WO2014077575A1 - 덱에이 효소반응으로 조제한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 한천 유래 네오아가로올리고당 복합 조성물 - Google Patents

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WO2014077575A1
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WO
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obesity
weight
diabetes
prevention
neoagarohexaose
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이제현
홍순광
홍선주
이문희
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    • A61K36/04—Rhodophycota or rhodophyta (red algae), e.g. Porphyra
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    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
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    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • the present invention relates to agar-derived neoagaroligosaccharide complex composition having anti-obesity and anti-diabetic efficacy prepared by the DagA enzymatic reaction, and specifically, Streptomyces coelicolor DagA and agar or agarose (agarose) enzymes.
  • the present invention relates to a composition exhibiting the effect of preventing, treating or improving obesity or diabetes by containing the reaction product obtained in the reaction as an active ingredient.
  • Agar is a representative seaweed-derived polysaccharide that has been widely used as food additives, medicines, cosmetics, livestock feed and industrial raw materials for a long time.
  • Agar is one of the relatively rich aquatic resources with annual production of about 3,600 tons. .
  • the added value is very low compared to the amount of resources remaining. Therefore, there is a great demand for research on new application development and value-added improvement of abundant domestic agar.
  • Agar is composed of agarose and agaropectin, and agarose is a unit of ⁇ -1, 4, which is combined with D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose. While agarobiose is repeated and has a linear structure connected by ⁇ -1 and 3 bonds and has a strong gel power, agaropectin is composed of agarobiose units like agarose, but has acidic groups such as sulfate groups. It is weak in gelation power.
  • the agarose is decomposed into neoagarobiose via neoagarotetraose by beta-agarase, which acts on ⁇ -1 and 4 bonds, followed by ⁇ -1, It is finally broken down into D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose by alpha-agarase, which acts on three bonds.
  • Actinomycetes Streptomyces coelicolor A3 (2) is known to produce extracellular (extracellularly secreted) agares that degrade agar (Stanier et al., 1942, J. Bacteriol .; Hodgson and Chater, 1981, J. Gen. Microbiol.), This agarez is encoded by the dagA gene.
  • the dagA gene is a beta-agarase gene whose only function is known and has an important position in the study of agarase production in actinomycetes.
  • Streptomyces silica is the most widely used strain for molecular biological research of actinomycetes.
  • the sequence of chromosomal DNA was analyzed at Sanger center in England (Bentley et al., 2002, Nature).
  • the inventors of the present invention have attempted to develop a method for more useful utilization of agar, abundant aquatic resources, and since agar is a polysaccharide, proper use of glycolytic enzymes can produce various sugar-derived compounds that exhibit bioactive effects during the decomposition of agar. It was noticed that there is a possibility. Actinomycetes are microorganisms that produce useful bioactive substances such as antibiotics. Since these bioactive substances contain various compounds related to sugars, actinomycetes contain enzymes capable of decomposing or modifying agar and converting them into useful sugar compounds. I thought there would be. Therefore, the search for useful enzymes from such actinomycetes and applying them to the enzyme reaction of agar tried to produce useful bioactive substances.
  • Polymer polysaccharides such as agar
  • oligosaccharides used in metabolism of the living body are similar in molecular form, but related enzymes cannot degrade, resulting in the inhibition of glycolysis activity.
  • the present inventors have attempted to develop an effective substance for obesity or diabetes by confirming the inhibitory ability of glycolytic enzyme activity on the agar enzyme reaction product.
  • the main object of the present invention is to provide a useful bioactive substance produced through an agar-based enzymatic reaction, in particular, a bioactive substance showing an excellent effect on obesity or diabetes by regulating adipocyte differentiation and glucose metabolism. .
  • the present invention provides the prevention and treatment of obesity or diabetes containing the reaction product obtained by the enzymatic reaction of Streptomyces coelicolor DagA and agar or agarose as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a functional food for the prevention and improvement of obesity or diabetes containing the reaction product as an active ingredient.
  • the present invention provides a feed for the prevention and improvement of obesity or diabetes containing the reaction product as an active ingredient.
  • the enzyme reaction is preferably made at a temperature of 35 to 45 °C and pH 6-8.
  • the enzymatic reaction is preferably performed by adding DagA at a concentration of 20 to 100 units / ml to agar or agarose solution of 0.5 to 5% (w / v).
  • 1 unit was reacted with 50 mM phosphate solution (pH 7) dissolved in agarose at 0.2% (w / v) for 5 minutes at 40 ° C (4 mL of reaction solution), and then the same amount of DNS reagent (dinitrosalicylic acid 6.5g, 2M NaOH 325ml, glycerol 45ml / 1L distilled water) and then boiled for 10 minutes and cooled to measure the absorbance ( ⁇ 540nm), the amount to produce an absorbance ( ⁇ 540nm) 0.001.
  • DNS reagent dinitrosalicylic acid 6.5g, 2M NaOH 325ml, glycerol 45ml / 1L distilled water
  • the reaction product contains 45 to 85% by weight of a neoagarooligosaccharide mixture based on the total weight of the reaction product, the neoagar oligosaccharide mixture is 10% by weight based on the total weight of the neoagar oligosaccharide mixture It is preferable to contain the following neoagarobiose, 50 to 70% by weight of neoagarotetraose and 30 to 50% by weight of neoagarohexaose.
  • the present invention contains a neoagar oligosaccharide mixture as an active ingredient, the neoagar oligosaccharide mixture is neoagarobiose (neoagarobiose), neoagarotetraose (neoagarotetraose) or neoagar It provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of obesity or diabetes, characterized in that it contains neoagarohexaose.
  • the present invention contains a neoagar oligosaccharide mixture as an active ingredient, the neoagar oligosaccharide mixture is neoagarobiose (neoagarobiose), neoagarotetraose (neoagarotetraose) or neoagar It provides a functional food for the prevention and improvement of obesity or diabetes, characterized in that it contains neoagarohexaose.
  • the present invention contains a neoagar oligosaccharide mixture as an active ingredient, the neoagar oligosaccharide mixture is neoagarobiose (neoagarobiose), neoagarotetraose (neoagarotetraose) or neoagar
  • neoagarobiose neoagarobiose
  • neoagarotetraose neoagarotetraose
  • the neoagar oligosaccharide mixture is 10% by weight or less of neoagarobiose (neoagarobiose), 50 to 70% by weight of neoagarotetraose and 30 to 50 based on the total weight of the neoagaroligosaccharides mixture. Preference is given to containing by weight of neoagarohexaose.
  • the streptomyces syphila DagA refers to a protein having an amino acid sequence between 31 and 309 of SEQ ID NO: 2, and includes a protein produced from a streptomyces syphila or a heterologous strain.
  • conventional genetic recombination methods such as including a labeled amino acid to favor purification or altering an amino acid sequence for heterologous expression, within a range that does not change to a completely different function or lose agarase activity. According to the recombinant protein.
  • DagA is a beta-agarase originally produced by Streptomyces sycara, which has 309 amino acids of SEQ ID NO: 2, is produced with a molecular weight of about 35 kDa, and the N-terminal 30 amino acid signal peptide is cut off. And secreted in the state of completed extracellular protein (about 32 kDa).
  • the dagA gene of Streptomyces cyricolor encodes this DagA, and the dagA gene may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 is a nucleotide sequence of a gene present in the genome of Streptomyces syphila A3 (2), and is named “SCO3471” on the NCBI database.
  • the transcription of the dagA gene is regulated by four or five different promoters recognized by at least three other homolozymes of RNA polymerase. Transcriptional analysis of the dagA gene showed transcription to be initiated at the top 32, 77, 125 and 220 bases of the coding sequence.
  • a recombinant vector may be prepared, and then, the recombinant vector may be transformed with Streptomyces redevelopment , and the transformant may be cultured.
  • the recombinant vector is preferably configured so that the dagA gene can be regulated by the actinomycetes-derived promoter.
  • Actinomycetes-derived promoters include a variety of promoters such as the sgtR promoter ( sgtRp ), the ermE promoter ( ermEp ), the tipA promoter ( tipAp ), and can be selected and used when preparing recombinant vectors.
  • Various types of vectors have been developed that can be regulated by these promoters. Cloning SCO3471 into these vectors allows the production of recombinant vectors of a structure in which transcription is regulated by actinomycetes-derived promoters.
  • the transformant may be prepared by transforming the host strain with a recombinant vector. Since a variety of methods for transformation exist depending on the host strain, an appropriate method may be selected and used. For example, in the case of using Streptomyces revidance as a host strain, a transformation method using polyethylene glycol (PEG) may be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • DagA-producing strains such as transformants
  • a liquid medium to produce DagA
  • a high-purity DagA can be produced using conventional protein purification methods such as ultrafiltration by obtaining a culture solution.
  • DagA can be more efficiently produced.
  • neoagarohexaose, neoagarotetraose, neoagarobiose were produced through the enzymatic reaction between agar or agarose and DagA. Therefore, in the present invention, the enzyme reaction product may be each of them, and they may be in a mixed state. However, other reaction products may be produced in addition to these three reaction products identified in the present invention, and are not necessarily limited to these three reaction products.
  • the reaction product obtained by ultrafiltration after the enzymatic reaction between agar or agarose and DagA is a form containing all, other than these Reaction products may be included
  • each neoagar hexaose, neoagarotetraose, neoagarobiose has also been found to be excellent in the prevention and treatment of obesity and diabetes.
  • composition of the present invention can be used for applications such as pharmaceuticals and food.
  • the active ingredient may be formulated according to the administration method, dosage form, and therapeutic purpose in a conventional manner.
  • the mixture can be diluted with the pharmaceutically acceptable carrier or encapsulated in a carrier in the form of a container.
  • parenteral administration refers to the administration of the active ingredient through oral vein, peritoneum, muscle, artery, transdermal, inhalation, and the like.
  • the formulation may further include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, flavors, emulsifiers, preservatives, and the like, and may be formulated to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the dosage of the present invention can be adjusted according to the condition of the patient, the route of administration and the dosage form is not limited and those skilled in the art according to the symptoms can be obviously used within various ranges, In general, in the present invention, it is determined that 10 to 200 mg / kg body weight per day may be continuously or intermittently administered in an experimentally effective amount.
  • the present invention provides a food containing a composition comprising agar or agarose and an enzyme reaction product of DagA itself or a food acceptable carrier.
  • a food acceptable carrier Meat products, fish products, tofu, jelly, porridge, noodles such as ramen or noodles, seasoned foods such as soy sauce, miso, red pepper paste, mixed soy sauce, dairy products such as sauces, sweets, fermented milk and cheese, pickles such as kimchi and pickles It can be used in foods such as beverages, fruits, vegetables, soy milk and fermented beverages.
  • the cooking method or the production method of each food will be apparent to those skilled in the art of the present invention, and a detailed description thereof will be omitted.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may also be used as the pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides a feed containing a composition containing agar or agarose and the enzyme reaction product of DagA itself or a carrier acceptable as a feed. It can be used including the composition of this invention in the basic dietary material of a feeding object. In particular, the lack of exercise to worry about obesity, dogs and cats, such as pets or race horses will be effective.
  • the enzymatic reaction product of Streptomyces syphila DagA and agar or agarose shows excellent anti-obesity and anti-diabetic effect
  • administration or ingestion of the composition of the present invention effectively prevents and treats obesity and diabetes. And improvement.
  • 1 is a map of the pUWL201pw vector.
  • FIG. 2 is a map of a recombinant vector according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a graph showing the result of HPLC-ELSD analysis of the enzyme reaction product of the present invention.
  • 'NAO' enzyme reaction product of the present invention
  • 'DP6' neoagarohexaose
  • 'DP4' neoagarotetraose
  • 'DP2' alpha-amylase inhibitory activity of neoagarobiose
  • 5 is a graph showing the results of alpha-glucosidase inhibitory activity of NAO or DP6, DP4, DP2.
  • 'ND' normal diet
  • 'HFD' high fat diet
  • 'HFD-NAO 0.5%' a high fat diet containing the enzyme reaction product of the present invention
  • 'HFD-NAO 0.5%' a high fat diet containing the enzyme reaction product of the present invention
  • 'HFD-NAO 0.25%' a high fat diet containing the enzyme reaction product of the present invention
  • Figure 7 is a microscopic photograph taken by H & E staining the liver tissue of the experimental animals ingested ND, HFD, HFD-NAO 0.25% or HFD-NAO 0.5%.
  • A represents ND
  • B represents HFD
  • C represents HFD-NAO 0.25%
  • D represents HFD-NAO 0.5%.
  • Figure 8 is a graph showing the degree of liver fat degeneration of the experimental animals ingested ND, HFD, HFD-NAO 0.25% or HFD-NAO 0.5%.
  • FIG. 9 is a graph showing the size of epididymal adipose tissue cells of experimental animals fed ND, HFD, HFD-NAO 0.25% or HFD-NAO 0.5%.
  • FIG. 10 is a graph showing microscopic photographs (A-D) and oral glucose loading test results of H & E staining of epididymal adipose tissue of experimental animals fed ND, HFD, HFD-NAO 0.25% or HFD-NAO 0.5%.
  • E A represents ND, B represents HFD, C represents HFD-NAO 0.25%, and D represents HFD-NAO 0.5%.
  • DagA gene fragment (947bp fragment encoded with the signal peptide and the finished peptide of DagA, sequence number was obtained by PCR using the Asm-F and Asm-R primers of 1) amplified part of the primer), and the dagA gene was cloned into the pUWL201pw vector (see FIG. 1) using the restriction enzyme site (NdeI / BamHI) of the fragment, so that the transcription of the dagA gene was induced by the ermE promoter.
  • Recombinant vectors (see FIG. 2) were prepared to be regulated.
  • Asm-F primer 5′-GACATATGGTGGTCAACCGACGTGATC-3 ′ (NdeI) (SEQ ID NO: 3)
  • Asm-R Primer 5′-GGTGGATCCCTACACGGCCTGATACG-3 ′ (BamHI) (SEQ ID NO: 4)
  • the recombinant strain obtained by transforming Streptomyces lividans TK24 with this recombinant vector was used for the production of DagA.
  • This strain was inoculated in R2YE liquid medium containing 0.3% (w / v) agar and shaken at 28 rpm for 48-72 hours at 120 rpm. After the pre-culture process, the main culture was carried out, and each culture time was 2.5 days.
  • the culture solution obtained through the main culture was centrifuged to remove the cells, and the supernatant was filtered through an ultrafiltration membrane (5kDa cut-off membrane) to separate and purify the protein that did not pass through the filtration membrane.
  • the obtained concentrate (enzyme solution) was used while being lyophilized and stored.
  • the agarase activity of DagA of Example 1 was measured by a reduction equivalent assay method (DNS method).
  • DNS method a reduction equivalent assay method
  • 100 ⁇ l of the enzyme solution obtained in Example 1 3.9 ml of 50 mM phosphate solution (pH 7) dissolved in agarose at 0.2% (w / v) was mixed and reacted at 40 ° C. for 5 minutes, followed by DNS reagent (dinitrosalicylic acid 6.5g, 2M NaOH 325ml, glycerol 45ml / 1L distilled water) 4ml was added and boiled for 10 minutes and cooled to measure the absorbance ( ⁇ 540nm).
  • Enzyme 1U was defined as the activity of generating an absorbance ( ⁇ 540 nm) of 0.001 after 5 minutes reaction.
  • the supernatant was recovered by centrifugation to remove undigested agarose from the enzymatic reaction product, and then the enzymatic reaction product was confirmed by TLC (thin layer chromatography).
  • the recovered supernatant was partially purified by ultrafiltration using a 5KD cut-off membrane.
  • neoagarobiose neogarobiose, hereinafter referred to as 'DP2'
  • neoagarotetraose neogarotetraose, hereinafter referred to as 'DP4'
  • neoagarohexaose neoagarohexaose
  • the total amount of neoagarooligosaccharides consisting of the sum of hereinafter referred to as 'DP6' accounted for 65 ⁇ 20% (weight), and based on the total amount of neoagar oligosaccharides, DP2, DP4, and DP6 were 0 to 10%, 50 to 70%, and 30 to 50% by weight, respectively.
  • the purified products were purified by gel permeation chromatography (GPC) using BioGel P-2 gel (Biorad, Cat.No .: 150-4115), and purified by TLC and HPLC. Purity was confirmed through.
  • Example 3 DP2, DP4, DP6 obtained through purification in Example 5 and the enzyme reaction product (hereinafter referred to as 'NAO') obtained in Example 3 were used as samples.
  • Acarbose which is widely known as a type 2 diabetes treatment agent, is known to have antidiabetic effect as a mechanism for delaying glucose absorption by inhibiting the activity of alpha-amylase and alpha-glucosidase. Therefore, to investigate the diabetic relatedness of neoagar oligosaccharide, we investigated whether there is an enzyme activity inhibitory function similar to that of acarbose.
  • Each sample was mixed with an alpha-amylase solution, reacted with a starch azure solution as a substrate for 10 minutes, and the enzyme concentration was analyzed by measuring absorbance ( ⁇ 595 nm).
  • each sample was shown to have alpha-amylase inhibitory activity, but the inhibitory activity was lower than that of acarbose (positive control).
  • p-NPG p-nitrophenyl- ⁇ -D-glucopyranoside
  • Feeding high-fat diet to experimental animals can lead to an obese animal model that reflects the characteristics of obese patients, resulting in excessive visceral fat increase, hyperglycemia, dyslipidemia, hyperinsulinemia, and fatty degeneration in liver tissue. have.
  • mice which had been purged, were weighed according to their body weight according to the weight of the normal group (Normal diet, ND), high fat diet (HFD), and high fat-0.25% NAO mixed group (HFD).
  • ND normal group
  • HFD high fat diet
  • HFD high fat-0.25% NAO mixed group
  • -NAO 0.25% high fat-0.5% NAO mixed group
  • HFD-NAO 0.5%) was divided into four groups and each sample was fed with a high-fat diet for 9 weeks, blood biochemical test of experimental animals The anti-obesity and anti-diabetic effects of NAO were confirmed through histological examination and histopathologic examination.
  • Weight gain and dietary intake of the experimental animals fed the 9-week experimental diet are shown in Figure 6 and Table 1.
  • Body weight increased statistically from 1 week after high-fat diet, and at 9 weeks of the end of the experiment, the high-fat diet group (HFD), a control group, increased by 29.5% compared to the normal diet group (ND).
  • HFD high-fat diet group
  • ND normal diet group
  • the weight of the diet group with 0.5% NAO was significantly lower than that of the high-fat diet group, and the weight gain was less than that of the normal group.
  • the diet group added with 0.25% NAO did not show a significant difference from the high-fat diet group.
  • liver tissues and epididymal adipose tissues were collected from experimental animals fed a 9-week experimental diet and observed under a microscope. The results of H & E staining of liver tissues are shown in FIG. 7.
  • HFD 10.74 ⁇ 1.444 significantly increased the size of fat cells in epididymal fat tissue as compared to ND (4.65 ⁇ 0.54), but in the NAO-added diet group Adipose cell size decreased in both 0.25% (6.74 ⁇ 0.38) and 0.5% (6.95 ⁇ 0.82) groups compared to the high-fat diet group. Therefore, NAO seems to inhibit fat accumulation in liver and adipose tissue.
  • Serum lipid content was examined in Table 2 to determine the effect of high fat diet and NAO on lipid metabolism.
  • Serum total cholesterol content was 140.1 ⁇ 5.2mg / dL in ND group, compared with 182.0 ⁇ 8.2mg / dL in HFD group.
  • NAO-added diet group showed a tendency to decrease to 173.0 ⁇ 4.3mg / dL in 0.25% group and to 159.6 ⁇ 5.6mg / dL in 0.5% group.
  • serum triglycerides it increased to 48.7 ⁇ 3.2mg / dL in the ND group and 64.8 ⁇ 4.0mg / dL in the HFD group.
  • the diet group with NAO showed a tendency to decrease to 56.7 ⁇ 4.4mg / dL in 0.25% group and to 47.3 ⁇ 2.9mg / dL in 0.5% group.
  • FFA free fatty acid
  • FFA and TG levels are closely related to hepatic tissue production and insulin resistance. Therefore, NAO modulates blood FFA and TG, which is thought to be effective in improving insulin resistance, one of the main causes of type 2 diabetes.
  • the NAO-added diet group showed lower values than HFD, and the blood adiponectin showed higher values than HFD in the NAO-added diet group.
  • Adiponectin levels are also known to be closely associated with insulin resistance, and adiponectin levels in people who have insulin resistance fall off and their insulin resistance improves.
  • the adiponectin concentration of the HFD group was not significantly different from that of the normal group, but the insulin resistance and diabetes due to obesity did not seem to be sufficiently advanced in the HFD group.
  • the adiponectin level was increased in the NAO-added diet group compared to the normal group, suggesting that NAO may play an important role in improving insulin resistance.
  • progress was not made from HFD to diabetes, but diabetes-related indicators tended to deteriorate, and this was confirmed to be substantially normalized by ingesting NAO.
  • the OGTT assay results showed a clear diabetic improvement effect in the NAO-ingested diet group, demonstrating the potential of NAO as an antidiabetic functional material.
  • the composition of the present invention since the enzymatic reaction product of Streptomyces syphila DagA and agar or agarose shows excellent anti-obesity and anti-diabetic effect, administration or ingestion of the composition of the present invention effectively prevents and treats obesity and diabetes. And improvement. Accordingly, the composition of the present invention may be used for the use of medicines, foods, feeds and the like for preventing, treating and improving obesity and diabetes.

Abstract

본 발명은 DagA 효소반응으로 조제한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 한천 유래 네오아가로올리고당 복합 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) DagA와 한천 또는 아가로스(agarose)의 효소반응으로 수득한 반응산물을 유효성분으로 함유함으로써 비만 또는 당뇨의 예방, 치료, 개선 효과를 나타내는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 스트렙토마이세스 시리칼라 DagA와 한천 또는 아가로스의 효소반응산물이 우수한 항비만 및 항당뇨 효과를 나타내기 때문에, 본 발명의 조성물을 투여하거나 섭취하면 효과적으로 비만 및 당뇨를 예방, 치료 및 개선할 수 있다.

Description

덱에이 효소반응으로 조제한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 한천 유래 네오아가로올리고당 복합 조성물
본 발명은 DagA 효소반응으로 조제한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 한천 유래 네오아가로올리고당 복합 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) DagA와 한천 또는 아가로스(agarose)의 효소반응으로 수득한 반응산물을 유효성분으로 함유함으로써 비만 또는 당뇨의 예방, 치료, 개선 효과를 나타내는 조성물에 관한 것이다.
한천(Agar)은 오래 전부터 식품첨가물, 의약품, 화장품, 가축사료 및 공업원료 등으로 널리 이용되고 있는 대표적인 해조류 유래 다당류로, 국내의 경우 해마다 그 생산량이 약 3,600톤에 이르고 있는 비교적 풍부한 수산자원의 하나이다. 그러나 실제 이용 면에서는 전체생산량의 일부만이 단순가공 처리되어 값싼 원료로 사용될 뿐이며, 그 나머지는 대부분 방치되고 있어 부존자원량에 비해 부가가치가 매우 낮은 실정이다. 따라서 풍부한 국내 한천의 새로운 용도개발과 부가가치 향상에 관한 연구가 크게 요구되고 있는 실정이다.
한천은 아가로스(agarose)와 아가로펙틴(agaropectin)으로 구성되어있는데, 아가로스는 갈락토스(D-galactose)와 3,6-anhydro-L-galactose가 β-1, 4 형태로 결합한 단위체인 아가로비오스(agarobiose)가 반복되어 α-1, 3 결합으로 연결된 직쇄구조로 되어있고 겔(gel)화력이 강한 반면, 아가로펙틴은 아가로스와 마찬가지로 아가로비오스 단위로 되어 있으나 황산기 등의 산성기를 함유하며 겔화력이 약하다.
이중 아가로스는 β-1, 4 결합에 작용하는 베타-아가레즈(β-agarase)에 의해서 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)를 거쳐 네오아가로비오스(neoagarobiose)로 분해되고 계속해서 α-1, 3 결합에 작용하는 알파-아가레즈(α-agarase)에 의해서 갈락토스(D-galactose)와 3,6-anhydro-L-galactose로 최종 분해된다.
한편, 방선균인 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) A3(2)는 한천을 분해하는 세포외(세포밖으로 분비되는) 아가레즈를 생산한다고 알려져 있으며(Stanier et al., 1942, J. Bacteriol.; Hodgson and Chater, 1981, J. Gen. Microbiol.), 이 아가레즈는 dagA 유전자에 의해서 코드되어 있다. 방선균에서는 dagA 유전자가 그 기능이 유일하게 알려진 베타-아가레즈(β-agarase) 유전자로서 방선균에서의 아가레즈 생산 연구에 있어서 중요한 위치를 갖는다. 특히 스트렙토마이세스 시리칼라는 방선균의 분자생물학적 연구에 가장 널리 사용되는 균주로서 2002년 영국의 Sanger centre에서 염색체 DNA의 서열이 분석되어 공개되어 있다(Bentley et al.,2002, Nature).
본 발명자는 풍부한 수산자원인 한천을 보다 유용하게 활용할 수 있는 방법을 개발하고자 하였고, 한천이 다당류이므로 당분해효소를 적절히 활용하면 한천의 분해과정에서 생리활성효과를 나타내는 다양한 당 유래 화합물이 생성될 수 있다는 가능성에 주목하게 되었다. 그리고 방선균은 항생제 등 유용한 생리활성물질을 생산하는 미생물이며, 이 생리활성물질에는 당과 관련된 다양한 화합물이 포함되기 때문에, 방선균 중에는 한천을 분해하거나 변형시켜 유용한 당 화합물로 전환시킬 수 있는 효소를 보유한 균주가 있을 것이라 생각하였다. 따라서 이러한 방선균으로부터 유용한 효소를 탐색하고 이를 한천의 효소반응에 적용하여 유용한 생리활성 물질의 생산을 시도하였다.
한천과 같은 고분자 다당류는 효소반응을 통해 상대적으로 크기가 작은 올리고당이 생성될 수 있다. 이러한 올리고당 중에는 생체의 대사에 사용되는 올리고당과 분자적 형태는 유사하지만 관련 효소가 분해할 수 없기 때문에 결과적으로 당분해 효소의 활성을 저해할 수 있는 것들이 존재한다. 본 발명자는 이 점에 주목하여, 한천의 효소반응산물에 대한 당분해 효소 활성의 저해능을 확인함으로써 비만이나 당뇨에 효과적인 물질을 개발하고자 하였다.
이의 결과, 방선균인 스트렙토마이세스 시리칼라의 DagA와 한천 또는 아가로스의 효소반응을 통해 수득한 반응산물이 비만 또는 당뇨의 예방, 치료, 개선에 우수한 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 특허출원은 2013 ~ 2014년도 농촌진흥청의 재원으로 차세대바이오그린21사업(과제고유번호 : PJ009536, 연구과제명 : 한천올리고당의 항비만효능 검정을 통한 고부가 가치 식의약소재 개발)의 지원을 받아 수행된 연구성과에 의한 것이다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 한천을 기질로 하는 효소반응을 통해 생산되는 유용한 생리활성 물질, 그 중에서도 특히 지방세포 분화 및 당 대사를 조절함으로써 비만 또는 당뇨에 우수한 효과를 나타내는 생리활성 물질을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) DagA와 한천 또는 아가로스(agarose)의 효소반응으로 수득한 반응산물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 반응산물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 반응산물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료를 제공한다.
본 발명에서 상기 효소반응은 35 내지 45℃의 온도 및 pH 6 내지 8에서 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에서 상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스(agarose) 용액에 20 내지 100unit/㎖의 농도로 DagA를 첨가하여 이루어지는 것이 바람직하다. 이때 1unit은 0.2%(w/v)로 아가로스를 녹인 50mM 인산용액(pH 7)과 40℃에서 5분간 반응(반응액 4㎖)한 후 반응액과 동량의 DNS 시약(dinitrosalicylic acid 6.5g, 2M NaOH 325㎖, glycerol 45㎖ / 1ℓ 증류수)을 넣고 10분간 끓인 다음 식혀 흡광도(Å540㎚)을 측정하였을 때, 흡광도(Å540㎚) 0.001을 생성하는 양을 의미한다.
본 발명에서 상기 반응산물은 반응산물 총중량을 기준으로 45 내지 85중량%의 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 혼합물을 함유하고, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 10중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 함유하며, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 함유하며, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 함유하며, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료를 제공한다.
본 발명에서 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 10중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 스트렙토마이세스 시리칼라 DagA는 서열번호 2의 31 ~ 309번 사이의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미하며, 스트렙토마이세스 시리칼라로부터 생산되거나 이종균주로부터 생산된 단백질을 포함한다. 또한, 기능이 전혀 다른 것으로 변경되거나 아가레즈 활성을 잃지 않는 범위 내에서 통상적인 유전자 재조합 방법 즉, 정제를 유리하게 하기 위해 표지 아미노산을 포함시키거나 이종 발현을 위해 아미노산 서열을 변경하는 등의 방법에 따라 재조합된 단백질을 포함한다.
DagA는 본래 스트렙토마이세스 시리칼라가 생산하는 베타-아가레즈로 유전자로부터 번역될 때 서열번호 2의 309개 아미노산을 갖고 분자량이 약 35kDa인 상태로 생산되며, N-말단 30개의 아미노산 시그널 펩티드가 잘려져서 완성된 세포외형 단백질(약 32kDa)의 상태로 분비된다.
스트렙토마이세스 시리칼라의 dagA 유전자가 이 DagA를 암호화하며, dagA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있다. 서열번호 1은 스트렙토마이세스 시리칼라 A3(2)의 게놈에 존재하는 유전자의 염기서열로 NCBI(미국 국립생물정보센터) 데이터베이스 상에 “SCO3471”로 명명되어 있다. In vitro 실험을 통해 확인된 바에 따르면, dagA 유전자의 전사는 RNA 중합효소의 적어도 다른 3가지의 완전효소(holoenzyme)에 의해 인지되는 4 또는 5가지의 다른 프로모터(promoter)에 의해 조절된다. dagA 유전자의 전사단계 분석을 통해, 전사가 암호화 서열의 상부 32, 77, 125 및 220번째 염기에서 개시되는 것으로 나타났다.
본래 DagA의 생산 균주인 스트렙토마이세스 시리칼라의 배양을 통해 본 발명의 DagA를 생산할 수 있으나, 생산효율을 높이기 위해 이종균주인 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans)의 발현 시스템을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 dagA 유전자를 방선균용 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조한 다음 이 재조합 벡터로 스트렙토마이세스 리비던스를 형질전환하고, 이 형질전환체를 배양하는 방법을 사용할 수 있다. 이 경우 재조합 벡터는 dagA 유전자가 방선균 유래 프로모터에 의해 전사가 조절될 수 있도록 구성하는 것이 바람직하다.
방선균 유래 프로모터에는 sgtR 프로모터(sgtRp), ermE 프로모터(ermEp), tipA 프로모터(tipAp) 등 다양한 프로모터가 존재하므로 재조합 벡터를 제조할 때 이들을 선택하여 사용할 수 있다. 이들 프로모터에 의해 전사가 조절될 수 있도록 구성된 여러 종류의 벡터들이 개발되어 있어, 이 벡터에 SCO3471를 클로닝하면 방선균 유래 프로모터에 의해 전사가 조절되는 구조의 재조합 벡터를 제조할 수 있다.
형질전환체는 숙주균주를 재조합 벡터로 형질전환시켜 제조할 수 있는데, 숙주균주에 따라 형질전환을 위한 방법이 다양하게 존재하므로, 적절한 방법을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 스트렙토마이세스 리비던스를 숙주균주로 사용하는 경우 PEG(polyethylene glycol)를 매개로한 형질전환 방법을 사용할 수 있다.
형질전환체 등과 같은 DagA 생산균주를 액체배지에서 배양하면 DagA를 생산할 수 있으며, 배양액을 수득하여 한외여과법과 같은 통상의 단백질 정제 방법을 이용하면 고순도의 DagA를 생산할 수 있다. 이때 액체배지에 아가(agar) 또는 아가로스(agarose)를 포함시키면 보다 효율적으로 DagA를 생산할 수 있다.
본 발명에 따르면, 한천 또는 아가로스와 DagA의 효소반응을 통해 네오아가로헥사오스, 네오아가로테트라오스, 네오아가로비오스가 생성되는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명에서 효소반응산물은 이들 각각이 될 수 있으며, 이들이 혼합된 상태가 될 수 있다. 하지만, 본 발명에서 확인된 이들 세 가지 반응산물 이외에도 다른 반응산물이 생성될 수 있으므로, 반드시 이들 세 가지 반응산물로만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 한천 또는 아가로스와 DagA의 효소반응 이후 한외여과를 통해 수득한 반응산물(네오아가로헥사오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로비오스가 모두 포함된 형태이며, 이들 이외의 반응산물이 포함되어 있을 수 있음) 뿐만 아니라 각각의 네오아가로헥사오스, 네오아가로테트라오스, 네오아가로비오스 또한 비만 및 당뇨의 예방 및 치료 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
본 발명의 조성물은 의약품 및 식품 등의 용도로 사용할 수 있다.
식품의약품안전처(MFDS)의 통상적인 약제학적 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있으며, 통상적인 방법으로 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 유효성분을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시킬 수 있다.
상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 물, 링거액 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제 등과 같은 제형으로 제조할 수 있다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 흡입 등을 통한 유효성분의 투여를 의미한다.
상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 10 내지 200㎎을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.
상기 유효량을 기준으로, 본 발명은 한천 또는 아가로스와 DagA의 효소반응산물 그 자체 또는 식품학적으로 허용된 담체를 혼합한 조성물을 함유하는 식품을 제공한다. 식육가공품, 어육제품, 두부, 묵, 죽, 라면이나 국수 등의 면류, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등의 조미식품, 소스, 과자, 발효유나 치즈 등의 유가공품, 김치나 장아찌 등의 절임식품, 과실, 채소, 두유, 발효음료 등의 음료수의 식품에 포함하여 사용할 수 있다. 각 식품의 조리 방법이나 생산 방법은 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명한 사항으로 이에 대한 구체적인 기재는 생략하기로 한다. 또한 식품학적으로 허용된 담체는 상술한 약제학적으로 허용된 담체도 사용할 수 있다.
상기 유효량을 기준으로, 본 발명은 한천 또는 아가로스와 DagA의 효소반응산물 그 자체 또는 사료로 허용된 담체를 혼합한 조성물을 함유하는 사료를 제공한다. 급이 대상의 기본식이소재에 본 발명의 조성물을 포함하여 사용할 수 있다. 특히, 운동이 부족하여 비만이 걱정되는 개, 고양이 등의 애완동물이나 경주마의 사료로 사용하면 효과적일 것이다.
본 발명에 따르면, 스트렙토마이세스 시리칼라 DagA와 한천 또는 아가로스의 효소반응산물이 우수한 항비만 및 항당뇨 효과를 나타내기 때문에, 본 발명의 조성물을 투여하거나 섭취하면 효과적으로 비만 및 당뇨를 예방, 치료 및 개선할 수 있다.
도 1은 pUWL201pw 벡터의 지도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 벡터의 지도이다.
도 3은 본 발명의 효소반응산물을 HPLC-ELSD 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 효소반응산물(이하, 'NAO'라 한다) 또는 이를 정제하여 수득한 네오아가로헥사오스(이하, 'DP6'라 한다), 네오아가로테트라오스(이하, 'DP4'라 한다), 네오아가로비오스(이하, 'DP2'라 한다)의 알파-아밀라아제 저해 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 NAO 또는 DP6, DP4, DP2의 알파-글루코시다아제 저해 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 정상식이(이하, 'ND'라 한다), 고지방식이(이하, 'HFD'라 한다), 0.25%(w/w) 본 발명의 효소반응산물이 포함된 고지방식이(이하, 'HFD-NAO 0.25%'라 한다) 또는 0.5%(w/w) 본 발명의 효소반응산물이 포함된 고지방식이(이하, 'HFD-NAO 0.5%'라 한다)를 섭취시킨 실험동물의 일자별 체중증가량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 ND, HFD, HFD-NAO 0.25% 또는 HFD-NAO 0.5%를 섭취시킨 실험동물의 간 조직을 H&E 염색하여 현미경으로 촬영한 사진이다. A는 ND, B는 HFD, C는 HFD-NAO 0.25%, D는 HFD-NAO 0.5% 실험군의 조직을 나타낸다.
도 8은 ND, HFD, HFD-NAO 0.25% 또는 HFD-NAO 0.5%를 섭취시킨 실험동물의 간 지방변성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 ND, HFD, HFD-NAO 0.25% 또는 HFD-NAO 0.5%를 섭취시킨 실험동물의 부고환지방조직 세포의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 10은 ND, HFD, HFD-NAO 0.25% 또는 HFD-NAO 0.5%를 섭취시킨 실험동물의 부고환지방조직을 H&E 염색하여 현미경으로 촬영한 사진(A ~ D)과 경구 당 부하시험 결과를 나타낸 그래프(E)이다. A는 ND, B는 HFD, C는 HFD-NAO 0.25%, D는 HFD-NAO 0.5% 실험군의 조직을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. DagA 생산
스트렙토마이세스 시리칼라 A3(2)의 염색체 DNA를 주형으로 하고 아래의 Asm-F 및 Asm-R 프라이머를 사용한 PCR을 통해 dagA 유전자 단편(DagA의 시그널 펩타이드 및 완성형 펩타이드가 암호화된 947bp 단편, 서열번호 1에 프라이머의 일부 서열이 포함된 상태)을 증폭하였고, 단편의 제한효소 부위(NdeI/BamHI)를 이용하여 pUWL201pw 벡터(도 1 참조)에 dagA 유전자를 클로닝하여 dagA 유전자의 전사가 ermE 프로모터에 의해 조절되도록 재조합 벡터(도 2 참조)를 제조하였다.
Asm-F 프라이머 : 5′-GACATATGGTGGTCAACCGACGTGATC-3′(NdeI) (서열번호 3)
Asm-R 프라이머 : 5′-GGTGGATCCCTACACGGCCTGATACG-3′(BamHI) (서열번호 4)
이 재조합 벡터로 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans) TK24를 형질전환하여 수득한 형질전환균주를 DagA의 생산을 위해 사용하였다.
이 균주를 0.3%(w/v)의 아가(agar)가 포함된 R2YE 액체배지에 접종하여 28℃에서 48 내지 72시간 120rpm으로 진탕배양하였다. 전배양 과정을 거친 다음 본배양을 실시하였으며, 각 배양시간은 2.5일로 하였다.
본배양을 통해 수득한 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 다음, 상층액을 한외여과막(5kDa cut-off membrane)으로 여과하여 여과막을 통과하지 못한 단백질을 분리 및 정제하였다. 수득한 농축액(효소액)은 동결건조하여 보관하면서 사용하였다.
실시예 2. DagA의 아가레즈 활성 측정
환원당량 검정방법(DNS method)으로 상기 실시예 1의 DagA에 대한 아가레즈 활성을 측정하였다. 실시예 1에서 수득한 효소액 100㎕에 0.2%(w/v)로 아가로스를 녹인 50mM 인산용액(pH 7) 3.9㎖를 섞어 40℃에서 5분간 반응시킨 후 DNS 시약(dinitrosalicylic acid 6.5g, 2M NaOH 325㎖, glycerol 45㎖ / 1ℓ 증류수) 4㎖를 넣고 10분간 끓인 다음 식혀 흡광도(Å540㎚)을 측정하였다. 효소 1U은 5분 반응 후에 흡광도(Å540㎚) 0.001을 생성하는 활성으로 정의하였다.
실시예 3. DagA 효소반응산물
3-1. DagA를 이용한 한천 또는 아가로스의 분해
0.5 내지 5%(w/v) 한천 또는 아가로스를 녹인 20mM Tris-HCl 용액 1ℓ를 제조하여 100℃에서 약 10분간 가열하여 충분히 녹인 다음 40℃로 온도를 떨어뜨리고 DagA 효소 2,000 내지 50,000U을 처리하여 24시간 효소반응을 실시하였다.
3-2. DagA 효소반응산물의 전처리
효소반응산물에서 미분해된 아가로스를 제거하기 위해 원심분리하여 상등액을 회수한 다음 TLC(thin layer chromatography)를 이용하여 효소반응 생성물을 확인하였다. 회수한 상등액을 5KDa cut-off membrane으로 한외여과방법을 통해 부분 정제하였다.
실시예 4. HPLC-ELSD 분석을 통한 DagA 효소반응산물의 조성 확인
HPLC-ELSD 분석을 통해 상기 실시예 4에서 수득한 효소반응산물의 조성을 확인하였다. NH2 P-50 4E multimode column(250 x 4.6mm)을 사용하였으며 이동상으로 아세토니트릴(acetonitrile)과 물의 혼합용액(acetonitrile : water = 65 : 35)을 사용하였다.
이의 결과, 도 3에서와 같이 반응산물 중 네오아가로비오스(neoagarobiose, 이하 'DP2'라 한다), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, 이하 'DP4'라 한다) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, 이하 'DP6'라 한다)의 합으로 이루어진 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharides)의 총량이 65±20%(중량)를 차지하는 것으로 나타났고, 이 네오아가로올리고당의 총량을 기준으로 DP2, DP4, DP6가 각각 0 ~ 10%, 50 ~ 70%, 30 ~ 50%(중량)를 차지하는 것으로 나타났다.
실시예 5. 겔여과 크로마토그래피를 이용한 DagA 효소반응산물의 정제
BioGel P-2 gel(Biorad, Cat. No.: 150-4115)을 이용하여 겔여과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC)를 통해 DP6, DP4, DP2를 순수하게 정제하여 정제한 산물들은 TLC와 HPLC를 통해 순도를 확인하였다.
실시예 6. DagA 효소반응산물의 항비만 및 항당뇨 효능 확인 시험
6-1. 알파-아밀라아제(α-amylase) 저해 활성
상기 실시예 5에서 정제를 통해 수득한 DP2, DP4, DP6 및 실시예 3에서 수득한 효소반응산물(이하 'NAO'라 한다)을 시료로 사용하였다.
제2형 당뇨병 치료제로 널리 알려져 있는 아카보스(acarbose)는 알파-아밀라아제 및 알파-글루코시다아제의 활성을 억제하여 당 흡수를 지연시키는 기작으로 항당뇨 효과를 나타낸다고 알려져 있다. 따라서 네오아가로올리고당의 당뇨관련성을 확인하기 위해 아카보스와 유사한 효소활성 억제 기능이 있는지를 조사하였다.
알파-아밀라아제 용액과 각 시료를 섞고 기질로서 전분 청색 시약(starch azure solution)을 넣어 10분간 반응시킨 다음 분해되어 나타나는 청색의 농도를 흡광도(Å595㎚)로 측정하여 효소활성을 분석하였다.
이의 결과, 도 4에서와 같이 각 시료가 알파-아밀라아제 저해 활성을 갖는 것으로 나타났으나, 아카보스(양성 대조군)에 비해서는 저해활성이 낮은 것으로 나타났다.
6-2. 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성
DP2, DP4, DP6 및 NAO를 시료로 사용하였다.
알파-글루코시다아제 용액과 각 시료를 섞고, 기질로서 p-NPG(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside) 용액을 넣어 10분간 반응시킨 다음 분해되어 생성된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 농도를 흡광도(Å405nm)로 측정하여 효소활성을 분석하였다.
이의 결과, 도 5에서와 같이 제2형 당뇨병 치료제인 아카보스(양성 대조군) 만큼 높은 저해활성은 아니지만 DP2, DP4, DP6 및 NAO 모두 저해활성이 있음을 확인하였다.
6-3. 비만 유발쥐에서의 항비만 및 항당뇨 효과 확인
실험동물(마우스)에 고지방사료를 급여하면 과다한 내장 지방 증가, 고혈당, 이상 지질증, 고인슐린혈증 및 간 조직에 지방 변성이 발생하여 비만 환자에 나타나는 특징을 잘 반영하는 비만 동물모델을 수립할 수 있다.
이에 따라 순화기간이 종료된 4주령의 C57bl/6 마우스를 체중에 따라 난괴법에 의하여 정상군(Normal diet, ND), 고지방대조군(High fat diet, HFD), 고지방-0.25% NAO 혼합군(HFD-NAO 0.25%), 고지방-0.5% NAO 혼합군(HFD-NAO 0.5%)의 4개 군으로 분리한 다음 각각에 대한 시료를 고지방식이와 함께 9주간 공급하였고, 실험동물의 혈액생화학적 검사, 조직학적 검사, 포도당 내성 검사를 통하여 NAO의 항비만 및 항당뇨 효과를 확인하였다.
9주간 실험식이를 급여한 실험동물의 체중증가량과 식이섭취량은 도 6 및 표 1과 같다. 체중은 고지방식이 공급 1주 이후부터 통계적 유의차가 나타나 실험종료 시점인 9주째에는 대조군인 고지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND)에 비하여 29.5% 증가해 고지방식이로 인한 마우스의 비만 유도를 관찰할 수 있었다. NAO를 0.5%로 첨가한 식이군의 체중은 고지방식이군에 비하여 유의적으로 낮았으며, 체중증가량에 있어서도 정상군보다 적은 체중증가량을 보였다. 반면에, NAO를 0.25%로 첨가한 식이군에서는 고지방식이군과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
표 1
급여전 체중(g) 급여완료후 체중(g) 체중증가량(g/10 wks) 식이섭취량(g/day) 사료효율1)
ND 21.13±0.27 29.35±0.27 8.22±0.19 4.15±0.09 2.02±0.07
HFD 21.30±0.30 37.78±1.04† 16.48±0.85 2.74±0.05† 6.40±0.51†
HFD-NAO 0.25% 21.00±0.25 37.59±0.63 16.59±0.58† 2.56±0.10 6.45±0.36
HFD-NAO 0.5% 20.89±0.27 34.37±0.97* 13.48±0.94* 2.77±0.01 4.82±0.36*
1) 사료효율 : 체중증가량/식이섭취량
결과값 : 평균±표준편차, T-검정(n=6~10)에 의해 p<0.05에서 유의적인 차이가 있음.
† 정상식이군에 대한 p<0.05, * 고지방식이군에 대한 p<0.05
9주간 실험식이를 급여한 실험동물로부터 간조직 및 부고환지방조직을 채취하여 현미경으로 관찰하였으며, 간 조직의 H&E 염색(staining) 결과는 도 7과 같다.
간조직의 경우, Kleiner DE et. al.(2005)의 간 지방변성(steatosis) 정도 비교 방법에 따라 지방변성 정도를 구분하였으며, 이의 결과는 도 8과 같다. 고지방식이 섭취에 따른 간조직 내 지방축적이 정상식이군에 비하여 현격하게 높은 것으로 나타나 소수포성 지방변성(micro-vescularsteotosis)과 대수포성 지방변성 (macro-vescularsteotosis) 형태를 나타내었다(grade 1.75±0.41). 이에 반하여 NAO 첨가 식이군에서는 0.25%군(grade 0.75±0.16)과 0.5%(grade 0.37±0.18)군 모두에서 지방공포의 수와 크기가 정상 수준으로 감소한 것으로 나타나, NAO에 의해 간조직내 지방침착이 억제됨을 확인하였다.
부고환주위 지방조직의 H&E 염색 결과, 도 9 및 10과 같이 HFD(10.74±1.44)가 ND(4.65±0.54)에 비하여 부고환지방 조직에서 지방세포의 크기가 현저히 증가하였으나, NAO를 첨가한 식이군에서는 0.25%군(6.74±0.38)과 0.5%(6.95±0.82)군 모두에서 고지방식이군에 비해 지방세포의 크기가 감소하였다. 따라서 NAO는 간 및 지방조직 내 지방축적을 억제시키는 것으로 사료된다.
고지방식이 및 NAO가 지질대사에 미치는 영향을 확인하기 위해 혈청 내 지질함량을 조사하여 표 2에 나타내었다. 혈청 총콜레스테롤 함량은 ND군의 경우 140.1±5.2mg/dL이었고, 이에 비해 HFD군에서는 182.0±8.2mg/dL로 증가하였다. 반면에 NAO를 첨가한 식이군은 0.25%군에서 173.0±4.3mg/dL로 감소하는 경향을 나타내었으며 0.5%군에서는 159.6±5.6mg/dL로 유의성 있게 감소하였다. 혈청 중성지방의 경우, ND군의 경우 48.7±3.2mg/dL인 반면 HFD군에서는 64.8±4.0mg/dL로 증가하였다. NAO를 첨가한 식이군은 0.25%군에서 56.7±4.4mg/dL로 감소하는 경향을 나타내었으며 0.5%군에서는 47.3±2.9mg/dL로 유의성 있게 감소하였다. 또한 혈중 FFA(Free fatty acid)도 고지방식이군에서는 정상보다 높은 수치를 나타냈으나 NAO를 첨가한 식이군에서는 정상과 비슷한 수준의 수치를 나타내었다. 혈중 FFA농도와 TG의 농도는 간조직의 지방침작과 인슐린저항성과 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다. 따라서 NAO가 혈중 FFA와 TG를 조절함으로서 제 2형 당뇨의 주된 원인중 하나인 인슐린 저항성을 개선하는 효과가 있는 것으로 판단된다.
표 2
T-CHO(mg/dL) TG(mg/dL) FFA(mEq/L)
ND 140.1±5.2 48.7±3.2 1.28±0.07
HFD 182.0±8.2† 64.8±4.0† 1.52±0.11†
HFD-NAO 0.25% 173.0±4.3 56.7±4.4 1.30±0.05*
HFD-NAO 0.5% 159.6±5.6* 47.3±2.9* 1.22±0.06*
결과값 : 평균±표준편차, T-검정(n=8)에 의해 p<0.05에서 유의적인 차이가 있음.
† 정상식이군에 대한 p<0.05, * 고지방식이군에 대한 p<0.05
NAO의 당뇨개선 효과 및 인슐린 저항성 개선 효과를 확인하기 위하여 Oral GTT와 인슐린저항성과 관련한 생화학적 분석을 수행하여 결과를 도 10(E)와 표 3에 나타내었다. NAO를 9주간 섭취시킨 후 포도당(glucose)을 경구 투여하고 혈당을 측정한 결과 고지방식이군은 혈당 투여 후 30분과 60분 시점에 정상군보다 높은 혈당수치를 나타내어 인슐린 저항성이 유발됐음을 확인할 수 있었다. 이에 반하여 NAO를 첨가한 식이군에서는 30분과 60분 시점에 고지방식이군 보다 유의성 있게 낮은 혈당 수치를 나타내었으며 AUC(Area under curve)를 계산하여 비교한 결과에서도 NAO를 첨가한 식이군에서 유의성이 있게 낮게 나타났다. 이는 고지방식이를 통해 유발된 인슐린저항성이 NAO를 같이 섭취함으로서 정상과 비슷한 수준으로 회복됨을 시사하고 있다. 또한 표 3에 나타낸 바와 같이 혈중 인슐린과 혈당 측정결과, NAO를 첨가한 식이군에서 HFD보다 낮은 수치를 나타내었고, 혈중 아디포넥틴은 NAO를 첨가한 식이군에서 HFD보다 높은 수치를 나타내었다. 아디포넥틴 수치는 인슐린저항성과도 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있는데, 인슐린저항성이 있는 사람의 아디포넥틴 수치가 떨어져 있고 이들의 인슐린저항성이 개선되면 아디포넥틴 수치도 올라간다고 하였다. 표 3에서 나타난 바와 같이 HFD군의 아디포넥틴 농도는 정상군과 큰 차이를 보이지 않았는데, HFD군에서 비만에 의한 인슐린저항성 및 당뇨가 충분히 진전되지 않은 것으로 보인다. 그렇지만, NAO를 첨가한 식이군에서 아디포넥틴의 수치가 정상군에 비해 증가하는 것으로 나타나, NAO가 인슐린 저항성 개선에 중요한 기능을 할 수 있음을 시사하였다. 본 실시예에서는 HFD에서 당뇨병으로까지는 진전이 되지 않았으나 당뇨관련 지표들이 악화되는 경향을 보였으며, 이는 NAO를 섭취함으로써 상당부분 정상화됨을 확인할 수 있었다. 또한, OGTT 검정 결과에서는 NAO를 섭취한 식이군에서 확실한 당뇨개선 효과를 보여 항당뇨 기능성 소재로서 NAO의 가능성을 입증하였다.
표 3
Insulin(ng/㎖) Glucose(㎎/㎗) Adiponectin(㎍/㎖)
ND 0.72±0.12 115.4±7.3 47.29±5.66
HFD 1.35±0.14† 153.3±7.3† 48.38±10.95
HFD-NAO 0.25% 0.92±0.13* 159.4±4.0 55.35±4.09
HFD-NAO 0.5% 0.94±0.14 156.8±19.6 58.91±11.45
결과값 : 평균±표준편차, T-검정(n=8)에 의해 p<0.05에서 유의적인 차이가 있음.
† 정상식이군에 대한 p<0.05, * 고지방식이군에 대한 p<0.05
본 발명에 따르면, 스트렙토마이세스 시리칼라 DagA와 한천 또는 아가로스의 효소반응산물이 우수한 항비만 및 항당뇨 효과를 나타내기 때문에, 본 발명의 조성물을 투여하거나 섭취하면 효과적으로 비만 및 당뇨를 예방, 치료 및 개선할 수 있다. 이에 따라 본 발명의 조성물은 비만 및 당뇨를 예방, 치료 및 개선하기 위한 의약품, 식품, 사료 등의 용도로 사용할 수 있을 것이다.

Claims (18)

  1. 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) DagA와 한천 또는 아가로스(agarose)의 효소반응으로 수득한 반응산물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 효소반응은 35 내지 45℃의 온도 및 pH 6 내지 8에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스 용액에 20 내지 100unit/㎖의 농도로 DagA를 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 반응산물은 반응산물 총중량을 기준으로 45 내지 85중량%의 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 혼합물을 함유하고, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 10중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  5. 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) DagA와 한천 또는 아가로스(agarose)의 효소반응으로 수득한 반응산물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 효소반응은 35 내지 45℃의 온도 및 pH 6 내지 8에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스 용액에 20 내지 100unit/㎖의 농도로 DagA를 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품.
  8. 제 5항에 있어서,
    상기 반응산물은 반응산물 총중량을 기준으로 45 내지 85중량%의 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 혼합물을 함유하고, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 10중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품.
  9. 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) DagA와 한천 또는 아가로스(agarose)의 효소반응으로 수득한 반응산물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 효소반응은 35 내지 45℃의 온도 및 pH 6 내지 8에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스 용액에 20 내지 100unit/㎖의 농도로 DagA를 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료.
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 반응산물은 반응산물 총중량을 기준으로 45 내지 85중량%의 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 혼합물을 함유하고, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 10중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료.
  13. 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 함유하며,
    상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 10중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  15. 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 함유하며,
    상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 10중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품.
  17. 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 함유하며,
    상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 10중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 사료.
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