KR102275125B1 - 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 포함하는 면역증강용 조성물 - Google Patents

난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 포함하는 면역증강용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인을 이용하여 제조된 난백 오보트랜스페린 가수분해물을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인을 이용하여 제조된 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의해 대식세포가 활성이 증가하는 것을 확인하였으며, 활성화된 대식세포에서 iNOS의 발현과 NO의 생성, 전염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 생성이 증가하였을 뿐만 아니라, 식세포 작용 활성 역시 증가된 것을 확인하였으므로, 본 발명의 오보트랜스페린 효소 가수분해물은 식품 및 제약 분야에서 면역 증진을 위한 기능성 소재로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 포함하는 면역증강용 조성물{Composition for Enhancing Immunity Comprising Egg White Ovotransferrin Enzyme Hydrolyzate}
본 발명은 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인을 이용하여 제조된 난백 오보트랜스페린 가수분해물을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.
오보트랜스페린(ovotransferrin)은 계란 난백에 존재하는 단백질로서 오보알부민 다음으로 많은 비중(12 ~ 13%)을 차지하고 있다. 오보트랜스페린은 트랜스페린 계열의 단백질로서 잘 알려져 있으며, 철과의 결합능력이 매우 우수한 것으로 알려져있다 (Wu J, Acero-Lopez A.. Food Res Int., 46:480-487, 2012).
오보트랜스페린은 686개의 아미노산으로 구성되어 있으며 분자량은 78 kDa으로 분자 구조 내에 2개의 철과의 결합 부위가 존재하여 한 분자당 두 개의 철 이온과 결합할 수 있다. 이러한 철과의 결합 능력으로 인해 항균활성이 있다고 보고되고 있으며, 이외에도 항산화, 항바이러스, 항암 효과 등이 있다고 보고되고 있다 (Giansanti F, et al., Biochem Cell Biol., 80:125-130, 2002; Ibrahim HR, et al., Int J Biol Macromol., 41:631-640, 2007; Moon SH, et al., Poult Sci., 92:424-434, 2013). 하지만, 다양한 기능성을 보고하고 있음에도 불구하고 오보트랜스페린의 효소 가수분해물의 면역 증진 활성에 대한 연구는 미비한 실정이다.
사람의 면역계를 활성화시키는 면역 증진 물질들은 최근 많은 연구에서 주목을 받고 있다. 면역 반응에 대한 적절한 조절은 고령의 노인이나 암환자 같은 면역 체계가 불안정한 사람들에게 특히 중요하다. 면역 반응은 다양한 질병을 예방하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있기 때문이다. 따라서 다양한 천연 물질 (허브, 계란 단백질, 포도, 유산균 등)로부터 면역 증진 물질을 찾는 연구가 진행되고 있다.
대식세포는 선천 면역과 적응 면역에서 중요한 역할을 하며 체내 다양하게 존재하고 있음이 잘 알려져 있다. 외부 병원성 균으로부터의 자극을 받았을 때, 대식세포는 인체를 보호하기 위해 전염증성 케모카인과 사이토카인을 생산해낸다. 예를 들면, 산화질소(nitric oxide; NO), 인터루킨(interleukin) 계열 사이토카인(IL-1β, IL-6, IL-12), 인터페론-γ(interferon-γ; IFN-γ), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등이다. 이런 대식세포의 활성화는 외부로부터 침입한 병원균으로부터 인체를 보호하기 위해 필수적인 단계이다. 대식세포가 활성화 되면, 식세포작용이나 전염증성 매개체의 생산과 같은 체내 방어 반응을 시작하게 된다. 이런 대식세포의 활성화는 잘 알려진 세포 신호 전달 경로인 MAPK 경로(mitogen activated protein kinase pathway)와 깊은 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
이에, 본 발명에서는 오보트랜스페린의 대식세포 활성 효과를 증가시킬 수 있는 효소 가수분해물을 선별하기 위해 예의 노력한 결과, 다른 효소들에 비해 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인을 처리하여 제조한 오보트랜스페린 효소 가수분해물이 MAPK 세포신호전달경로를 통해 대식세포를 활성화 시키는 것을 확인하였으며, 활성화된 대식세포는 iNOS의 발현과 NO의 생성, 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 생성이 증가될 뿐만 아니라, 식세포 활성이 증가된 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 포함하는 면역증강용 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인을 이용하여 제조된 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약학적 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의해 대식세포가 활성화될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물은 MAPK 세포신호전달경로를 통해 대식세포를 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의해 대식세포의 iNOS 발현, NO 생성 및 전염증사이토카인 생성이 증가될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 오보트렌스페린 가수분해물에 의해 대식세포의 식세포 작용이 증가할 수 있다.
또한, 본 발명은 난백 오보트랜스페린에 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인을 처리하는 단계를 포함하는 대식세포 활성능을 가지는 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서는 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인을 이용하여 제조된 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의해 대식세포가 활성이 증가하는 것을 확인하였으며, 활성화된 대식세포에서 iNOS의 발현과 NO의 생성, 전염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 생성이 증가하였을 뿐만 아니라, 식세포 작용 활성 역시 증가된 것을 확인하였으므로, 본 발명의 오보트랜스페린 효소 가수분해물은 식품 및 제약 분야에서 면역 증진을 위한 기능성 소재로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 오보트랜스페린 효소 가수분해물 처리에 따른 RAW 264.7 대식세포의 NO 생성에 미치는 영향을 확인한 데이터이다. 도면에서 OTF는 오보트랜스페린, Bro는 브로멜라인 효소 가수분해물, Fla는 플라보자임 효소 가수분해물, Neu는 뉴트레아제 효소 가수분해물, Pan은 판크레아틴 효소 가수분해물, Pap는 파파인 효소 가수분해물, Pep는 펩신 효소 가수분해물, Pro는 프로타맥스 효소 가수분해물을 의미한다.
도 2는 오보트랜스페린 효소 가수분해물 처리에 따른 RAW 264.7 대식세포의 iNOS 발현에 미치는 영향을 확인한 데이터이다. 도면에서 Con은 시료 무처리군, Bro는 브로멜라인 효소 가수분해물, Pan은 판크레아틴 효소 가수분해물, Pap은 파파인 효소 가수분해물을 의미한다.
도 3은 오보트랜스페린 효소 가수분해물 처리에 따른 RAW 264.7 대식세포의 세포 생존률을 나타낸 데이터이다.
도 4는 오보트랜스페린 효소 가수분해물 처리에 따른 RAW 264.7 대식세포의 TNF-α 생성에 미치는 영향을 확인한 데이터이다.
도 5는 오보트랜스페린 효소 가수분해물 처리에 따른 RAW 264.7 대식세포의 IL-6 생성에 미치는 영향을 확인한 데이터이다.
도 6은 오보트랜스페린 효소 가수분해물 처리에 따른 RAW 264.7 대식세포의 식세포 작용 활성에 미치는 영향을 확인한 데이터이다.
도 7은 오보트랜스페린 효소 가수분해물 처리에 따른 MAPK (p38, ERK, JNK) 세포신호전달경로 인산화 정도를 확인한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 일관점에서, 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인을 이용하여 제조된 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 일관점에서, 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인을 이용하여 제조된 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물은 MAPK 세포신호전달경로를 통해 대식세포를 활성화시키며, 활성화된 대식세포는 iNOS 발현 증가; 산화질소(nitric oxide; NO) 생성 증가; 전염증성 사이토카인 생성 증가; 및 식세포 작용 증가;를 통해 면역을 증가시킬 수 있다.
상기 산화질소, iNOS, 전염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6는 대식세포 활성화 마커로 알려져 있으며, 난백 오소트랜스페린 효소 가수분해물에 의해 대식세포의 면역매개인자(NO, IL-1β, IL-6) 생성이 촉진되면, 면역이 증가되어 병원균 및 노화세포 제거 효과가 촉진된다.
또한, 본 발명은 또 다른 관점에서, 난백 오보트랜스페린에 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인을 처리하는 단계를 포함하는 대식세포 활성능을 가지는 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물의 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로, (a) 증류수에 녹인 오보트랜스페린에 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인을 처리하는 단계; 및 (b) 효소를 처리한 후 50 ~ 65℃에서 2 ~ 5시간 동안 가수분해를 수행하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조되며, 가수분해가 종료된 후 (c) 효소를 불활성화하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 총 7종의 단백질 분해효소(브로멜라인, 플라보자임, 뉴트레아제, 판크레아틴, 파파인, 펩신 및 프로타맥스)를 처리하여 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 제조하였으며, 이 중 대식세포 활성 증가 효능이 우수한 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 선별하기 위해, 대식세포의 NO 생성에 미치는 영향을 확인하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 3종의 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 처리하였을 경우 (브로멜라인, 판크레아틴, 파파인), 비교군으로 사용한 오보트랜스페린 및 다른 효소 가수분해물보다 NO의 생성이 증가하는 것을 확인하였으며, 도 2에 나타난 바와 같이, 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인으로 제조한 오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의해 대식세포에서 NO 생성을 조절하는 iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인으로 제조한 오보트랜스페린 효소 가수분해물은 고농도에서도 대식세포의 생존에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
NO는 외부로부터 침입한 병원성 균 혹은 바이러스 등 침입자로부터 체내를 보호하는 첫 번째 역할을 하는 물질로서, 대식세포가 활성화되었을 때 생산을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인으로 제조한 오보트랜스페린 효소 가수분해물이 대식세포에서 iNOS mRNA 발현을 증가시켜 NO의 생성을 증가시키고, 이로 인해 면역 증진에 도움을 줄 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에서는, 오보트랜스페린 효소 가수분해물이 대식세포의 TNF-α 및 IL-6 생성이 미치는 영향을 확인하였다. 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 가수분해물 농도 의존적으로 TNF-α 및 IL-6 생성이 증가하는 것을 확인하였다.
TNF-α 및 IL-6는 대식세포가 활성화 되었을 때, 초기에 생성되는 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)으로 알려져 있다 (Ma X., Microbes Infect., 3:121-129. 2001). 이러한 전염증성 사이토카인은 염증 반응을 시작할 수 있도록 세포의 조직으로의 이동, 다른 염증사이토카인의 분비를 촉진하거나 T 세포 및 B 세포의 분화를 촉진하는 등 면역 반응에서 다양한 역할을 수행하고 있다. 따라서, 오보트랜스페린 효소 가수분해물의 처리가 면역 증진에 도움을 줄 수 있음을 확인하였다.
또한, 오보트랜스페린 효소 가수분해물이 대식세포의 식세포 작용에 미치는 영향을 확인한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인으로 제조한 오보트랜스페린 효소 가수분해물 모두 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
식세포 작용은 활성화된 대식세포의 큰 특징 중 하나로, 병원균이나 암세포에 대항하여 대식세포가 취하는 첫 번째 단계이다 (Liu J. et al., Food Sci Biotechnol., 27:1791-1799, 2018). 따라서 오보트랜스페린 효소 가수분해물의 처리가 대식세포의 활성화를 유도한다는 것을 확인할 수 있었다.
마지막으로, 본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에서, 오보트랜스페린 효소 가수분해물이 대식세포를 활성화 시키는 메커니즘을 확인한 결과, 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 처리함에 따라 MAPK 세포신호전달경로의 서브유닛(subunit)인 p38, ERK, JNK의 인산화를 증가시키는 것을 확인하였다.
즉, 브로멜라인, 판크레아틴 또는 파파인으로 제조한 오보트랜스페린 효소 가수분해물은 MAPK 세포신호전달경로를 통해 대식세포를 활성화 시키고, 활성화된 대식세포는 iNOS의 발현과 NO의 생성, 전염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 생성을 증진시켰으며, 식세포 작용 활성 역시 증진시켰음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 오보트랜스페린 효소 가수분해물은 식품 및 제약 분야에서 면역 증진을 위한 기능성 소재로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 상기 약학 조성물을 제제화나 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 본 발명은 약학 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자 등에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물은 1~10,000㎎/㎏/일의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 건강 기능성 식품 조성물은, 전체 식품 중량의 0.00001 중량 % 내지 50 중량%로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다, 본 발명의 건강 기능성 식품 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등일 수 있으나, 건강기능식품의 종류는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서 건강 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 기능성 식품은 면역증강 효과에 관한 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현할 수 있는 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
오보트랜스페린 효소 가수분해물의 제조
오보트랜스페린은(순도 95% 이상) 미국의 아이오와주립대학교(Iowa state University) 안동욱 교수로부터 제공받아 사용하였다 (Abeyrathne EDNS et al., Poult Sci., 92:1091-1097, 2013).
효소는 브로멜라인(Bromelain), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트레아제(Neutrase), 판크레아틴(Pancreatin), 파파인(Papain), 펩신(Pepsin) 및 프로타맥스(Protamex)와 같이 총 7종의 단백질 분해효소를 이용하여 오보트랜스페린 가수분해물을 제조하였다.
구체적으로, 오보트랜스페린 2 g을 증류수 100 mL에 녹여 pH를 6.5 ~ 7.0으로 조정한 뒤 (펩신의 경우 pH 2.0으로 조정), 2%의 비율로 단백질 분해 효소를 처리하여 50 ~ 65℃에서 4시간 동안 가수분해를 진행하였다. 가수분해가 종료 된 후 100℃에서 10 분간 효소의 불활성화 단계를 거쳤으며, 3,000×g에서 20 분동안 원심분리를 한 후, 상등액을 동결건조하여 실험에 사용하였다.
오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의한 대식세포의 NO 생성 확인
2-1 : 대식세포 배양
오보트랜스페린 효소 가수분해물의 면역 증강 효과를 측정하기 위해 한국세포주 은행으로부터 마우스 유래 대식세포인 RAW 264.7 세포주를 분양받아 사용하였다. 세포 배양을 위해 DMEM 배지(HyClon Laboratories, Inc., 미국)에 10% FBS(Fetal bovine serum, HyClon Laboratories, Inc., 미국), 100 unit/mL의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Gibco-BRL, 미국)을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2 배양기(MCO-18AIC, SANYO, 일본)에서 배양하였다.
2-2 : NO 생성 확인
오보트랜스페린 효소 가수분해물의 대식세포의 NO 생성에 대해 미치는 영향을 확인하기 위해 그리스 시약(griess reagent)을 사용하였다.
RAW 264.7 세포가 2 × 105 개/웰이 되도록 96-웰 플레이트에 각각 분주하고, 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 각각 250μg/mL, 500 μg/mL로 농도별로 처리한 뒤 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 양성대조군으로 10 ng/mL LPS(lipopolysaccharide, Sigma Chemical Co., 미국)를 사용하였다.
발생된 NO는 그리스 시약(0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride in distilled water 및 1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid, Sigma Chemical Co., 미국)를 이용하여 정량하였다. 상등액과 그리스시약을 각각 100 μL씩 혼합하고 15 분 뒤 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 질산나트륨(sodium nitrate, Sigma Chemical Co., 미국) 표준물질을 이용하여 얻은 표준곡선(standard curve)을 이용하여 정량하였다.
모든 실험은 3번 반복 수행하였으며, 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 시료간의 유의적인 차이를 확인하기 위하여 Student's t-test, ANOVA(one-way analysis of variance)를 실시하였으며, SPSS(SPSS Windows version 18.0; SPSS Inc., 미국)를 이용하여 분석하였다.
오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의한 대식세포의 NO 생성
오보트랜스페린 효소 가수분해물 NO (μM)
250 μg/mL 500 μg/mL
오보트랜스페린 3.89 ± 2.27 17.96 ± 3.76
브로멜라인 가수분해물 7.87 ± 2.63 24.22 ± 3.63
플라보자임 가수분해물 1.61 ± 0.41 6.69 ± 2.10
뉴트라아제 가수분해물 0.34 ± 0.32 1.13 ± 0.57
판크레아틴 가수분해물 14.82 ± 3.67 30.15 ± 3.26
파파인 가수분해물 12.93 ± 3.38 27.5 ± 2.85
펩신 가수분해물 1.62 ± 0.63 1.38 ± 0.64
프로타멕스 가수분해물 0.97 ± 0.99 6.12 ± 1.10
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 3종의 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 처리하였을 경우 (브로멜라인, 판크레아틴, 파파인), 비교군으로 사용한 오보트랜스페린 및 다른 효소 가수분해물보다 NO의 생성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 오보트랜스페린의 경우 500 μg/mL에서 17.96 μM의 NO를 생성시킨 반면, 오보트랜스페린 효소 가수분해물의 경우 같은 농도에서 24.22 μM(브로멜라인 가수분해물), 30.15 μM(판크레아틴 가수분해물), 27.50 μM(파파인 가수분해물)의 NO를 생성시켜 모든 효소 가수분해물이 NO 생성을 오보트랜스페린보다 증진 시킨 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 이후의 실험에서는 대식세포에서 NO 생성 효능이 우수한 것으로 확인된 브로멜라인, 판크레아틴 및 파파인을 이용하여 제조한 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 이용하여 대식세포 활성 효능을 확인하였다.
2-3 : iNOS mRNA 발현 확인
iNOS 발현은 qRT-PCR(quantitative real-time PCR)을 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포가 1 × 106 개/웰이 되도록 6-웰 플레이트에 각각 분주하고 24시간 동안 배양한 다음, 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 각각 250μg/mL, 500 μg/mL로 농도별로 처리한 뒤 24시간 동안 추가 배양하였다.
24시간 뒤에 총 RNA를 RNA 분리 키트(RNA isolation kit, RNeasy Mini Kit, Qiagen, 이탈리아)를 이용하여 분리한 뒤, cDNA로 합성하고(Revert Aid First Strand cDNA synthesis kit, Thermo Fisher 미국), SYBR 그린 키트(PhileKorea, 한국)를 이용하여 qRT-PCR을 진행하였다.
실험에 사용된 iNOS와 β-actin의 프라이머 서열은 다음과 같다;
iNOS forward : 5'-CCC TTC CGA AGT TTC TGG CAG CAG C-3' (서열번호 1),
iNOS reverse : 5'-GGC TGT CAG AGC CTC GTG GCT TTG G-3' (서열번호 2),
β-actin forward : 5'-GTG GGC CGC CCT AGG CAC CAG-3' (서열번호 3),
β-actin reverse : 5'-GGA GGA AGA GGA TGC GGC AGT-3' (서열번호 4).
증폭 결과는 ΔΔCt방법(delta-delta Ct method)을 이용하여 확인하였고, β-actin은 하우스키핑(housekeeping) 유전자로 사용하였다.
오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의한 대식세포의 iNOS mRNA 발현
iNOS mRNA 발현
(Control 대비 변화량)
Control 1.0
브로멜라인 가수분해물 250 μg/mL 2.6
브로멜라인 가수분해물 500 μg/mL 3.7
판크레아틴 가수분해물 250 μg/mL 2.2
판크레아틴 가수분해물 500 μg/mL 3.1
파파인 가수분해물 250 μg/mL 3.0
파파인 가수분해물 500 μg/mL 3.6
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 각 오보트랜스페린 효소 가수분해물 농도 의존적으로 iNOS mRNA의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 즉, 오보트랜스페린 효소 가수분해물은 대식세포의 iNOS mRNA 발현을 증가시켜 NO의 생성을 증가시키는 것을 확인하였다.
2-4 : 대식세포 생존율 측정
오보트랜스페린 효소 가수분해물의 대식세포 생존률에 대한 영향을 측정하기 위하여 MTT 어세이를 실시하였다. RAW 264.7 세포가 2 × 105 개/웰이 되도록 96-웰 플레이트에 각각 분주하고, 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 각각 250μg/mL, 500 μg/mL로 농도별로 처리한 뒤 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그 다음, PBS 완충액에 녹인 2.5 mg/mL MTT (3-[4,5-dimethythiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma Chemical Co., 미국) 용액을 50 μL씩 각 웰에 첨가하고 4시간 추가 배양하며 포르마잔(formazan) 형성을 유도하였다. 반응 후 웰 바닥에 형성된 포르마잔이 흩어지지 않게 상등액을 제거한 다음, 200 μL DMSO(Dimethyl sulfoxide, Samchun, 한국)을 첨가하여 포르마잔을 녹인 후, 마이크로플레이트 리더기(Model 680, BioRad, 미국)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율을 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였다.
[수학식 1]
세포 생존율(%) = (오보트랜스페린 효소 가수분해물 처리군/ 대조군) × 100
오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의한 대식세포 생존률
대식세포 생존률 (%)
브로멜라인 가수분해물 250 μg/mL 96.17 ± 3.05
브로멜라인 가수분해물 500 μg/mL 97.88 ± 1.37
판크레아틴 가수분해물 250 μg/mL 98.27 ± 1.24
판크레아틴 가수분해물 500 μg/mL 98.83 ± 0.47
파파인 가수분해물 250 μg/mL 98.34 ± 1.33
파파인 가수분해물 500 μg/mL 98.09 ± 1.02
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 실험에 사용한 오보트랜스페린 효소 가수분해물은 모든 농도에서 대식세포의 생존에 어떠한 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의한 TNF-α 및 IL-6 발현 정도 확인
오보트랜스페린 효소 가수분해물이 대식세포에서 TNF-α, IL-6 생성에 대해 미치는 영향을 확인하기 위해 ELISA 분석을 실시하였다. TNF-α, IL-6 분석을 위한 ELISA 키트는 AB 프론티어(AB frontier, 한국)로부터 구입하여 메뉴얼에 따라 정량화 하였다.
먼저, RAW 264.7 세포가 4 × 105 개/웰이 되도록 12-웰 플레이트에 각각 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 그 다음, 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 각각 250 μg/mL, 500 μg/mL로 농도별로 처리한 뒤 24시간 동안 추가 배양하였다. 상등액에 존재하는 TNF-α, IL-6를 ELISA 키트를 사용하여 정량하였다.
오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의한 대식세포의 TNF-α 및 IL-6 발현
TNF-α (ng/mL) IL-6 (ng/mL)
Control 0.14 ± 0.01 0.00 ± 0.00
브로멜라인 가수분해물 250 μg/mL 34.95 ± 2.64 2.88 ± 0.92
브로멜라인 가수분해물 500 μg/mL 54.60 ± 5.23 14.63 ± 0.94
판크레아틴 가수분해물 250 μg/mL 36.91 ± 3.16 5.23 ± 1.46
판크레아틴 가수분해물 500 μg/mL 53.46 ± 6.76 22.18 ± 2.09
파파인 가수분해물 250 μg/mL 40.47 ± 1.41 6.80 ± 1.33
파파인 가수분해물 500 μg/mL 54.14 ± 6.13 22.94 ± 2.80
그 결과, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 처리함에 따라 NO의 생성과 유사하게 오보트랜스페린 효소 가수분해물 농도 의존적으로 TNF-α, IL-6의 생성량이 증가하는 것을 확인하였다.
TNF-α의 경우, 500 μg/mL의 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 처리하였을 때, 모두 50 ng/mL 이상의 생성량을 보이는 것을 확인하였다 (브로멜라인 가수분해물: 54.60 ng/mL, 판크레아틴 가수분해물: 53.46 ng/mL, 파파인 가수분해물: 54.14 ng/mL). 세 효소 가수분해물 간의 유의적인 차이는 관찰되지 않았으나, 낮은 농도인 250 μg/mL에서는 다른 효소 가수분해물에 비해 파파인 가수분해물이 유의적으로 높은 수준의 TNF-α를 생성하는 것을 확인하였다.
IL-6의 경우, 500 μg/mL의 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 처리하였을 때, 판크레아틴 가수분해물 및 파파인 가수분해물이 각각 22.18 ng/mL, 22.94 ng/mL의 IL-6을 생성하는 것을 확인하였으며, 14.63 ng/mL을 생성한 브로멜라인 가수분해물 처리군에 비해 유의적으로 높은 생성양을 보이는 것을 확인하였다. 낮은 농도인 250 μg/mL의 처리 군에서도 같은 양상을 보였다
오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의한 대식세포의 식세포 활성 확인
오보트랜스페린 효소 가수분해물이 대식세포의 식세포 활성(phagocytic activity)에 대해 미치는 영향을 확인하기 위해 NRU(Neutral Red uptake) 법을 활용하여 측정하였다.
먼저, RAW 264.7 세포가 2 × 105 개/웰이 되도록 24-웰 플레이트에 분주하고 4시간 동안 전배양을 실시하였다. 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 각각 250 μg/mL, 500 μg/mL로 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양한 다음, 상등액을 제거하고 0.075%의 neutral red 용액(Sigma Chemical Co., 미국)을 400 μL씩 처리한 뒤 1시간을 추가 배양하였다. PBS를 이용하여 3번 세척한 다음, 용해버퍼(lysis buffer; ethanol: 0.01% glacial acetic acid= 1:1, (v/v))를 500 μL씩 처리하고 15분 뒤에 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의한 대식세포의 식세포 활성
식세포 활성 (%)
Control 100.00 ± 4.65
브로멜라인 가수분해물 250 μg/mL 116.98 ± 7.70
브로멜라인 가수분해물 500 μg/mL 120.58 ± 8.05
판크레아틴 가수분해물 250 μg/mL 122.46 ± 9.78
판크레아틴 가수분해물 500 μg/mL 123.27 ± 7.84
파파인 가수분해물 250 μg/mL 116.77 ± 8.95
파파인 가수분해물 500 μg/mL 117.49 ± 7.45
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 대식세포에 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 처리함에 따라 식세포 작용이 모든 실험군에서 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 500 μg/mL의 판크레아틴 가수분해물을 처리하였을 때 123.27%로 가장 높은 식세포 작용 활성을 보이는 것으로 확인되었다. 250 μg/mL 파파인 가수분해물을 처리한 경우에는 107.18%로 가장 낮은 식세포 작용 활성을 보이는 것으로 확인되었으나, 이 경우에도 대조군에 비해 높은 식세포 작용 활성을 보이는 것으로 나타났다.
오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의한 대식세포 활성화 메커니즘 확인
오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의한 대식세포 활성화 메커니즘을 확인하기 위하여 웨스턴 블랏 분석을 통해 MAPK 세포신호전달경로의 인산화 여부를 확인하였다.
먼저, RAW 264.7 세포가 2.5 × 105 개/웰이 되도록 6-웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 전배양을 실시하였다. 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 각각 250μg/mL, 500 μg/mL로 농도별로 처리하고 30분 동안 배양한 뒤, RIPA 버퍼(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 총 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질(30 μg)을 12% SDS-PAGE 겔을 이용하여 전기영동한 후, PVDF 멤브레인에 트랜스퍼하였다. 5% 스킴 밀크가 포함된 TBST(Tris-buffered saline + 1% Tween-20)으로 블로킹한 뒤, 특이적인 1차 항체 (p-p38, t-p38, p-ERK, t-ERK, p-JNK, t-JNK; Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 마지막으로, 2차 항체(Goat anti-mouse IgG-HRP, Bio-Rad, 미국)를 처리하여 2시간 동안 상온에서 배양한 뒤, ECL 키트(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 단백질을 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군(Con)에서는 MAPK 세포신호전달경로의 서브유닛(subunit)인 p38, ERK 및 JNK의 인산화를 확인할 수 없었다. 하지만, 오보트랜스페린 효소 가수분해물 처리에 의해 인산화된 p38, ERK 및 JNK가 확인되었으며, 양성대조군으로 사용된 LPS의 실험 결과와 유사한 것으로 확인되었다. 즉, 본 발명에 따른 오보트랜스페린 효소 가수분해물의 경우 MAPK 세포신호전달경로를 통해 대식세포를 활성화 시킴을 확인할 수 있었다.
<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Composition for enhancing Immunity Comprising Egg White Ovotransferrin Enzyme Hydrolyzate <130> 1066478 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward <400> 1 cccttccgaa gtttctggca gcagc 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse <400> 2 ggctgtcaga gcctcgtggc tttgg 25 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin forward <400> 3 gtgggccgcc ctaggcacca g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b-actin reverse <400> 4 ggaggaagag gatgcggcag t 21

Claims (8)

  1. 판크레아틴 또는 파파인을 이용하여 가수분해하여 제조된 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하고,
    상기 오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의해 활성화된 대식세포는 iNOS 발현 증가; 산화질소(nitric oxide; NO) 생성 증가; 전염증성 사이토카인 생성 증가; 및 식세포 작용 증가;를 통해 면역을 증가시키는 것을 특징으로 하는,
    면역증강용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의해 대식세포가 활성화되는 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물은 MAPK 세포신호전달경로를 통해 대식세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 판크레아틴 또는 파파인을 이용하여 가수분해하여 제조된 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하고,
    상기 오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의해 활성화된 대식세포는 iNOS 발현 증가; 산화질소(nitric oxide; NO) 생성 증가; 전염증성 사이토카인 생성 증가; 및 식세포 작용 증가;를 통해 면역을 증가시키는 것을 특징으로 하는,
    면역증강용 건강기능성 식품 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물에 의해 대식세포가 활성화되는 것을 특징으로 하는 면역증강용 건강기능성 식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물은 MAPK 세포신호전달경로를 통해 대식세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 면역증강용 건강기능성 식품 조성물.
  8. 삭제
KR1020190135388A 2019-10-29 2019-10-29 난백 오보트랜스페린 효소 가수분해물을 포함하는 면역증강용 조성물 KR102275125B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Food Funct. 2017, 8, 1452*
Jae Hoon Lee, 건국대학교 박사학위 논문 ‘Immune-enhancing and Cytotoxic Activities of Phosvitin and Ovotransferrin Isolated from Egg’ 2018.2*

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