KR101511095B1 - 생물전환된 사포닌을 함유하는 도라지발효주의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물 이용하여 생물전환된 사포닌을 함유하는 도라지발효주에 관한 것으로, 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)와 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 공생배양(co-culture)을 통하여 플라티코딘(platycodin) E으로부터 전환된 PD, PD3, DHPD(16-oxo PD)를 함유하는 도라지발효주를 제조할 수 있다.

Description

생물전환된 사포닌을 함유하는 도라지발효주의 제조방법{Method for production of Platycodon radix fermented liquor with bioconverted saponin}

본 발명은 미생물을 이용하여 생물전환된 사포닌을 함유하는 도라지발효주에 관한 것이다.

도라지(Platycodon radix)는 전통적으로 폐질환, 가래, 기침, 천식, 진통, 해열 등의 증상에 많이 사용되어온 약초로, 주요 활성물질은 사포닌 계열의 화합물로 알려져 있다. 도라지 내 사포닌 함량은 2% 내외, 종류는 20여 가지 이상으로 알려져 있다. 이 중에서 많이 연구되어온 물질은 플라티코딘(platycodin)과 폴리갈라신(polygalacin)인데, 당 잔기, 작용기의 차이에 따라 다양한 형태로 존재한다. 사포닌 화합물에서 구조, 작용기, 결합된 당의 종류와 수, 결합의 형태 및 다른 배당체와 상호작용 등은 이들 물질을 섭취했을 때 생체이용능 및 생리활성에 영향을 미치는 주요 인자이다.

한편, 대부분의 생리활성 배당체는 동물의 장 내에 존재하는 수많은 미생물들이 지니고 있는 효소에 의해 비배당체로 전환되어 흡수된다. 이때, 기질에 포함된 당의 종류, 결합된 형태 및 섭취자의 장내 미생물 환경에 따라 이들 배당체의 전환효율은 변화하기 때문에, 생리활성 역시 달라진다. 배당체의 비배당체로의 전환 혹은 구조, 작용기의 변환을 통한 이용효율의 향상은 고온, 고압 처리나 산, 알칼리 용액을 통한 가수분해 등과 같은 물리, 화학적 방법을 통해 이루어져 왔다. 일 예로, 고온, 고압 조건을 처리하여 배당체의 이용성을 향상시키고, 독성을 경감시킨 홍삼관련 제품이 있는데, 이러한 처리를 통해 만들어진 비배당체 산물은 비특이적인 반응 특성으로 인해, 원하는 활성 물질의 생산을 분석하고 조절하는데 어려움이 있으며, 부가적으로 발생할 수 있는 독성물질의 제어에 제약이 있는 한계가 있다.

그런데, 이들 배당체를 특이적으로 전환할 수 있는 효소 혹은 특정한 균과 곰팡이 등을 통해 전환 또는 발효한 경우, 목적으로 하는 비배당체를 선택적으로 생산하는 것이 용이하며, 비차별적인 화학결합의 파괴로 인한 독성물질의 생산으로 인해 식품의 안전성이 위협받는 것을 막을 수 있는 장점이 있다. 대표적인 예로, 도라지에 존재하는 사포닌 배당체 중 하나인 플라티코딘 D(platycodin D)는 사포닌 비배당체에 글루코오스, 아피오스, 자일로오스, 람노오스, 아라비노오스 등의 다양한 당이 결합된 구조인데 (도 1 참조), 16번 탄소에 존재하는 OH기의 케톤으로의 전환 등이 시도된바 있다 (도 2 참조).

대한민국 특허공개번호 제10-2011-0050117호 (공개일자: 2011. 05. 13)에는, 사포닌의 체내 흡수 증진을 위해 인삼 사포닌을 화합물K로 생물전환시킨 인삼 발효물 및 이의 제조방법, 그리고 이를 이용한 기능성 막걸리에 관한 것으로서, 생균제인 황국균을 이용하여 인삼을 발효시키고 발효과정에서 인삼 사포닌의 배당체 성분이 분해되어 우수한 생리활성 성분인 화합물K로 생물전환된 사포닌 대사체를 함유하는 인삼 발효물 및 이의 제조방법, 그리고 이를 이용한 기능성 막걸리가 기재되어 있다.

본 발명은 미생물을 이용하여 생물전환된 사포닌을 함유하는 도라지발효주를 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 도라지 추출물에 설탕을 넣어 제조한 배지에, 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)와 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 도라지발효주의 제조방법을 제공한다. 본 발명에서는 도라지 추출물을 배지로 하여 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)와 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 공생배양(co-culture)함으로써, 도라지 내 플라티코딘 E가 PD, PD3, DHPD(16-oxo PD)로 생물전환되어 생산됨을 확인하였고, 이를 함유하는 도라지발효주가 효과적으로 제조됨을 확인하였다.

한편, 본 발명의 도라지발효주 제조방법에 있어서, 상기 도라지 추출물은, 바람직하게 도라지 파쇄물에 물을 넣고 50~100℃ 온도에서, 1~10 시간 동안 추출하여 수득된 것이 좋다. 이와 같은 추출조건을 통해 알코올 발효를 위해 사용될 도라지 추출물이 도라지로부터 효과적으로 수득될 수 있기 때문이다.

한편, 본 발명의 도라지발효주 제조방법에 있어서, 상기 설탕은, 바람직하게 배지 전체 조성에 대하여 5~40 중량% 비율로 첨가되는 것이 좋다. 상기와 같은 배합비의 설탕이 첨가됨으로써, 알코올 발효가 효과적으로 촉진될 수 있기 진행될 수 있기 때문이다.

한편, 본 발명의 도라지발효주 제조방법에 있어서, 상기 발효는, 바람직하게 25~35℃의 온도에서 1~10일간 호기발효를 수행하고, 10~20℃로 온도를 낮춰 혐기발효를 수행하는 것이 좋다. 이와 같은 조건에서 발효를 수행할 경우, 알코올 생성능과 DHPD 전환, 발효 속도가 다른 조건에 비해 상대적으로 우수하게 나타났기 때문이다.

본 발명에 의할 경우, 도라지 내 플라티코딘 E이 생물전환되어 생산된 PD, PD3, DHPD(16-oxo PD)를 함유한 도라지발효주를 효과적으로 제조할 수 있는 효과가 발휘된다.

도 1은 플라티코딘 D에 글루코오스, 아피오스, 자일로오스, 람노오스, 아라비노오스 등의 다양한 당이 결합된 구조를 보여준다.
도 2는 플라티코딘 D의 16번 탄소에 존재하는 OH기가 케톤으로 전환되어 생성된 DHPD(16-oxo platycodin D)를 보여준다.
도 3은 설탕의 양을 10%로 하여 발효를 수행한 후, 발효물 내 잔존하는 당을 확인하기 위한 TLC 결과이다.
도 4는 설탕의 양을 30%로 하여 발효를 수행한 후, 발효물 내 잔존하는 당을 확인하기 위한 TLC 결과이다.
도 5는 '효모로 단독 혐기 발효한 샘플' 내 사포닌 성분의 생물전환을 확인하기 위한HPLC 결과(단위는 mM)이다.
도 6은 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 5일간 30℃ 호기 발효 후, 15℃, 혐기 발효한 샘플' 내 사포닌 성분의 생물전환을 확인하기 위한 HPLC 결과(단위는 mM)이다.
도 7은 A'. awamori 와 효모를 함께 넣고 15℃ 혐기 발효한 샘플' 내 사포닌 성분의 생물전환을 확인하기 위한 HPLC 결과(단위는 mM)이다.

본 발명에서는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)와 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 공생배양(co-culture)을 통하여 플라티코딘 E를 생물전환하는 공정기술을 개발하였고, 이를 통하여 생산된 PD, PD3, DHPD(16-oxo PD)를 함유한 도라지발효주를 완성하였다.

하기 본 발명의 실험 결과, 발효 완료 시점을 거품 생성이 중단될 때로 잡았을 때, 발효 속도를 비교해보면, 'A. awamori 와 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 함께 넣고 5일간 30℃ 호기 발효 후, 15℃ 혐기 발효한 군' > '효모로 단독 혐기 발효한 군' > 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 15℃ 혐기 발효한 군'의 순으로 나타났다.

발효 완료 시점에서 DHPD 양도 위의 순서와 동일한데, 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 5일간 30℃ 호기 발효 후, 15℃ 혐기 발효한 군', '효모로 단독 혐기 발효한 군'의 경우, DHPD 양은 두드러진 차이가 없었으나, 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 15℃ 혐기 발효한 군'의 경우, 도라지 사포닌의 DHPD 전환 정도가 다른 군에 비해 많이 낮았다. 전환 패턴으로만 봤을 때, '효모로 단독 혐기 발효한 군'의 경우, 일반적인 도라지 발효처럼 DHPD의 양이 PE, PD3, PD보다 두드러지게 높았으나, 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 5일간 30℃ 호기 발효 후, 15℃, 혐기 발효한 군'의 경우, DHPD 양이 가장 높았고, DHPD 외에 PD3 양도 발효 전보다 높아졌음을 확인할 수 있었다.

알코올 도수 측정 시, 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 5일간 30℃ 호기 발효 후, 15℃ 혐기 발효한 군'이 9.6도로 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 15℃ 혐기 발효한 군'이 4.6인 것에 비해 많이 높게 나타났다.

당(설탕) 소비 또한 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 5일간 30℃ 호기 발효 후, 15℃ 혐기 발효한 군'이 넣어준 당을 전부 소비한 것에 비해, 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 15℃ 혐기 발효한 군'은 발효 완료 시점에도 당이 남아 있었다.

결국 알코올 생성능과 DHPD 전환, 발효 속도의 세 가지 측면에서 비교했을 경우, 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 5일간 30℃ 호기 발효 후, 15℃, 혐기 발효한 군'이 가장 효율적인 것으로 사료된다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 1: 10중량% 설탕 첨가에 의한 도라지발효주의 제조

본 실시예에서는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)와 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 공생배양(co-culture)을 이용하여 발효주를 제조하고자 하였다.

균주로는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) KFRI 900 균주 (한국식품연구원 균주은행번호)를 사용하였고, PDA(Potato dextrose agar) 배지에서 30℃, 2주간 배양한 포자를 사용했다. 효모로 사용한 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7919 균주는 YN 배지에서 하룻동안 활성화시킨 후 접종하였다.

본 발명에서 배지로 사용된 도라지 추출물은 건조된 도라지(경동시장에서 구입)를 갈아서 무게를 잰 후 10배의 증류수를 넣고 80℃, 4h 동안 열수 추출한 후, 오토클레이브(121℃, 15 min)로 멸균과정을 거쳤다.

본격적인 실험을 위해 A. awamori의 포자 수를 계수하여 도라지 추출물 50ml 당 2 x 10⁸ 씩 접종했고, 설탕은 전체 도라지 추출물에 10중량% 만큼 첨가하였으며, 활성화 상태의 효모는 전체 도라지 추출물의 5중량%를 접종했다. 첫 번째 샘플은 5일 동안 A. awamori가 자랄 수 있는 최적조건인 호기, 30℃, 120 rpm의 환경에서 배양했고, 그 이후는 혐기, 15℃, 정치 상태에서 기포가 멈출 때까지 술 발효를 진행했다. 두 번째 샘플은 처음부터 혐기, 15℃, 정치 상태에서 기포가 멈출 때까지 술 발효를 진행했다. 대조군으로는 효모를 단독으로 접종한 다음 15℃ 온도 조건에서 혐기 발효한 군을 사용하였다.

발효 후, 'whatman No 1. Paper'로 필터링하여 -4℃에서 보관하였다.

한편, 알코올 도수는 증류장치를 사용해서 증류액을 받아내고, 주정계를 이용하여 측정했다. 또한, 발효주 내에 주요 성분은 TLC로 분석하였는데, '1-propanol : ethylacetate : water = 7:1:2' 용매를 이동상으로 사용했고, 상기의 발효 샘플 1ul를 각각 로딩했다. 10% 황산용액을 이용하여 발색시켰고, 110℃로 예열한 오븐에서 3분간 구웠다.

발효 결과, 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 5일간 30℃ 조건에서 호기 발효 후, 15℃ 혐기 발효한 군'의 알코올 도수는 9.5도로 나타났고, 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 15℃ 조건에서 혐기 발효한 군'의 알코올 도수는 4.6도로 나타났다.

한편, 발효물 내 잔존하는 당을 확인하기 위한 TLC 결과는 도 3과 같이 나타났다. 도 3에서, 왼쪽부터 세 스팟은 차례대로 1mM의 수크로오스(sucrose), 프룩토오스(fructose), 글루코오스(glucose) 표준 시약의 로딩 결과이다. 1번은 '도라지 추출액에 10% 설탕을 첨가한 대조군', 2번은 '도라지 추출액 대조군', 3번은 '10% 설탕을 넣고 효모를 단독으로 접종한 다음 15℃ 온도 조건에서 혐기 발효한 대조군', 4번은 '10% 설탕을 넣고 A. awamori 와 효모를 함께 접종하고 5일간 30℃ 조건에서 호기 발효 후, 15℃ 온도 조건에서 혐기 발효한 실험군', 5번은 '10% 설탕을 넣고 A. awamori 와 효모를 함께 넣고 15℃ 조건에서 혐기 발효한 실험군'의 로딩 결과이다.

도 3의 3, 4, 5번을 보면 각각의 조건에서 발효 완료 시점엔 10%의 설탕이 전부 소비됨을 알 수 있었다.

[ 실시예 2: 30중량% 설탕 첨가에 의한 도라지발효주의 제조]

본 실시예에서는 상기 실시예 1과 동일 조건으로 발효를 수행하되 도라지 추출액에 첨가한 설탕의 양만 30중량%로 변경하여 발효를 수행한 후, 당 성분의 변화를 관찰하였다. 실험결과는 상기 실시예 1과 같은 조건의 TLC를 통해 확인하였다. 도 4는 실시예 1과 비교하여 첨가한 설탕의 양만 30%로 늘린 샘플의 TLC 결과이다.

왼쪽부터 세 스팟(spot)은 차례대로 1mM의 수크로오스, 프룩토오스, 글루코오스 표준 시약의 로딩 결과이다. 1번은 '도라지 추출액 대조군', 2번은 '도라지 추출액에 30% 설탕 첨가 대조군', 3번은 '발효 종료 후 영하 4℃에 3개월간 보관했던 샘플 A', 4번은 '발효 종료 직후의 샘플 B', 5번은 '발효 종료 직후의 샘플 A', 6번은 'A가 발효 종료 시 발효 진행 중이었던 샘플 B'의 로딩 결과이다. 이때, 상기 샘플 A는 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 5일간 30℃ 조건에서 호기 발효 후, 15℃ 혐기 발효한 샘플'이고, 상기 샘플 B는 'A. awamori 와 효모를 함께 넣고 15℃ 조건에서 혐기 발효한 샘플'이다.

샘플 A의 수크로오스 소비가 샘플 B의 수크로오스 소비보다 현저히 높음을 알 수 있고, 10%의 당을 첨가했을 때 모든 조건에서 당을 전부 소진한 것과 달리 30%의 당 첨가는 발효 완료 시에도 TLC 상에서 당이 검출됨을 알 수 있었다.

실험예 1: 도라지 추출물 내 사포닌 성분의 생물전환 확인

상기 실시예 1의 샘플에 대해 도라지 추출물 내 사포닌 성분의 생물전환을 확인하기 위한 HPLC를 수행하였다. HPLC 분석은 하기와 같은 조건으로 수행하였다.

-컬럼 오븐 온도 : 40℃

-Flow : 1.5 ml/min

-컬럼 : ZORBAX SB C-18 (Agilent사, 4.6*250mm, 5micron)

-용매조건 : 하기 표 1의 멀티-스탭 그래디언트(Multi-step gradient)

HPLC 멀티-스탭 그래디언트(gradient) 조건

Time(minutes)	0.1% TFA	ACN
0	90	10
6	85	15
24	75	25
48	60	40
50	0	100
52	90	10
65	90	10

도 5는 효모로 단독 혐기 발효 시 HPLC 결과(단위는 mM)이다. 도 5에서 보듯이, 0h에서 PE 0.116mM, PD3 0.065mM, PD 0.085mM, DHPD 0.031mM인 것에 비해, 효모 단독 혐기 발효 완료 시 PE, PD3, PD는 각각 0.037mM, 0.036mM, 0.041mM로 감소하였고, DHPD는 0.426mM로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

도 6은 A. awamori 와 효모를 함께 넣고 5일간 30℃, 호기 발효 후 15℃, 혐기 발효한 HPLC 결과(단위는 mM)이다. 도 6에서 보듯이 0h에서 PE 0.116mM, PD3 0.065mM, PD 0.085mM, DHPD 0.031mM인 것에 비해, A. awamori 와 효모의 호기 발효 후 혐기 발효 완료 시, PE, PD는 각각 0.021mM, 0.069mM로 감소하였고, PD3와 DHPD 각각 0.231mM, 0.426mM로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

도 7은 A. awamori 와 효모를 함께 넣고 15℃ 혐기 발효한 HPLC 결과(단위는 mM)이다. 도 7에서 보듯이 0h에서 PE 0.116mM, PD3 0.065mM, PD 0.085mM, DHPD 0.031mM인 것에 비해 A. awamori 와 효모의 혐기 발효 완료 시 PE, PD는 각각 0.045mM, 0.038mM로 감소하였고, PD3와 DHPD 각각 0.123mM, 0.179mM로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

Claims (4)

1. 도라지 추출물에 설탕을 넣어 제조한 배지에, 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)와 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 발효시켜 16-옥소 플라티코딘 디(16-oxo platycodin D, DHPD) 성분이 강화되며,
   상기 발효는 25~35℃의 온도에서 1~10일간 호기발효를 수행하고, 10~20℃로 온도를 낮춰 혐기발효를 수행하는 것을 특징으로 하는 도라지발효주의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 도라지 추출물은,
   도라지 파쇄물에 물을 넣고 50~100℃ 온도에서, 1~10 시간 동안 추출하여 수득된 것을 특징으로 하는 도라지발효주의 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 설탕은,
   배지 전체 조성에 대하여 5~40 중량% 비율로 첨가되는 것을 특징으로 하는 도라지발효주의 제조방법.
   
4. 삭제

Images