TWI801770B - 葛仙米藻（Nostoc sphaeroides）萃取物用於減脂及美肌之用途 - Google Patents
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Abstract
一種葛仙米藻萃取物之用途，其是用於製備減少脂肪堆積、提升脂肪分解基因表現量、提升粒線體活性、及肌膚保濕的組合物之用途。其中，葛仙米藻萃取物是由含水之溶劑進行萃取。
Description
本發明涉及一種葛仙米藻萃取物之用途，特別是用於製備減少脂肪堆積、提升脂肪分解基因、提升粒線體活性、及肌膚保濕的組合物之用途。
葛仙米藻之學名為Nostoc sphaeroides
，是一種陸生藍綠菌。相傳東晉時，因被尊稱為「葛仙翁」的葛洪採食，因此物託人名，稱為「葛仙米」。葛仙米藻之其他俗名包含：「地木耳」、「地耳菜」、「情人的眼淚」、「天使眼淚」、「上帝的眼淚」、「下雨天的大便」等。葛仙米藻於潮濕環境中呈藍色、橄欖色；失水後藻體呈不顯眼的黃綠色或黃褐色。葛仙米藻分布於世界各地，且能於極端條件下生存。雖然葛仙米藻沒有葉綠體，但其含有能光合作用的細胞質，其亦可自大氣抓取氮，所以可以生活於無氮之土地上。
葛仙米藻係可食用，其口感類似黑木耳與海藻，為台灣恆春半島居民餐桌上的在地美食，台灣原住民稱其為「上帝的眼淚」或是「下雨天的大便」。
有鑑於此，為了更積極提升葛仙米藻其他層面的開發與應用，故而提出一種減脂美肌組合物及葛仙米藻萃取物，其可應用於製備減少脂肪堆積、提升脂肪分解基因、提升粒線體活性、及肌膚保濕的組合物。
在一些實施例中，一種葛仙米藻萃取物，其是由一種含水之溶劑進行萃取，其中葛仙米藻萃取物所包含之多醣體含量為0.2wt%。
在一些實施例中，一種葛仙米藻萃取物用於製備提升肌膚外觀的組合物之用途，其中葛仙米藻萃取物是透過提高細胞中粒線體活性達到肌膚外觀提升之用途，且葛仙米藻萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。
在一些實施例中，一種葛仙米藻萃取物用於製備提升肌膚外觀的組合物之用途，其中葛仙米藻萃取物是透過提高細胞中保濕相關基因表現量達到肌膚外觀提升之用途，且葛仙米藻萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。
在一些實施例中，保濕相關基因包含KRT10或KRT1基因。
在一些實施例中，葛仙米藻萃取物具維持角質細胞的結構緊密完整之功效。
在一些實施例中，葛仙米藻萃取物具提升角質層能有保護內部柔嫩肌膚的能力。
在一些實施例中，一種葛仙米藻萃取物用於製備抑制及/或減少脂肪堆積的組合物之用途，其中葛仙米藻萃取物是透過細胞脂肪油滴堆積以達到抑制及/或減少脂肪堆積之用途，且葛仙米藻萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。
在一些實施例中，一種葛仙米藻萃取物用於製備抑制及/或減少脂肪堆積的組合物之用途，其中葛仙米藻萃取物是透過促進脂肪分解以達到抑制及/或減少脂肪堆積之用途，且葛仙米藻萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。
在一些實施例中，葛仙米藻萃取物是透過提升脂肪分解相關基因脂表現量以達到促進脂肪分解。
在一些實施例中，脂肪分解相關基因包含ATGL基因或LIPE基因。
在一些實施例中，葛仙米藻萃取物可以延緩細胞老化。
在一些實施例中，葛仙米藻萃取物之Brix值為5±0.5。
綜上所述，任一實施例的葛仙米藻萃取物可用以提升肌膚外觀的組合物之用途。任一實施例的葛仙米藻萃取物可用以製備提高細胞中保濕相關基因表現量（如，KRT1基因及KRT10基因）表現量的組合物。任一實施例的葛仙米藻萃取物可用以製備促進脂肪分解的組合物。任一實施例的葛仙米藻萃取物可用以製備減少脂肪堆積的組合物。任一實施例的葛仙米藻萃取物可用以製備提升脂肪分解相關基因表現量（如，ATGL基因及LIPE基因）的組合物。
以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。
本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示，各組之間的差異以學生t檢驗（student’s t-test）進行分析。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。
本文中之「wt%」係指重量百分比，而「vol%」係指體積百分比。
如本文中所使用，術語「萃取物」係指藉由萃取作用所製備之產物。該萃取物可以溶於溶劑中之溶液形式呈現，或萃取物可為不含或大體上不含溶劑之濃縮物或精華呈現，亦可以乾燥後之粉體呈現。
如本文所用「葛仙米藻原料」通常係指藻類之本體，其中該本體可包含原始、經乾燥或以其他物理方式加工以利於處理之藻類本體，其可進一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式經加工以影響原物料之大小及實體完整性之型態。
參考圖1。在一些實施例中，一種葛仙米藻萃取物，其是由一種含水之溶劑對葛仙米藻原料進行萃取。在一些實施例中，葛仙米藻萃取物（Nostoc sphaeroides
extract）係將葛仙米藻原料依序進行、粉碎程序S01、加熱程序S02、過濾程序S03、及濃縮程序S04後得到。
在一些實施例中，葛仙米藻原料可以是粉碎或完整的葛仙米藻。在一些實施例中，葛仙米藻原料可以是新鮮或乾燥的葛仙米藻。
在一些實施例中，葛仙米藻係來自於極端氣候之產區。
在一些實施例中，葛仙米藻係來自於受強風吹拂之地區。
在一些實施例中，葛仙米藻係來自受下坡風吹拂之地區。在一些實施例中，該下坡風為落山風。
在一些實施例中，該強風造成葛仙米藻所生長之區域較易散失。
在一些實施例中，該極端氣候造成葛仙米藻之多醣含量大於0.2wt%。
在一些實施例中，粉碎程序S01是指將葛仙米藻原料攪打至平均粒徑小於20mm。舉例而言，粉碎可以採用果汁機、調理機或均質機。
在一些實施例中，加熱程序S02是指將碎裂之葛仙米藻原料與含水之溶劑混合後加熱一段固定時間。在一些實施例中，加熱是指將葛仙米藻原料與含水之溶劑的溫度提升到50℃~100℃。在一些實施例中，一段固定時間是指0.5小時到3小時。舉例而言，將葛仙米藻原料與含水之溶劑的溫度提升到95℃進行提取1小時。
在一些實施例中，加熱程序S02中的重量比例（含水之溶劑：葛仙米藻原料）為5：1至20：1。舉例而言，含水之溶劑：葛仙米藻原料為10:1。
在一些實施例中，含水之溶劑可以是純水或含有有機酸之水溶劑。在一些實施例中，有機酸之濃度為0.05%到2.00%。在一些實施例中，有機酸可是可食用酸。在一些實施例中，可食用酸可以是檸檬酸（Citric Acid）、蘋果酸、酒石酸、乳酸、葡萄糖酸、醋酸等，並不以此為限。
舉例而言，採用90公斤重的葛仙米藻原料、900公斤重的水及0.63公斤重的檸檬酸混合後持續加熱到100℃，並維持100℃持續0.5小時。舉例而言，採用90公斤重的葛仙米藻原料、900公斤重的水及0.7公斤重的檸檬酸混合後持續加熱到85℃，並維持85℃持續1小時。
在一些實施例中，過濾程序S03是指將加熱後（或降溫後）的葛仙米藻原料及溶劑通過篩網以將溶劑內的固體濾除形成過濾液。舉例而言，篩網可以是400網目（mesh）的篩網。
在一些實施例中，加熱程序S02與過濾程序S03之間還包括一降溫程序，其中降溫程序是指將加熱後的葛仙米藻原料及溶劑靜置以自然降溫至室溫。
在一些實施例中，濃縮程序S04是指將過濾程序S03所得到的過濾液進行減壓濃縮（廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100）以得到初萃液。在一些實施例中，濃縮程序S04所得的初萃液可即為葛仙米藻萃取物。在濃縮程序S04的一些實施例中，在40℃~70℃之間進行減壓濃縮。舉例而言，葛仙米藻萃取物是將葛仙米藻原料依序進行粉碎程序S01、加熱程序S02、過濾程序S03及濃縮程序S04後得到。
在一些實施例中，葛仙米藻萃取物用於製備提升肌膚外觀的組合物之用途，其中葛仙米藻萃取物是透過提升粒線體活性以達到該提升皮膚外觀的功效，且葛仙米藻萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。
在一些實施例中，經圖1所揭示之萃取程序使得葛仙米藻之多醣含量大於0.2wt%。
在一些實施例中，葛仙米藻萃取物用於製備延緩皮膚自然衰老的組合物之用途，其中葛仙米藻萃取物是透過提升粒線體活性以達到該抵抗皮膚自然衰老的功效，且葛仙米藻萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。自然衰老是指在無其他疾病或非自然外力等影響下，一個人身體的組成隨著時間形成而產生自然改變的過程。
在一些實施例中，葛仙米藻萃取物可以延緩皮膚細胞老化。於此，所指的老化（Aging）是指細胞隨著時間變化而發生各種機能下降或死亡的過程。
在一些實施例中，葛仙米藻萃取物用於製備肌膚保濕的組合物之用途，其中葛仙米藻萃取物是透過提升肌膚保濕相關基因之表現量以達到該提升皮膚外觀的功效，且葛仙米藻萃取物是以一種含水之溶劑進行萃取。
在一些實施例中，肌膚保濕相關基因所轉錄出之蛋白質有助於維持角質結構緊密完善、及/或能達到保護肌膚之能力。
在一些實施例中肌膚保濕相關基因包含KRT1基因（GeneID: 3848）以及KRT10基因（GeneID: 3858）。
在一些實施例中，Brix值為5.0以上的葛仙米藻萃取物可提升肌膚保濕相關基因的表現量，藉以保濕肌膚，進而提升肌膚外觀。
其中，KRT1基因（GeneID: 3848）以及KRT10基因（GeneID: 3858）所轉錄出之蛋白質有助於維持角質結構緊密完善、及/或能達到保護肌膚之能力。
具體而言，KRT1基因及KRT10基因分別承載製備角蛋白1與角蛋白10的資訊。角蛋白是一種纖維狀蛋白質，其組成了角質細胞（keratinocytes）之主要架構。角蛋白1與角蛋白10相互結合形成角蛋白中間纖維（intermediate filaments），而這些中間纖維所形成的堅固網絡，可為皮膚提供強度和彈性，並保護其免受摩擦和其他日常物理性的損害。
換言之，葛仙米藻萃取物可藉由提高上述基因表現量，提升肌膚保濕相關基因之表現量以達到該提升皮膚外觀的功效。
在一些實施例中，葛仙米藻萃取物可以用於製備促進脂肪分解的組合物之用途。在一些實施例中，具有促進脂肪分解之能力的葛仙米藻萃取物之Brix值為5.0以上。
在一些實施例中，葛仙米藻萃取物係透過提升脂肪分解相關基因以達到促進脂肪分解之功效。其中，具有促進脂肪分解之能力的葛仙米藻萃取物之Brix值為5.0以上。
在一些實施例中，脂肪分解相關基因所轉錄出之蛋白質具有將較大體積之油滴分解為體積較小之油滴。
在一些實施例中，脂肪分解相關基因包含ATGL基因（GeneID: 57104，亦稱為PNPLA2）、LIPE基因（GeneID: 3991）。
其中，ATGL基因與LIPE基因分別轉錄脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，簡稱ATGL）與荷爾蒙敏感性脂解酶（Hormone-Sensitive Lipase，簡稱HSL）。具體而言，ATGL可將細胞儲存的三酸甘油脂水解成游離之脂肪酸以及雙酸甘油脂，而HSL則將雙酸甘油脂進一步水解成單酸甘油脂，兩者均於脂方上扮演舉足輕重的角色。
在一些實施例中，葛仙米藻萃取物用於製備減少脂肪堆積之組合物之用途。在一些實施例中，在一些實施例中，具有減少脂肪堆積之能力的葛仙米藻萃取物之Brix值為5.0以上。
換言之，葛仙米藻萃取物可藉由提高上述基因表現量，提升脂肪分解相關基因之表現量以達到該促進脂肪分解的功效。
在一些實施例中，前述之組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有有效含量的葛仙米藻萃取物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道或口服的投藥劑型。這些投藥劑型包括，但不限於：錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）以及類似之物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地（parenterally）或局部地（topically）投藥的劑型，這些投藥劑型包括，但不限於：注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）以及類似之物。在一些實施例中，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑（parenteral routes）來投藥：皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）以及病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，醫藥品可進一步包含有被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列的試劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之組合物可為可食用組合物。在一些實施例中，此可食用組合物可以製成食品產品或可為食品添加物（food additive），意即藉由習知方法於食材製備時添加而製得食品產品，或是於食品產品的製作過程中添加。於此，食品產品可以是與可食性材料配製成供人類或動物攝食的產品。
在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）以及膳食補充品（dietary supplements）。
[
範例一
]
葛仙米藻萃取物製備方法
萃取物的製備方法
在此實施例中，葛仙米藻萃取物的製備步驟如下：
1. 首先，進行加熱程序。將葛仙米藻（產地：台灣恆春，受落山風吹拂之地區）的整體進行粗碎（Osterizer 品牌的10 speed blender）並以孔徑為12mm的篩網將其過篩，去除過大顆粒後取得葛仙米藻粗碎物。
2. 接著，加熱程序中，以水為溶劑與葛仙米藻粗碎物以10:1（液固比）的重量比混合，並於95±5℃下萃取約60分鐘以形成一萃取液。在另一些實施例中，溶劑與葛仙米藻粗碎物的重量比亦可為5:1至20:1，浸泡時的溫度可為50℃至100℃，萃取時間可為30分鐘至90分鐘。若溶劑過少或萃取時間過短，則萃取效率將會明顯下降；若萃取時間過長，則萃取物中的有效成分可能會產生降解。
3. 冷卻前述萃取液至室溫（25℃-30℃）。
4. 將萃取液以400目數的濾網進行過濾，去除細微固體。
5. 將前述萃取液以濃縮機（廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100），在60℃±5℃下進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值（Degrees Brix）為5±0.5時停止濃縮，得到本發明之葛仙米藻萃取物。在另一些實施例中，可於45℃-70℃下進行減壓濃縮。
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範例二
]
多醣定量實驗
標準曲線繪製：
首先，精密秤取D-葡萄糖（D-Glucose）（購自J.T. Baker，料號：1916-01） 10 mg，置於10 mL 容量瓶中，以二次蒸餾水（ddH2
O）定量至10 mL，配置成1 mg/mL濃度之D-葡萄糖溶液。
接著，將上述標準品進行系列稀釋，以二次蒸餾水稀釋為0, 20, 50, 100, 150, 200 μg/mL 之D-葡萄糖溶液。可參酌下表1之方式配置標準溶液。
表1：D-葡萄糖溶液標準溶液配置方法
| 濃度（ μg/mL ） | 0 | 20 | 50 | 100 | 150 | 200 |
| D- 葡萄糖溶液 （ 1 mg/mL ） | 0μL | 20μL | 50μL | 100μL | 150μL | 200μL |
| ddH2 O | 1000μL | 980μL | 950μL | 900μL | 850μL | 800μL |
之後，取標準溶液各100 μL放置於玻璃試管中，再各加入500 μL 濃度為5%的苯酚溶液（Phenol）（購自Merck，料號：1.00206.0250）。
接著緩慢加入2.5 mL濃度為95.5%，比重1.84之濃硫酸溶液（H2
SO4
）（購自Showa，料號：1970-5250）。經由渦旋（vortex）確保無氣泡後，靜置20分鐘。最後，取200 μL樣品放入96孔培養盤，於490 nm下測定其吸光值，並繪製標準曲線。
樣品總多醣定量實驗：
另外，將範例1所得的葛仙米藻萃取物水稀釋20倍至1200μL並取100μL的體積至玻璃試管中，每組樣品需三重複。之後，加入500 μL 濃度為5%的苯酚溶液（Phenol）（購自Merck，料號：1.00206.0250）。
接著緩慢加入2.5 mL濃度為95.5%，比重1.84之濃硫酸溶液（H2
SO4
）（購自Showa，料號：1970-5250）。經由渦旋（vortex）確保無氣泡後，靜置20 分鐘。最後，取200 μL樣品放入96孔培養盤，於490 nm下測定其吸光值，並以內插法算出濃度後再乘回稀釋倍數以取得原萃取液濃度。
實驗結果：
根據前述實驗之結果，本發明之葛仙米藻多醣含量為0.29wt%。
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範例三
]
皮膚細胞粒線體活性實驗
為探討葛仙米藻萃取物對皮膚細胞粒線體功能的影響，本實施例以流式細胞儀評估人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk經葛仙米藻萃取物處理後，其粒線體活性的變化。
材料與儀器
1. 細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk（BCRC No. 60153）。
2. 細胞培養基：含有10 vol% FBS（購自Gibco）之基礎培養基。其中，基礎培養基是由Eagle’s最低限度基本培養基（Eagle’s minimum essential medium（MEM），購自Gibco，產品編號15188-319）額外添加成分使其含有1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma）及0.1 mM 非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco）所配製而成。
3. 磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco。
4. 粒線體膜電位偵測套組（BDTM
MitoScreen （JC-1） kit，型號551302）。其中，粒線體膜電位偵測套組具有JC-1染料（凍乾）及10X分析緩衝液。於使用前，以1X PBS將10X分析緩衝液稀釋10倍，以形成1X分析緩衝液。加入130 μL DMSO至JC-1染劑（凍乾）中，以形成JC-1儲備溶液。然後，再以1X分析緩衝液稀釋JC-1儲備溶液，以形成JC-1工作試劑（JC-1 working solution；即JC-1粒線體特異性染劑）。稀釋倍率為JC-1儲備溶液比1X分析緩衝液為1:100。
5. 胰蛋白酶：10X Trypsin-EDTA（購自Gibco）以1X PBS溶液稀釋10倍。
6. 流式細胞儀：購自BD Pharmingen公司，型號BDTM Accuri C6 Plus。
7. 葛仙米藻萃取物：由本案範例1之製備方式所製得。
實驗步驟
實驗將會分為實驗組以及控制組（未添加葛仙米藻萃取物的組別）二組進行，各組分別進行三重複試驗：
1. 將CCD-966sk細胞以每孔1×105
個的方式，接種於每孔含2 mL細胞培養基之6孔培養盤中。
2. 將培養盤的各孔中的培養基更換成2 mL實驗培養基。其中，實驗組的實驗培養基含有1.25μL（即濃度為0.0625vol%）的範例一得到的葛仙米藻萃取物之細胞培養基。控制組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含葛仙米藻萃取物）。
3. 將培養盤置於5%CO2
、37℃下，培養24小時。
4. 移除培養盤中的實驗培養基並以1 mL的1X PBS溶液潤洗2次。
5. 將200 μL胰蛋白酶加至每孔中並在暗處反應5分鐘。反應後，添加細胞培養基終止反應。將各孔中之細胞與細胞培養基收集至個別對應的1.5 mL離心管內，並將含有細胞與細胞培養基之離心管以400 xg離心10分鐘。
6. 於離心後移除上清液，再以1 mL的1X PBS溶液重新回溶或轉移細胞沉澱物至15 mL離心管以形成細胞懸浮液。
7. 將含有細胞懸浮液的離心管以400 xg離心5分鐘。
8. 於離心後移除各離心管中的上清液並加入100 μL的JC-1工作試劑至各離心管。
9. 將各離心管中的細胞沉澱物與JC-1工作試劑渦旋均勻並在避光處理下培養15分鐘。
10. 15分鐘後，將各離心管以400 xg離心5分鐘。
11. 於離心後，移除各離心管中的上清液、以1 mL的1X PBS溶液回溶各試管中的細胞沉澱物並以400 xg離心5分鐘。
12. 於離心後，移除各離心管中的上清液、以1 mL的1X PBS溶液回溶各離心管中的細胞沉澱物並以400 xg離心5分鐘。
13. 於離心後，移除各離心管中的上清液、以500 μL的1X PBS重新懸浮細胞，以得到待測細胞液。
14. 以流式細胞儀量測各孔的待檢測細液中細胞粒線體的膜電位，以進行粒線體活性分析。因實驗係進行三重複，故將各組的三重複實驗之結果平均以得平均值，然後以控制組的平均值為100%之相對JC-1聚集量，將實驗組的平均值換算為相對JC-1聚集量，如圖2所示。
實驗結果
參閱圖2，其為經本發明葛仙米藻萃取物處理之實驗組與未經本發明葛仙米藻萃取物處理之控制組之JC-1聚集相對量比較長條圖。（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
由該圖可知，實驗組之相對JC-1聚集量約為117.5%。換言之，與控制組相較之下，實驗組的人類皮膚纖維母細胞的粒線體活性提升17.5%。顯示葛仙米藻萃取物可提升皮膚細胞之粒線體活性，而達到提升皮膚細胞活性之效果。
[
範例四
]
保濕相關基因試驗
此範例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定人類表皮角質細胞HPEK-50經本發明之葛仙米藻萃取物處理後，細胞中保濕相關基因的變化。
材料與儀器
1. 角質細胞專用之無血清培養基（Keratinocyte-SFM；購自Thermo，產品編號17005042）。
2. 人類表皮角質細胞（以下簡稱HPEK-50細胞或角質細胞；購自CELLnTEC）。
3. RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G)。
4. 反轉錄酶(SuperScript® III Reverse Transcriptase) (Invitrogen公司，美國，編號18080-051) 。
5. 測量標的基因引子，其中包含KRT1基因、KRT10基因，另包括內部控制組(TBP基因)。
6. KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)。
7. ABI StepOnePlusTM即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））。
8. 葛仙米藻萃取物：由本案範例一所述之製備方式所得之葛仙米造萃取物。
實驗步驟
細胞培養的實驗流程如下：
於此，培養基採用角質細胞專用之無血清培養基。
首先以每孔1×105
個細胞量培養於含有2 mL上述培養液之六孔培養盤中，並在37 ℃下培養16小時，然後將HPEK-50細胞分為實驗組與控制組。
實驗組：每毫升培養液含有1.25μL範例一之方式製備而成之葛仙米藻萃取物萃取物的比例（即，濃度為0.125 vol%）製得含萃取物的培養液，將HPEK-50細胞更換為含萃取物的培養液中繼續培養。
控制組：不作任何處理，即不額外添加其他化合物至含有培養後的HPEK-50細胞的培養液中。
實驗組與控制組於培養6小時後，將培養後的實驗組與控制組細胞以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液分別破細胞膜以形成二組的細胞溶液。
聚合酶連鎖反應的實驗流程如下：
1. 使用RNA萃取試劑套組分別收集二組細胞溶液內之RNA。
2. 接著，每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶以表2中之引子（primer）黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。
3. 後續利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以及KAPA SYBR FAST將二組反轉錄後產物分別以表2之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction），以觀察實驗組和控制組的HPEK-50細胞的基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95 °C反應1秒，60 °C反應20秒，總共40個迴圈。
4. 爾後，使用2-ΔΔCt
方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之一目標基因相對於控制組或對照組之同一基因的RNA表現量倍數變化。該方法以TBP基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值（Ct），按照以下公式計算倍數變化：
△Ct = Ct實驗組之目標基因 / 控制組或對照組之目標基因
- Ct TBP
△△Ct= △Ct實驗組之目標基因
- △Ct控制組之目標基因
倍數變化 = 2-ΔΔCt 平均值
最終，利用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾Student t-test分析是否具有統計上顯著差異 (*p值＜0.05; **p值＜0.01; ***p值＜0.001)。其中 ，KRT1基因對應的引子對為KRT1-F與KRT1-R，KRT10基因對應的引子對為KRT10-F與KRT10-R，TBP基因對應的引子對為TBP-F與TBP-R。
表2
| 引子名稱 | 序列編號 | 序列 |
| KRT1-F | SEQ ID NO:1 | AGAGTGGACCAACTGAAGAGT |
| KRT1-R | SEQ ID NO:2 | ATTCTCTGCATTTGTCCGCTT |
| KRT10-F | SEQ ID NO:3 | TCCTACTTGGACAAAGTTCGGG |
| KRT10-R | SEQ ID NO:4 | CCCCTGATGTGAGTTGCCA |
| TBP-F | SEQ ID NO:5 | TATAATCCCAAGCGGTTTGC |
| TBP-R | SEQ ID NO:6 | GCTGGAAAACCCAACTTCTG |
實驗結果
參照圖3，其為經本發明葛仙米藻萃取物處理之實驗組與未經本發明葛仙米藻萃取物處理之控制組之保濕相關基因相對表現量之長條圖。（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
由該圖可知，實驗組之KRT1基因相對表現量約為125%，KRT10基因相對表現量則約為156%。換言之，與控制組相較之下，實驗組的角質細胞中的保濕相關基因KRT1基因與KRT10基因分別提升25%與56%，且均達統計學上之顯著差異。由此可知，本案之葛仙米藻萃取物有防止肌膚水分過度散失，增強保濕度，進而改善肌膚外觀之功能。
[
範例五
]
抑制脂肪堆積功效試驗
脂肪細胞內以油滴（Lipid droplet）的形式貯存脂肪。基此，本次試驗分析染色後的油滴，以觀察細胞內油滴的數量，藉以確認脂肪堆積的狀態。後續，再將染劑溶出並分析以作為量化的數值指標。
本次試驗採用小鼠骨髓基質細胞（後續簡稱OP9細胞），OP9細胞購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC®
）之OP9細胞株 （ATCC CRL-2749）。
首先，取24孔培養盤將每孔接種8×104
個OP9細胞及500μL培養基（Medium），培養基其中包含90%之MEMAM（Minimum Essential Medium Alpha Medium，購自Gibco，美國）細胞培養液、20%之胎牛血清（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，美國，Cat#10437-028），且加入0.1%之青黴素/鏈黴素（Penicillin-streptomycin，購自Gibco，美國），在37℃下培養7天。此7天的細胞培養期間每隔3天更換培養基。7天後，以顯微鏡（ZEISS；放大倍率400x）觀察細胞內油滴形成，藉以確認細胞已完全分化為脂肪細胞。
然後，將分化完成的脂肪細胞分為二組：實驗組與控制組。
實驗組：依照每孔2000μL培養基含有1.25μL由範例一所製備之葛仙米藻萃取物的比例（即，濃度為0.0625%）將該葛仙米藻萃取物添加至含分化後的培養基中，在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
控制組：不作任何處理，即不額外添加其他化合物至含分化後的脂肪細胞的分化培養基中，在37℃下培養7天。此7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
接下來，依據下列步驟進行紅油O的染色。於7天細胞處理後，將培養基移除，以1mL之磷酸鹽緩衝溶液（Phosphate buffered saline, PBS）清洗脂肪細胞兩次，再加入1mL之10%甲醛並於室溫下反應30分鐘以固定脂肪細胞。接著移除甲醛後以1mL之PBS輕輕地清洗脂肪細胞兩次，接著於每孔細胞內加入1mL之60%異丙醇，反應1分鐘後，移除異丙醇並加入1mL之油紅O作用溶液與脂肪細胞反應，於室溫下反應1小時，接著移除與脂肪細胞作用的油紅O作用溶液並迅速地以1mL之60%異丙醇進將脂肪細胞行脫色5秒鐘，再使用顯微鏡觀察並拍攝細胞，如圖5所示。
參考圖5。實驗組經由葛仙米藻萃取物的處理之後可見油滴數量（深色點之數量）明顯少於控制組。換言之，在脂肪細胞的成長過程中，經由葛仙米藻萃取物的作用可以有效降低脂肪細胞堆積油脂。
後續，將染色後的各組再依下列步驟進行紅油O的定量。加入100%異丙醇於染色之細胞中，並置於振盪器上反應10分鐘以溶解油滴，接著取100μL至96孔培養盤中，以測量ELISA讀取儀（BioTek）讀取各組之OD510nm
讀值。其中，利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖4所示（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
參考圖4。將控制組的脂肪油滴含量視為1（即100%）時，實驗組的脂肪油滴含量為71.9%。意即經由葛仙米藻萃取物處理之後能顯著地減少28.1%的脂肪堆積量。此結果顯示，葛仙米藻萃取物能有效阻斷脂肪細胞的增大，以減少脂肪細胞中油滴的含量，而達到抑制脂肪堆積功效。
[
範例六
]
脂肪分解相關基因試驗
此範例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定小鼠骨髓基質細胞OP9經本發明之葛仙米藻萃取物處理後，細胞中脂肪代謝基因的變化。
材料與儀器
1. 細胞株：小鼠骨髓基質細胞OP9（以下簡稱為OP9細胞，購自BCRC，編號6566）。
2. 培養基：含有20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GIBCO公司，編號10438-026，美國)、1%抗生素-抗黴菌素(Antibiotic-Antimycotic)（Gibco公司，編號15240-062）的α-最低限度必需培養基（α-Minimum essential medium，簡稱α-MEM）（Gibco公司，編號12000-022）。
3. RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G)。
4. 反轉錄酶(SuperScript® III Reverse Transcriptase) (Invitrogen公司，美國，編號18080-051)。
5. 測量標的基因引子，其中包含ATGL基因、LIPE(HSL)基因，另包括內部控制組(m-ACTB基因)。
6. KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)。
7. ABI StepOnePlusTM即時PCR系統（ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））。
8. 葛仙米藻萃取物：由本案範例一所述之製備方式所得之葛仙米造萃取物。
實驗步驟
細胞培養的實驗流程如下：
於此，培養基採用含有20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(GIBCO公司，編號10438-026，美國)及1%抗生素-抗黴菌素(Antibiotic-Antimycotic)（Gibco公司，編號15240-062）的α-最低限度必需培養基（α-Minimum essential medium，簡稱α-MEM）（Gibco公司，編號12000-022）的培養基。
首先，取1.5x105
個小鼠骨髓基質細胞至每孔含有2毫升上述培養基的六孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時；將每孔培養後的小鼠骨髓基質細胞依據下列測試條件分為控制組以及實驗組（共二組）來處理每孔培養後的小鼠骨髓基質細胞。
實驗組：每毫升培養液含有0.625 μL範例一之方式製備而成之葛仙米藻萃取物萃取物的比例（即，濃度為0.0625 vol%）製得含萃取物的培養液，將OP9細胞更換為含萃取物的培養液中繼續培養。
控制組：不作任何處理，即不額外添加其他化合物至含有培養後的OP9細胞的培養液中。
實驗組與控制組於培養6小時後，將培養後的實驗組、對照組與控制組細胞以RNA萃取試劑套組的細胞裂解液分別破細胞膜以形成二組的細胞溶液。
聚合酶連鎖反應的實驗流程如下：
1. 使用RNA萃取試劑套組分別收集二組細胞溶液內之RNA。
2. 接著，每組取2000奈克（ng）所萃取出的RNA為模板，藉由SuperScript® III反轉錄酶以表2中之引子（primer）黏合進行反轉錄作用產生相應之cDNA。
3. 後續利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以及KAPA SYBR FAST將二組反轉錄後產物分別以表2之組合引子進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction），以觀察實驗組和控制組的HPEK-50細胞的基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95℃反應1秒，60℃反應20秒，總共40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量各基因的mRNA表現量，進而推斷各基因編碼的蛋白質的表現量。
4. 爾後，使用2-ΔΔCt
方法測定目標基因的相對表現量。所謂相對表現量定義為實驗組之一目標基因相對於控制組或對照組之同一基因的RNA表現量倍數變化。該方法以m-ACTB基因的循環閾值作為內部對照之參考基因的循環閾值（Ct），按照以下公式計算倍數變化：
△Ct = Ct實驗組之目標基因 / 控制組或對照組之目標基因
- Ct m-ACTB
△△Ct= △Ct實驗組之目標基因
- △Ct控制組之目標基因
倍數變化 = 2-ΔΔCt 平均值
最終，利用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾Student t-test分析是否具有統計上顯著差異 (*p值＜0.05; **p值＜0.01; ***p值＜0.001)。其中，ATGL基因對應的引子對為ATGL-F與ATGL-R，LIPE基因對應的引子對為LIPE-F與LIPE-R，m-ACTB基因對應的引子對為m-ACTB-F與m-ACTB-R。
表3
| 引子名稱 | 序列編號 | 序列 |
| ATGL-F | SEQ ID NO:7 | GGATGGCGGCATTTCAGACA |
| ATGL-R | SEQ ID NO:8 | CAAAGGGTTGGGTTGGTTCAG |
| LIPE-F | SEQ ID NO:9 | TGGCACACCATTTTGACCTG |
| LIPE-R | SEQ ID NO:10 | TTGCGGTTAGAAGCCACATAG |
| m-ACTB-F | SEQ ID NO:11 | GGCTGTATTCCCCTCCATCG |
| m-ACTB-R | SEQ ID NO:12 | CCAGTTGGTAACAATGCCATGT |
實驗結果
參照圖6，其為經本發明葛仙米藻萃取物處理之實驗組與未經本發明葛仙米藻萃取物處理之控制組之脂肪分解相關基因相對表現量之長條圖。（圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著）。
由該圖可知，實驗組之ATGL基因相對表現量約為273%，LIPE基因相對表現量則約為1891%。換言之，與控制組相較之下，實驗組的OP9細胞中的脂肪分解相關基因ATGL基因與LIPE基因分別提升18.9倍與2.7倍，且均達統計學上之顯著差異。由此可知，本案之葛仙米藻萃取物有促進脂肪分解，藉以達到減脂之功能。
[
範例
7]
肌膚光澤人體實驗
-
以內服方式使用葛仙米藻萃取物
使用樣品：含本發明之葛仙米藻萃取物之飲品50g/瓶（以水以及本發明之葛仙米藻萃取物所配製成每50g的飲品中含有4g的葛仙米藻萃取物，即佔8%）。其中，此葛仙米藻萃取物係由實施例1之方法所製備而成。其糖度為5。
受試者人數：8位25-60歲之受試者。
實驗方式：受試者每日飲用一瓶含本發明之葛仙米藻萃取物之飲品（每瓶含有4g的葛仙米藻萃取物），共飲用28日（即4週）。並於開始飲用前（臉部已清潔，第0週）以及飲用14及28日後，進行肌膚光澤度檢測，紀錄臉部肌膚之數值。（於飲用前、後進行檢測時，受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致，以減少外界的溫濕度等因素會對皮膚所造成的影響）。
肌膚光澤度檢測：
使用德國Courage+Khazaka electronic公司之肌膚光澤度檢測探頭Glossymeter GL200 (C+K Multi Probe Adapter System, Germany) 對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行檢測。該儀器是由照射到皮膚表面的光的直接反射和散反射來進行測試與計算。當測量數值越高，說明皮膚越具有光澤。
實驗結果：
請參閱圖7。該圖係受試者在飲用含本案葛仙米藻萃取物之飲品2周及4周後之皮膚狀態之平均改善百分比，而改善之人數比例佔達受試人數之100%。其中，飲用4周後，肌膚光澤度改善16.2%。由此可見，本發明之葛仙米藻萃取物具提升肌膚光澤之用途。
[
範例
8]
減重減脂人體實驗
-
以內服方式使用葛仙米藻萃取物
使用樣品：含本發明之葛仙米藻萃取物之飲品50g/瓶（以水以及本發明之葛仙米藻萃取物所配製成每50g的飲品中含有4g的葛仙米藻萃取物，即佔8%）。其中，此葛仙米藻萃取物係由實施例1之方法所製備而成。其糖度為5。
受試者人數：8位25-60歲之受試者。
實驗方式：受試者每日飲用一瓶含本發明之葛仙米藻萃取物之飲品（每瓶含有4g的葛仙米藻萃取物），共飲用28日（即4週）。並於開始飲用前（第0週）以及飲用14及28日後，依據不同檢測項目，使用對應的儀器及測量方式，紀錄體重與體脂之數值。（於飲用前、後進行檢測時，受試者之飲食與運動習慣均保持不變，以避免影響檢測之結果）。
體重與BMI檢測：
使用體重機TANITA四肢與軀幹體組成計，型號BC-545F。對同一受試者在飲用前與飲用後進行測量，並透過BMI公式（BMI = 體重（kg）/ 身高2
（m2
））獲得BMI值。
體脂檢測：
使用體脂測量儀器TANITA四肢與軀幹體組成計，型號BC-545F進行全身體脂測量以及軀幹體脂測量。
實驗結果：
請參閱圖8及圖9。其分別為受試者在飲用含本案葛仙米藻萃取物之飲品2周及4周後之體重與BMI之平均變化量。其中，改善之人數比例佔達受試人數之87.5%。飲用4周後，受試者體重顯著減輕 0.6公斤，BMI降低0.4。
請參閱圖10及圖11。其分別為飲用含本案葛仙米藻萃取物之飲品2周及4周後之全身體脂量與軀幹體脂之平均變化量（以百分比計算）。其中，改善之人數比例佔達受試人數之87.5%。飲用4周後，受試者全身體脂減少0.7%，軀幹體脂有效減少0.9%。由此可見，本發明之葛仙米藻萃取物具瘦身、減重以及減體脂之功效。
無
圖1是範例一中葛仙米藻萃取物製備過程之一較佳實施例之流程圖。
圖2是範例三中控制組與實驗組的相對JC-1聚集量結果比較圖。
圖3是範例四中控制組及實驗組的保濕基因表現量的結果比較圖。
圖4是範例五中實驗組及控制組的相對脂肪油滴含量比例圖。
圖5是範例五中實驗組及控制組的脂肪細胞紅油O染色顯微鏡照片圖。
圖6是範例六中控制組及實驗組的脂肪分解基因表現量的結果比較圖。
圖7是範例七中試驗者飲用美藻萃取飲2週及4週後，肌膚光澤度變化圖。
圖8是範例八中試驗者飲用美藻萃取飲2週及4週後，體重變化圖。
圖9是範例七中試驗者飲用美藻萃取飲2週及4週後，BMI變化圖。
圖10是範例七中試驗者飲用美藻萃取飲2週及4週後，全身體脂變化圖。
圖11是範例七中試驗者飲用美藻萃取飲2週及4週後，軀幹體脂變化圖。
Claims (7)
- 一種葛仙米藻(Nostoc sphaeroides)萃取物用於製備一減脂的組合物之用途，且該葛仙米藻萃取物係以一含水之溶劑對一葛仙米藻萃取所得。
- 如請求項1所述之用途，且該葛仙米藻萃取物之白利糖度(Brix)值為5.0±0.5。
- 一種葛仙米藻(Nostoc sphaeroides)萃取物用於製備一維持角質結構緊密完善的組合物之用途，且該葛仙米藻萃取物係以一含水之溶劑對一葛仙米藻萃取所得。
- 如請求項3所述之用途，且該葛仙米藻萃取物之白利糖度(Brix)值為5.0±0.5。
- 如請求項1所述的用途，其中該減脂為減少體重、減少BMI、減少全身體脂、減少軀幹體脂、或其組合。
- 如請求項1或3所述的用途，其中該葛仙米藻萃取物之萃取時間為50℃~100℃，且該溶劑與該葛仙米藻之比例為5：1至20：1。
- 如請求項1或3所述的用途，其中該組合物為醫藥組合物、食品組合物、或保健食品組合物。
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