KR100884616B1

KR100884616B1 - 홍국발효홍삼 및 홍국발효홍삼 제조방법

Info

Publication number: KR100884616B1
Application number: KR1020080079499A
Authority: KR
Inventors: 이인형; 오지환; 홍성윤; 장익순
Original assignee: 리뉴얼라이프(주)
Priority date: 2008-08-13
Filing date: 2008-08-13
Publication date: 2009-02-20

Abstract

본 발명에서는 홍국균을 이용하여 홍삼 진세노사이드 중 Rg3, Rh1, Rh2, Compound K 의 함량을 높이고 홍국균의 독성물질인 시트리닌을 생성하지 않으면서도 혈중 콜레스테롤 수치를 개선하는 monakolin K의 함량을 증대시킨 홍국발효홍삼의 대량 제조공정을 제공한다.

이를 위한 본 발명은 홍삼을 기질로 하는 발효대사에서 시트리닌이 생합성 되지 않는 홍국균인 Monascus pilosus 또는 Monascus anka 중 어느 하나 또는 이들의 혼합에 의한 홍국균 홍삼발효로 홍삼 진세노사이드 전환에 의해 진세노사이드 Rh1 또는 진세노사이드 Rh2 또는 진세노사이드 Rg3 또는 진세노사이드 Compound K 중 어느 하나 또는 이들이 혼합된 진세노사이드를 함유함과 더불어, 상기 홍국균 발효에 의해 모나콜린 K의 기능성 요구기준치(500 mg/kg)가 초과되어 함유되어 이루어진다. 그리고, 이러한 발효홍삼을 제조하기 위한 본 발명은 시트리닌이 생합성이 되지 않고 모나콜린 K를 대량 생성하는 홍국균을 선별하여 이 균주의 진세노사이드 전환 효소 분비를 촉진시키는 홍국균 전배양 단계와, 배양된 홍국균의 홍삼접종으로부터 홍삼의 진세노사이드를 전환시키는 홍삼발효단계로 이루어진다.

홍국, 발효, 홍삼, 제조

Description

홍국발효홍삼 및 홍국발효홍삼 제조방법{Monascus-Fermented-RedGingsen Manufacturing Method and Monascus-Fermented-RedGingsen thereof}

본 발명은 발효홍삼 및 이것의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 홍국균을 이용하여 홍삼 진세노사이드 중 체내 흡수율이 높은 Rg3, Rh1, Rh2, Compound K 의 함량을 높이고 홍국균의 독성물질인 시트리닌을 생성하지 않으면서도 혈중 콜레스테롤 수치를 개선하는 monakolin K의 함량을 증대시킨 홍국발효홍삼의 대량 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로, 홍삼의 사포닌은 혈관 이완인자인 nitric oxide(NO)를 내피세포에서 유리하고 진세노사이드(ginsenoside)들은 혈압강하작용, 항 콜레스테롤작용 및 발기부전 등 성인병과 당뇨병 및 노화에 대한 예방 또는 치료 효과가 있다고 많은 연구에 의해 규명되어 있다. 또한 감기와 정신적인 스트레스 개선작용과 체지방분해 작용 역시 보고되고 있다.

이에 의해 홍삼은 홍삼 농축액, 홍삼 정과, 다이어트 식품, 건강음료 등 여러 식품 분야에 응용되고 있으며, 그 효능도 매우 다양하다.

그러나, 상기 사포닌은 장내 미생물에 의해 분해 및 전환이 이루어져 체내로 흡수된다는 사실이 밝혀졌으며, 이러한 결과 사람에 따라 사포닌의 흡수정도가 다른 것으로 규명되어 있다. 예를 들어, 2004년도 한국 식품영양학회 국제학술대회 Ham et al. 에 따르면 사포닌을 흡수할 수 있는 그룹을 제외하고 Protopanaxadiol 계의 사포닌만을 흡수할 수 있는 그룹이 20.3%, Protopanaxatriol 계의 사포닌만을 흡수할 수 있는 그룹이 12.5%, 아예 사포닌 흡수를 못하는 그룹이 4.7%로 사람마다 흡수율을 차이가 두드러지고 있는 것이다.

한편, 현재 알려져 있는 주요 진세노사이드는 13가지 기본 진세노사이드와 전환된 진세노사이드 11가지 형태로 34종의 진세노사이드가 알려져 있다. 인삼에는 Ra, Rb1, Rb2, Rc, Re 등의 배당체 진세노사이드가 주를 이루고 있으며 이를 찌고 말리는 과정을 반복한 홍삼의 경우 인삼에는 거의 존재하지 않는 Rg3, Rh1, Rh2 Compound K의 함량이 증가하는 것으로 나타나 있다.

현재까지 알려져 있는 홍삼 진세노사이드 중 항암 및 항암전이효과가 가장 우수한 물질로는 상기 진세노사이드 Rg3, Rh1, Rh2 및 Compound K(20-O-b-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol)로 알려져 있으며, 이 네 가지 진세노사이드는 홍삼에 존재하는 사포닌으로 인삼에 존재하는 사포닌과 차별성이 있으며, 섭취시 소화흡수가 용이하여 그 기능성이 우수한 것으로 알려져 있다.

이러한 결과, 사포닌의 체내 흡수율을 증가시키기 위해서는 인삼을 홍삼으로 가공하고 다시 홍삼의 사포닌을 장내 미생물이나 효소로 전환시켜 발효홍삼으로 가공할 것이 필요하다.

좀 더 구체적으로, 홍삼에 존재하는 대표적인 진세노사이드는 상기 Protopanaxadiol 과 Protopanaxatriol 그리고 Oleanane을 기본구조로 하여 여기에 glucose, rhamnose, arabinose 가 연결되어 있는 형태로 종류가 결정된다.

상기 glucose가 2분자 이상 연결되어 있는 진세노사이드는 Rb1, Rd, F2 이며, arabinose가 연결되어 있는 진세노사이드는 Rb2, Rc이고, rhamnose가 연결되어 있는 형태가 Re, Rg2 인데, 이러한 진세노사이드는 극성 고분자물질이어서 체내흡수율이 낮다.

따라서, 이러한 고분자의 진세노사이드를 α-L-arabinosidase, β-D-glucosidase, α-L-rhamnosidase 효소로 분해하게 되면 상대적으로 저분자 진세노사이드 Rh1, Rh2, Rg1, Rg3 형태로 전환되어 홍삼 사포닌의 체내흡수율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 전기된 바와 같이 항암효과와 암 및 종양 전이억제 기능성 효율을 높일 수 있는 것이다.

이러한 이유에서 발효홍삼의 연구가 의욕적으로 추진되고 있다. 또한 예를 들어, 대한민국 출원 제1020050069032호(명칭: 유산균을 이용한 발효 홍삼 조성물 및 그 제조방법), 출원 제1020050094311호(명칭: 김치 유산균을 이용한 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법), 출원 제1020060067946호(명칭: 발효·팽화 처리에 의해 풍미와 사포닌 함량이 우수한 홍삼액의 제조방법), 출원 제1020070111888호(명칭: 압출성형 팽화 및 발효에 의한 기호성과 우수한 사포닌함량이 증가된 홍삼액과 산삼배양근액의 제조방법) 등에 사포닌의 체내흡수율을 증대시키기 위한 발효홍삼이 공지되어 있다.

그러나, 이러한 것들은 발효홍삼에서 진세노사이드의 체내흡수율 증대에만 치중된 것에 불과한 것이고, 발효홍삼의 생산성과 상품성 및 발효과정에서 또 다른 기능성 물질의 생성을 위한 발효공정을 도출하는 것은 용이하지 않다.

더욱이, 상기 제1020060067946호나 출원 제1020070111888호는 발효를 위하여 아스퍼질러스 속균을 이용하고 있는데, 발효대사 중에 독성물질인 시트리닌이 생성될 우려 역시 포함되어 있는 것이다.

이에 본 발명은 홍국균을 이용하여 홍삼 진세노사이드 중 체내 흡수율이 높은 Rg3, Rh1, Rh2, Compound K 의 함량을 높이고 홍국균의 독성물질인 시트리닌을 생성하지 않으면서도 혈중 콜레스테롤 수치를 개선하는 monakolin K의 함량을 증대시킨 홍국발효홍삼의 대량 제조방법을 제공함에 그 목적이 있는 것이다.

이를 위한 본 발명은 홍삼을 기질로 하는 발효대사에서 시트리닌이 생합성 되지 않는 홍국균인 Monascus pilosus 또는 Monascus anka 중 어느 하나 또는 이들의 혼합에 의한 홍국균 홍삼발효로 홍삼 진세노사이드 전환에 의해 진세노사이드 Rh1 또는 진세노사이드 Rh2 또는 진세노사이드 Rg3 또는 진세노사이드 Compound K 중 어느 하나 또는 이들이 혼합된 진세노사이드를 함유함과 더불어, 상기 홍국균 발효에 의해 모나콜린 K의 기능성 요구기준치가 초과되어 함유되어 이루어진 혈중 콜레스테롤 개선과 고기능 사포닌으로 체내흡수율을 향상시킨 홍국발효홍삼이다.

이러한 발효홍삼을 제조하기 위한 본 발명은 시트리닌이 생합성이 되지 않고 모나콜린 K를 대량 생성하는 홍국균을 선별하여 이 균주의 진세노사이드 전환 효소 분비를 촉진시키는 홍국균 전배양 단계와, 배양된 홍국균의 홍삼접종으로부터 홍삼의 진세노사이드를 전환시키는 홍삼발효단계로 이루어진 혈중 콜레스테롤 개선과 고기능 사포닌으로 체내흡수율을 향상시킨 홍국발효홍삼 제조방법이다.

이때, 상기 홍삼발효단계에는 발효가 완료된 발효홍삼을 멸균한 다음 냉각시 켜 건조시키는 건조단계가 더 포함된 것을 특징으로 한다.

좀 더 구체적으로, 일실시예로서 홍국균 배양단계에서 홍국균은 pilosus로부터 배양된 것을 특징으로 한다.

다른 실시예로서 홍국균 배양단계에서 홍국균은 anka로부터 배양된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 홍국균을 이용하여 홍삼을 발효시킴으로써, 홍삼발효를 통해 항암 및 항 암전이에 우수한 Rh1, Rh2, Rg3 및 compound K 로의 진세노사이드 전환이 우수하여 상품성이 증대되며 특히 대량생산 시 발효공정이 짧아 생산성이 증대되는 효과가 있다.

이때, 홍삼발효는 홍국균이 사용됨으로써, 홍국균의 대사물질이자 체내 콜레스테롤 조절에 관여하는 모나콜린 K가 발효홍삼에 첨가되면서도, 독성물질인 시트리닌은 생합성되지 않아 상품성과 기능성이 더욱 증대되는 효과가 있다.

또한, 홍국균에 의한 색소발현은 발효홍삼의 풍미감을 유지하여 상품성을 유지케하는 효과가 있다.

이를 통한 상기 홍삼발효단계는 일실시예로서, 1%~2.5% dextrose가 첨가된 8%~13% 홍삼배지에 Monascus pilosus를 6일~8일 배양시켜 스타터를 형성하고, 상기 스타터 8%~12%를 멸균처리된 수화홍삼에 접종하여 6일~8일간 25℃~35℃로 발효시킨 것을 특징으로 한다.

한편, 상기 홍삼발효단계는 다른 실시예로서, 1%~2.5% dextrose가 첨가된 8%~13% 홍삼배지에, 각각 Monascus pilosus를 6일~8일 배양시킨 Monascus pilosus 3%~5%와, Monascus pilosus를 6일~8일 배양시킨 Monascus pilosus 1%~3%와, Monascus anka를 18일~22일 배양시킨 Monascus anka 3%~5%를 혼합시켜 스타터 8%~12%를 형성하고, 상기 스타터를 수화홍삼에 접종하여 6일~8일간 25℃~35℃로 발효시킨 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 수화홍삼은 12%~14%의 홍삼 분말과 1%~2.5% Dextrose를 수화시킨 다음, 홍삼 사포닌에 의해 생성되는 거품을 억제시키기 위해 0.03%~0.07% 식품 첨가물용 소포제를 첨가하고, 115℃~125℃에서 20~30분간 바람직하기로는 121℃에서 20분간 멸균시켜 제조한다.

이러한 홍국균 발효에 의해 상기 홍삼발효단계는 홍국균에 의한 발효에 의해 모나콜린 K가 생성되어 첨가되는 모나콜린 K 첨가단계인 것을 특징으로 한다.

또한, 홍삼발효단계는 홍국균에 의해 진세노사이드 전환효소인 α-L-arabinosidase, β-D-glucosidase, α-L-rhamnosidase 중 어느 하나 또는 이들이 혼합된 것이 생성되고, 이에 의해 홍삼진세노사이드가 Rh1 또는 Rh2 또는 Rg3 또는 Compound K 중 어느 하나 또는 이들이 혼합되는 진세노사이드로 전환되는 진세노사이드 전환단계인 것을 특징으로 한다.

아울러, 상기 홍삼발효단계는 홍국균에 의한 발효에 의해 발효홍삼을 적색계열 또는 오렌지색계열 또는 황색계열로 발현시키는 풍미발현단계인 것을 특징으로 한다.

이하 첨부된 예시도면과 함께 본 발명의 실시예를 더욱 구체적으로 설명한다.

상기 홍국은 Monascus속 곰팡이를 백미에 증식시켜 만든 koji로 600여년 전부터 중국, 대만 등지에서 술, 두부, 어육제품의 착색제나 보존제로 사용해 왔다. 홍국색소는 황색이나 오랜지색 또는 자색과 적색을 띄는 등 10여 종 이상의 색소가 복합적으로 이루어져 있는 것으로 밝혀져 있다.

한편, 이러한 착색제나 보존제와 더불어 홍국의 중요한 기능은 콜레스테롤 생합성을 억제하거나, 혈압강하 및 혈관이완 효과 등 다양한 약리효능을 갖고 있는 것이다.

즉, 홍국균 대사산물의 일종인 monacolin(모나콜린) K 가 혈중 지질을 저하시킨다는 것이 입증되었고, 혈중 catalase 활성을 증가시켜 활성산소에 의한 동맥경화증의 예방기능의 효과도 보고되어 있다.

구체적으로, 모나콜린 K는 전체 모나콜린계의 80%를 차지하며, 내인성 콜레스테롤 생합성 경로의 속도결정 단계에 관여하는 HMG-CoA reductase(DL-3-Hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase)를 특이적으로 억제하여 저밀도지단백질(LDL)과 결합된 콜레스테롤 농도를 저하시킴으로써 혈중 콜레스테롤의 양을 감소시킬 수 있다.

또한 모나콜린 K는 콜레스테롤 생합성 조절효소인 히드록시메틸글루타릴 코엔자임-에이 환원효소에 작용해 히드록시메틸글루타릴 코엔자임-에이 환원효소가 메발로네이트(Mevalonate)로의 환원을 억제하여 간에서의 콜레스테롤 합성을 억제 시킨다는 보고가 있다.

콜레스테롤의 생성은 내인성 80%와 외인성 20%로 이루어지는데, 홍국의 모나콜린 K는 히드록시메틸글루타릴코엔자임-에이 환원효소에 부분적으로 작용하기 때문에 콜레스테롤 수치의 단순 저하가 아니고 조절기능을 한다. 이러한 모나콜린 K의 기능성은 현대사회에서 가장 크게 자리 잡고 있는 비만에 의한 성인병의 주요 원인 중의 하나인 고지혈증을 예방하는데 큰 역할을 할 것으로 기대된다.

이러한 이유에서 본 발명은 홍국균을 이용하여 홍삼을 발효시킴으로써, 홍삼 진세노사이드의 체내흡수율을 증대시키고, 이때, 홍국균의 기능 중 천연의 착색기능을 이용하여 발효홍삼의 풍미를 유지시키며, 또한 발효홍삼에는 존재하지 않지만 홍국균으로부터 생성되는 기능성 물질인 monacolin K 를 발효홍삼에 함유시킴으로써, 홍삼의 항암 및 암 전이억제 기능과 더불어 홍국의 고지혈증 예방 기능을 동시에 얻을 수 있는 것이다.

그러나, 상기 홍국균이 2차 대사를 하면서 생산하는 홍국 적색소, 모나콜린 K와 같은 유용한 기능성 물질은 다방면에 응용될 수 있겠지만, 동시에 시트리닌(citrinin)이라는 독소를 생산하기도 한다.

상기 시트리닌은 곰팡이 유래 신장독(Mycotoxin) 중 하나로 Aspergillus sp. 또는 Penicillium sp. 또는 Fusarium sp. 에서 주로 발견되지만 Monascus sp. 의 경우에도 생상을 한다. 상기 시트리닌은 주로 신장, 신경, 위장 장애를 동반하는 것이 특징이며 특히 열에 안정하기 때문에 식품가공 시 열처리 조건에도 안정되어 식품 위생관리 차원에서 주의를 요하는 물질이다.

이러한 이유에서 본 발명은 홍국균을 이용하여 홍삼을 발효시키되, 발효대사 중에 시트리닌을 생성하지 않는 홍국균을 선별하여 홍삼을 발효시킨다. 이러한 본 발명을 실시예를 통하여 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.

도 1 은 본 발명에 적용된 홍국균 리스트를 나타낸 명명표이고, 도 2 는 2차 선별을 위한 홍국 홍삼 발효액에서 시트리닌의 생성량을 나타낸 비교그래프이다.

도 3 은 홍국균을 이용하여 30일간 홍삼발효 시 진세노사이드를 전환시키기 위한 효소활성량을 비교그래프이며, 도 4 는 홍국균을 이용하여 30일간 홍삼발효 시킨 후 모나콜린 K의 생성량을 나타낸 비교그래프이고, 도 5 는 홍국균을 이용하여 30일간 홍삼발효 시킨 후 시트리닌 생성량을 나타낸 비교그래프이다.

도 6 은 Monascus sp. RK-03의 단독배양에 따른 홍삼발효공정을 나타낸 블럭도이고, 도 7 은 Monascus sp. RK-03, Monascus sp. RC-02, Monascus sp. RU-03 세 균주의 혼합배양에 따른 홍삼발효공정을 나타낸 블럭도이며, 도 8 은 50L 스케일 업 발효 시 RK-03 단독배양에서 홍삼발효조건을 나타낸 그래프, 도 9 는 50L 스케일 업 발효 시 혼합배양에서 홍삼발효조건을 나타낸 그래프이다.

도 10 은 50L 스케일 업 발효 시 7일간 진행된 RK-03 단독배양 및 혼합배양에서 생성된 모나콜린 K를 나타낸 그래프이며, 도 11 는 50L 스케일 업 발효 시 7일간 진행된 단독배양 및 혼합배양에서 진세노사이드 전환을 확인하기 위한 TLC(Thin Layer Cromatograpy)이다.

도 12 는 50L 스케일 업 발효 시 7일간 진행된 RK-03 단독배양에 따른 홍삼발효 중 특정 진세노사이드 변화량을 나타낸 그래프이며, 도 13 은 50L 스케일 업 발효 시 7일간 진행된 Monascus sp. RK-03, Monascus sp. RC-02, Monascus sp. RU-03 혼합배양에 따른 홍삼발효 중 특정 진세노사이드 변화량을 나타낸 그래프이다.

도 14 는 도 12의 단독배양에 따른 진세노사이드 변화량을 나타낸 비교표이며, 도 15 는 도 13의 혼합배양에 따른 진세노사이드 변화량을 나타낸 비교표이다.

그리고, 도 16 은 본 발명의 홍삼발효에 이용된 Monascus sp. RK-03, Monascus sp. RC-02, Monascus sp. RU-03의 DNA 염기서열 분석표이다.

실시예.

1단계: 홍국균 선별단계

1-1. 1차 균주분리

여러 홍국미와 홍국 누룩 분말을 일본, 중국, 한국에서 수집하였고 수집한 샘플을 PDA(Potato Dextrose Agrar)에 샘플 자체를 직접 접종하여 계대 배양하여 30℃ 에서 72시간 배양한 다음 분리하였고, 0.8% saline buffer에 10배 희석시켜 75℃에서 80시간 정도 배양하여 분리하였다.

분리된 균들 중 HPLC를 통해 모나콜린 K 정성분석 시 양성으로 나온 22가지 서로 다른 홍국균을 PDB (Potato Dextrose Broth)액상 배지에 3일간 배양하여 15% 글리세롤 스톡을 제조하여 보관하였다. 상기 모나콜린 K가 함유된 22가지 홍국균은 도 1과 같이 수집된 지역에 따라 국내산 RK-01 ~ RK-10, 중국산 RC-01 ~ RC-07, 원산지불명 RU-01 ~ RU-05로 명명하였다.

이때, 모나콜린 K의 HPLC 분석조건은 홍삼발효액을 동결 건조시켜 분말화한 다음에 1g 당 10mL의 추출용매(30% Acetonitrile, 30% Methanol, 40% Water)에 혼합한 후 80℃ 항온수조에서 4시간 동안 교반시켜 추출하였다. 추출된 샘플을 14,000rpm에서 10분 동안 원심분리 하였으며 상등액을 0.45㎛ pore size PVDF 필터에 여과시켜 분석시료를 전처리 하였다. 전처리된 시료를 분석하기 위해 Thermo Hypersil Gold C18 column을 사용하여 238nm 파장에서 분당 0.5mL의 유속으로 분리하였다. 모나콜린 K에 사용된 이동상으로는 65% acetonitile, 35% water(0.1% 인산 포함)의 조성으로 분석 retention time 40분이다.

1-2. 2차 균주분리

상기 1차적으로 선별된 균주들은 홍국 홍삼발효에 응용시키고자 하였고 식품에 응용할 수 있는지를 판단하기 위해 시트리닌을 분석하였다.

구체적으로, 22가지 균주를 5% 홍삼 액상 배지에 25일간 배양시켜 HPLC로 분석한 결과 도 2 에서와 같이, RK-01,02,05,06,09,10 와 RC-01,03,06 및 RU-04 총 10가지 홍국균은 시트리닌을 우려할 수준으로 생성하여 홍삼발효에 부적합한 것으로 판단되었다.

반면, RK-03, 04 와 RC-02,04 와 RU-03 인 홍국균은 시트리닌이 검출되지 않아 안전한 것으로 기대되며, RK-07,08 과 RC-05,07 과 RU-01,02,05 는 안전할 정도의 미량의 시트리닌이 검출되었다. 따라서, 12가지의 홍국균이 시트리닌으로부터 안전한 것으로 선별되었다.

이때, 시트리닌 HPLC 분석조건은 홍삼발효액을 동결 건조시켜 분말화한 다음 에 1g 당 10mL의 추출용매(50%Acetonitrile, 50%Ethyl Acetate)에 섞은 후 40℃에서 3시간 동안 교반하여 추출하였다. 추출된 샘플을 14,000rpm에서 10분 동안 원심분리 하였으며 상등액을 0.45㎛ pore size PVDF 필터에 여과시켜 Thermo Hypersil Gold C18 column을 사용하여 203nm 파장에서 분당 0.6mL의 유속으로 분리하였다. 시트리닌 분석에 사용된 이동상으로는 30% methanol, 30% acetonitile, 40% water(0.1% 인산 포함)의 조성으로 분석 retention time 40분이다.

1-3. 3차 균주분리

홍삼을 홍국균으로 발효시켜 여러 기능성 물질을 얻기 전에 분리된 홍국균의 성장이 잘되도록 홍국균 액상 배양 최적조건을 설정하였다. 시트리닌이 음성으로 확인된 균주를 PDA에서 접종하여 30℃에서 1주일 동안 배양한 다음 0.8% saline buffer에 포자수가 100,000개/mL가 되도록 희석시켜 10% 홍삼배지에 2% 접종하였다. 여러가지 조건 중 Dextrose를 1% 또는 2% 첨가하였을 때, 대수기로 접어드는 시간이 앞당겨졌으며, control에 비해 빠른 균체 증가량을 보이는 것으로 확인되었다.

따라서, 상기 선별된 12가지의 홍국균을 2% Dextrose가 포함된 10% 홍삼배지에 2% 접종하여 20일간 30℃ 교반 배양기에서 발효시켰다. 홍삼발효액을 동결건조한 다음 HPLC 분석을 수행한 결과, RC-04에서 40㎍/kg, RU-05에서 28.4㎍/kg의 시트리닌이 분석되어 상기 홍국균 배양조건에서 RC-04 와 RU-05는 시트리닌을 생성하는 것으로 판단되었다.

결과, 상기 RC-04 와 RU-05가 제외된 10가지의 홍국균이 홍국균 배양 최적조건에 적합한 것으로 선별되었다.

1-4. 최종 홍국균 선별

전기된 바와 같이, 홍삼에 존재하는 대표적인 진세노사이드는 Protopanaxadiol 과 Protopanaxatriol 그리고 Oleanane을 기본구조로 하여 여기에 glucose, rhamnose, arabinose 가 연결되어 있는 형태로 종류가 결정된다.

따라서, 이러한 고분자의 진세노사이드를 α-L-arabinosidase, β-D-glucosidase, α-L-rhamnosidase 효소로 분해처리하게되면, 상대적으로 저분자 진세노사이드 Rh1, Rh2, Rg1, Rg3, Compound K 형태로 전환되어 홍삼 사포닌의 체내흡수율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 항암효과와 암 및 종양 전이억제 기능성 효율을 높일 수 있는 것이다.

따라서, 상기 3차 선별된 10가지 홍국균을 10% 홍삼액에 30일간 배양시키면서, 5일 간격으로 효소활성을 비교하였다. 구체적으로, 10% 홍삼 배지에 2차 선별된 균주의 포자 현탁액 (100,000개/mL)을 2% 접종하였고 30℃에서 30일 동안 교반시켜 배양하였고 5일 간격으로 샘플을 회수하여 원심분리기에서 13,000 rpm 5분 원심분리한 후 균체를 제외한 상등액을 이용하여 효소 활성을 측정하였다. 샘플 중 상기 α-L-Rhamnosidase, α-L-Arabinosidase, β-D-glucosidase 세 가지 효소 활성을 측정하기 위해서 사용된 기질로는 4-Nitrophenyl α-L-rhamnopyranoside, 4-Nitrophenyl α-L-arabinopyranoside, p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside 세가지로 이 시약들을 50mM potassium phosphate용액에 5mM농도가 되도록 첨가하여 녹인 후 500μL 씩 분주하여 냉동 보관하였다. 효소 활성을 분석하기 위해 500 μL의 기질 용액을 30℃ 항온수조에 10분간 미리 예열하였으며 원심분리 후 얻은 발효액 200 μL를 예열된 기질용액과 섞은 후 30℃ 배양기에서 30분간 반응을 시켰다. 반응 후 기질에서 분리된 p-Nitrophenol (PNP)의 양을 O.D.₄₀₅ _nm에서의 흡광도로 측정하여 흡광도의 차이를 이용하여 효소 활성을 측정하였으며 효소 측정단위 1 Unit는 1분당 1 μmol의 PNP가 생성됨을 나타낸다.

도 3 에 의거, 상기 α-L-arabinosidase, β-D-glucosidase, α-L-rhamnosidase 세가지 효소가 분비되는 시점을 살펴보면 α-L-arabinosidase의 발현이 접종 후 5일에서 10일까지 활성화되는 것으로 나타났다.

β-D-glucosidase는 10일에서 20일 사이에 활성화되었으며, α-L-rhamnosidase는 20일에서 25일 사이에 발현 양이 증가하는 것으로 나타났다. 그러나, 효소의 활성은 각각의 홍국균에 따라 크게 차이가 났다.

즉, α-L-arabinosidase의 발현양은 RC-02가 0.73unit/mL로 가장 높은 것으로 측정되었다. β-D-glucosidase의 발현양은 RU-03이 4.96unit/mL 로 가장 높았 다. α-L-rhamnosidase의 발현양은 RU-03이 7.14unit/mL로 가장 높은 것으로 측정되었다.

다음으로, 상기 10가지 홍국균으로 발효시킨 홍삼에서 모나콜린 K의 함량을 측정한 결과 도 4 에서와 같이 모두 모나콜린 K가 검출되었으며, 홍국균을 이용한 홍삼발효 시 특히 RK-03이 5,000mg/kg 이상으로 다른 홍국균에 비해 월등히 높은 것으로 측정되었다. 참고로 기능성 식품으로 구분된 모나콜린 K의 기능성 요구 기준치는 500mg/kg 이상으로 되어 있다.

한편, 도 5 에서와 같이, 최종 균주 선별과정에서 시트리닌의 정량분석 결과, RK-04, RC-07, RU-02에서 시트리닌이 검출되었다.

결과, 홍삼발효에 적합한 홍국균으로는 RC-02, RU-03 및 RK-03이다. 한편, 선별된 홍국균을 동정하기 위해서 홍국균 genomic DNA의 ITS(Internal Transcribed Region)의 염기서열을 분석하여 현재 ITS의 정보가 알려져 있는 공시균주의 것과 대조하여 상관관계를 분석하였다.

ITS 염기서열 분석을 위해 ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATAT, 18mer), ITS5 (GGAGTAAAAGTCGTAACAA, 20mer) 두 가지의 primer를 사용하여 genomic DNA에서 ITS region을 PCR(Polymerization Chain Reaction)을 이용하여 분리하였다.

PCR은 총 부피 50ul (template DNA 1ul, dNTP mix 3ul, reaction buffer 5ul, H₂O 37ul, Taq polymerase 1ul, ITS4primer 2ul, ITS5 primer 2ul)으로 맞추어 다음과 같은 조건에서 수행하였다.(①95℃ 5min ②94℃ 1min ③50℃ 1min ④72℃ 1min ⑤ ②~④ x 30 cycle ⑥ 72℃ 5min ⑦ 4℃-END)

분석된 염기서열 비교는 DNA Star program으로 분석하여 선별된 홍국균 동정을 수행하였으며, 상기 선별된 Monascus sp. RK-03, RC-02, RU-03으로부터 genomic DNA를 분리하여 ITS resion을 증폭시켜 그 부분의 염기서열을 Monascus purpureus , Monascus ruber , Monascus pilosus , Monascus anka , Monascus kaoliang 과 비교한 결과 RK-03과 RC-02는 각각 Monascus pilosus와 98.5%, 99.3% 일치하였으며 RU-03은 Monascus anka와 98.8% 일치하였다. 따라서 선별된 균주의 명칭을 각각 Monascus pilosus RK-03, Monascus pilosus RC-02 그리고 Monascus anka RU-03으로 명명한다.(도 16 참조)

2단계 : 홍국균을 이용한 홍삼발효단계

상기 홍국균의 선별단계에서 나타난 바와 같이, 균주별로 효소활성에 차이가 있으며, 또한 모나콜린 K의 생성량에도 차이가 있다. 먼저, 홍국균을 단독 배양했을 때 보다 각각의 효소분비활성이 뛰어난 균주를 혼합 배양했을 때 전환율이 더 좋을 것이라고 기대 되며, 혼합배양 시제품 생산에 필요한 조건을 설정하였다.

한편, 시제품 생산에서 고려해야 할 사항이 발효시간과 연계되는 생산성이 다. 특히 생산성은 작업시간에 따른 생산량과 투입되는 소모품의 비율로 결정되는 것이기 때문에 발효 시간을 줄이는 것이 가장 큰 관건이라 할 수 있다. 발효 시간을 줄이기 위해서 고려해야 할 주요 사항이 초기pH, 온도, 탄소원 및 접종량이다.

13% 홍삼액의 경우 pH가 4.5-5.0으로 Monascus sp. 가 성장하기에 좋은 조건 이며 온도는 30℃, 탄소원은 2% dextrose로 이미 결정 되었고 나머지 변수가 바로 starter의 접종량이다.

상기 Starter를 제조하기에 앞서 홍국균별로 측정한 효소활성을 보면 전기된 바와 같이, α-L-arabinosidase의 발현이 접종 후 5일에서 10일, β-D-glucosidase가 10일에서 20일 사이, 그리고 α-L-rhamnosidase는 20일에서 25일 사이에 발현 양이 크게 증가한다.

따라서, 홍삼액에서는 순차적으로 효소가 분비된다는 것을 발견할 수 있었고 이를 이용하여 각각의 홍국균이 효소를 최적으로 분비하는 시점 바로 이전까지 starter를 배양하여 접종하는 것을 기본제조방법으로 응용하였다.

도 6 및 도 7 과 같이, 홍국발효홍삼의 시제품 테스트를 위해 2% dextrose가 첨가되어있는 10% 홍삼액에 RK-03을 7일 간 단독 배양한 스타터와 RC-02, RK-03 을 각각 7일 RU-03을 20일 배양한 스타터를 준비하여 동량으로 접종하고 같은 조건에서 발효시켰을 때 최종적으로 얻어지는 홍국 홍삼분말의 진세노사이드조성 및 monacolin K, citrinin 함량을 조사하였다.

공정을 살펴보면 혼합균주 배양의 경우 홍삼액에 배양된 RC-02, RK-03, RU-03 스타터를 우선 준비해 놓은 후 생산장비에 원료를 투입하기 전에 13%에 해당하는 홍삼 분말과 2% Dextrose를 Homogenizer를 이용하여 수화시켰으며 여기에 홍삼 사포닌에 의해 생성되는 거품을 억제시키기 위해 0.05% 식품 첨가물용 소포제(LS-303, Dow Coning)를 첨가한다.

수화시킨 홍삼액을 발효기에 투입하고 계산된 부피에 맞게 물을 투입하여, 예를 들어 수화시킨 홍삼액을 50L 액상 발효기에 투입하고 총 부피를 35L로 설정하고 홍삼 고형분 함량이 13%가 되도록 부피를 맞춘다. 부피를 맞출 때 starter 투입량만큼 부피를 뺀 부분까지 물을 채우는 것이 바람직하며, 원료 투입이 끝난 후 투입구 및 연결 배관을 닫고 발효기 내부 교반기의 rpm을 150으로 맞춰 교반 시키면서 121℃ 에서 20분간 멸균을 수행한다.

멸균이 끝나면 발효기 자켓에 냉각수를 투입시켜 즉시 30 ℃로 냉각시켜 접종 준비를 수행한다. 접종은 전기된 바와 같이 2% RC-02, 4% RK-03, 4% RU-03 혼합 접종한 것과 10% RK-03를 접종한 발효기 2대를 각각 사용하여 홍삼을 발효시킨다.

이때, 혼합배양한 발효기와 RK-03만 배양한 발효기 조건을 온도 30℃, 교반속도 150rpm을 기본으로 하여 7일간 발효하며 12시간 별로 pH, 온도, 용존산소량(D.O.)을 기록하여 발효가 안정적으로 진행이 됐는지 판단하였다. 온도는 30℃를 기준으로 2℃ 밖으로 오차가 있었고 pH는 혼합배양의 경우 초기 4.4에서 최종 4.6까지 변화가 거의 없었으며 RK-03발효 도 마찬가지로 초기 4.75에서 최종 4.65로 pH변화가 거의 없이 안정적으로 발효가 진행됨을 알 수 있었다.(도 8 및 도 9 참조)

용존 산소량을 비교해보면 혼합 배양을 했을 때 초기 8.6ppm 에서 48시간이 지난 후 1.06ppm으로 균체가 성장하면서 용존산소량을 급격하게 떨어뜨리는 것으로 나타났다. RK-03의 경우에는 초기 9.00ppm에서부터 108시간이 되서야 1.00ppm 으로 떨어진 것을 보면 혼합 배양의 경우 균체 성장 속도가 매우 빠를 것을 확인할 수 있었다. 발효기에서 용존 산소량이 급격하게 줄어들 때 중간에 한번 발효액에 필 터로 정제된 공기를 불어 넣어주어 용존 산소량을 늘려 주었고 그래프는 발효 중 용존 산소량의 변화와 pH, 온도의 변량에 대해 나타내고 있다.

두 조건을 적용시킨 발효를 7일간 진행시킨 후 회수하기에 앞서 두 발효기의 온도를 110℃로 올린 후 30분간 교반하여 살균을 해주고 살균이 끝난 후 즉시 냉각수를 발효기 자켓에 투입하여 20℃로 냉각을 시킨다. 냉각이 끝나고 살균된 이송탱크에 옮겨 담고 100L 동결건조기가 있는 GMP (Good Manufacturing Practice) 적용 작업장으로 이동시켜 동결건조 트레이에 2L씩 부어 동결 건조시킨다. 동결건조는 2일간 진행하였다.

동결건조가 끝난 샘플을 분쇄하여 소분하여 냉장보관 하였고 각각의 발효기에서 발효 과정 중간에 샘플을 취하여 monacolin K와 citrinin을 추출하여 비교 분석하였다.(도 10 참조) RK-03 단일 배양을 했을 경우 접종 후 당일 회수한 본 배양 샘플에서168.93 mg/kg 의 monacolin K가 검출 되었으며 발효가 끝난 후 최종 분말에서는 3089.32 mg/kg의 monacolin K가 검출되어 7일로 발효시간을 단축했을 때 예상했던 결과 이상의 수율을 보였다. 혼합배양의 경우에는 169.24 mg/kg 의 monacolin K가 접종 시 본배양액에서 검출 되었고 최종 발효 분말에서는 693.04 mg/kg으로 상기 기능성 기준치인 500mg/kg 이상이 검출되었음을 확인하였다.

한편, Citrinin의 정량분석 결과는 모든 샘플에서 음성으로 검출 되지 않아 섭취 시 매우 안전할 것으로 예측되며 각 샘플에서 McConkey plate에서 대장균 군 시험을 한 결과 음성으로 검출되지 않아 식품에 응용하기 적합한 것으로 판단하여 소량 섭취 해본 결과 이미 이취는 확인되지 않았다..

다음으로, 상기 홍국발효홍삼분말에서 진세노사이드 조성이 어떻게 변했는지 확인하기 위해 혼합배양 및 RK-03 발효 샘플을 접종시점으로부터 1일, 2일, 4일, 6일, 7일 샘플을 홍삼 고형분 농도를 균일하게 맞추고 분석한 결과 RK-03을 이용하여 발효했을 때 6일이 되면서부터 TLC 하단 부분의 Rc, Rb1 밴드가 전환된 것을 확인할 수 있었으며 중간부분의 Rd와 상단 부분의 Rg, Rh 밴드 영역이 진해진 것을 확인 할 수 있어 진세노사이드가 전환이 되었음을 알 수 있었다.(도 11 참조)

한편, 혼합배양의 경우 4일 이전에 Rc, Rb1 밴드가 Rd, Rg3, Rh1, Rh2 로 전환된 것을 확인할 수 있었다. 혼합배양의 경우, RK-03 만을 이용하여 발효시켰을 때 보다 2-3일 앞당겨 전환시켜 전환능력이 우수함을 알 수 있다.

다음으로, HPLC를 이용하여 진세노사이드를 분리하여 발효 진행 중에 진세노사이드가 어떤 순서로 전환이 되는지 또한 홍삼분말과 홍국 발효홍삼의 진세노사이드 조성이 어떤 차이가 있는지 알아보았다.

즉, 홍국균을 혼합 배양하여 발효시킨 것과, RK-03 균주를 단독으로 배양시켜 발효한 것을 발효 시간에 따라 홍삼 진세노사이드의 함량이 어떻게 변화하는지 알아보기 위하여 HPLC를 이용하여 비교하였으며, 본 발명에서 주요 대상으로 하고 있는 Rg3, Rh1, Rh2의 함량 증대와 진세노사이드 대사물인 M-1(compound K)의 양을 확인하였고 어떤 진세노사이드가 전환되는지 알 수 있었다.(도 12 및 도 13 참조)

두 가지 조건에서 접종 후 0일, 2일, 4일, 7일 순으로 분석을 하였고 최종적으로 얻은 홍국 발효홍삼 분말을 최종 샘플로 설정하여 비교 분석한 결과 두 가지 조건 모두 진세노사이드 Rb1, Rc의 함량이 줄어드는 것을 확인 할 수 있었다.(도 14 및 도15 참조) Re는 그렇게 큰 변화를 보이지 않았고 Rg3, Rh2의 경우에는 2배 이상의 증가량을 보였다. 그러나 혼합배양의 경우에는 Rh1이 상당량 증가 되는 것을 확인 할 수 있는 반면에 RK-03 단일 배양한 시료에서는 시간이 경과할수록 줄어드는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 compound K의 경우에는 홍삼에는 거의 존재하지 않았으며 발효 후 3배 이상 증가하여 혼합배양의 경우 1329mg/kg이 전환되었고 RK-03 단일 배양한 경우 1515.5mg/kg이 전환된 것을 확인할 수 있어 발효가 진행 됨에 따라 실제로 진세노사이드가 전환이 됨을 알 수 있었다.

진세노사이드의 정량 분석결과에서 기본적으로 Rb1, Rb2, Rc의 진세노 사이드에서 Rd 를 걸쳐 대부분 Rg3로 전환되는 것을 확인할 수 있었으며 나머지 일부는 F2를 걸쳐 Rh2와 compound K로 전환되는 것을 확인할 수 있었다.

또 다른 한편으로는 Re의 양은 기간별로 큰 차이를 보이지 않으나 발효시간이 지날수록 Rg2의 양이 증가하는 것으로 볼 때 Re의 양도 상당량 늘었다는 것으로 판단된다. 즉, 다른 고분자 진세노사이드로부터 Re로 전환이 되면서 동시에 Re는 Rg2로 전환 되었다는 것을 보여주고 있다.

또한 Rh1의 량이 혼합 배양시 발효 후 432mg/kg에서 2948mg/kg으로 4배 이상 증가하였고, RK-03단일 배양한 시료에서는 발효 후 39.2mg/kg으로 양이 줄어들었다. 이것은 혼합배양 시 발효 초반에 propanaxadiol 계의 진세노사이드Rb2, Rc, Rb1을 Rd와 propanaxatriol 계의 Rg2로의 전환수율을 높인다는 것이며 이는 발효 초반에 진세노사이드 전환효소의 활성이 높았으며 발효 중반에 효소 활성이 떨어진 것을 나타내고 있다. 마지막으로 혼합 배양에서 Rh2의 함량이 Rb1이나 Rc가 전환됨에 따라 증가하는 것을 확인했지만 RK-03을 순수배양한 샘플의 경우보다 Rh2함량이 적게 나온 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 Rh2의 경우 최종적으로 PPD(Protopanaxadiol)로 전환된 것으로 예상된다.

한편, RK-03 단일 배양 시에는 발효가 천천히 진행됨에 따라 Rb2, Rc, Rb1의 전환 속도가 느렸으며 4일 이후에는 Rd와 Rg1, Rg2의 전환이 급격하게 진행되어 Rg3, Rh2, compound K 의 전환률을 높인 것으로 예측된다. 특히 단일 배양 시 Rh1의 함량이 줄어든 것은 Rh1이 PPT(Protopanaxatriol)로 전환이 되었을 가능성이 높다.

결과적으로 혼합배양 시 PPD계열의 진세노사이드 전환이 단일배양보다 빠르게 진행되었으며 단일 배양 시에는 효소 활성이 혼합배양보다 안정적으로 오래 지속되어 Rh2 및 compound K로 전환을 지속시킬 수 있었다.

따라서, 본 발명에서 진세노사이드 전환 속도를 기준으로 하였을 때는 혼합배양조건이 바람직하다. 한편, 혼합배양조건보다는 느리지만 진세노사이드를 전환시키며 monacolin K함량을 증대시킨 것은 RK-03 단일 배양 조건이며 초기 홍국균주 접종 시 균체 성장과 효소 생산 및 전환 효소의 활성 반감기를 조사하여 최적조건은 실험적으로 결정될 것이다.

도 1 은 본 발명에 적용된 홍국균 리스트를 나타낸 명명표,

도 2 는 2차 선별을 위한 홍국 홍삼 발효액에서 시트리닌의 생성량을 나타낸 비교그래프,

도 3 은 최종 홍국균을 선별하기 위한 홍국균의 효소활성량을 나타낸 비교그래프,

도 4 는 모나콜린 K의 생성량을 나타낸 비교그래프이고, 도 5 는 시트리닌 생성량을 나타낸 비교그래프,

도 6 은 본 발명에 따른 홍국균(Monascus pilosus RK-03)의 단독배양에 따른 홍삼발효공정을 나타낸 블럭도,

도 7 은 본 발명에 따른 홍국균 혼합배양에 의한 홍삼발효공정을 나타낸 블럭도,

도 8 은 본 발명에 따른 홍국균(Monascus pilosus RK-03) 단독배양에서 홍삼발효조건을 나타낸 그래프,

도 9 는 혼합배양에서 홍삼발효조건을 나타낸 그래프,

도 10 은 본 발명에 따른 홍국균(Monascus pilosus RK-03) 단독배양 및 혼합배양에서 생성된 모나콜린 K를 나타낸 그래프,

도 11 는 단독배양 및 혼합배양에서 진세노사이드 전환을 확인하기 위한 TLC(Thin Layer Cromatograpy),

도 12 는 본 발명에 따른 홍국균(Monascus pilosus RK-03) 단독배양에 따른 홍삼발효 중 진세노사이드 변화량을 나타낸 그래프,

도 13 은 혼합배양에 따른 홍삼발효 중 진세노사이드 변화량을 나타낸 그래프,

도 14 는 단독배양에 따른 진세노사이드 변화량을 나타낸 비교표,

도 15 는 혼합배양에 따른 진세노사이드 변화량을 나타낸 비교표,

도 16 은 본 발명의 홍삼발효에 이용된 홍국균인 Monascus pilosus RK-03 과 Monascus pilosus RC-02 및 Monascus anka RU-03의 염기서열 분석표이다.

Claims

시트리닌의 생합성이 배제되는 Monascus pilosus RK-03, Monascus pilosus RC-02 또는 Monascus anka RU-03 중 어느 하나 또는 이들 혼합스타터의 수화홍삼접종으로 홍국균 발효에 의한 홍삼 진세노사이드 전환에 의해 생성된 진세노사이드 Rh1 또는 진세노사이드 Rh2 또는 진세노사이드 Rg3 또는 진세노사이드 Compound K 중 어느 하나 또는 이들이 혼합된 진세노사이드가 발효홍삼에 포함함과 더불어, 상기 홍국균 발효에 의해 500mg/kg 내지 3000mg/kg의 모나콜린 K 가 함유되어 이루어진 홍국발효홍삼.
시트리닌이 배제되면서 모나콜린 K를 생성하는 홍국균으로Monascus pilosus RK-03, Monascus pilosus RC-02 또는 Monascus anka RU-03 를 배양시키는 홍국균 배양단계와, 상기 Monascus pilosus RK-03, Monascus pilosus RC-02 또는 Monascus anka RU-03 중 어느 하나 또는 이들의 혼합스타터를 수화홍삼에 접종하여 홍삼을 발효시키는 홍삼발효단계로 이루어진 홍국발효홍삼 제조방법.
제 2 항에 있어서, 홍삼발효단계는 1%~2.5% dextrose가 첨가된 8%~13% 홍삼배지에 Monascus pilosus RK-03을 6일~8일 배양시켜 스타터를 형성하고, 상기 스타터 8%~12%를 멸균처리된 수화홍삼에 접종하여 6일~8일간 25℃~35℃로 발효시킨 것을 특징으로 하는 홍국발효홍삼 제조방법.
제 2 항에 있어서, 홍삼발효단계는 1%~2.5% dextrose가 첨가된 8%~13% 홍삼배지에, 각각 Monascus pilosus RK03를 6일~8일 배양시킨 Monascus pilosus RK03 3%~5%와, Monascus pilosus RC-02를 6일~8일 배양시킨 Monascus pilosus RC-02 1%~3%와, Monascus anka RU-03을 18일~22일 배양시킨 Monascus anka RU-03 3%~5%를 혼합시켜 스타터 8%~12%를 형성하고, 상기 스타터를 수화홍삼에 접종하여 6일~8일간 25℃~35℃로 발효시킨 것을 특징으로 하는 홍국발효홍삼 제조방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 수화홍삼은 12%~14%의 홍삼 분말과 1%~2.5% Dextrose를 수화시킨 다음, 홍삼 사포닌에 의해 생성되는 거품을 억제시키기 위해 0.03%~0.07% 식품 첨가물용 소포제를 첨가하고, 115℃~125℃에서 20~30분간 멸균시켜 제조한 것을 특징으로 하는 홍국발효홍삼 제조방법.