KR20130142707A

KR20130142707A - 효소전환과 유산균 발효를 이용한 화합물 ｋ의 함량이 강화된 발효홍삼 농축액의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 제품

Info

Publication number: KR20130142707A
Application number: KR1020120066147A
Authority: KR
Inventors: 최일동; 라제현; 윤병훈; 박현준; 허철성
Original assignee: 주식회사한국야쿠르트
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2013-12-30
Also published as: JP5917772B2; KR101409761B1; JP2015521478A; WO2014007427A1

Abstract

본 발명은 홍삼을 효소전환과 유산균발효를 이용한 발효홍삼농축액의 제조방법에 관한 것으로서 4년 홍미삼 주정 추출물과 식용가능효소인 Cytolase PCL5, Sumizyme AC, Cellulase KN, Crystalzyme APXL 및 Rapidase C80Max 중 3종의 효소를 사용하며, 김치로부터 분리한 유산균 Lactobacillus sakei HY7802를 이용하여 발효하여 홍삼으로부터 소화율 및 흡수율이 증대된 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 얻을 수 있다.

Description

효소전환과 유산균 발효를 이용한 화합물 Ｋ의 함량이 강화된 발효홍삼 농축액의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 제품{A method of preparation for fermented red ginseng using conversion by enzyme mixture and fermentation by lactic acid bacterium and the products containing fermented red ginseng manufactured thereof as effective factor}

본 발명은 효소전환과 유산균 발효를 이용한 화합물 K의 함량이 강화된 발효홍삼 농축액의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 홍미삼을 주정으로 추출하고 그 추출물을 자체 선정한 식용 가능한 복합효소로 전환한 후, 김치에서 분리한 유산균을 접종, 발효시킴으로서 다양한 기능의 생체유효성이 높은 화합물 K의 함량이 강화된 발효홍삼 농축액의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 제품에 관한 것이다.

인삼 및 홍삼의 효능성분으로 알려진 것은 사포닌(saponin)이다. 인삼 및 홍삼의 사포닌은 배당체의 일종으로 다른 식물에서 발견되는 사포닌과는 다른 특이한 화학구조를 가지고 있으며, 그 효능도 큰 차이가 난다. 인삼 및 홍삼의 사포닌은 타 식물계 사포닌과 구별하기 위해서 인삼(ginseng) 배당체(glycoside)란 의미로 '진세노사이드(Ginsenoside)'라고 부른다. 최근 분석기술의 발달에 따라 지금까지 30여종의 진세노사이드 화학구조가 밝혀졌다. 이는 서양삼 14종, 중국의 전칠삼 15종에 비해 월등히 많은 종류가 들어있다. 진세노사이드는 dammarane 골격을 갖는 배당체에 일종의 화학구조상 R1, R2, R3자리에 어떤 종류의 당이 몇 개 붙느냐에 따라 디올계(PPD)와 트리올계(PPT)의 진세노사이드 등으로 분류된다. 가공과정 중 이러한 진세노사이드에 높은 압력을 가하거나 효소 첨가, 또는 가열을 하면 당이 일부 떨어져 나가기도 하고 새로운 이중결합이 생기면서 특이한 진세노사이드가 만들어진다. 따라서 인삼의 가공방법에 따라 여러 가지 특이 진세노사이드가 함유된 제품들이 출시되고 있다.

인삼 사포닌이 체내에 흡수되기 위해서는 디올계 진세노사이드는 20(S)-프로토파낙사디올 20-O-β-D-글루코피라노사이드(20(S)-protopanaxadiol 20-O-β-D-glucopyranoside, FGM 1, 이하, '화합물 K'라 함)으로 그리고 트리올계 진세노사이드는 20(S)-프로토파낙사트리올 (20(S)-protopanaxatriol, FGM 4)로 분해된 후 체내에 흡수되면서 효능을 발휘하는데 열이나 산, 압력, 소화효소 등에 의해서는 소량만 전환, 흡수될 뿐이다. 최근 연구결과에 따르면 인삼 사포닌이 이러한 최종산물로 전환할 때 장내미생물이 필요하다고 밝혀졌다.

경구 복용한 사포닌이 흡수되려면 장내 미생물에 의해 분해되어야 하는데 Privotella oris균이 진세노사이드를 사포닌을 대사하는 대표적 균이며 이외에 유산균 등의 여러 가지 유익균이 사포닌 대사에 관여한다. 일반인들 중 인분을 조사해 추정한 연구에서 정상인 중 30%는 사포닌을 대사할 수 있는 균이 전혀 없고, 비록 균이 있는 나머지 70% 중에도 대사 능력에 차이가 있어 디올계와 트리올계 사포닌을 모두 정상적으로 대사할 수 있는 사람은 소수에 지나지 않는다. 특히 지속적인 항암치료나 약제를 복용하는 경우에는 장내균총이 안정적이지 않으므로 사포닌 대사율이 더 떨어짐이 보고되었다. 이런 면에서 이미 외부에서 장내 미생물로 발효하여 개인의 신체 상황에 관계없이 인삼의 효능성분을 흡수할 수 있는 형태로 전환하여 누구나 효과를 볼 수 있도록 발효 홍삼을 개발하는 것은 매우 바람직하다고 볼 수 있다.

지금까지 언급한 바와 같이 모든 인삼사포닌은 장내 미생물의 분해를 통해 최종 대사물로 대사되어야 흡수된다. 그러나 사람의 장내 미생물 균총은 균일하지도 않고 시시각각 변하는 것이어서 개인에 따라 인삼 사포닌 흡수율이 다름이 밝혀졌다. 따라서 이것을 극복할 수 있는 방법이 바로 인삼 및 홍삼을 장내 미생물로 발효시켜 직접 체내에 흡수시키는 방안이 있다. 발효 홍삼은 이러한 장내미생물의 차이로 인한 흡수와 효능의 차이를 줄이기 위해 홍삼을 미리 특유 미생물로 발효시킴으로써 흡수가 용이한 유용 사포닌으로 전환하여 개인차 민족차를 극복하여 인삼 효능의 표준화를 이룰 수 있다는 장점이 있다. 이러한 이유 때문에 국내에서 최근 발효 홍삼에 대한 제품이 출시되고 있으며, 이에 대한 효능이 연구되고 있다.

발효 홍삼은 사포닌의 균형적인 대사에도 도움을 준다. 디올계 사포닌은 신체를 안정화 시키고 면역력을 높이며 지나친 것은 낮추어 정상화시키는 작용이 있다. 트리올계 사포닌의 경우 혈액순환을 좋게 하고 원기를 높이며 활력을 주는 서로 보완하며 상반되는 작용을 가지고 있다. 만약 장내 균총이 불안정하여 디올계와 트리올계 사포닌을 한 쪽만 대사시키거나 둘 다 대사시키지 못하면 사포닌 흡수에 불균형이 오고, 따라서 인삼을 복용하여도 효과가 떨어질 수 있으며 일부 사람에서는 열이 나거나 답답함 등의 불편한 경험을 하게 된다. 그러나 외부에서 디올계와 트리올계 사포닌을 균형적으로 대사시켜 신체에 흡수시켰을 경우에는 인삼 및 홍삼이 가지고 있는 본연의 효능을 모두 볼 수 있으며 그 외 부작용 등이 현저히 줄어든다는 연구결과들이 보고되고 있다.

대한민국 공개번호 제10-2011-0052218호(발명의 명칭: 펙티넥스를 이용하여 화합물 K의 함량이 증가된 인삼 및 홍삼 농축액의 제조방법, 2011.05.18. 공개) 대한민국 공개번호 제10-2010-0069194호(발명의 명칭: 효소 및 초고압을 이용한 홍삼제조방법, 2010.06.24. 공개) 대한민국 공개번호 제10-2006-0001834호(발명의 명칭: 김치 유산균을 이용한 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조 방법, 2006.01.06. 공개) 대한민국 공개번호 제10-2010-0089701호(발명의 명칭: 2단계 발효 방식에 의한 발효 홍삼 및 그 제조 방법, 2010.08.12. 공개)

Biotransformation of Panax notoginseng saponins into ginsenoside compound K production by Paecilomyces bainier sp. 229. J Appl Microbiol. 2008 Mar;104(3):699-706.

본 발명은 홍미삼으로부터 효소전환과 김치유래 유산균을 이용한 발효를 통하여 화합물 K의 함량이 강화된 발효홍삼 농축액을 제조하는 방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 제품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a)4년근 홍미삼에 50% 주정(酒精)을 첨가하여 홍미삼 주정추출물을 제조하는 단계; b)상기 a)단계의 홍미삼 주정추출물을 냉각한 후 여과하는 단계; c)상기 b)단계의 여과액을 25~30브릭스(Brix)까지 농축하여 주정(酒精)을 제거하는 단계; d)상기 c)단계의 농축액을 희석하여 Cytolase PCL5, Sumizyme AC, Cellulase KN, Crystalzyme APXL 및 Rapidase C80Max로 이루어진 군으로부터 선택된 3종의 효소의 조합농도 1~3%의 범위로 50℃에서 48~72시간 동안 처리하여 사포닌을 전환시키는 단계; e)상기 d)단계의 효소 반응액에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) HY7802 균주를 접종하여 발효시키는 단계; f)상기 e)단계의 발효액을 가열하여 d)단계의 효소를 불활성화 시키는 단계; g)상기 f)단계의 효소가 불활성화 된 발효액을 70~80브릭스(Brix)까지 감압 농축하는 단계; 및 h)상기 g)단계의 농축액을 살균하는 단계를 포함하는 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액의 제조방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

상기 a)단계의 홍미삼 주정추출물의 제조는 홍미삼 무게의 20배의 50% 주정을 이용하여 80℃에서 6시간 동안 3회 추출하는 것이 바람직하다. 일반적으로 홍삼 추출시 10~20배의 주정을 사용한다고 알려져 있어 수율을 최대로 하기 위해서 홍삼 무게의 20배로 사용하여 3회 추출한다.

상기 b)단계의 홍미삼 주정추출물의 냉각은 40~50℃까지 하며, 여과는 퍼라이트(perlite)를 이용하는 것이 바람직하다. 퍼라이트 여과는 일반적으로 미세한 현탁물이나 콜로이달 입자를 제거하기 위함으로 진세노사이드 성분은 여과에 의해서 함량의 변화가 없기 때문이다. 40~50℃로 냉각하는 이유는 추출온도인 80℃에서는 추출물의 용해도 등의 원인으로 여과 효과가 반감되기 때문이다.

또한 상기 b)단계의 여과액을 25~30브릭스(Brix)까지 농축하여 주정(酒精)을 제거하는 것이 바람직하다. 최소한 25브릭스(Brix)까지 농축을 하지 않으면 남아 있는 주정이 효소반응을 저해할 수 있다.

또한 상기 d)단계의 3종의 효소의 조합은 Cytolase PCL5, Sumizyme AC 및 Rapidase C80Max의 효소 조합인 것이 바람직하다.

상기 f)단계의 효소의 불활성화는 90℃에서 10분 동안 실시하는 것이 바람직하다. 효소를 불활성화 해서 다음 단계인 유산균 발효 시 유산균의 생육저해의 가능성을 없애기 위함이다.

상기 h)단계의 살균은 90℃에서 2시간 동안 실시하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료는 본 발명의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액과 혼합과즙시럽 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조한다.

또한, 본 발명의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품은 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 포함하는 것 이외에 영양보조성분으로서 비타민 B₁, B₂, B₅, B₆, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.

또한, 본 발명의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물은 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 통상적인 화장료 조성물 제조방법에 첨가하여 제조된다.

본 발명의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액은 효소전환과 유산균 발효과정을 통하여 진세노사이드를 변환시킴으로써 인체 내에서 소화 흡수율이 증대된 화합물 K를 다량 함유하고 있는 건강기능식품 또는 식품소재로서 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 화합물 K의 전환 활성을 가지는 효소를 선발하기 위해서 반응물을 TLC 전개한 사진이다.
도 2는 본 발명에서 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase) 활성을 보이는 균주들 중 진세노사이드 전환능을 보이는 균주를 선발하기 위해서 반응물을 TLC 전개한 사진이다.
도 3은 본 발명의 효소전환 및 유산균 발효에 의한 발효홍삼 농축액 제조방법의 바람직한 실시예를 보인 공정도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.

<실시예 1>

홍삼 원료의 선정

풍기인삼농협으로부터 구입한 6년근 본삼, 6년근 미삼, 4년근 본삼, 4년근 미삼을 구입하여 사용하였다.

6년근 홍삼의 본삼 100g, 6년근 홍삼의 미삼 100g, 4년근 홍삼의 본삼 100g, 4년근 홍삼의 미삼 100g 각각에 70% 주정 2ℓ를 넣고 80℃에서 환류추출하여 감압농축 후 동결건조하였다.

상기 방법에 의해 얻어진 주정추출물에서 진세노사이드(ginsenoside) Rb1 및 Rg1의 함량을 측정하여 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본삼에 비해서 미삼에 화합물 K의 주요 기질이 되는 Rb1의 함량이 많았으며, 6년근 보다 4년근에서 함량이 더 많았다. 따라서, 화합물 K의 함량이 강화된 발효홍삼 농축액의 원료로써 4년근 홍미삼을 선택하였다.

<실시예 2>

사용 효소의 선정

화합물 K의 주요 기질이 되는 진세노사이드 Rb1을 사용한 효소반응을 통하여 식용 가능한 효소 13종(Sumizym AC, TG-B, Lumicell YX1, Cellulase KN, Rapidase TF, Pectinase UltraSP, Cytolase PCL5, Filtrase Premium, Multifect Pectinase FE, Crystalzyme APXL, Rapidase C80MAx, GC220, Multifect CXXL)으로부터 화합물 K를 생성하는 효소 7종을 선별하였다.

상기의 반응은 1%(w/v)의 진세노사이드 Rbl 수용액 1㎖에 13종의 효소 각각을 총 반응 부피 1㎖의 5%인 0.05㎖를 첨가하여 50℃에서 200rpm으로 24시간 반응하여 총 반응 부피 1㎖의 동량의 수포화 부탄올(butanol)로 진세노사이드를 추출한 후 TLC(thin layer chromatography)에 점적 및 전개하여 화합물 K의 생성여부를 확인하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

세로축의 "C-K"는 "화합물 K"를 나타낸다. "AC"는 "Sumizym AC"를 나타낸다.

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, Cytolase PCL5(제조사: DSM, 효소 종류: pectinase, pectin lyase, polygalacturonase and endoarabinase, 효소 생산 미생물: Aspergillus niger), Multifect Pectinase FE(제조사: Genencor, 효소종류: pectinase, cellulase, henmicellulase and beta-glucosidase, 효소 생산 미생물: Aspergillus niger), Sumyzyme AC(제조사: ShinNippon, 효소 종류: cellulase, beta-glucosidase and hemicellulase, 효소 생산 미생물: Aspergillus niger), Cellulase KN(제조사: ShinNippon, 효소 종류: cellulase, hemicellulase, pretease and naringinase, 효소 생산 미생물: Aspergillus niger), Rapidase TF(제조사: DSM, 효소 종류: pectinase and hemicellulase, 효소 생산 미생물: Aspergillus niger), Crystalzyme APXL(제조사: DSM, 효소 종류: pectin esterase, pectin depolymerase, cellulase and hemicellulase, 효소 생산 미생물: Aspergillus niger) 및 Rapidase C80Max(제조사: YC International, 효소 종류: pectinase, 효소 생산 미생물: Aspergillus niger)의 총 7종의 화합물 K로의 전환 효소를 선별하였다.

<실시예 3>

선별 효소의 최적 조합 선정

선별된 상기 실시예 2의 7종의 효소 중 Multifect Pectinase FE는 Genencor사의 단종으로 인해 제품 생산에 적용이 불가능하여 제외하였으며, Rapidase TF와 Rapidase C80Max 중 Rapidase C80Max를 선정함에 따라 총 5종의 효소 Cytolase PCL5, Sumizyme AC, Cellulase KN, Crystalzyme APXL 및 Rapidase C80Max를 가지고 최적 조합을 찾는 실험을 진행하였다.

상기 실시예 1의 10%(w/v)의 4년근 홍미삼 주정추출물 10㎖에 상기 5종류의 효소 중 3종류의 효소의 조합을 각각 1%씩 4년근 홍미삼 주정추출물 총 부피 10㎖의 3%인 0.3㎖ 첨가하여 50℃에서 200rpm으로 24시간 반응하여 반응물의 화합물 K를 HPLC를 통하여 정량하였다.

그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

효소의 조합			화합물 K의 함량 (mg/g)
Crystalzyme APXL	Cytolase PCL5	Sumizym AC	1.32
Crystalzyme APXL	Cytolase PCL5	Cellulase KN	1.17
Crystalzyme APXL	Cytolase PCL5	Rapidase C80Max	1.19
Crystalzyme APXL	Sumizym AC	Cellulase KN	1.32
Crystalzyme APXL	Sumizym AC	Rapidase C80Max	1.40
Crystalzyme APXL	Cellulase KN	Rapidase C80Max	0.68
Cytolase PCL5	Sumizym AC	Cellulase KN	1.52
Cytolase PCL5	Sumizym AC	Rapidase C80Max	1.86
Cytolase PCL5	Cellulase KN	Rapidase C80Max	0.86
Sumizym AC	Cellulase KN	Rapidase C80Max	1.00

상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와같이, 화합물 K의 생성능이 가장 좋은 Cytolase PCL5, Sumizyme AC 및 Rapidase C80Max의 효소조합을 선정하였다.

<실시예 4>

선별 효소 조합의 최적 조건 결정

상기 실시예 3에서 선별된 3종 효소조합, Cytolase PCL5, Sumizyme AC 및 Rapidase C80Max의 최적 전환조건을 설정하기 위하여 기질인 상기 실시예 1의 4년근 홍미삼 주정추출물의 농도를 5%, 10% 및 15%, 상기 3종 효소 Cytolase PCL5, Sumizyme AC 및 Rapidase C80Max의 조합 농도를 1%(Cytolase PCL5 0.33%, Sumizyme AC 0.33% 및 Rapidase C80Max 0.34%), 2%(Cytolase PCL5 0.67%, Sumizyme AC 0.66% 및 Rapidase C80Max 0.67%) 및 3%(Cytolase PCL5 1%, Sumizyme AC 1% 및 Rapidase C80Max 1%), 반응시간을 24시간, 48시간 및 72시간 중 선택된 조건으로 50℃에서 200rpm으로 진행하였으며 반응표면분석법(response surface methology)을 이용하여 하기 표 3과 같이 최적전환 조건을 결정하였다.

Sample	반응조건 (4년근 홍미삼 주정추출물/ 반응시간/ 3종 효소조합 농도)	화합물 K 생성량 (mg/g)
1	10%/3d/3%	2.59
2	5%/2d/3%	7.21
3	15%/1d/2%	0.3
4	10%/1d/3%	0.9
5	15%/2d/3%	1.7
6	5%/2d/1%	2.63
7	10%/1d/1%	0.36
8	10%/2d/2%	0.43
9	10%/2d/2%	0.66
10	10%/3d/1%	0.56
11	5%/3d/2%	5.19
12	15%/2d/1%	0.33
13	15%/3d/2%	1.43
14	10%/2d/2%	1.07
15	5%/1d/2%	2.76

상기의 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 4년근 홍미삼 주정추출물 5%, 효소조합농도 3% 및 반응시간 48시간(샘플 2)의 경우에 최대의 화합물 K의 생성량을 보였다.

이후 72시간 동안 반응하여 화합물 K의 생성량을 측정한 결과 48시간 반응과 비교했을 때 그 생성량이 7.43 mg/g으로 다소 증가하는 결과를 나타내었다.

따라서 발효홍삼농축액 제조시에 반응 조건을 4년근 홍미삼 주정추출물 5%, 효소조합농도 3% 및 반응시간 72시간으로 결정하였다.

<실시예 5>

5-1. 김치유산균으로부터 진세노사이드 전환 유산균의 분리

여러 지역의 가정집 및 음식점으로부터 여러 종의 김치를 수집하여 각 김치의 김치액을 멸균수를 이용하여 희석한 후 MRS Agar 배지에 도말하여 30℃에서 배양한 후 균주모양, 색, 투명도, 크기, 외형구조 등을 육안으로 관찰하여 김치 유산균을 1차 선발하였다.

상기의 방법을 통하여 1차 선발된 108 종의 균주를 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성, 진세노사이드 전환능 및 홍삼 추출액에서의 성장능을 통하여 최고의 전환능 및 성장능을 보이는 1종의 유산균을 최종 선발하였다.

먼저, 베타-글루코시다아제 활성을 갖는 유산균을 선발하기 위하여 1차 선발된 유산균 배양물(균체포함) 0.2㎖ 각각에 최종 농도가 10mM이 되도록 p-Nitrophenyl β-D-glucoside 용액 0.2㎖를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 1.6㎖의 0.5M 탄산나트륨(Na₂CO₃)을 첨가하여 반응을 종료하고 420nm에서 흡광도를 측정하여 OD₄₂₀값이 1.5 이상인 균주 8종을 선발하였다.

그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4의 균주 8종을 대상으로 진세노사이드 Rb1의 전환능을 측정하기 위하여 1%(w/v)의 진세노사이드 Rbl 수용액 1㎖에 1㎖의 상기 8종의 유산균 배양물 각각을 첨가하여 37℃에서 200rpm으로 24시간 반응하여 TLC에 점적 및 전개한 후 진세노사이드 전환능을 보인 4종의 균주를 선발하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 진세노사이드 전환능을 보인 4종의 균주는 #25, #31, #35, #66임을 알 수 있었다.

상기 선발된 4종의 균주를 10% 홍미삼 추출물에 접종한 후 37℃에서 48시간 배양 후 성장능을 관찰하였다.

그 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 최고의 성장능을 보인 균주 1종 #35을 최종 선발하였다.

5-2. 분리된 김치유산균의 동정

상기 5-1의 선별된 균주 #35를 MRS 배지에서 배양한 후 게놈 DNA를 분리하였다. 16rDNA 부위는 시발체(primer)로 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 증폭시켰다. 시발체 서열은 5`-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3`(순방향)과 5`-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3`(역방향)을 사용하였다. PCR 반응을 위하여 추출한 게놈 DNA 50ng, 각 dNTPs 100μM, 시발체 각 0.2μM, 1× enzyme buffer, Taq polymerase 2unit를 넣고 증류수로 전체 50μl 부피가 되도록 추가하였다. 증폭반응은 초기 94℃에서 90초 동안 변성한 후, 28사이클로 94℃에서 30초, 42℃에서 60초, 72℃에서 60초 실시하였고, 추가로 72℃에서 5분 연장하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에서 분리한 후, 용출하여 (주)코스모진텍에 염기 서열 분석을 의뢰하여 결과를 얻었다. 그 얻은 결과를 BLSAT Search를 통하여 분석할 결과 기존에 데이터베이스(Data Base)에 올려져 있는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주들과 99% 이상의 상동성을 나타내었다.

본 발명에 따른 유산균의 특성은 다음과 같다.

1)균의 형태

엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균의 특성

① 세포의 형태: 간균

② 운동성: 없음

③ 포자형성능: 없음

④ 그람(Gram) 염색: 양성

2)균락의 형태

엠알에스(MRS) 한천평판배지에서 37℃, 2일간 배양했을 때 균락의 형태

① 형상: 원형

② 융기: 볼록

③ 표면: 매끈(smooth)

3)생리적 성질

① 최적 생육온도: 36~38℃

② 최적 생육 pH: 5.0~7.0

③ 산소에 대한 영향: 통성혐기성

4)카탈라제: -

5)가스형성여부: -

6)15℃에서 생육: -

7)45℃에서 생육: +

8)인돌생산: -

9)젖산생산: +

이상에서와 같은 본 발명의 신균주의 형태학적 특성, 생리적 및 생장 특성과 16S rDNA 분석을 통한 분자유전학적인 방법에 근거하여 동정한 결과, 본 발명의 신균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)에 속한다는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 신균주를 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) HY7802로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2011년 12월 6일자로 기탁하였다(기탁번호:KCTC 12097BP).

<실시예 6>

발효홍삼 농축액의 제조

도 3의 공정도에서와 같이 본 발명의 발효홍삼 농축액의 제조방법은 다음과 같다.

(1)원료삼 계량

풍기인삼농협에서 구입한 4년근 홍미삼 100kg을 사용하였다.

(2)추출

상기 홍미삼에 식품원료로 사용할 수 있는 50% 주정 2000ℓ씩(주정 1000ℓ+정제수 1000ℓ) 첨가하여 80℃에서 6시간 동안 3회 추출하였다.

(3)여과

상기 추출물을 50℃로 냉각한 후 퍼라이트(perlite)를 이용하여 여과하였다.

(4)농축

상기 여과액을 30브릭스(Brix)로 감압농축하였다.

(5)효소전환

상기 감압농축액에 정제수를 첨가하여 5브릭스(Brix)가 되게 희석한 후 여기에 총 부피 0.8%의 Cytolase PCL5, Sumizyme AC 및 Rapidase C80Max 효소조합을 첨가하여 50℃에서 72시간 동안 반응하였다.

(6)유산균발효

상기 효소 반응액에 김치유래 유산균 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) HY7802를 접종하여 37℃에서 발효하였다.

(7)효소실활

상기 발효액을 90℃에서 10분 동안 가열하여 상기 효소 Cytolase PCL5, Sumizyme AC 및 Rapidase C80Max를 불활성화 하였다.

(8)농축

상기 효소가 불활성화된 발효액을 75브릭스(Brix)가 되게 감압농축하였다.

(9)살균 및 포장

상기 농축액을 90℃에서 2시간 동안 살균한 후 포장하여 본 발명의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 제조하였다.

<실시예 7>

화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료의 제조

본 발명의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액과 혼합과즙시럽으로 구성된 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.

먼저, 혼합과즙시럽은 액상과당 13중량%, 백설탕 2.5중량%, 갈색설탕 2.5중량%, 혼합과즙농축액 56Brix^o 10.9중량%, 펙틴 1.0중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.1중량% 및 정제수 70중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.

그리고 상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 30.4중량%와 상기 실시예 6의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액 0.1중량% 및 나머지 정제수 69.5중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 본 발명의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.

<실시예 8>

화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품의 제조

상기 실시예 6의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B₁, B₂, B₅, B₆, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기 상기 실시예 6의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물 100중량부에 대하여 멸균 정제수 10중량부를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.

<실시예 9>

화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물의 제조

본 발명의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물은 크림 형태로서, 프로필렌글리콜 5중량%를 가열하여 70℃에 보존한 다음 스테아릴 알콜 8중량%, 스테아린산 2중량%, 스테아린산 콜레스테롤 2중량%, 스쿠알란 4중량%, 2-옥틸도데실알콜 6중량%, 폴리옥시에틸렌 알콜에스테르 3중량%, 글리세릴모노스테아린산 아스테르 2중량%의 혼합물을 가한 다음 예비 유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각한 다음 45℃에서 상기 실시예 6의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액 6중량% 및 잔량의 정제수를 첨가하여 32℃까지 냉각하여 본 발명의 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제조하였다.

한국생명공학연구원

KCTC12097BP

20111206

Claims

a)4년근 홍미삼에 50% 주정(酒精)을 첨가하여 홍미삼 주정추출물을 제조하는 단계;
b)상기 a)단계의 홍미삼 주정추출물을 냉각한 후 여과하는 단계;
c)상기 b)단계의 여과액을 25~30브릭스(Brix)까지 농축하여 주정(酒精)을 제거하는 단계;
d)상기 c)단계의 농축액을 희석하여 Cytolase PCL5, Sumizyme AC, Cellulase KN, Crystalzyme APXL 및 Rapidase C80Max로 이루어진 군으로부터 선택된 3종의 효소의 조합 농도 1~3%의 범위로 50℃에서 48~72시간 동안 처리하여 사포닌을 전환시키는 단계;
e)상기 d)단계의 효소 반응액에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) HY7802 균주(기탁번호: KCTC 12097BP)를 접종하여 발효시키는 단계;
f)상기 e)단계의 발효액을 가열하여 d)단계의 효소를 불활성화 시키는 단계;
g)상기 f)단계의 효소가 불활성화 된 발효액을 70~80브릭스(Brix)까지 감압 농축하는 단계; 및
h)상기 g)단계의 농축액을 살균하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 a)단계의 홍미삼 주정추출물의 제조는 홍미삼 무게의 20배의 50% 주정(酒精)을 이용하여 80℃에서 6시간 동안 3회 추출하는 것을 특징으로 하는 발효홍삼 농축액의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 b)단계의 홍미삼 주정추출물의 냉각은 40~50℃까지 하며, 여과는 퍼라이트(perlite)를 이용하는 것을 특징으로 하는 발효홍삼 농축액의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 d)단계의 3종의 효소의 조합은 Cytolase PCL5, Sumizyme AC 및 Rapidase C80Max의 효소 조합인 것을 특징으로 하는 발효홍삼 농축액의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 f)단계의 효소의 불활성화는 90℃에서 10분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 발효홍삼 농축액의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 h)단계의 살균은 90℃에서 2시간 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 발효홍삼 농축액의 제조방법.
제1항의 방법으로 제조된 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 포함하는 기능성 음료.
제1항의 방법으로 제조된 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품.
제1항의 방법으로 제조된 화합물 K가 강화된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물.