KR101805176B1 - 김 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 김 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약제학적 조성물 및 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명은 다양한 질환에 적용가능한 면역증강용 조성물로, 천연소재인 김 추출물을 유효성분으로 포함하여, 경제적인 생산비용과 사용의 편이성을 제공한다.

Description

김 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물{A Composition Comprising Extract of Porphyra tenera for Immuno-stimulating Activity}

본 발명은 김 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.

인체는 항상성을 유지하려고 하는 특징을 가지고 있으며 이는 면역 시스템에서도 작용을 하게 된다. 면역이란 생체가 자기 성분 이외의 물질 등이 생체의 항상성을 깨뜨리거나 자기를 위협하는 것을 배제하기 위해 일어나는 일련의 생체 방어 반응을 의미하며 피부, 소화관, 호흡기 등을 통해 침입한 유해물질로부터 신체를 보호하는 방어체계로 외부 자극물질을 제거하는 대식 작용을 하거나, 상처에 발생한 심각한 염증을 줄이는 작용을 통한 항상성 유지 활동이라고 할 수 있다. 체내 병원균의 유입으로 인해 활성화 되었던 염증 반응을 포함한 모든 면역작용은 병원균의 제거가 이루어지고 나면 정상의 상태로 돌아오게 되지만 면역 조절에 어려움이 있는 경우, 면역 반응이 정상인 사람에 비해 현저히 높거나 낮게 발생한다. 면역기능이 결핍되거나 저하된 상태를 면역부전이라고 하며 이 상태에서는 면역반응이 제대로 활성화 되지 못하여 체내의 이물질에 대한 반응을 제대로 못하여 감염을 일으키게 된다. 반대로 면역과민반응은 일부의 면역반응이 과하게 반응하여 면역체계가 불균형을 이루어 결과적으로 알레르기 반응을 일으키는 것이다(Immunology. 49, 1992; Dig dis Sci. 52, pp 1890-1896, 2007; J Life Sci. 19, pp 479-485, 2009; Biol Pharm Bull. 27, pp 617-620, 2004).

면역 체계가 정상적으로 조절되지 못하고 불균형을 이루게 되면 체내 사이토카인의 불균형, T/B 세포의 증식 불균형, 항산화 영양소 고갈 등의 원인으로 면역 조절에 장애가 발생하여 염증성 물질 분비가 증가하여 세포와 조직에 손상을 입히게 되며 병원체 유입에 대처하지 못하여 염증의 심화가 이루어질 수 있다. 따라서 인체의 면역반응은 균형을 이루어 조절이 정상적으로 되어야 건강을 유지할 수 있으므로 면역 조절 능력은 질병 예방과 치료에 중요시 된다(J Allergy clin immunol. 9, pp 616, 1993; Immunology. 47, pp 75, 1982).

비장에서는 면역조절에 관여하며 IFN(interferon)-γ, TNF(tumor necrosis factor)-α과 IL(interleukin)-1β, IL-5, IL-6 및 PGE2 등의 사이토카인을 분비한다. 이런 사이토카인은 면역반응의 실행단계에서 작용을 나타내며, 면역 세포와 염증계간의 신호 전달 과정에서도 중요한 역할을 한다.

2000년 이후 전 세계적으로 급성호흡기증후군 SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome), 조류독감, 에볼라 바이러스 등과 같은 급성 신종 전염병들이 등장하면서 이러한 전염병에 대한 인체의 방어능력인 면역력의 중요성이 더욱 대두되고 있다. 인체의 체내 항상성이 깨지거나 병원균의 침입과 같이 위협이 되는 것들에 대한 생체방어력인 면역력은 대식세포나 자연살해(Natural killer, NK) 세포 등이 관련된 비특이적 면역과 T 세포나 B 세포가 관여하는 특이적 면역으로 분류할 수 있다(A-Reum Yu, Ho-Young Park, Yun-Sook Kim, Sang-Keun Ha, Hee-Do Hong, Hee-Don Choi. 2012. Immuno-enhancing Effect of Seed Extracts on a RAW 264.7 Macrophage Cell Line. J Korean Soc Food Sci Nutr 41(12): 1671-1676). 병원균이 인체에 침입했을 때 neutrophile(호중구), monocyte(단핵구), macrophage(대식세포)와 같은 탐식세포(phagocytes)들은 가장 먼저 인체를 병원균들로부터 방어하는 선천 면역반응의 주요 세포군이다(Uthaisangsook S, Day NK, Bahna SL, Good RA, Haraguchi S. 2002. Innate immunity and its role against infections. Ann. Allergy Asthma Immunol. 88: 253-264). 특히, 대식세포는 상피세포 장벽 이후의 생체방어에 있어 최초 대응세포로 항원제시세포(antigen presenting cell)로써의 기능도 수행하며, 적응면역과 관련하여 T 세포에 작용에도 영향을 주고(3. Birk RW, Gratchev A, Hakiy N, Politz O, Schledzewski K, Guillot P, Orfanos CE, Goerdt S. 2001. Alternative activation of antigen-presenting cells: concepts and clinical relevance. Hautarzt 52: 193-200), 병원균에 감염된 세포나 암세포 등도 제거하고, 면역반응에 기여하는 NO(nitric oxide) 와 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등의 사이토카인 등도 분비한다(Seon A Yoo, Ok Kyung Kim, Da-Eun Nam, Yongjae Kim, Humyoung Baek, Woojin Jun, Jeongmin Lee. 2014. Immunomodulatory Effects of Fermented Curcuma longa L. Extracts on RAW 264.7 Cells. J Korean Soc Food Sci Nutr 43(2): 216-243).

인체의 적응면역이 작동하기 전에 질병들로부터 대응할 수 있는 선천성 면역기능을 담당하는 대식세포의 활성인자를 찾기 위한 천연물질들의 연구가 활발히 진행되고 있다. 유 등(A-Reum Yu, Ho-Young Park, In-Wook Choi, Yong-Kon Park, Hee-Do Hong, Hee-Don Choi. 2012. Immune Enhancing Effect of Medicinal Herb Extracts on a RAW 264.7 Macrophage Cell Line. J Korean Soc Food Sci Nutr 41(11): 1521-1527)은 생약 추출물을 이용하여 대식세포의 면역증강 효과를 보고하였고, 변은 사과씨 에탄올 추출물을 이용하여 대식세포 면역조절 활성 보고하였으며(6.Myung-Woo Byun. 2013. Immunomodulatory Activities of Apple Seed Extracts on Macrophage. J Korean Soc Food Sci Nutr 42(9): 1513-1517), 유 등은 RAW264.7 대식세포주에서 발효울금의 면역조절 효과를 보고하였다(Seon A Yoo, Ok Kyung Kim, Da-Eun Nam, Yongjae Kim, Humyoung Baek, Woojin Jun, Jeongmin Lee. 2014. Immunomodulatory Effects of Fermented Curcuma longa L. Extracts on RAW 264.7 Cells. J Korean Soc Food Sci Nutr 43(2): 216-243).

대식세포는 탐식작용을 하는 면역세포로 인체의 거의 모든 조직에 존재하는 내재면역의 중요한 1차 방어기능을 담당한다. 대식세포는 세균이나 이물질을 탐색, 제거하는 과정에서 여러 가지 사이토키인을 분비하고 항원에 대한 면역작용의 중추적인 역할을 하는 면역세포이다(Yi Seul Seo and Kwang-Soon Shin. 2012. Immune System-Stimulating Activities of Mucilage Polysaccharides Isolated from Opuntia humifusa. J Korean Soc Food Sci Nutr 41(1): 95-102). 대식세포에서 생성되는 NO는 면역계에서 종양세포나 세포내 감염된 미생물에 대한 방어작용을 하는 중요한 신호전달물질로 유 등은 감초, 건지황, 당귀, 도라지, 목천료의 생약추출물의 RAW264.7에서의 NO 생성능을 평가하였는데, 이들 생약추출물들은 양성대조군인 LPS의 처리와 비슷한 수준으로 대식세포의 NO 생성능을 보였다(A-Reum Yu, Ho-Young Park, In-Wook Choi, Yong-Kon Park, Hee-Do Hong, Hee-Don Choi. 2012. Immune Enhancing Effect of Medicinal Herb Extracts on a RAW 264.7 Macrophage Cell Line. J Korean Soc Food Sci Nutr 41(11): 1521-1527).

김(Porphyra tenera)는 해태(海苔)라고도 하고 바다의 암초에 이끼처럼 붙어서 자란다. 긴 타원 모양 또는 줄처럼 생긴 달걀 모양이며 가장자리에 주름이 있다. 붉은 갈색과 파란빛을 띤 녹색이다. 탄수화물인 한천이 가장 많이 들어 있으며, 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 소르비톨(sorbitol) 및 둘시톨(dulcitol) 등이 들어 있다. 지방은 거의 없으나 단백질은 30-40% 들어 있다. 특히 트레오닌(Threonine) 발린(Valine), 로이신(Leucine), 이소로이신(Isoleucine), 리신(Lysine), 메티오닌(Methionine), 페닐알라닌(Phenylalanine) 및 트립토판(Tryptophan) 등의 필수아미노산이 많이 들어 있다. 특히 달콤한 맛과 기름진 맛이 나는 아미노산인 글리신(Glycine) 및 알라닌(Alanine)이 들어 있어 감칠맛을 낸다(정보섭 외, 식품과 건강, 신광문화사, pp232-236, 2004년).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

Immunology. 49, 1992; Dig dis Sci. 52, pp 1890-1896, 2007; J Life Sci. 19, pp 479-485, 2009; Biol Pharm Bull. 27, pp 617-620, 2004 J. Allergy clin immunol. 9, pp 616, 1993; Immunology. 47, pp 75, 1982 A-Reum Yu, Ho-Young Park, Yun-Sook Kim, Sang-Keun Ha, Hee-Do Hong, Hee-Don Choi. 2012. Immuno-enhancing Effect of Seed Extracts on a RAW 264.7 Macrophage Cell Line. J Korean Soc Food Sci Nutr 41(12): 1671-1676 Uthaisangsook S, Day NK, Bahna SL, Good RA, Haraguchi S. 2002. Innate immunity and its role against infections. Ann. Allergy Asthma Immunol. 88: 253-264 Birk RW, Gratchev A, Hakiy N, Politz O, Schledzewski K, Guillot P, Orfanos CE, Goerdt S. 2001. Alternative activation of antigen-presenting cells: concepts and clinical relevance. Hautarzt 52: 193-200 Seon A Yoo, Ok Kyung Kim, Da-Eun Nam, Yongjae Kim, Humyoung Baek, Woojin Jun, Jeongmin Lee. 2014. Immunomodulatory Effects of Fermented Curcuma longa L. Extracts on RAW 264.7 Cells. J Korean Soc Food Sci Nutr 43(2): 216-243 Myung-Woo Byun. 2013. Immunomodulatory Activities of Apple Seed Extracts on Macrophage. J Korean Soc Food Sci Nutr 42(9): 1513-1517 Yi Seul Seo and Kwang-Soon Shin. 2012. Immune System-Stimulating Activities of Mucilage Polysaccharides Isolated from Opuntia humifusa. J Korean Soc Food Sci Nutr 41(1): 95-102 A-Reum Yu, Ho-Young Park, In-Wook Choi, Yong-Kon Park, Hee-Do Hong, Hee-Don Choi. 2012. Immune Enhancing Effect of Medicinal Herb Extracts on a RAW 264.7 Macrophage Cell Line. J Korean Soc Food Sci Nutr 41(11): 1521-1527 정보섭 외, 식품과 건강, 신광문화사, pp232-236, 2004년.

본 발명자들은 천연물 유래의 면역증강용 소재를 찾고자 노력하였다. 그 결과, 김(Porphyra tenera) 추출물이 산화질소(Nitric Oxide)의 생성을 증가시키고, IL-2, IL-4 및 IFN-γ 등의 면역능 관련 사이토카인의 발현을 증가시키며, 자연 살해 세포(Natural Killer cells)의 세포 활성을 증가시켜 비장세포의 증식을 촉진시키는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 면역증강용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 면역증강용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 김(Porphyra tenera) 추출물의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역증강용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 천연물 유래의 면역증강용 소재를 찾고자 노력하였다. 그 결과, 김 추출물이 산화질소(Nitric Oxide)의 생성을 증가시키고, IL-2, IL-4 및 IFN-γ 등의 면역능 관련 사이토카인의 발현을 증가시키며, 자연 살해 세포(Natural Killer cells)의 세포 활성을 증가시켜 비장세포의 증식을 촉진시키는 효과를 확인하였다.

본 명세서에서 용어 “면역증강(immunostimulatory)”은 초기 면역 반응을 유도하거나 항원에 대한 기존의 면역 반응을 측정 가능할 정도로 증가시키는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 김 추출물은 제염된(desalinized; 또는 탈염된) 김 추출물이다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 김 추출물은 김에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 김 추출물은 물, 에탄올 또는 이의 조합을 김에 처리하여 수득한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 김 추출물은 김의 물, 탄소수 1-4 개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 또는 1,3-부틸렌 글리콜의 용매 추출물이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 김 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 김 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 김 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 추출물은 건조 상태의 김에 시료 중량의 약 1 내지 100배(v/w)의 물, 주정, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매를 가하여 30 내지 150℃, 바람직하게는 50 내지 120℃에서 1 내지 24시간, 바람직하게는 2 내지 12시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각추출 또는 가열추출법, 바람직하게는, 환류 추출법으로 2차 추출하는 제1단계; 상기 수득한 시료를 여과하여 농축시키는 제2단계: 상기 농축된 추출물을 동결건조시켜 분말을 수득하는 제3단계를 포함하는 공정을 통하여 본원 발명의 추출물을 제조한다.

본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 하기의 김 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 김로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 김 추출물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

하기 실시예에서 입증된 바와같이, 본 발명의 김 추출물은 대식세포를 대상으로 실시한 세포독성실험에서 세포독성을 나타내지 않았다(실험예 1).

본 발명의 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 김 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물은 (ⅰ) 대식세포에 대한 세포독성실험을 나타내지 않고(실험예 1); (ⅱ) 산화질소(Nitric Oxide)의 생성을 증가시키며(실험예 2); (ⅲ) IL-2, IL-4 및 IFN-γ의 면역능 관련 사이토카인의 발현을 증가시키고(실험예 3); (ⅳ) 자연살해세포(Natural Killer cell)의 활성을 증가시켜 비장세포의 증식을 촉진시키는(실험예 4); 효과를 갖는다.

본 발명의 면역 증강용 조성물은 다양한 질환에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 (i) 암(예컨대, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암);

(ii) 바이러스(예컨대 아데노바이러스, 허르페스바이러스(예를 들어 HSV-I, HSV-II, CMV 또는 VZV), 폭스바이러스(예를 들어 천연두(variola), 백시니아 또는 물사마귀바이러스(molluscum contagiosum)와 같은 진성두창바이러스(orthopoxvirus), 피코르나바이러스(예를 들어 리노바이러스 또는 엔테로바이러스)), 오르토믹소바이러스(예를 들어 인플루엔자바이러스), 파라믹소바이러스(예를 들어 5-파라인플루엔자바이러스, 유핸성 이하선염 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스 및 호흡기합포체 바이러스), 코로나 바이러스(예를 들어 SARS), 파포바바이러스(예를 들어 성기사마귀, 보통사마귀 또는 족저 사마귀를 유발하는 파필로마 바이러스), 헤파드나바이러스(예를 들어 B형간염 바이러스), 플라비바이러스(예를 들어 C형간염 바이러스 또는 뎅기열바이러스(Dengue virus)) 또는 레트로바이러스(예를 들어 HIV와 같은 렌티바이러스))에 의한 감염성 질환; (ⅲ) 박테리아(예컨대 에스케리치아, 엔테로박터, 살모넬라, 스타필로코커스, 쉬겔라, 리스테리아, 에어로박터, 헬리코박터, 클레브시엘라, 프로테우스, 수도모나스, 나이세리아, 클로스트리듐, 바실러스, 코리네박테리움, 마이코박테리움, 캠필로박터,비브리오, 세라티아, 프로비덴시아, 크로모박테리움, 브루셀라, 예르시니아, 해모필러스 또는 보르데텔라 속)에 의한 감염성 질환; (ⅳ) 그 밖의 다른 감염성 질병(예를 들어 클라미디아와 칸디다증, 국균증, 히스토마플라스마증 및 크립토콕쿠스 뇌막염을 포함하는 진균성 질병 및 말라리아, 뉴머시스터스성 폐렴, 리슈마니아증, 립토스포리디움증, 톡소 포자충증 및 트리파소노마 감염을 포함하는 기생충성 질환);

(ⅴ) 아토피성 피부염 또는 습진, 호산구증가증, 천식, 알레르기, 알레르기비염 및 오멘 증후군과 같은 Th2-매개된 아토피질환;

(ⅵ) 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증과 같은 자가면역질환;

(ⅶ) 천식, 엔세필리티스(encephilitis), 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 알러지, 폐혈병성 쇼크증, 폐섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증을 포함하는 염증성 질환; 및

(ⅷ) 켈로이드 및 다른 형태의 흉터생성 억제(예를 들어 만성상처 등의 치유촉진)와 같은 상처 치유와 관련된 질병의 예방 또는 치료에 이용되나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 면역증강용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 99% 중량으로 포함된다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 김 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 김 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 g/kg 내지 5 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 또한 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 외용제제에는 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명의 김 추출물을 유효성분 포함하는 면역증강용 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 김 추출물뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 김 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 김 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물은 건강기능식품으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강보조식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 식품제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토 스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 면역증강용 조성물은면역증강을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 추출물은, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량부에 대하여 0.1 내지 70 중량부, 바람직하게는 2 내지 50 중량부 첨가될 수 있다. 상기 추출물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 김 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약제학적 조성물 및 식품 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 다양한 질환에 적용가능한 면역증강용 조성물로, 천연소재인 김 추출물을 유효성분으로 포함하여, 경제적인 생산비용과 사용의 편이성을 제공한다.

도 1a 내지 1c는 김 추출물(물 추출물, 10% 에탄올 추출물 및 70% 에탄올 추출물)의 RAW264.7 대식세포의 세포생존율에 미치는 영향을 나타낸다. 상기 결과는 삼중치의 mean±SD을 나타내고, ‘n.s.’는 유의성 없음(no significance)을 의미한다.
도 2는 김 추출물의 RAW264.7 대식세포의 NO 생성에 미치는 영향을 나타낸다. 막대상 서로 상이한 문자는 ANOVA 시험법(P<0.05)상에 유의적으로 상이함을 의미한다.
도 3은 김 추출물의 RAW264.7 대식세포의 시토킨 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸다. 막대상 서로 상이한 문자는 ANOVA 시험법(P<0.05)상에 유의적으로 상이함을 의미한다.
도 4는 김 추출물의 비장세포에서 NK 세포 활성에 미치는 영향을 나타낸다. 막대상 서로 상이한 문자는 ANOVA 시험법(P<0.05)상에 유의적으로 상이함을 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 시료의 제조

김(Porphyra tenera) 추출물 제조에 사용된 김은 완도에서 구입하였고, 제염 과정을 거쳐 제조하였다. 김 물추출물, 김 10%에탄올추출물과 70%에탄올추출물은 환류추출(추출온도 90℃ 및 시간 4시간)한 후 추출액을 왓맨(Whatman) No.4 필터페이퍼(Whatman plc, Kent, UK)로 여과하여, 감압농축기(100 kg, (주)대명이엔지)를 사용하여 추출용매를 제거한 후 동결건조하여 얻어진 24 g 분말 형태(이하 PTW, PTE10 및 PTE70라 함)를 다시 멸균한 3차 증류수에 녹여서 실험에 사용하였다.

실험예 1: 세포생존율 실험

상기 실시예 시료의 면역증진 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 대식세포에 대한 세포독성을 하기와 같이 실험을 수행하였다.

1.1. 세포 배양

RAW264.7은 마우스 유래의 대식세포(TIB-71, ATCC)이고, YAC-1(TIB-160, ATCC) 세포는 마우스 림프종 유래 세포로 두 세포주 모두 경희대학교 의학영양학과(Suwon, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양을 위한 배지의 조성은 RAW264.7 세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA)에, YAC-1 세포는 RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute 1640, Hyclone Laboratories)에 각각 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Hyclone Laboratories)과 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

1.2. 세포 생존율 실험

김 추출물의 RAW264.7 세포에 대한 최적 처리 농도를 결정하기 위하여 WST(Water soluble Tetrazolium Salt) 시약인 키트(EZ-CYTOX Cell Viability assay kit, EZ1000, DAEILLAB SERVICE CO., LTD, Seoul, Korea)를 이용하여 살아 있는 세포의 양을 측정하였다.

RAW254.7 세포는 1×10⁴ cells/웰이 되도록 96 웰 세포 배양 플레이트에 분주하여 안정화시킨 후 김 추출물을 0, 10, 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800 및 1000 ㎍/㎖의 농도로 DMEM 배지에 희석하여 48시간 배양하였다. WST 시약을 20 ㎕씩 각 웰에 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 3시간 동안 반응시킨 후 판독기(microplate reader, SpectraMAX340PC384, Molecular Devices, CA, USA)에서 450 ㎚로 흡광도를 측정하였다.

1.3. 실험 결과

세포 실험에 사용할 김 추출물의 최적 농도를 결정하기 위해 실시한 세포독성 시험에서 추출물은 최저 농도 0 ㎍/㎖부터 최고농도 1000 ㎍/㎖까지 RAW264.7 세포에 처리 한 결과, 최고 농도에서도 48시간까지 독성을 나타내지 않았다. 세포독성 시험 결과는 도 1a 내지 1c에 제시하였으며, 독성실험 결과에서 확인된 안전농도 범위 안에서 이 후의 실험을 진행하였다.

실험예 2: 산화질소(Nitric Oxide) 유도능 평가

상기 실시예 시료의 면역증진 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 산화질소(Nitric Oxide) 유도능에 미치는 영향을 하기와 같이 실험을 수행하였다(KOREAN J. FOOD SCI. TECHNOL. Vol. 43, No. 1, pp. 65~71 (2011) 이한나 외 4명, 등골나물 추출물의 항염증효과).

2.1. 산화질소(Nitric Oxide) 유도능 평가

RAW264.7 세포(TIB-71, ATCC)를 1×10⁴ cells/웰이 되도록 96웰 세포 배양 플레이트에 분주하여 안정시킨 후 DMEM 배지에 희석한 김 물추출물(20 및 40 ㎍/㎖) 및 김 10% 주정추출물(10 및 20 ㎍/㎖)을 농도별로 처리하였고, 양성대조군으로 1 ㎍/㎖의 LPS(Lipopolysaccharide, L4291, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 처리하여 24시간 배양하였다. 새로운 96웰 플레이트에 세포배양 상등액 50 ㎕와 동량의 그리스 시약(Griess reagent; G4410, Sigma, St. Louis, MO, USA) 시약을 넣어 상온에서 15분 동안 반응시킨 후 판독기(microplate reader; Molecular Devices, CA, USA)에서 흡광도 540 ㎚로 측정하였다. 산화질소(NO)의 농도는 아질산나트륨(sodium nitrite, S2252, NaNO₂, Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 얻은 표준곡선으로 계산하였다.

2.2. 실험결과

김 추출물의 대식세포 면역조절능을 알아보기 위하여 RAW264.7 세포에 독성시험에서 안전성이 확인된 농도로 김 추출물을 처리한 결과를 도 2에 나타내었다. 김 추출물에 의한 RAW264.7 세포에서 NO의 분비량을 측정한 결과, 김 물추출물 농도 20 ㎍/㎖ 및 김 10% 주정추출물 농도 10 ㎍/㎖에서부터 NO의 분비가 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다. 김 추출물의 NO 분비능은 양성대조군인 LPS 처리군 보다는 모두 낮은 증가를 보였다.

실험예 3: 사이토카인(cytokine) 발현능 평가

상기 실시예 시료의 면역증진 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 시토킨(cytokine) 발현능에 미치는 영향을 하기와 같이 실험을 수행하였다(KOREAN J. FOOD SCI. TECHNOL. Vol. 43, No. 1, pp. 65~71 (2011) 이한나 외 4명, 등골나물 추출물의 항염증효과).

3.1. 실시간(Real-time) PCR에 의한 김 추출물의 사이토카인 발현능 평가

RAW264.7 세포(TIB-71, ATCC)를 60 ㎜ 세포 배양 디쉬에 5×10⁶ cells/웰의 농도로 분주하여 안정화시킨 후, 김 물추출물 20 ㎍/㎖ 및 40 ㎍/㎖과 김 10%주정추출물 10 ㎍/㎖ 및 20 ㎍/㎖을 LPS 1 ㎍/㎖을 양성대조군(positive control)으로 하여 4시간 동안 처리 한 후 RNeasy 추출 키트(Qiagen, Gaithersburg, Maryland, USA)를 제조사의 실험방법에 따라 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA로 PrimeScript^TM 리버스 트랜스크립타아제(TAKARA BIO INC., Shiga, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 패스트스타트 유니버살 SYBR 그린 마스터(FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 이용하여 실-시간 PCR을 PIKOREAL 96(Thermo SCIENTIFIC, MA, USA) 기기를 이용하여 실시하였다. 분석에 사용한 각각의 프라이머의 염기서열은 GAPDH 정방향 5’-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3’(서열목록 제1서열), 역방향 5’-GCG GCA CGT CAG ATC CA-3’(서열목록 제2서열), IL-2 정방향 5′-CCT GAG CAG GGA GAA TTA CA-3′(서열목록 제3서열), 역방향 5′-TCC AGA ACA TGC CGC AGA-3′(서열목록 제4서열), IL-4 정방향 5’-AGA TGG ATG TGC CAA ACG TCC TCA-3’(서열목록 제5서열), 역방향 5’-AAT ATG CGA AGC ACC TTG GAA GCC-3’(서열목록 제6서열), IFN-γ 정방향 5’-GGC CAT CAG CAA CAA CAT AAG CGT-3’(서열목록 제7서열), 역방향 5’-TGG GTT GTT GAC CTC AAA CTT GGC-3’(서열목록 제8서열)와 같다.

3.2. 실험 결과

김 추출물의 면역조절 능력을 측정하기 위하여 RAW264.7에서 김 추출물 처리에 따른 사이토카인의 분비능을 알아보기 위해 실-시간 PCR을 통하여 유전자의 발현을 측정하였다. 대식세포가 활성화 되면 IL-2, IL-4 및 IFN-γ등과 같은 사이토카인을 분비하게 되고 이러한 사이토카인들은 다른 면역세포들과의 면역반응을 촉진시키는 역할을 하게 된다. 도 3은 IL-2, IL-4 및 IFN-γ 측정한 결과로 김 추출물의 농도 의존적으로 IL-2, IL-4 및 IFN-γ의 발현이 증가하는 것으로 나타났으나, 양성대조군인 LPS를 처리한 결과보다는 발현양이 적게 나타났다.

실험예 4: NK(Natural Killer) 세포 활성 측정

상기 실시예 시료의 면역증진 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 NK(Natural Killer) 세포 활성에 미치는 영향을 하기와 같이 실험을 수행하였다(J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 천년초에서 분리한 점질다당의 면역자극 활성 서이슬 신광순).

4.1. 마우스 비장세포 분리 및 NK(Natual Killer) 세포 활성 측정

6-7주령 웅성 ICR 마우스는 오리엔트 바이오(성남, 한국)에서 구입하였고, 경추탈구로 희생시켜 비장을 적출하였다. 비장은 40 ㎛ 크기 세포 스트레이너(SPL, Seoul, Korea)에서 마쇄하여 RPMI1640(SH30255.01, Hyclone Laboratories)에 10% 우태아혈청(FBS, Hyclone Laboratories)과 100 U/㎖ 페니실린(SV30010, Hyclone Laboratories), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(SV30010, Hyclone Laboratories)을 첨가한 배지(SH30255.01, Hyclone Laboratories)로 세척한 후, 완충액(red blood cell lysing buffer; R7757, Sigma, St. Louis, MO, USA)로 적혈구를 제거하였다.

YAC-1 세포(NK-민감 세포주, TIB-160, ATCC)는 NK 세포에 의해 공격되는 세포로 YAC-1세포가 NK 세포에 의해 공격을 받아 배지에 유리된 젖산 탈수소효소(Lactate Dehydrogenase; LDH)를 측정하여 NK 세포의 활성을 측정하였다. NK 세포와 YAC-1 세포를 96웰 플레이트에 농도별 CJE와 함께 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 배양한 후 유리된 LDH를 LDH-사이토톡식 컬러메트릭 어세이 키트 II(K313-500, Biovision, CA, USA)으로 키트의 프로토콜을 따라 측정하였다.

4.2. 실험결과

NK 세포의 활성은 YAC-1세포에 대한 NK 세포의 공격으로 인해 발생한 LDH를 측정함으로써 평가하여 김 추출물 처리에 따른 NK 세포 활성을 도 4에 제시하였다. 김 추출물은 NK 세포의 활성에 농도 의존적으로 영향을 주는 것으로 나타났으며, 김 물추출물 40 ㎍/㎖ 이상과 김 10% 주정 추출물 20 ㎍/㎖ 이상에서는 NK 세포의 활성이 통계적 유의성은 없는 것으로 나타났다.

본 발명의 추출물들을 포함하는 조성물의 제제 예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1: 산제의 제조

PTE10 ------------------------------------------- 20 ㎎

유당 -------------------------------------------- 100 ㎎

탈크 --------------------------------------------- 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2: 정제의 제조

PTE10 ------------------------------------------- 10 ㎎

옥수수전분 -------------------------------------- 100 ㎎

유당 -------------------------------------------- 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 ------------------------------- 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3: 캅셀제의 제조

PTE10 ------------------------------------------- 10 ㎎

결정성 셀룰로오스 --------------------------------- 3 ㎎

락토오스 --------------------------------------- 14.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트 --------------------------- 0.2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4: 주사제의 제조

PTE10 ------------------------------------------- 10 ㎎

만니톨 ------------------------------------------ 180 ㎎

주사용 멸균 증류수 ----------------------------- 2974 ㎎

Na₂HPO₄12H₂O ------------------------------------ 26 ㎎

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5: 액제의 제조

PTE10 ------------------------------------------- 20 ㎎

이성화당 ------------------------------------------ 10 g

만니톨 --------------------------------------------- 5 g

정제수 -------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6: 건강 식품의 제조

PTE10 ----------------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 ------------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 ------------------------------ 70 ㎍

비타민 E ---------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B₁ --------------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B₂ --------------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B₆ ---------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ --------------------------------------- 0.2 ㎍

비타민 C ----------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ------------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ---------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 --------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 ----------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 ------------------------------------- 적량

황산제1철 -------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 --------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ----------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 -------------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 -------------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 --------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 ---------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 ----------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7: 건강 음료의 제조

PTE10 ------------------------------------------ 100 ㎎

비타민 C ------------------------------------------- 15 g

비타민 E(분말) ------------------------------------ 100 g

젖산철 ------------------------------------------ 19.75 g

산화아연 ------------------------------------------ 3.5 g

니코틴산아미드 ------------------------------------ 3.5 g

비타민 A ------------------------------------------ 0.2 g

비타민 B₁ ----------------------------------------- 0.25 g

비타민 B₂ ------------------------------------------ 0.3 g

물 -------------------------------------------------- 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제제예 8: 씨리얼의 제조

PTE10 ------------------------------------------- 7.51 g

쌀 ---------------------------------------------- 40.49 g

현미 -------------------------------------------- 24.29 g

수수 --------------------------------------------- 2.02 g

보리 --------------------------------------------- 2.02 g

찹쌀 --------------------------------------------- 2.02 g

소금 --------------------------------------------- 0.49 g

깨 ----------------------------------------------- 0.16 g

설탕 -------------------------------------------- 17.75 g

해바라기유 --------------------------------------- 1.21 g

물 ------------------------------------------------- 정량

통상의 씨리얼 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 압출성형, 1차건조, 숙성, 파칭, 시럽코팅, 2차건조 과정, 포장한 다음 본 발명의 씨리얼 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제제예 9: 과자류의 제조

PTE10 ------------------------------------------- 5 g

쌀 ---------------------------------------------- 40.49 g

현미 -------------------------------------------- 24.29 g

수수 --------------------------------------------- 2.02 g

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Immunostimulatory Compositions comprising Extract from Citrus junos Sieb. <130> PN160105 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> forward primer for GAPDH <400> 1 catggccttc cgtgttccta 20 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> reverse primer for GAPDH <400> 2 gcggcacgtc agatcca 17 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> forward primer for IL-2 <400> 3 cctgagcagg gagaattaca 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> reverse primer for IL-2 <400> 4 tccagaacat gccgcaga 18 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> forward primer for IL-4 <400> 5 agatggatgt gccaaacgtc ctca 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> reverse primer for IL-4 <400> 6 aatatgcgaa gcaccttgga agcc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> forward primer for IFN-r <400> 7 ggccatcagc aacaacataa gcgt 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> reverse primer for IFN-r <400> 8 tgggttgttg acctcaaact tggc 24

Claims (7)

1. 김(Porphyra tenera) 10% 에탄올 추출물의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역증강용 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 김 추출물은 제염된(desalinized) 김 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 산화질소(Nitric Oxide; NO)를 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 대식세포의 활성화를 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 자연살해 세포의 활성화를 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 김(Porphyra tenera) 10% 에탄올 추출물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역증강용 식품 조성물.

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