TWI815071B - 用於抑制澱粉酶活性、促進脂肪代謝和延緩老化的阿薩伊果發酵物 - Google Patents
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Abstract
一種阿薩伊果發酵液用以製備抑制澱粉酶活性、促進脂肪代謝和改延緩老化的組合物之用途，其中該阿薩伊果發酵液是由一阿薩伊果浸提液經複數菌種發酵後所製得，複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
Description
本發明係關於一種阿薩伊果發酵物，特別是涉及一種以阿薩伊果發酵物製備具有抑制澱粉酶活性、促進脂肪代謝和延緩老化的組合物的用途。
由微生物發酵的食品具有更易於消化、香味增加、儲藏時間提升等優勢。例如：泡菜、納豆、水果醋等等都是廣受歡迎的發酵類食品。飲品界中，發酵飲品愈來愈受到消費者的喜愛。發酵飲品常以乳品、蔬菜、水果、豆類等為原料基底，再經由不同種類的微生物作用而製得。
阿薩伊果（學名：Euterpe oleracea）又稱巴西莓，為棕櫚科花椰屬物種，是一種原產於巴西亞馬遜地區的棕櫚科植物，其果實類似藍莓，可食用
。成年阿薩伊果的高度可超過25米，葉可長3米。阿薩伊果之棕櫚葉可製成帽子、墊子或籃子，因其樹幹具抗蟲特性，樹枝可用於建築。
在一些實施例中，一種阿薩伊果發酵物用以製備減重的組合物之用途，其中該阿薩伊果發酵液是由一阿薩伊果浸提液經複數菌種發酵後所製得，複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。在一些實施例中，該阿薩伊果發酵物係透過減少個體澱粉之吸收來達到該減重之功效。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有減少一個體澱粉吸收之能力。
在一些實施例中，一種阿薩伊果發酵物用以製備抑制澱粉酶活性的組合物之用途，其中該阿薩伊果發酵液是由一阿薩伊果浸提液經複數菌種發酵後所製得，複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
在一些實施例中，一種阿薩伊果發酵物用以製備抑制葡萄糖苷酶活性的組合物之用途，其中該阿薩伊果發酵液是由一阿薩伊果浸提液經複數菌種發酵後所製得，複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有抑制澱粉酶活性之能力。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有抑制葡萄糖苷酶活性之能力。
在一些實施例中，一種阿薩伊果發酵物用以製備促進脂肪分解的組合物之用途，其中該阿薩伊果發酵液是由一阿薩伊果浸提液經複數菌種發酵後所製得，複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有促進脂肪分解之能力。
在一些實施例中，一種阿薩伊果發酵物用以製備提升肌肉生長的組合物之用途，其中該阿薩伊果發酵液是由一阿薩伊果浸提液經複數菌種發酵後所製得，複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
在一些實施例中，一種阿薩伊果發酵物用以製備促進肌纖維增生的組合物之用途，其中該阿薩伊果發酵液是由一阿薩伊果浸提液經複數菌種發酵後所製得，複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
在一些實施例中，一種阿薩伊果發酵物用以製備抗氧化的組合物之用途，其中該阿薩伊果發酵液是由一阿薩伊果浸提液經複數菌種發酵後所製得，複數菌種包括酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。在一些實施例中，該阿薩伊果發酵物係透過減少細胞內自由基之含量以達到該抗氧化。在一些實施例中，該阿薩伊果發酵物細透過提升細胞內穀胱甘肽（Glutathione，以下簡稱：GSH）合成量以達到該抗氧化之功效。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有提升以下基因中至少一基因的表現量的能力：KRT1
基因、KRT10
基因及KRT14
基因。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有提升肌膚保濕能力之能力。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物的多酚含量至少為291μg/mL。
在一些實施例中，阿薩伊果浸提液是由阿薩伊果基液在50℃-100℃下靜置0.5小時-1.5小時所製得。
在一些實施例中，阿薩伊果基液包括阿薩伊果溶液及相對於阿薩伊果溶液總重10%的葡萄糖，阿薩伊果溶液包括1重量份的阿薩伊果果汁及15重量份的水。
綜上所述，根據任一實施例的阿薩伊果發酵物，其可用以製備減重的組合物。其中，阿薩伊果發酵物是將阿薩伊果浸提液以複數菌種發酵所得之。在一些實施例中，阿薩伊果發酵物的多酚含量至少為291μg/mL。在一些實施例中，阿薩伊果發酵物可藉由抑制澱粉酶活性或葡萄糖苷酶，降低受體吸收澱粉或葡萄糖之能力，進而使受體體重降低。在一些實施例中，阿薩伊果發酵物可藉由分解受體細胞內脂肪以達到減脂或減重之功效。在一些實施例中，阿薩伊果酵素可分解受體細胞內脂肪以達到減脂或減重之功效。
根據任一實施例的阿薩伊果發酵物，其可用以製備提升肌肉增生的組合物。根據任一實施例的阿薩伊果發酵物，其可用以製備提升細胞抗氧化能力的組合物。在一些實施例中，阿薩伊果發酵物可藉由減少受體細胞內自由基之含量、或提升細胞合成GSH之能力以達到該抗氧化之提升。
根據任一實施例的阿薩伊果發酵物，其可用以製備提升肌膚保濕能力的組合物。在一些實施例中，阿薩伊果酵素可提升保濕相關基因之基因表現量。在一些實施例中，保濕相關基因為KRT1
基因、KRT10
基因及/或KRT14
基因。
於下列實施方式的說明中，除非另有相關說明，則「%」符號是指重量百分比。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物是由阿薩伊果浸提液經過複數菌種發酵所製得。舉例來說，複數菌種包括酵母菌（Yeast）、乳酸桿菌（Lactobacillus
）及醋酸菌（Acetobacter aceti
）。
在一些實施例中，阿薩伊果浸提液可以以阿薩伊果（Euterpe oleracea）之果汁
、水及葡萄糖來製備。舉例來說，阿薩伊果浸提液可以以阿薩伊果基液經浸提程序後所得，而阿薩伊果基液可由阿薩伊果溶液及相對於該阿薩伊果溶液10%的葡萄糖混合而成。在一些實施例中，阿薩伊果溶液包括1重量份的阿薩伊果果汁、15重量份的水，而阿薩伊果果汁係由阿薩伊果果實粗碎汁液而成。
在一些實施例中，將阿薩伊果果汁及水混合以形成阿薩伊果溶液。接著，於阿薩伊果溶液中加入相對阿薩伊果溶液總重10%的葡萄糖，以得到阿薩伊果基液。並且，將阿薩伊果基液進行浸提程序以得到阿薩伊果浸提液。於此，由於進行浸提程序前，阿薩伊果基液中的葡萄糖為完全溶解或未完全溶解。因此，透過浸提程序有助於將阿薩伊果基液內的葡萄糖完全溶解。
在一些實施例中，將阿薩伊果及水混合以形成阿薩伊果溶液後進行浸提程序，並於浸提程序後加入葡萄糖以形成阿薩伊果浸提液。於此，先將阿薩伊果溶液先行進行浸提程序，有助於阿薩伊果溶液中的阿薩伊果內的有效成分釋出。
在一些實施例中，浸提程序為於50℃-100℃下靜置0.5小時-1.5小時。舉例來說，浸提程序係指將阿薩伊果基液或阿薩伊果溶液維持在95℃並靜置1小時。
在一些實施例中，阿薩伊果浸提液的糖度為9°Bx~10°Bx。於此，足夠的糖度可以確保後續發酵的順利進行，並使菌種有足夠的養分生長。
接著，加入複數菌種至阿薩伊果浸提液中進行發酵7~15.5日以得到阿薩伊果發酵物。其中，複數菌種包括0.01%~0.5%的酵母菌、0.01%~0.25%的乳酸菌及3~10%的醋酸菌（Acetobacter aceti
）。在一些實施例中，於發酵前不濾除阿薩伊果浸提液中的固形物（即，進行浸提程序後的阿薩伊果）。換言之，是直接將菌種加入阿薩伊果浸提液進行發酵，藉以利用菌種進一步提取固形物中的活性成分。
在一些實施例中，酵母菌可以是市售的啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae
）。舉例而言，向財團法人食品工作發展研究所所採購寄存編號BCRC20271（國際寄存ATCC26602）菌株的啤酒酵母。
在一些實施例中，乳酸菌可以為市售的胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum
）、市售的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles
）或植物乳桿菌。舉例而言，採用寄存編號BCRC910805（國際寄存DSM33108）菌株的胚芽乳酸桿菌TCI028或寄存編號BCRT910760（國際寄存DSM32451）菌株的胚芽乳酸桿菌TCI378。再舉例而言，採用寄存編號BCRC910636（國際寄存DSM28121）菌株的嗜熱鏈球菌TCI633。在一較佳實施例中，採用寄存編號BCRC910983（國際寄存DSM33504）菌株的植物乳桿菌TCI405（Lactobacillus plantarum TCI405）。
在一些實施例中，醋酸菌可以為向美國菌種中心（American Type Culture Collection, ATCC）採購寄存編號ATCC15973（國內寄存編號BCRC11688）的醋酸菌。
在一些實施例中，於阿薩伊果浸提液中加入酵母菌後進行發酵1日~2.5日後形成第一初發酵液。基此，透過先添加酵母菌至阿薩伊果浸提液中，可於酵母菌發酵過程中產生酒精，並有利於提取出阿薩伊果內不同的有效成份。在一些實施例中，第一初發酵液的酸鹼值（pH值）小於4，且其糖度約為9°Bx。
加入乳酸菌至第一初發酵液後進行發酵1日~3日後形成第二初發酵液。基此，透過添加乳酸菌至第一初發酵液中可使其內的葡萄糖被進一步消耗而降低糖度，並產生乳酸以降低第一初發酵液的pH值。並且，降低pH值有利於進一步提取出阿薩伊果內其他不同的有效成分。在一些實施例中，第二初發酵液的pH值小於3.5，且其糖度約為6°Bx。
加入醋酸菌至第二初發酵液後進行發酵3日~10日後形成第三初發酵液。基此，透過添加醋酸菌至第二初發酵液可使其內的酒精被消耗，並一步降低葡萄糖的含量。在一些實施例中，第三初發酵液的pH值小於3.5，且其糖度為約為3°Bx。
在一些實施例中，將第三初發酵液過濾並濃縮以得到阿薩伊果發酵物。舉例來說，過濾方式可以是以200mesh過濾，且濃縮方式可以採取在60℃下的減壓濃縮。於此，阿薩伊果發酵物的pH值小於3.5。
在一些實施例中，添加寡糖至阿薩伊果發酵物以使其糖度達到40°Bx以形成阿薩伊果發酵飲品。於此，寡糖係指由3個~10個單醣分子聚合而成的低聚糖。其中，寡糖可為果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、異麥芽寡糖等。在一些實施例中，所添加的寡糖可為含40%~70%異麥芽寡糖的寡糖溶液。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有抑制澱粉酶活性之能力。在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有抑制葡萄糖苷酶活性之能力。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有促進脂肪分解之能力。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有提升肌纖維增生量之能力。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有減少細胞內自由基之能力。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有促進GSH合成量之能力。
在一些實施例中，抗氧化係指減緩或防止氧化作用。而氧化係是一種使電子自物質轉移至氧化劑的化學反應，過程中可生成自由基，進而啟動鏈反應。當鏈反應發生於細胞中，細胞易受到破壞或凋亡。在一些實施例中，阿薩伊果發酵物能去除自由基，終止連鎖反應並且抑制其它氧化反應。在一些實施例中，自由基之產生係因為光照、化學物質、或生物體自然衰老之過程中所產生。在一些實施例中，前述化學物質包含醣化終產物。
如前所述，超氧化物（Superoxide Anion）與過氧化氫（Hydrogen Peroxide）等自由基會導致皮膚細胞受損。其中，阿薩伊果發酵物能降低去除自由基，舉例而言，其可透過促進穀胱甘肽（Glutathione，GSH）的生成達到抗氧化與去除自由基之功效。GSH是動植物、真菌及某些細菌和古細菌的抗氧化劑。GSH能夠防止自由基、過氧化物、脂質過氧化物和重金屬等自由基對細胞的損害。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物的總多酚（Polyphenols）含量至少為291μg/mL。
在一些實施例中，阿薩伊果發酵物具有提升以下基因中至少一基因的表現量的能力：KRT1
基因（Gene ID:3848）、KRT10
基因（Gene ID: 3858）及KRT14
基因（Gene ID:3861）。其中，KRT1
基因、KRT10
基因以及KRT14
基因所轉錄出之蛋白質則有助於維持角質結構緊密完善、及/或能達到保護肌膚之能力。具體而言，KRT1
基因、KRT10
基因及KRT14
基因分別承載製備角蛋白1（keratin 1）、角蛋白10（keratin 10）及角蛋白14（keratin 14）的資訊。角蛋白是一種纖維狀蛋白質，其組成了角質細胞（keratinocytes）之主要架構。角蛋白1、角蛋白10及角蛋白14相互結合形成角蛋白中間纖維（intermediate filaments），而這些中間纖維所形成的堅固網絡，可為皮膚提供強度和彈性，並保護其免受摩擦和其他日常物理性的損害，其亦可使皮膚表皮細胞較緊密排列，減少水分經由皮膚細胞間之縫隙散失之比例，進而達到肌膚保濕之功效。
基此，阿薩伊果發酵物可用以製備改善肌膚狀態、增肌減脂的組合物。
在一些實施例中，組合物可以為液態（如，阿薩伊果發酵飲品等）或固態（如，阿薩伊果發酵物粉末、阿薩伊果發酵物錠等）。在一些實施例中，液態的組合物的使用劑量為6毫升/天，而固態組合物的使用量為0.75克/天。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的阿薩伊果發酵物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服的、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation） 或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、或含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為食用產品。換言之，食用產品包含特定含量的阿薩伊果發酵物。在一些實施例中，食用產品可為一般食品、保健食品或膳食補充品。
在一些實施例中，前述之食用產品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於口服的劑型。在一些實施例中，前述之一般食品可為食用產品本身。在一些實施例中，一般食品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）或調味料。
在一些實施例中，所得的阿薩伊果發酵物可進一步作為食品添加物（food additive），以製得含有阿薩伊果發酵物的食品組合物。於此，能藉由習知方法於原料製備時添加任一實施例的阿薩伊果發酵物，或是於食品的製作過程中添加任一實施例的阿薩伊果發酵物，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食用產品（即食品組合物）。
例
1
：阿薩伊果發酵物的製備
首先，準備1重量份的阿薩伊果（產地來源：巴西）及15重量份的水，並將其粉碎並混合均勻以形成阿薩伊果溶液。接著，加入相對於阿薩伊果溶液10%總重的葡萄糖，以形成阿薩伊果基液。並且，將阿薩伊果基液於95℃下靜置1小時，以形成阿薩伊果浸提液。
於靜置後，待阿薩伊果浸提液冷卻後（低於38℃）加入0.1%的BCRC20271菌株之啤酒酵母，並於30℃下進行發酵1天以形成第一初發酵液。再加入0.05%的BCRC910983菌株的植物乳桿菌至第一初發酵液中，並於30℃下進行發酵1天以形成第二初發酵液。接著，加入5%的BCRC11688菌株之醋酸菌至第二初發酵液中，並於30℃下進行發酵5天以形成第三初發酵液。於此，第三初發酵液的pH值小於3.5，且其糖度為約為3°Bx。
接著，以200mesh過濾第三初發酵液後，於60℃下減壓濃縮，以得到本發明之阿薩伊果發酵物。
例
2
：
總多酚
含量測試
標準曲線繪製：
首先，將10mg的沒食子酸（gallic acid，GA）（購自Sigma，料號：G7384）溶於水中，並添加10mL的體積至量瓶中，得到1000μg/mL濃度的沒食子酸溶液後，將該溶液儲存於-20℃作為儲備溶液。之後，將儲備溶液稀釋10倍至100μg/mL的濃度，而未使用完之液體則儲存於-20℃之環境。接著，於玻璃試管中分別配製0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL及100μg/mL的沒食子酸標準溶液，配製方式顯示如下表一：
表一：沒食子酸標準溶液配置方法
| 濃度 （ μg /mL ） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| GA 1,000ppm | 0 μL | 20 μL | 40 μL | 60 μL | 80 μL | 100 μL |
| ddH2 O | 100 μL | 80 μL | 60 μL | 40 μL | 20 μL | 0 μL |
之後，添加500μL的佛蕭酚試劑（Folin-Ciocalteu’s phenol reagent）（購自Merck，料號：1.09001.0100）、混合均勻並靜置3分鐘，接而添加400μL的7.5%碳酸鈉（sodium carbonate）（Sigma 31432，溶於水中）、混合均勻並反應30分鐘。接著，經由渦旋（vortex）確保無氣泡後取200μL的標準溶液於750nm下測量吸光值，並繪製標準曲線。
樣品總多酚定量實驗：
於此，例1所得的阿薩伊果發酵物為樣本（實驗組），並以未經發酵程序的阿薩伊果浸提液作為比較組。將各組分別以水稀釋20倍至1200μL並取100μL的體積至玻璃試管中，每組樣品需三重複。之後，添加500μL的佛蕭酚試劑、混合均勻並靜置3分鐘。
接而添加400μL的7.5%碳酸鈉、混合均勻並反應30分鐘~1小時。再經由渦旋確保無氣泡後取200μL的各組反應溶液於750nm下測量吸光值，並以內差法算出濃度後再回乘稀釋倍數以取得原濃度。
圖1是本發明阿薩伊果酵素的總多酚含量檢測數據圖。由圖1可見，比較組（未經發酵程序之阿薩伊果浸提液）之總多酚含量為217.32 μg/mL。而本發明之阿薩伊果酵素之總多酚含量為291.12 μg/mL與比較組（未經發酵程序之阿薩伊果浸提液）相較之下，阿薩伊果酵素的總多酚含量具有顯著的提升。具體而言，實驗組的總多酚含量提升34%。由此可知，透過複數菌種發酵後可顯著提高阿薩伊果發酵物的總多酚含量。因此，相較於服用阿薩伊果浸提液，當受體服用阿薩伊果發酵物或以其製備的組合物時，更有助於受體增肌減脂及改善受體肌膚狀態的能力。
例
3
：
α-
澱粉酶活性測試
溶液配置：
含有6mM氯化鈉的0.02莫爾濃度（M）磷酸鈉緩衝溶液（Sodium phosphate buffer）（以下簡稱NaCl-Pi緩衝溶液）：將0.7356克的磷酸一氫鈉（購自J.T.Baker，編號3828-01）、0.5492克的磷酸二氫鈉（購自Sigma，編號04270）及1.7532克的氯化鈉（購自第一化工，編號C4B07）混合並溶於500毫升的水（H2
O）中，以配置含有6mM氯化鈉且酸鹼值（pH）為6.3的NaCl-Pi緩衝溶液。
2當量濃度（N）氫氧化鈉（NaOH）溶液：以8克氫氧化鈉（購自Macron，編號7708-10）溶於100毫升水中，以配置2N的氫氧化鈉溶液。
二硝基水楊酸顏色試劑（Dinitrosalicylic acid color reagent，以下稱終止劑）：將1克3,5-二硝基水楊酸（購自Sigma，編號D0550）溶入50毫升去離子水中，再緩慢加入30克酒石酸鉀鈉（sodium potassium tartrate tetrahydrate，購自Sigma，編號32312）及緩慢加入20毫升2N氫氧化鈉溶液，並以去離子水定量至100毫升。於此，可得到終止劑。
1%澱粉溶液：秤取1克澱粉（購自Sigma，編號S9765）至100毫升NaCl-Pi緩衝溶液並緩慢加熱使澱粉完全溶解於NaCl-Pi緩衝溶液中，待加熱後的含有澱粉的NaCl-Pi緩衝溶液降至室溫後，以水定量至100毫升。於此，可得到1%澱粉溶液。
α-澱粉酶（α-amylase）溶液（5單位/毫升）：將0.0096克α-澱粉酶（購自Sigma，編號A3176）溶解於25毫升NaCl-Pi緩衝溶液。於此，可得到每毫升5單位的α-澱粉分解酶溶液。
測試流程：
於此，以例1之方法所製備之阿薩伊果發酵物與阿薩伊果浸提液作為測試樣品，其中阿薩伊果發酵物為實驗組，阿薩伊果浸提液為比較組，而將澱粉溶液、α-澱粉酶及測試樣品混合後，在反應時間點為0分鐘時為空白組，其係代表α-澱粉酶並無與澱粉產生反應的情況，而反應時間點10分鐘時為實驗組（以阿薩伊果發酵物為測試樣品的組別）與比較組（以阿薩伊果浸提液為測試樣品的組別），其係代表α-澱粉酶、澱粉與測試樣品已進行10分鐘反應的。於此。實驗進行三次重複。
流程如下，取200μL的測試樣品至離心管中，接著於離心管中加入200μL的α-澱粉酶溶液（5單位/毫升），並進行震盪以將離心管內的測試樣品及α-澱粉酶溶液混合均勻以形成待反應溶液。接著，將離心管置於25℃環境下反應10分鐘。
將反應起始點（0分鐘）的空白組加入400μL的終止劑至離心管中與待反應溶液混合均勻，再加入200μL的1%澱粉溶液並於25℃下靜置10分鐘以形成未反應溶液。換言之，在反應起始點（0分鐘）的空白組別中，α-澱粉酶不會與澱粉產生反應。
將反應終止點（10分鐘）的實驗組與比較組別加入200μL的1%澱粉溶液至離心管中，使1%澱粉溶液與待反應溶液混合均勻以形成混合溶液。將裝有混合溶液的離心管置於25℃下反應10分鐘以形成反應溶液，然後再加入400μL的終止劑與反應溶液混合均勻，以停止澱粉與α-澱粉酶的反應。
接著，將所有組別置於沸水（100℃）中反應5分鐘，並冷卻至室溫（25℃），以形成待測溶液。從各組別分別取出150μL待測溶液與850μL水混合以稀釋待測溶液。接著取200μL稀釋後的待測溶液至96孔盤中，並測量其在540nm下之吸光值。
實驗結果：
根據下列公式計算實驗組相對於空白組的澱粉酶活性，如圖2所示。換言之，是將空白組的澱粉酶活性視為100%，來計算實驗組的澱粉酶活性。
α-Amylase 活性 =
其中，α-Amylase活性代表澱粉酶活性；A540nm
(Sample10min
-Sample0min
)代表反應終止點（10分鐘）的待測溶液在540nm下之吸光值與反應起始點（0分鐘）的待測溶液在540nm下之吸光值之間的差值，且此測試組別為實驗組。A540nm
(Control10min
-Control0min
)代表反應終止點（10分鐘）的空白組在540nm下之吸光值與反應起始點（0分鐘）的空白組在540nm下之吸光值之間的差值。
請參閱圖2。相較於空白組（即其澱粉酶活性視為100%），比較組的澱粉酶活性為92%，而實驗組的澱粉酶活性為56%。換言之，實驗組的澱粉酶活性除了相對於空白組明顯下降44%之外，亦與比較組（即未經發酵程序之阿薩伊果浸提液）相比，下降36%。由此可知，本發明之阿薩伊果發酵物對於澱粉酶的活性具有很高的抑制能力，進而能用於製備抑制澱粉酶活性、減重、減少澱粉吸收等組合物。
例
4： α- 葡萄糖苷酶活性測試
溶液配置：
0.1莫爾濃度（M）磷酸鈉緩衝溶液（Sodium phosphate buffer，以下簡稱Pi緩衝溶液）：將4.7283克的磷酸一氫鈉（購自J.T.Baker，編號3828-01）及2.0028克的磷酸二氫鈉（購自Sigma，編號04270）混合並溶於400毫升的逆滲透水（RO水）中，並以定量瓶定量至500毫升，以得到酸鹼值（pH）為7.0的Pi緩衝溶液。
2.5mM對硝基苯酚-β-D葡萄糖苷（p-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside, PNPG）：秤取0.0377克 PNPG以逆滲透水（RO水）定量至100毫升。
0.2M碳酸鈉（Na2
CO3
）：秤取2.1198克碳酸鈉（購自Sigma，編號31432）以RO水定量至100毫升，作為葡萄糖苷酶的終止劑。
0.2單位/毫升（units/ml）α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，購自 sigma Chemical Co.（St. Louis, MO, G5003-100UN））溶液：取3.85毫克的固態α-葡萄糖苷酶以2.0毫升的0.1M Pi緩衝溶液溶解，以得到50 U/毫升之α-葡萄糖苷酶原液。接著，取0.1毫升 50 U/毫升之α-葡萄糖苷酶原液並以RO水定量至25毫升，即可得到0.2 U/毫升α-葡萄糖苷酶溶液。
測試流程：
於此，以例1所製備的阿薩伊果發酵物作為測試樣品的組別為實驗組，以例1所製備的阿薩伊果浸提液作為測試樣品的組別為比較組，而未加入測試樣品之組別為空白組。並且，各組依反應時間點分為實驗組（0分鐘）、比較組（0分鐘）、空白組（0分鐘）、實驗組（15分鐘）、比較組（15分鐘）及空白組（15分鐘）。其中，實驗組（0分鐘）、比較組（0分鐘）及空白組（0分鐘）代表葡萄糖苷酶並無與PNPG反應的組別（以下稱反應起始點（0分鐘）），而實驗組（15分鐘）、比較組（15分鐘）及空白組（15分鐘）代表葡萄糖苷酶與PNP進行15分鐘反應的組別（以下稱反應終止點（15分鐘））。
表二
| 測試組別 | 測試樣品 | 反應酵素 |
| 實驗組（0分鐘） | 阿薩伊果發酵物 | Pi緩衝溶液 |
| 實驗組（15分鐘） | 阿薩伊果發酵物 | 葡萄糖苷酶 |
| 比較組（0分鐘） | 阿薩伊果浸提液 | Pi緩衝溶液 |
| 比較組（15分鐘） | 阿薩伊果浸提液 | 葡萄糖苷酶 |
| 空白組（0分鐘） | (無) | Pi緩衝溶液 |
| 空白組（15分鐘） | (無) | 葡萄糖苷酶 |
依照表二，取160μL的測試樣品至96孔盤中，接著分別於各孔中加入20μL Pi緩衝溶液以形成待反應溶液。
反應起始點（0分鐘）的測試組別：加入20μL的Pi緩衝溶液至對應的孔中與待反應溶液混合均勻並於25℃下反應10分鐘。於反應10分鐘後，於每孔中加入20μL的2.5mM PNPG，並將待反應溶液、Pi緩衝溶液及PNPG混合均勻後置於37℃下反應15分鐘以形成0分鐘組反應溶液。於0分鐘組反應溶液中加入80μL終止劑。接著，於0分鐘組反應溶液與終止劑混合均勻後，測量其在405nm下之吸光值。
反應終止點（15分鐘）的測試組別：將加入20μL的0.2單位/毫升α-葡萄糖苷酶溶液至對應的孔中與待反應溶液混合均勻並於25℃下反應10分鐘，以活化α-葡萄糖苷酶。於反應10分鐘後，再於每孔中加入20μL的2.5mM PNPG，並將待反應溶液、α-葡萄糖苷酶溶液及PNPG混合均勻後置於37℃下反應15分鐘，使活化的α-葡萄糖苷酶與PNPG作用，以形成15分鐘組反應溶液。於15分鐘組反應溶液中加入80μL終止劑，以中止α-葡萄糖苷酶的活性。接著，於15分鐘組反應溶液與終止劑混合均勻後，測量其在405nm下之吸光值。
實驗結果：
根據下列公式計算各組的葡萄糖苷酶活性，如圖3所示。換言之，是將空白組的葡萄糖苷酶活性視為100%，來計算實驗組的葡萄糖苷酶活性。
α-Glucosidase活性=
其中，α-Glucosidase活性代表葡萄糖苷酶活性；A405nm
(Sample15min
-Sample0min
)代表反應終止點（15分鐘）的實驗組(或空白組)在405nm下之吸光值與反應起始點（0分鐘）的實驗組(或比較組)在405nm下之吸光值之間的差值。A405nm
(Control15min
- Control0min
)代表反應終止點（15分鐘）的空白組在405nm下之吸光值與反應起始點（0分鐘）的空白組在405nm下之吸光值之間的差值。
請參閱圖3，相較於空白組（即其葡萄糖苷酶活性視為100%），實驗組的葡萄糖苷酶活性趨近於0（圖示中n.d.係指no detection）。換言之，實驗組的葡萄糖苷酶活性相對於空白組明顯下降約100%。而實驗組與比較組（即未經發酵程序的阿薩伊果浸提液）相比，更下降107%。由此可知，本發明之阿薩伊果發酵物對於葡萄糖苷酶活性的抑制能力非常高，可用於製備抑制葡萄糖苷酶活性、抑制糖類分解、減重之組合物。
例
5
：
抑制脂肪堆積功效試驗
脂肪細胞內以油滴（Lipid droplet）的形式貯存脂肪。基此，本次試驗分析染色後的油滴，以觀察細胞內油滴的數量，藉以確認脂肪堆積的狀態。後續，再將染劑溶出並分析以作為量化的數值指標。
本次試驗採用小鼠骨髓基質細胞（後續簡稱OP9細胞），OP9細胞購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC®
）之OP9細胞株 （ATCC CRL-2749）。
實驗步驟：
首先，取24孔培養盤將每孔接種8×104
個OP9細胞及500μL培養基（Medium），培養基其中包含90%之MEMAM（Minimum Essential Medium Alpha Medium，購自Gibco，美國）細胞培養液、20%之胎牛血清（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，美國，Cat#10437-028），且加入0.1%之青黴素/鏈黴素（Penicillin-streptomycin，購自Gibco，美國），在37℃下培養7天。此7天的細胞培養期間每隔3天更換培養基。7天後，以顯微鏡（ZEISS；放大倍率400x）觀察細胞內油滴形成，藉以確認細胞已完全分化為脂肪細胞。
然後，將分化完成的脂肪細胞分為三組：實驗組、比較組與空白組。
實驗組：依照每孔500μL培養基含有5μL的阿薩伊果發酵物（以例1之方式製備而成）的比例（即，濃度為1vol%）將阿薩伊果發酵物添加至含分化後的培養基中，在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
比較組：依照每孔500μL培養基含有5μL的阿薩伊果發酵物（以例1之方式製備而成）的比例（即，濃度為1vol%）將阿薩伊果浸提液添加至含分化後的培養基中，在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
空白組：不作任何處理，即不額外添加其他化合物至含分化後的脂肪細胞的分化培養基中，在37℃下培養7天。此7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
接下來，依據下列步驟進行油紅O的染色。於7天細胞處理後，將培養基移除，以1mL之磷酸鹽緩衝溶液（Phosphate buffered saline, PBS）清洗脂肪細胞兩次，再加入1mL之10%甲醛並於室溫下反應30分鐘以固定脂肪細胞。接著移除甲醛後以1mL之PBS輕輕地清洗脂肪細胞兩次，接著於每孔細胞內加入1mL之60%異丙醇，反應1分鐘後，移除異丙醇並加入1mL之油紅O作用溶液與脂肪細胞反應，於室溫下反應1小時，接著移除與脂肪細胞作用的油紅O作用溶液並迅速地以1mL之60%異丙醇進將脂肪細胞行脫色5秒鐘。
後續，將染色後的各組再依下列步驟進行油紅O的定量。加入100%異丙醇於染色之細胞中，並置於振盪器上反應10分鐘以溶解油滴，接著取100μL至96孔培養盤中，以測量ELISA讀取儀（BioTek）讀取各組之OD510nm
讀值。其中，利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖5所示（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
實驗結果：
參考圖4。將空白組的脂肪油滴含量視為1（即100%）時，比較組的脂肪油滴含量為88.67%，而實驗組的脂肪油滴含量為51.45%，且達統計上之顯著差異。意即經由阿薩伊果發酵物處理後能顯著地減少48.55%的脂肪堆積量，且與未經發酵程序的阿薩伊果浸提液相比效果更顯著。此結果顯示，本發明之阿薩伊果發酵物能有效阻斷脂肪細胞的增大，以減少脂肪細胞中油滴的含量，而達到抑制脂肪堆積功效。由此可知，本發明阿薩伊果發酵物可用於製備減脂、減重、減少脂肪堆積、促進脂肪分解之組合物。
例
6
：
增加骨骼肌細胞增生實驗
為測試本發明之阿薩伊果發酵物對於肌肉生長之影響，於此利用細胞增殖 ELISA 套組檢測本發明之阿薩伊果發酵物對於骨骼肌細胞增生的影響。
本實驗所採用之係細胞為小鼠肌母細胞（Skeletal muscle cells ，以下簡稱：C2C12細胞），購自美國典型培養物保存中心 （American Type Culture Collection，ATCC®
；Cat. CRL-1772)。
試劑/材料準備：
1. 1X DPBS：將 10X DPBS(購自 Gibco；Cat. 14200-075) 以滅菌後的 ddH2O 稀釋 10 倍。
2. 1X 胰蛋白酶：將 10X 胰蛋白酶(購自 Gibco；Cat. 15400-054)以 1X DPBS 稀釋 10 倍。
3.培養基：Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (購自Gibco； Cat. 11965-092) 加入 10% FBS (購自Gibco；Cat. 10437-028) 和 1% 青黴素-鏈黴素 (購自Gibco；Cat. 15140122)。
4. 細胞增殖 ELISA 套組 (購自Roche；Cat. 11647229001)。
5. BrdU labeling solution (10X)：以細胞培養液稀釋BrdU labeling reagent（細胞增殖 ELISA 套組內附）100倍達到最終濃度 100 μM。
6. Anti-BrdU-POD stock solution (100X)：於 Anti-BrdU-POD 管（細胞增殖 ELISA 套組內附）中加入 1.1 ml ddH2O，混和均勻(此步驟須靜置10分鐘使其完全溶解)。
7. Anti-BrdU-POD working solution (1X)：以 Antibody dilution solution （細胞增殖 ELISA 套組內附）稀釋 Anti-BrdU-POD stock solution 100 倍。
8. Washing solution (1X)：以 ddH2O 稀釋 Washing buffer（細胞增殖 ELISA 套組內附）10倍。
實驗步驟：
於96孔細胞培養盤中每孔種入 5 × 103
個 C2C12細胞，並於37℃下培養2小時。接著，加入100 μL/well 的 1X BrdU labeling solution和每毫升培養基有10微升的測試樣品（即1 vol%），於37℃下培養24小時。實驗共分三組進行，其中，實驗組之測試樣品為例1之阿薩伊果發酵物；比較組之測試樣品為例1中未經發酵程序之阿薩伊果浸提液；而空白組則不另外加入任何溶液或化合物。
而後，去除培養液，加入200 μL/well的FixDenat，於常溫下處理30分鐘。接著，去除上清液，用1X DPBS沖洗細胞1次。
再去除上清液，加入100 μL/well的Anti-BrdU-POD working solution，於常溫下處理90分鐘。接著，去除上清液，用200-300 μL/well的Washing solution沖洗3次。同樣去除上清液後，加入100 μL/well 的 Substrate solution（細胞增殖 ELISA 套組內附），於常溫下處理5-30分鐘。
加入25 μL/well的1M H2
SO4
水溶液，置於震盪器上，以300 rpm震盪1分鐘。最後，以分光光度計測得O.D. 450值，並以「空白組」的結果為基準，計算其他各組骨骼細胞增生的相對活性，結果示於圖5。前述數據係參考細胞增殖 ELISA 套組中之使用說明書進行計算，並使用Excel軟體進行統計分析，以學生t（student’s t-test）檢驗是否達到統計學上的顯著性。
實驗結果：
請參照圖5。將空白組之骨骼肌細胞量視為100%時，比較組（即未經發酵程序之阿薩伊果浸提液）之骨骼肌細胞數量為40.0%，而實驗組（即經發酵程序之阿薩伊果發酵物）之骨骼肌細胞數量為170.%。由此可見，本發明之阿薩伊果發酵物具有增加骨骼肌細胞增生之功效，可用於製備增肌、提升肌肉密度等組合物。
例
7
：細胞抗氧化能力試驗
-
抑制
ROS
生成（雙氧水處理
）
於此，以螢光探針DCFH-DA配合流式細胞儀，測定人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk經本發明之阿薩伊果發酵物處理後，其活性氧物質含量的變化。
材料與儀器：
1. 細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk（生物資源保存及研究中心（BCRC），No. 60153），以下簡稱CCD-966sk細胞。
2. 培養基：含有10 vol% FBS（fetal bovine serum，購自Gibco）之基礎培養基。其中，基礎培養基是由Eagle’s最低限度基本培養基（Eagle’s minimum essential medium（MEM），購自Gibco，產品編號15188-319）額外添加成分使其含有1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma）及0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco）所配製而成。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco，產品編號10437-028。
4. DCFH-DA溶液：將二氯二氫螢光素二乙酸酯（2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；產品編號SI-D6883，購自Sigma）溶於二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO，購自Sigma，產品編號SI-D6883-50MG）以配製成5 mg/ml的DCFH-DA溶液。
5. 流式細胞儀（Flow cytometry），Bd AccuriTM
C6 Plus Flow Cytometer 產品編號 660517。
6. 雙氧水（H2
O2
）：購自Sigma-Aldrich，產品型號95299-1L。
7. 胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）：10X Trypsin-EDTA（購自Gibco）以1X PBS溶液稀釋10倍。
8. 本發明之阿薩伊果發酵物：此實驗中所使用的阿薩伊果發酵物係以例1之方式製備而成。
9. 未經發酵程序之阿薩伊果浸提液：此實驗中所使用的阿薩伊果浸提液係以例1之方式製備而成。
實驗步驟：
實驗將會分為實驗組、空白組（未添加阿薩伊果發酵物或阿薩伊果浸提液、亦無經過雙氧水處理的組別）、以及比較組A（未添加阿薩伊果發酵物或阿薩伊果浸提液，但經過雙氧水處理的組別）、比較組B（添加阿薩伊果浸提液，且經過雙氧水處理的組別），以及實驗組（添加阿薩伊果發酵物，且經過雙氧水處理的組別）四組進行，各組分別進行二重複試驗：
1. 將CCD-966sk細胞以每孔1×105
個的方式，接種於每孔含2ml培養基之6孔培養盤中。
2. 將培養盤置於5％CO2
、37℃下，培養24小時。
3. 移除培養基。
4. 加入2mL實驗培養基至培養盤的各孔中，並於37℃下培養1小時。其中，實驗組的實驗培養基為添加有20 μL的例1得到的阿薩伊果發酵物之2mL細胞培養基（即阿薩伊果發酵物佔細胞培養基的體積百分比為1%）。比較組B的實驗培養基為添加有20μL的例1得到的阿薩伊果浸提液（未經發酵程序）之2mL細胞培養基（即阿薩伊果浸提液佔細胞培養基的體積百分比為1%）。比較組A與空白組的實驗培養基均為單純的2mL細胞培養基（即不含阿薩伊果發酵物或阿薩伊果浸提液）。
5. 添加濃度為5 μg/mL的DCFH-DA溶液2μL於每孔中的細胞培養基，使DCFH-DA處理細胞15分鐘。
6. 於DCFH-DA處理後，於實驗組的實驗培養基以及比較組的實驗培養基分別加入H2
O2
，並於37℃下反應1小時。具體來說，35% wt的雙氧水先稀釋成100 mM（將10 μL的雙氧水加入990μL的二次蒸餾水），再取20μL的100 mM的雙氧水加入2mL的細胞培養盤中。
7. 反應後，每孔以1 mL的1X PBS溶液潤洗2次。
8. 將200μL胰蛋白酶加至每孔中並在暗處反應5分鐘。反應後，添加6mL細胞培養基終止反應。
9. 將各孔中之細胞與細胞培養基收集至個別對應的1.5 mL離心管內，並將含有細胞與培養基之離心管以400 xg離心5分鐘。
10. 離心後，移除上清液，並以1X PBS溶液回溶細胞沉澱物。
11. 再以400 xg離心5分鐘。
12. 離心後，移除上清液，於暗處以每離心管200μL的1X PBS溶液再次懸浮細胞，以得到待測細胞液。
13. 使用流式細胞儀偵測各孔的待測細胞液中DCFH-DA的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為450-490 nm，放射波長為510-550 nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為DCFH（二氯二氫螢光素），再被活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的DCF（二氯螢光素），經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反映細胞內活性氧物質含量，並藉此得知細胞內活性氧物質高度表現的細胞數佔原細胞數的比例。因實驗係進行二重複，故將各組的二重複實驗之量測結果平均以取得平均值，然後以空白組的平均值為100%之相對ROS的生成量，將比較組與實驗組的平均值換算為相對ROS的生成量，如圖6所示。
實驗結果：
如圖6所示，由比較空白組、比較組A的結果可知，在經過雙氧水處理後，相對ROS的生成量（高螢光表現）會大幅增加（約244.1%）；其顯示雙氧水處理確實會導致細胞內產生活性氧物質，進而對人類皮膚纖維母細胞產生後續傷害。另一方面，根據比較組A與比較組B之結果可知，當細胞經過阿薩伊果浸提液處理後，ROS相對生成量大幅減少。然更甚者，根據實驗組的結果可知，當細胞經過阿薩伊果發酵物處理後，相對ROS的生成量明顯減少至17.8%，低於未經發酵程序之阿薩伊果浸提液之比較組A。由此顯示本發明之阿薩伊果發酵物可有效減少活性氧物質在細胞內的產生或累積。換言之，發明之阿薩伊果發酵物可作為一種活性氧物質清除劑。亦即，發明之阿薩伊果發酵物可透過降低細胞內活性氧物質含量，減少細胞受到活性氧物質等所導致的氧化傷害，進而達到延緩老化等功效。
例
8
：細胞抗氧化能力試驗
-
穀胱
甘肽
（
GSH
）含量檢測
實驗材料：
1. 細胞株：人類周邊血單核球細胞（human peripheral blood mononuclear cell，hPBMC）。
2. 培養基：X-VIVO10培養基（購自Lonza，型號04-380Q）。
3. GSH檢測試劑（購自abcam，型號Ab112132）。
4. 阿薩伊果浸提液：此實驗中所使用的阿薩伊果浸提液是透過如上例1所獲得。
5. 阿薩伊果發酵物：此實驗中所使用的阿薩伊果發酵物是透過如上例1所獲得。
實驗步驟：
1.於6孔培養盤中，每孔培養基中植入2x106
個人類周邊血單核球細胞（於後方步驟中將略稱為細胞）。
2.於37℃培養24小時。
3.將細胞分為三組：空白組、比較組與實驗組。其中，比較組加入阿薩伊果浸提液，使加入阿薩伊果浸提液後，整體溶液中的阿薩伊果浸提液濃度為1 vol%；實驗組則加入阿薩伊果發酵物，使加入阿薩伊果發酵物後，整體溶液中的阿薩伊果發酵物濃度為1 vol%；而空白組則不另外加入測試樣品。接著，將三組細胞於37℃培養24小時。
4.收集細胞後，用磷酸鹽緩衝生理鹽水（Phosphate-Buffered Saline，PBS）（購自Gibco）沖洗一次。
5.重懸浮細胞（Resuspend cells）於1毫升的PBS。
6.以GSH試劑（1：1000）將細胞染色15分鐘。
7.用PBS沖洗一次後，重懸浮細胞（Resuspend cells）於200微升的PBS。
8.通過流式細胞儀（購自BD Accuri，型號C6 Plus）分析相對的螢光異硫氰酸鹽（FITC）訊號。
9.偵測出之數值以微軟EXCEL軟體，利用Student t檢定分析數值間的統計顯著性，其結果如圖7所示。其中，相較於空白組，***表示p
＜0.001。
由圖7結果可知，若視空白組織GSH含量為100%，加入阿薩伊果浸提液的比較組的細胞，其GSH含量提升至212.5%，而加入阿薩伊果發酵物之實驗組的細胞，GSH含量則是相較於空白組明顯提升至238.3%，較未經發酵程序的阿薩伊果浸提液之GSH含量來得高。需特別說明的是，GSH是由麩胺酸、胱胺酸和甘胺酸所組成的三胜肽，其硫醇基（-SH）與氧化還原相關，主要功能為細胞內生性抗氧化的防禦，可以對抗ROS的氧化傷害。因此，由圖7的結果亦可證實，添加本案例1而得之阿薩伊果發酵物，確實可提升細胞中GSH含量，增加細胞內氧化還原的能力，以達到細胞抗氧化的功效，且其效果更勝未經發酵程序之阿薩伊果浸提液。
例
9
：
保濕相關基因試驗
此範例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定人類表皮角質細胞HPEK-50經本發明之阿薩伊果發酵液處理後，細胞中保濕相關基因的變化。
材料與儀器
1. 角質細胞專用之無血清培養基（Keratinocyte-SFM；購自Thermo，產品編號17005042）。
2. 人類表皮角質細胞（以下簡稱HPEK-50細胞或角質細胞；購自CELLnTEC）。
3. RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）。
4. 反轉錄酶（SuperScript® III Reverse Transcriptase） （Invitrogen公司，美國，編號18080-051）。
5. 測量標的基因引子，其中包含KRT1
基因、KRT1 0
基因及KRT1 4
基因，另包括內部空白組（TBP
基因）。
6. KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）。
7. ABI StepOnePlusTM即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））。
8. 阿薩伊果浸提液：此實驗中所使用的阿薩伊果浸提液是透過如上例1所獲得。
9. 阿薩伊果發酵物：此實驗中所使用的阿薩伊果發酵物是透過如上例1所獲得。
實驗步驟：
細胞培養的實驗流程如下：
1. 於此，培養基採用角質細胞專用之無血清培養基。
2. 首先以每孔1×105
個細胞量培養於含有2 mL上述培養液之六孔培養盤中，並在37℃下培養16小時，然後將HPEK-50細胞分為實驗組、比較組與空白組。
3. 實驗組：每毫升培養液含有10 μL例1之方式製備而成之阿薩伊果發酵物的比例（即，濃度為1 vol%）製得含發酵物的培養液，將HPEK-50細胞更換為含發酵物的培養液中繼續培養。
4. 比較組每毫升培養液含有10 μL例1之方式製備而成之阿薩伊果浸提液的比例（即，濃度為1 vol%）製得含浸提液的培養液，將HPEK-50細胞更換為含浸提液的培養液中繼續培養。
5. 空白組：不做任何處理，即不額外添加其他化合物至含有培養後的HPEK-50細胞的培養液中。
6. 實驗組、比較組與空白組於培養6小時後，將培養後的實驗組、比較組與空白組細胞以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液分別裂解細胞膜以形成三組的細胞溶液。
聚合酶連鎖反應的實驗流程如下：
1. 使用RNA萃取試劑套組分別收集三組細胞溶液內之RNA。
2. 接著，每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶以表2中之引子（primer）黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。
3. 後續利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以及KAPA SYBR FAST將三組反轉錄後產物分別以表三之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction），以觀察實驗組和空白組的HPEK-50細胞的基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應1秒，60°C反應20秒，總共40個迴圈。
4. 爾後，使用2-ΔΔCt
方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之一目標基因相對於空白組或比較組之同一基因的RNA表現量倍數變化。該方法以TBP
基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值（Ct），按照以下公式計算倍數變化：
△Ct = Ct實驗組之目標基因 / 空白組或比較組之目標基因
- Ct TBP
△△Ct= △Ct實驗組之目標基因
- △Ct空白組之目標基因
倍數變化 = 2-ΔΔCt 平均值
5. 最終，利用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾Student t-test分析是否具有統計上顯著差異 （*p值＜0.05; **p值＜0.01; ***p值＜0.001）。其中，KRT1
基因對應的引子對為KRT1-F
以及KRT1-R
，KRT1 0
基因對應的引子對為KRT1 0 -F
以及KRT1 0 -R
，KRT14
基因對應的引子對為KRT14-F
以及KRT14-R
，TBP
基因對應的引子對為TBP -F
以及TBP -R
。
表三
| 引子名稱 | 序列編號 | 序列 |
| KRT1-F | SEQ ID NO:1 | AGAGTGGACCAACTGAAGAGT |
| KRT1-R | SEQ ID NO:2 | ATTCTCTGCATTTGTCCGCTT |
| KRT10-F | SEQ ID NO:3 | TCCTACTTGGACAAAGTTCGGG |
| KRT10-R | SEQ ID NO:4 | CCCCTGATGTGAGTTGCCA |
| KRT14-F | SEQ ID NO:5 | TTCTGAACGAGATGCGTGAC |
| KRT14-R | SEQ ID NO:6 | GCAGCTCAATCTCCAGGTTC |
| TBP-F | SEQ ID NO:7 | TATAATCCCAAGCGGTTTGC |
| TBP-R | SEQ ID NO:8 | GCTGGAAAACCCAACTTCTG |
實驗結果
參照圖8。圖8為經本發明阿薩伊果發酵物（實驗組）處理、經阿薩伊果浸提液（比較組）處理與未經本任何處理之空白組之KRT1
基因、KRT10
與KRT14
基因之相對表現量之長條圖。（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
由圖8可知，當空白組之KRT1
基因、KRT10
基因與KRT14
基因表現量為100%時，比較組之KRT1
基因、KRT10
基因與KRT14
基因表現量分別為420%、122%及334%，而實驗組之KRT1
基因、KRT10
基因與KRT14
基因表現量分別為702%、185%及502%。換言之，與空白組相較之下，比較組與實驗組的角質細胞中的之KRT1
基因、KRT10
基因與KRT14
基因均大幅提升，且實驗組（經發酵製程之阿薩伊果發酵物）之基因表現量均各自大於比較組（未經發酵製程之阿薩伊果浸提液）。
如前所述，KRT1
基因、KRT10
基因與KRT14
基因所轉錄出之蛋白質則有助於維持角質結構緊密完善、及/或能達到保護肌膚及減少肌膚水分散失之能力。
因此，由上述圖及敘述可知，本案之阿薩伊果發酵物可透過提升KRT1
基因、KRT1 0
基因及KRT14
基因之表現量，達到支撐肌膚的結構、防止肌膚水分過度散失、促進皮膚表皮細胞緊密排列，減少水分經由皮膚細胞間之縫隙散失之比例、增強肌膚保濕度之功效。
綜上所述，根據本發明任一實施例的阿薩伊果發酵物可用以製備減重、減脂、增肌及/或抗老的組合物。經複數菌種發酵的阿薩伊果發酵物具有較高含量的多酚含量，且具有下列一種或多種的功能：抑制澱粉酶活性、抑制葡萄糖苷酶活性、促進脂肪分解、抑制脂肪堆積、提升骨骼肌增生、提升肌膚保濕、減少細胞內自由基含量、提升GSH生成、提升KRT1
基因表現量、提升KRT10
基因表現量、提升KRT14
基因表現量。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是阿薩伊果發酵物中與阿薩伊果浸提液的總多酚含量比較圖；
圖2是抑制澱粉酶活性的實驗結果圖；
圖3是抑制葡萄糖苷酶活性的實驗結果圖；
圖4是細胞內脂肪相對堆積的實驗結果圖；
圖5是骨骼肌細胞相對增生活性的實驗結果圖；
圖6是細胞內自由基含量的實驗結果圖；
圖7是細胞內GSH合成量的實驗結果圖；以及
圖8是保濕相關基因表現量的實驗結果圖。
Claims (14)
- 一種阿薩伊果發酵物用以製備減重的組合物之用途，其中該阿薩伊果發酵物是由一阿薩伊果浸提液經複數菌種發酵後所製得，該複數菌種是由酵母菌、乳酸菌及醋酸菌所組成，該複數菌種的添加順序依序為酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
- 如請求項1所述之用途，其中該阿薩伊果發酵物具有抑制澱粉酶活性之能力。
- 如請求項1所述之用途，其中該阿薩伊果發酵物具有抑制葡萄糖苷酶活性之能力。
- 如請求項1所述之用途，其中該阿薩伊果發酵物具有抑制脂肪堆積之能力。
- 一種阿薩伊果發酵物用以製備抗老化的組合物之用途，其中該阿薩伊果發酵物是由一阿薩伊果浸提液經複數菌種發酵後所製得，該複數菌種是由酵母菌、乳酸菌及醋酸菌所組成，該複數菌種的添加順序依序為酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
- 如請求項5所述之用途，其中該阿薩伊果發酵物具有清除一細胞內自由基之能力。
- 如請求項5所述之用途，其中該阿薩伊果發酵物具有提升一細胞內穀胱甘肽含量之能力。
- 一種阿薩伊果發酵物用以製備促進肌肉生長的組合物之用途，其中該阿薩伊果發酵物是由一阿薩伊果浸提液經複數菌種發酵 後所製得，該複數菌種是由酵母菌、乳酸菌及醋酸菌所組成，該複數菌種的添加順序依序為酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
- 一種阿薩伊果發酵物用以製備提升肌膚保濕組合物之用途，其中該阿薩伊果發酵物是由一阿薩伊果浸提液經複數菌種發酵後所製得，該複數菌種是由酵母菌、乳酸菌及醋酸菌所組成，該複數菌種的添加順序依序為酵母菌、乳酸菌及醋酸菌。
- 如請求項9所述之用途，其中該阿薩伊果發酵物具有提升以下基因中至少一基因的表現量的能力：KRT1基因、KRT10基因及KRT14基因。
- 如請求項1、5、8或9所述之任一用途，其中該阿薩伊果發酵物的多酚含量至少為291μg/ml。
- 如請求項1、5、8或9所述之任一用途，其中該阿薩伊果浸提液是由一阿薩伊果基液在50℃-100℃下靜置0.5小時-1.5小時所製得。
- 如請求項12所述之用途，其中該阿薩伊果基液包括一阿薩伊果溶液及相對該阿薩伊果溶液總重10%的葡萄糖，該阿薩伊果溶液包括1重量份阿薩伊果果汁及15重量份的水。
- 如請求項1、5、8或9所述之任一用途，其中該阿薩伊果浸提液是由一阿薩伊果溶液在50℃-100℃下靜置0.5小時-1.5小時後加入相對該阿薩伊果溶液總重10%的葡萄糖所製得，該阿薩伊果溶液包括1重量份阿薩伊果果汁及15重量份的水。
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-
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