필요로 하는 개체에 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물을 유효한 양으로 투여하여 관절염 또는 골다공증을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 필요로 하는 개체에 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물을 포함하는 조성물을 유효한 양으로 투여하여 관절염 또는 골다공증을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1 : DagA 효소의 생산
스트렙토마이세스 시리칼라 A3(2)의 염색체 DNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머 및 Ex-Taq(TAKARA) 중합효소를 이용하여 중합연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였고, 그 결과 증폭된 DagA 유전자 단편(DagA의 시그널 펩타이드 및 완성형 펩타이드가 암호화된 947bp 길이의 단편으로서, 서열번호 1의 염기서열 양 말단에 프라이머의 일부 서열이 연결된 상태에 해당함)을 수득하였다.
* DagA 유전자 단편의 증폭에 사용된 프라이머
Asm-F(Forward Primer) : 5′-GACATATGGTGGTCAACCGACGTGATC-3′(NdeI) (서열번호 3)
Asm-R(Reverse Primer) : 5′-GGTGGATCCCTACACGGCCTGATACG-3′(BamHI) (서열번호 4)
이후, 증폭된 DagA 유전자 단편의 제한효소 부위(NdeI/BamHI)를 이용하여 DagA 유전자를 도 1의 pUWL201pw 벡터에 클로닝하여 도 2의 재조합 벡터를 제작하였다. 도 2의 재조합 벡터에서는 DagA 유전자의 전사가 ermE 프로모터에 의해 조절된다. 이후, 도 2의 재조합 벡터로 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans) TK24 균주를 형질전환하여 재조합 균주를 제조하고, 상기 재조합 균주를 DagA의 생산을 위해 사용하였다.
구체적으로, 상기 재조합 균주를 0.3%(w/v)의 한천(agar)이 포함된 R2YE 액체 배지에 접종하고 28℃의 온도 및 120rpm의 교반 조건에서 약 60시간 동안 전 배양을 실시하였다. 전 배양 과정을 거친 다음 약 60시간 동안 본 배양을 실시하였다. 본 배양을 통해 수득한 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고, 상등액을 한외 여과막(5kDa cut-off membrane)으로 여과하여 분리 및 정제하였다. 여과막을 통과하지 못한 효소 농축액을 동결건조하여 고형화하고, 고형화된 DagA 효소를 보관하면서 이후의 실험에 사용하였다.
실시예 2 : DagA 효소의 아가레이즈 활성 측정
상기 실시예 1에서 수득한 DagA 효소의 아가레이즈 활성을 환원당량 검정방법(DNS method)으로 측정하였다. 실시예 1에서 수득한 DagA 효소를 PBS(phosphate buffered saline) 용액에 10㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조한 DagA 효소액 100㎕와 0.2%(w/v)의 농도로 아가로스를 녹인 50mM PBS 용액(pH 7) 3.9㎖를 혼합하고 40℃에서 5분간 반응시킨 후, 여기에 DNS 시약(dinitrosalicylic acid 6.5g, 2M NaOH 325㎖ 및 glycerol 45㎖를 증류수 1ℓ에 용해시켜 제조함) 4㎖를 넣고 10분간 끓인 다음 식히고, 흡광도를 540㎚에서 측정하였다. 효소 1U(Unit)는 540㎚에서의 흡광도가 0.001인 활성으로 정의하였다.
실시예 3 : DagA 효소반응 산물의 제조
1.5%(w/v)의 농도로 한천을 녹인 20mM Tris-HCl 용액 1ℓ를 제조하고, 100℃에서 약 10분간 가열한 다음 40℃로 온도를 떨어뜨리고, 여기에 125U/㎖ 농도의 DagA 효소 수용액을 전체 시료의 양을 기준으로 20,000U가 되도록 처리하고 약 24시간 동안 반응시켰다. 이후, 효소반응 산물을 원심분리하여 미분해된 한천을 제거하고, 상등액을 회수한 다음 TLC(thin layer chromatography)를 이용하여 효소반응 생성물을 확인하였다. 회수한 상등액을 한외 여과막(5KDa cut-off membrane)으로 여과하여 부분 정제하였다. 여과막을 통과한 DagA 효소반응 산물을 동결건조하여 고형화하였고, 고형화된 DagA 효소반응 산물을 보관하면서 이후의 실험에 사용하였다. 상기 과정을 반복하면서 4 배치(batch)에 해당하는 부분 정제된 효소반응 산물을 수득하였다.
실시예 4 : HPLC - ELSD 분석을 통한 DagA 효소반응 산물의 네오아가로올리고당 조성 확인
상기 실시예 3에서 수득한 효소반응 산물의 네오아가로올리고당 조성을 HPLC-ELSD 분석을 통해 확인하였다. HPLC-ELSD 분석 조건은 다음과 같다.
* 칼럼 : NH2 P-50 4E multimode column(250㎜×4.6㎜)
* 이동상 : 아세토니트릴(acetonitrile)과 물의 혼합용액(acetonitrile : water의 부피비는 65 : 35임
도 3은 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물을 HPLC-ELSD로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3에서 보이는 4개의 피크 그래프는 4 배치(batch)에서 각각 얻은 부분 정제된 효소반응 산물에 대응하는 것이다. 또한, 도 3에서 표 안의 면적(%)은 각각의 네오아가로올리고당에 해당하는 피크의 면적을 전체 피크 면적에 대해 백분율로 나타낸 것이며 당 업계에서 중량%와 동일한 의미로 해석될 수 있다. 도 3에서 보이는 바와 같이 DagA 효소반응 산물은 주성분이 네오아가로비오스(neoagarobiose, 이하 'DP2'라 한다), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, 이하 'DP4'라 한다) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, 이하 'DP6'라 한다) 등과 같은 네오아가로올리고당인 것으로 나타났다. DagA 효소반응 산물에서 네오아가로올리고당의 함량은 고형분(HPLC-ELSD 분석에서 검출되지 않은 성분을 포함한다)의 전체 중량을 기준으로 할 때 약 65±5 중량%인 것으로 나타났으나, 효소반응 조건에서 따라 상기 함량은 다양한 범위에서 선택될 수 있다. 예를 들어, DagA 효소반응 산물에서 네오아가로올리고당의 함량은 고형분 전체 중량을 기준으로 65±20 중량%일 수 있다. 또한, DagA 효소반응 산물에서 DP2, DP4 및 DP6의 함량은 DP2, DP4 및 DP6를 합한 네오아가로올리고당 전체 중량을 기준으로 할 때 각각 2~4 중량%, 65~70 중량% 및 25~30 중량%인 것으로 나타났으나, 효소반응 조건에서 따라 상기 함량은 다양한 범위에서 선택될 수 있다. 예를 들어, DagA 효소반응 산물에서 DP2, DP4 및 DP6의 함량은 DP2, DP4 및 DP6를 합한 네오아가로올리고당 전체 중량을 기준으로 할 때 각각 1~10 중량%, 55~75 중량% 및 20~40 중량%일 수 있다.
실시예 5 : 겔여과 크로마토그래피를 이용한 DagA 효소반응 산물의 정제
상기 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 효소반응 산물을 겔여과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC; 제품명 : BioGel P-2 gel, Biorad, Cat. No.: 150-4115)를 통해 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, DP6), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, DP4) 및 네오아가로비오스(neoagarobiose, DP2)로 분리 및 정제하였다. 이후 정제한 산물들을 동결건조하여 고형화하였고, 고형화된 DagA 효소반응 정제 산물을 보관하면서 이후의 실험에 사용하였다. 정제한 산물들인 DP2, DP4 및 DP6의 순도를 TLC와 HPLC를 통해 확인한 결과 약 85%(w/w) 수준이었다.
실시예 6 : 네오아가로올리고당 혼합물의 류마티스 관절염 및 골다공증 개선 효능 확인 시험
6-1. 실험방법
(1) 류마티스 관절염 환자의 활막세포(Fibroblasts-like synoviocytes) 배양
류마티스 관절염 환자의 관절치환 수술시 관절조직을 분리한 후 collagenase로 처리하여 활막세포를 분리하였다. 분리한 류마티스 관절염 환자의 활막세포를 10% FBS(Fetal bovine serum)의 농도가 10 중량%인 DMEM((Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하였다. 본 실험에서는 계대(passage)가 5~10인 세포를 사용하였고, 세포를 6-well plate에 well 당 3×105의 양으로 접종하고, 염증성 사이토카인인 IL-17로 자극을 주었으며, 네오아가로올리고당 혼합물의 효과를 보기 위해 활막세포를 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물(이하, 'NAO'라 한다)로 전처리 하였다.
(2) 인간 말초혈액 단핵세포의 분리와 파골세포로의 분화 유도
혈액을 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 용액과 1:1의 부피 비로 섞어 혈액 완충액을 제조하였다. 이후, 혈액 완충액이 수용된 튜브에 피콜(Ficoll)을 피콜층이 흐트러지지 않게 천천히 띄운 다음(피콜 대 혈액 완충액의 중량비는 1:4임), 2000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 퍼비코트(buffy coat)층만을 수거하였다. 이후, 수거한 퍼비코트(buffy coat)층을 새로운 튜브에 담고 PBS로 세척하여 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 수득하였다. 이후, 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 48-well plate에 well 당 5×105의 양으로 접종하고 배양하였다. 말초혈액 단핵세포의 파골세포로의 분화 유도를 위해 M-CSF와 IL-17 자극을 주었고 네오아가로올리고당 혼합물의 분화 억제 효과를 보기 위해 말초혈액 단핵세포를 실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물(이하, 'NAO'라 한다)로 전처리 하였다.
(3) Real Time PCR
real-time PCR을 통해 특정 유전자의 발현 수준을 분석하였다. PCR 수행시 사용한 특정 유전자별 프라이머을 하기의 표 1에 나타내었다.
유전자 종류 Forward primer 염기서열 Reverse primer 염기서열
RANKL ACC AGC ATC AAA ATC CCA AG CCC CAA AGT ATG TTG CAT CC
IL-6 CCC ACA CAG ACA GCC ACT CA GGT TGT TTT CTG CCA CTG CC
β-actin GAA ATC GTG CGT GAC ATC AAA G TGT AGT TTC ATG GAT GCC ACA
TRAP GAC CAC CTT GGC AAT GTC TCT G TGG CTG AGG AAG TCA TCT GAG TTG
Cathepsin K TGA GGC TTC TCT TGG TGT CCA TAC AAA GGG TGT CAT TAC TGC GGG
calcitonin receptor TGG TGC CAA CCA CTA TCC ATG C CAC AAG TGC CGC CAT GAC AG
또한, real-time PCR 분석시 SYBR Green I(Roche Diagnostic, Mannheim,Germany)을 사용하여 핵산을 표지하였고, Light Cycler instrument(Roche Diagnostic)를 사용하여 형광 세기를 측정하였다.
(4) TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) staining
48-well plate의 각 well에 세포를 넣고, 세포 고정을 위해 각 well에 포름알데하이드 1㎖를 넣은 후 상온에서 10분 동안 방치하였다. 이후, 고정액을 석션(suction)하고 증류수로 3회 세척하였다. 이후, 각 well에 TRAP stain solution(Sigma, USA)을 넣고, 37℃의 incubator에서 30분 동안 반응시켰다. 이후, 각 well에 증류수를 넣고 석션하는 것을 3회 반복한 후 현미경으로 측정하였다.
6-2. 실험결과
(1) 류마티스 관절염 환자의 활막세포에서 네오아가로올리고당 혼합물의 파골세포 유도인자 억제 효과
도 4는 네오아가로올리고당 혼합물(NAO)이 류마티스 관절염 환자의 활막세포에서 파골세포 유도인자인 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 4에서 보이는 바와 같이 류마티스 관절염 환자의 활막세포에 염증성 사이토카인인 IL-17을 처리하면 파골세포 유도인자인 RANKL의 활성이 증가하지만, 네오아가로올리고당 혼합물(실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물, NAO)을 처리하면 농도 의존적으로 RANKL의 발현을 감소시켰다.
(2) 류마티스 관절염 환자의 활막세포에서 네오아가로올리고당 혼합물의 IL-6 억제 효과
도 5는 네오아가로올리고당 혼합물(NAO)이 류마티스 관절염 환자의 활막세포에서 염증성 사이토카인인 IL-6의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 5에서 보이는 바와 같이 류마티스 관절염 환자의 활막세포에 염증성 사이토카인인 IL-17을 처리하면 염증성 사이토카인인 IL-6의 활성이 증가하지만, 네오아가로올리고당 혼합물(실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물, NAO)을 처리하면 농도 의존적으로 IL-6의 발현을 감소시켰다.
(3) 말초혈액 단핵세포의 파골세포로의 분화 유도 조건에서 네오아가로올리고당 혼합물의 파골세포로의 분화 억제 효과
인간 말초혈액 단핵세포를 분리하고 파골세포로의 분화를 유도하기 위해 염증성 사이토카인인 IL-17을 처리하여 자극을 주고, 네오아가로올리고당 혼합물로 전처리한 군과 전처리하지 않은 대조군의 TRAP(Tartrate resistant acid phosphatase) staining을 수행하였다. 도 6은 네오아가로올리고당 혼합물(NAO)이 말초혈액 단핵세포의 파골세포로의 분화 유도 조건에서 파골세포로의 분화에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 6에서 보이는 바와 같이 인간 말초혈액 단핵세포에 네오아가로올리고당 혼합물(실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물, NAO)을 고농도로 전처리하는 경우 파골세포로의 분화가 현저하게 억제되었다.
도 7은 네오아가로올리고당 혼합물(NAO)이 말초혈액 단핵세포의 파골세포로의 분화 유도 조건에서 파골세포 분화 마커의 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 7에서 보이는 바와 같이 인간 말초혈액 단핵세포에 네오아가로올리고당 혼합물(실시예 3에서 수득한 부분 정제된 DagA 효소반응 산물, NAO)을 전처리하는 경우 파골세포로의 분화 유도 조건에서 농도 의존적으로 파골세포 분화 마커인 TRAP, Calcitonic receptor, cathepsin K의 발현을 감소시켰다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 특정 실시 형태로 국한되는 것이 아니며, 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
    상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하고,
    단핵세포의 파골세포로의 분화에 의해 발생하거나 진행되는 관절염 또는 골다공증을 예방 또는 치료하기 위한 용도의 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총 중량을 기준으로 네오아가로비오스(neoagarobiose) 1~10 중량%, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 55~75 중량% 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 20~40 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
    상기 효소반응 산물 또는 이의 정제물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하고,
    단핵세포의 파골세포로의 분화에 의해 발생하거나 진행되는 관절염 또는 골다공증을 예방 또는 치료하기 위한 용도의 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 효소반응 산물 또는 이의 정제물은 네오아가로올리고당 총 중량을 기준으로 네오아가로비오스(neoagarobiose) 1~10 중량%, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 55~75 중량% 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 20~40 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
    상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하고,
    단핵세포의 파골세포로의 분화에 의해 발생하거나 진행되는 관절염 또는 골다공증을 예방 또는 개선하기 위한 용도의 식품 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총 중량을 기준으로 네오아가로비오스(neoagarobiose) 1~10 중량%, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 55~75 중량% 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 20~40 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  7. 한천(Agar) 또는 아가로스(Agarose)에서 선택되는 기질과 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) 유래 베타-아가레이즈인 DagA와의 효소반응 산물 또는 이의 정제물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
    상기 효소반응 산물 또는 이의 정제물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 포함하고,
    단핵세포의 파골세포로의 분화에 의해 발생하거나 진행되는 관절염 또는 골다공증을 예방 또는 개선하기 위한 용도의 식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 효소반응 산물 또는 이의 정제물은 네오아가로올리고당 총 중량을 기준으로 네오아가로비오스(neoagarobiose) 1~10 중량%, 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 55~75 중량% 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose) 20~40 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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