CN112843097A - 葛仙米藻汁液用于减脂及美肌的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种葛仙米藻汁液的用途,其是用于制备减少脂肪堆积、提升脂肪分解基因表现量、提升粒线体活性、及肌肤保湿的组合物的用途。其中,葛仙米藻汁液是由含水的溶剂进行提取。
Description
技术领域
本发明涉及一种葛仙米藻汁液的用途,特别是用于制备减少脂肪堆积、提升脂肪分解基因、提升粒线体活性、及肌肤保湿的组合物的用途。
背景技术
葛仙米藻之学名为Nostoc sphaeroides,是一种陆生蓝绿菌。相传东晋时,因被尊称为「葛仙翁」的葛洪采食,因此物托人名,称为「葛仙米」。葛仙米藻之其他俗名包含:「地木耳」、「地耳菜」、「情人的眼泪」、「天使眼泪」、「上帝的眼泪」等。葛仙米藻于潮湿环境中呈蓝色、橄榄色;失水后藻体呈不显眼的黄绿色或黄褐色。葛仙米藻分布于世界各地,且能于极端条件下生存。虽然葛仙米藻没有叶绿体,但其含有能光合作用的细胞质,其亦可自大气抓取氮,所以可以生活于无氮之土地上。
葛仙米藻可食用,其口感类似黑木耳与海藻,为中国台湾恒春半岛居民餐桌上的在地美食。
发明内容
有鉴于此,为了更积极提升葛仙米藻其他层面的开发与应用,故而提出一种减脂美肌组合物及葛仙米藻汁液,其可应用于制备减少脂肪堆积、提升脂肪分解基因、提升粒线体活性、及肌肤保湿的组合物。
在一些实施例中,一种葛仙米藻汁液,其是由一种含水之溶剂进行提取,其中葛仙米藻汁液所包含之多醣体含量为0.2wt%。
在一些实施例中,一种葛仙米藻汁液用于制备提升肌肤外观的组合物之用途,其中葛仙米藻汁液是透过提高细胞中粒线体活性达到肌肤外观提升之用途,且葛仙米藻汁液是以一种含水之溶剂进行提取。
在一些实施例中,一种葛仙米藻汁液用于制备提升肌肤外观的组合物之用途,其中葛仙米藻汁液是透过提高细胞中保湿相关基因表现量达到肌肤外观提升之用途,且葛仙米藻汁液是以一种含水之溶剂进行提取。
在一些实施例中,保湿相关基因包含KRT10或KRT1基因。
在一些实施例中,葛仙米藻汁液具维持角质细胞的结构紧密完整之功效。
在一些实施例中,葛仙米藻汁液具提升角质层能有保护内部柔嫩肌肤的能力。
在一些实施例中,一种葛仙米藻汁液用于制备抑制及/或减少脂肪堆积的组合物之用途,其中葛仙米藻汁液是透过细胞脂肪油滴堆积以达到抑制及/或减少脂肪堆积之用途,且葛仙米藻汁液是以一种含水之溶剂进行提取。
在一些实施例中,一种葛仙米藻汁液用于制备抑制及/或减少脂肪堆积的组合物之用途,其中葛仙米藻汁液是透过促进脂肪分解以达到抑制及/或减少脂肪堆积之用途,且葛仙米藻汁液是以一种含水之溶剂进行提取。
在一些实施例中,葛仙米藻汁液是透过提升脂肪分解相关基因脂表现量以达到促进脂肪分解。
在一些实施例中,脂肪分解相关基因包含ATGL基因或LIPE基因。
在一些实施例中,葛仙米藻汁液可以推迟细胞老化。
在一些实施例中,葛仙米藻汁液之Brix值为5±0.5。
综上所述,任一实施例的葛仙米藻汁液可用以提升肌肤外观的组合物之用途。任一实施例的葛仙米藻汁液可用以制备提高细胞中保湿相关基因表现量 (如,KRT1基因及KRT10基因)表现量的组合物。任一实施例的葛仙米藻汁液可用以制备促进脂肪分解的组合物。任一实施例的葛仙米藻汁液可用以制备减少脂肪堆积的组合物。任一实施例的葛仙米藻汁液可用以制备提升脂肪分解相关基因表现量(如,ATGL基因及LIPE基因)的组合物。
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述,但不作为对本发明的限定。
附图说明
图1是范例一中葛仙米藻汁液制备过程之一较佳实施例之流程图。
图2是范例三中控制组与实验组的相对JC-1聚集量结果比较图。
图3是范例四中控制组及实验组的保湿基因表现量的结果比较图。
图4是范例五中实验组及控制组的相对脂肪油滴含量比例图。
图5是范例五中实验组及控制组的脂肪细胞红油O染色显微镜照片图。
图6是范例六中控制组及实验组的脂肪分解基因表现量的结果比较图。
图7是范例七中试验者饮用美藻提取饮2周及4周后,肌肤光泽度变化图。
图8是范例八中试验者饮用美藻提取饮2周及4周后,体重变化图。
图9是范例七中试验者饮用美藻提取饮2周及4周后,BMI变化图。
图10是范例七中试验者饮用美藻提取饮2周及4周后,全身体脂变化图。
图11是范例七中试验者饮用美藻提取饮2周及4周后,躯干体脂变化图。
具体实施方式
以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下,本案尚可以多种不同形式之态样来实践,不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。
本案使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示,各组之间的差异以学生t检验(student’s t-test)进行分析。图式中「*」代表 p值小于0.05,「**」代表p值小于0.01,以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时,代表统计上的差异越显着。
本文中所使用数值为近似值,所有实验数据皆表示在正负10%的范围内,最佳为在正负5%的范围内。
本文中之「wt%」系指重量百分比,而「vol%」系指体积百分比。
如本文中所使用,术语「汁液」系指藉由提取作用所制备之产物。所述汁液可以溶于溶剂中之溶液形式呈现,或汁液可为不含或大体上不含溶剂之浓缩物或精华呈现,亦可以干燥后之粉体呈现。
如本文所用「葛仙米藻原料」通常系指藻类之本体,其中所述本体可包含原始、经干燥或以其他物理方式加工以利于处理之藻类本体,其可进一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式经加工以影响原物料之大小及实体完整性之型态。
参考图1。在一些实施例中,一种葛仙米藻汁液,其是由一种含水之溶剂对葛仙米藻原料进行提取。在一些实施例中,葛仙米藻汁液(Nostoc sphaeroides extract)系将葛仙米藻原料依序进行、粉碎程序S01、加热程序S02、过滤程序 S03、及浓缩程序S04后得到。
在一些实施例中,葛仙米藻原料可以是粉碎或完整的葛仙米藻。在一些实施例中,葛仙米藻原料可以是新鲜或干燥的葛仙米藻。
在一些实施例中,葛仙米藻系来自于极端气候之产区。
在一些实施例中,葛仙米藻系来自于受强风吹拂之地区。
在一些实施例中,葛仙米藻系来自受下坡风吹拂之地区。在一些实施例中,所述下坡风为落山风。
在一些实施例中,所述强风造成葛仙米藻所生长之区域较易散失。
在一些实施例中,所述极端气候造成葛仙米藻之多醣含量大于0.2wt%。
在一些实施例中,粉碎程序S01是指将葛仙米藻原料搅打至平均粒径小于 20mm。举例而言,粉碎可以采用果汁机、调理机或均质机。
在一些实施例中,加热程序S02是指将碎裂之葛仙米藻原料与含水之溶剂混合后加热一段固定时间。在一些实施例中,加热是指将葛仙米藻原料与含水之溶剂的温度提升到50℃~100℃。在一些实施例中,一段固定时间是指0.5小时到3小时。举例而言,将葛仙米藻原料与含水之溶剂的温度提升到95℃进行提取1小时。
在一些实施例中,加热程序S02中的重量比例(含水之溶剂:葛仙米藻原料)为5:1至20:1。举例而言,含水之溶剂:葛仙米藻原料为10:1。
在一些实施例中,含水之溶剂可以是纯水或含有有机酸之水溶剂。在一些实施例中,有机酸之浓度为0.05%到2.00%。在一些实施例中,有机酸可是可食用酸。在一些实施例中,可食用酸可以是柠檬酸(Citric Acid)、苹果酸、酒石酸、乳酸、葡萄糖酸、醋酸等,并不以此为限。
举例而言,采用90公斤重的葛仙米藻原料、900公斤重的水及0.63公斤重的柠檬酸混合后持续加热到100℃,并维持100℃持续0.5小时。举例而言,采用90公斤重的葛仙米藻原料、900公斤重的水及0.7公斤重的柠檬酸混合后持续加热到85℃,并维持85℃持续1小时。
在一些实施例中,过滤程序S03是指将加热后(或降温后)的葛仙米藻原料及溶剂通过筛网以将溶剂内的固体滤除形成过滤液。举例而言,筛网可以是 400网目(mesh)的筛网。
在一些实施例中,加热程序S02与过滤程序S03之间还包括一降温程序,其中降温程序是指将加热后的葛仙米藻原料及溶剂静置以自然降温至室温。
在一些实施例中,浓缩程序S04是指将过滤程序S03所得到的过滤液进行减压浓缩(厂牌/型号:BUCHI-Rotavapor R-100)以得到初萃液。在一些实施例中,浓缩程序S04所得的初萃液可即为葛仙米藻汁液。在浓缩程序S04的一些实施例中,在40℃~70℃之间进行减压浓缩。举例而言,葛仙米藻汁液是将葛仙米藻原料依序进行粉碎程序S01、加热程序S02、过滤程序S03及浓缩程序S04后得到。
在一些实施例中,葛仙米藻汁液用于制备提升肌肤外观的组合物之用途,其中葛仙米藻汁液是透过提升粒线体活性以达到所述提升皮肤外观的功效,且葛仙米藻汁液是以一种含水之溶剂进行提取。
在一些实施例中,经图1所揭示之提取程序使得葛仙米藻之多醣含量大于0.2wt%。
在一些实施例中,葛仙米藻汁液用于制备推迟皮肤自然衰老的组合物之用途,其中葛仙米藻汁液是透过提升粒线体活性以达到所述抵抗皮肤自然衰老的功效,且葛仙米藻汁液是以一种含水之溶剂进行提取。自然衰老是指在无其他疾病或非自然外力等影响下,一个人身体的组成随着时间形成而产生自然改变的过程。
在一些实施例中,葛仙米藻汁液可以推迟皮肤细胞老化。于此,所指的老化(Aging)是指细胞随着时间变化而发生各种机能下降或死亡的过程。
在一些实施例中,葛仙米藻汁液用于制备肌肤保湿的组合物之用途,其中葛仙米藻汁液是透过提升肌肤保湿相关基因之表现量以达到所述提升皮肤外观的功效,且葛仙米藻汁液是以一种含水之溶剂进行提取。
在一些实施例中,肌肤保湿相关基因所转录出之蛋白质有助于维持角质结构紧密完善、及/或能达到保护肌肤之能力。
在一些实施例中肌肤保湿相关基因包含KRT1基因(GeneID:3848)以及 KRT10基因(GeneID:3858)。
在一些实施例中,Brix值为5.0以上的葛仙米藻汁液可提升肌肤保湿相关基因的表现量,藉以保湿肌肤,进而提升肌肤外观。
其中,KRT1基因(GeneID:3848)以及KRT10基因(GeneID:3858)所转录出之蛋白质有助于维持角质结构紧密完善、及/或能达到保护肌肤之能力。
具体而言,KRT1基因及KRT10基因分别承载制备角蛋白1与角蛋白10 的信息。角蛋白是一种纤维状蛋白质,其组成了角质细胞(keratinocytes)之主要架构。角蛋白1与角蛋白10相互结合形成角蛋白中间纤维(intermediate filaments),而这些中间纤维所形成的坚固网络,可为皮肤提供强度和弹性,并保护其免受摩擦和其他日常物理性的损害。
换言之,葛仙米藻汁液可藉由提高上述基因表现量,提升肌肤保湿相关基因之表现量以达到所述提升皮肤外观的功效。
在一些实施例中,葛仙米藻汁液可以用于制备促进脂肪分解的组合物之用途。在一些实施例中,具有促进脂肪分解之能力的葛仙米藻汁液之Brix值为 5.0以上。
在一些实施例中,葛仙米藻汁液系透过提升脂肪分解相关基因以达到促进脂肪分解之功效。其中,具有促进脂肪分解之能力的葛仙米藻汁液之Brix值为 5.0以上。
在一些实施例中,脂肪分解相关基因所转录出之蛋白质具有将较大体积之油滴分解为体积较小之油滴。
在一些实施例中,脂肪分解相关基因包含ATGL基因(GeneID:57104,亦称为PNPLA2)、LIPE基因(GeneID:3991)。
其中,ATGL基因与LIPE基因分别转录脂肪甘油三酯脂肪酶(adiposetriglyceride lipase,简称ATGL)与荷尔蒙敏感性脂解酶(Hormone-Sensitive Lipase,简称HSL)。具体而言,ATGL可将细胞储存的三酸甘油脂水解成游离之脂肪酸以及双酸甘油脂,而HSL则将双酸甘油脂进一步水解成单酸甘油脂,两者均于脂方上扮演举足轻重的角色。
在一些实施例中,葛仙米藻汁液用于制备减少脂肪堆积之组合物之用途。在一些实施例中,具有减少脂肪堆积之能力的葛仙米藻汁液之Brix值为5.0以上。
换言之,葛仙米藻汁液可藉由提高上述基因表现量,提升脂肪分解相关基因之表现量以达到所述促进脂肪分解的功效。
在一些实施例中,前述之组合物可为医药品。换言之,此医药品包含有有效含量的葛仙米藻汁液。
在一些实施例中,前述之医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于经肠道或口服的投药剂型。这些投药剂型包括,但不限于:锭剂 (tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似之物。
在一些实施例中,前述之医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型,这些投药剂型包括,但不限于:注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(externalpreparation)以及类似之物。在一些实施例中,所述医药品可以一选自于由下列所构成之群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药:皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermalinjection)以及病灶内注射(intralesional injection)。
在一些实施例中,医药品可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技术之医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如,医药上可接受的载剂可包含下列的试剂中一种或多种:溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂 (wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术之人士的专业素养与例行技术范畴内。
在一些实施例中,医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成之群组中的溶剂:水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。
在一些实施例中,前述之组合物可为可食用组合物。在一些实施例中,此可食用组合物可以制成食品产品或可为食品添加物(food additive),意即藉由习知方法于食材制备时添加而制得食品产品,或是于食品产品的制作过程中添加。于此,食品产品可以是与可食性材料配制成供人类或动物摄食的产品。
在一些实施例中,食品产品可为但不限于:饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods) 以及膳食补充品(dietary supplements)。
[范例一]葛仙米藻汁液制备方法汁液的制备方法
在此实施例中,葛仙米藻汁液的制备步骤如下:
1.首先,进行加热程序。将葛仙米藻(产地:中国台湾恒春,受落山风吹拂之地区)的整体进行粗碎(Osterizer品牌的10speed blender)并以孔径为 12mm的筛网将其过筛,去除过大颗粒后取得葛仙米藻粗碎物。
2.接着,加热程序中,以水为溶剂与葛仙米藻粗碎物以10:1(液固比)的重量比混合,并于95±5℃下提取约60分钟以形成一提取液。在另一些实施例中,溶剂与葛仙米藻粗碎物的重量比亦可为5:1至20:1,浸泡时的温度可为 50℃至100℃,提取时间可为30分钟至90分钟。若溶剂过少或提取时间过短,则提取效率将会明显下降;若提取时间过长,则汁液中的有效成分可能会产生降解。
3.冷却前述提取液至室温(25℃-30℃)。
4.将提取液以400目数的滤网进行过滤,去除细微固体。
5.将前述提取液以浓缩机(厂牌/型号:BUCHI-Rotavapor R-100),在60 ℃±5℃下进行减压浓缩至溶液的白利糖度值(Degrees Brix)为5±0.5时停止浓缩,得到本发明之葛仙米藻汁液。在另一些实施例中,可于45℃-70℃下进行减压浓缩。
[范例二]多醣定量实验
标准曲线绘制:
首先,精密秤取D-葡萄糖(D-Glucose)(购自J.T.Baker,料号:1916-01) 10mg,置于10mL容量瓶中,以二次蒸馏水(ddH2O)定量至10mL,配置成1mg/mL浓度之D-葡萄糖溶液。
接着,将上述标准品进行系列稀释,以二次蒸馏水稀释为0,20,50,100,150, 200μg/mL之D-葡萄糖溶液。可参酌下表1之方式配置标准溶液。
表1:D-葡萄糖溶液标准溶液配置方法
之后,取标准溶液各100μL放置于玻璃试管中,再各加入500μL浓度为5%的苯酚溶液(Phenol)(购自Merck,料号:1.00206.0250)。
接着缓慢加入2.5mL浓度为95.5%,比重1.84之浓硫酸溶液(H2SO4)(购自Showa,料号:1970-5250)。经由涡旋(vortex)确保无气泡后,静置20分钟。最后,取200μL样品放入96孔培养盘,于490nm下测定其吸光值,并绘制标准曲线。
样品总多醣定量实验:
另外,将范例1所得的葛仙米藻汁液水稀释20倍至1200μL并取100μL 的体积至玻璃试管中,每组样品需三重复。之后,加入500μL浓度为5%的苯酚溶液(Phenol)(购自Merck,料号:1.00206.0250)。
接着缓慢加入2.5mL浓度为95.5%,比重1.84之浓硫酸溶液(H2SO4)(购自Showa,料号:1970-5250)。经由涡旋(vortex)确保无气泡后,静置20分钟。最后,取200μL样品放入96孔培养盘,于490nm下测定其吸光值,并以内插法算出浓度后再乘回稀释倍数以取得原提取液浓度。
实验结果:
根据前述实验之结果,本发明之葛仙米藻多醣含量为0.29wt%。
[范例三]皮肤细胞粒线体活性实验
为探讨葛仙米藻汁液对皮肤细胞粒线体功能的影响,本实施例以流式细胞仪评估人类皮肤纤维母细胞CCD-966sk经葛仙米藻汁液处理后,其粒线体活性的变化。
材料与仪器
1.细胞株:人类皮肤纤维母细胞CCD-966sk(BCRC No.60153)。
2.细胞培养基:含有10vol%FBS(购自Gibco)之基础培养基。其中,基础培养基是由Eagle’s最低限度基本培养基(Eagle’s minimum essential medium(MEM),购自Gibco,产品编号15188-319)额外添加成分使其含有 1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate,购自Gibco)、1.5g/L碳酸氢钠(sodium bicarbonate,购自Sigma)及0.1mM非必需胺基酸(non-essential amino acid solution,购自Gibco)所配制而成。
3.磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液):购自Gibco。
4.粒线体膜电位侦测套组(BDTM MitoScreen(JC-1)kit,型号551302)。其中,粒线体膜电位侦测套组具有JC-1染料(冻干)及10X分析缓冲液。于使用前,以1X PBS将10X分析缓冲液稀释10倍,以形成1X分析缓冲液。加入130μL DMSO至JC-1染剂(冻干)中,以形成JC-1储备溶液。然后,再以1X分析缓冲液稀释JC-1储备溶液,以形成JC-1工作试剂(JC-1workingsolution;即JC-1粒线体特异性染剂)。稀释倍率为JC-1储备溶液比1X分析缓冲液为1:100。
5.胰蛋白酶:10X Trypsin-EDTA(购自Gibco)以1X PBS溶液稀释10倍。
6.流式细胞仪:购自BD Pharmingen公司,型号BDTM Accuri C6 Plus。
7.葛仙米藻汁液:由本案范例1之制备方式所制得。
实验步骤
实验将会分为实验组以及控制组(未添加葛仙米藻汁液的组别)二组进行,各组分别进行三重复试验:
1.将CCD-966sk细胞以每孔1×105个的方式,接种于每孔含2mL细胞培养基之6孔培养盘中。
2.将培养盘的各孔中的培养基更换成2mL实验培养基。其中,实验组的实验培养基含有1.25μL(即浓度为0.0625vol%)的范例一得到的葛仙米藻汁液之细胞培养基。控制组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含葛仙米藻汁液)。
3.将培养盘置于5%CO2、37℃下,培养24小时。
4.移除培养盘中的实验培养基并以1mL的1X PBS溶液润洗2次。
5.将200μL胰蛋白酶加至每孔中并在暗处反应5分钟。反应后,添加细胞培养基终止反应。将各孔中之细胞与细胞培养基收集至个别对应的1.5mL离心管内,并将含有细胞与细胞培养基之离心管以400xg离心10分钟。
6.于离心后移除上清液,再以1mL的1X PBS溶液重新回溶或转移细胞沉淀物至15mL离心管以形成细胞悬浮液。
7.将含有细胞悬浮液的离心管以400xg离心5分钟。
8.于离心后移除各离心管中的上清液并加入100μL的JC-1工作试剂至各离心管。
9.将各离心管中的细胞沉淀物与JC-1工作试剂涡旋均匀并在避光处理下培养15分钟。
10.15分钟后,将各离心管以400xg离心5分钟。
11.于离心后,移除各离心管中的上清液、以1mL的1X PBS溶液回溶各试管中的细胞沉淀物并以400xg离心5分钟。
12.于离心后,移除各离心管中的上清液、以1mL的1X PBS溶液回溶各离心管中的细胞沉淀物并以400xg离心5分钟。
13.于离心后,移除各离心管中的上清液、以500μL的1X PBS重新悬浮细胞,以得到待测细胞液。
14.以流式细胞仪量测各孔的待检测细液中细胞粒线体的膜电位,以进行粒线体活性分析。因实验系进行三重复,故将各组的三重复实验之结果平均以得平均值,然后以控制组的平均值为100%之相对JC-1聚集量,将实验组的平均值换算为相对JC-1聚集量,如图2所示。
实验结果
参阅图2,其为经本发明葛仙米藻汁液处理之实验组与未经本发明葛仙米藻汁液处理之控制组之JC-1聚集相对量比较直方图。(图式中「*」代表p值小于0.05,「**」代表p值小于0.01,以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时,代表统计上的差异越显着)。
由所述图可知,实验组之相对JC-1聚集量约为117.5%。换言之,与控制组相较之下,实验组的人类皮肤纤维母细胞的粒线体活性提升17.5%。显示葛仙米藻汁液可提升皮肤细胞之粒线体活性,而达到提升皮肤细胞活性之效果。
[范例四]保湿相关基因试验
材料与仪器
1.角质细胞专用之无血清培养基(Keratinocyte-SFM;购自Thermo,产品编号17005042)。
2.人类表皮角质细胞(以下简称HPEK-50细胞或角质细胞;购自 CELLnTEC)。
3.RNA提取试剂套组(购自Geneaid公司,中国台湾,Lot No.FC24015-G)。
5.测量目标基因引子,其中包含KRT1基因、KRT10基因,另包括内部控制组(TBP基因)。
7.ABI StepOnePlusTM实时PCR系统(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司,美国))。
8.葛仙米藻汁液:由本案范例一所述之制备方式所得之葛仙米造汁液。
实验步骤
细胞培养的实验流程如下:
于此,培养基采用角质细胞专用之无血清培养基。
首先以每孔1×105个细胞量培养于含有2mL上述培养液之六孔培养盘中,并在37℃下培养16小时,然后将HPEK-50细胞分为实验组与控制组。
实验组:每毫升培养液含有1.25μL范例一之方式制备而成之葛仙米藻汁液汁液的比例(即,浓度为0.125vol%)制得含汁液的培养液,将HPEK-50细胞更换为含汁液的培养液中继续培养。
控制组:不作任何处理,即不额外添加其他化合物至含有培养后的 HPEK-50细胞的培养液中。
实验组与控制组于培养6小时后,将培养后的实验组与控制组细胞以RNA 提取试剂套组的细胞裂解液分别破细胞膜以形成二组的细胞溶液。
聚合酶连锁反应的实验流程如下:
1.使用RNA提取试剂套组分别收集二组细胞溶液内之RNA。
3.后续利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system,以及KAPA SYBR FAST将二组反转录后产物分别以表2之组合引子进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction),以观察实验组和控制组的HPEK-50细胞的基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应1秒,60℃反应20秒,总共40 个循环。
尔后,使用2-ΔΔCt方法测定目标基因的相对表现量。所谓相对表现量定义为实验组之一目标基因相对于控制组或对照组之同一基因的RNA表现量倍数变化。所述方法以TBP基因的循环阈值作为内部对照之参考基因的循环阈值 (Ct),按照以下公式计算倍数变化:
△Ct=Ct实验组之目标基因/控制组或对照组之目标基因-CtTBP
△△Ct=△Ct实验组之目标基因-△Ct控制组之目标基因
倍数变化=2-ΔΔCt平均值
最终,利用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差,并在Excel软件中以单尾Student t-test分析是否具有统计上显着差异(*p值<0.05;**p值<0.01;***p 值<0.001)。其中,KRT1基因对应的引子对为KRT1-F与KRT1-R,KRT10基因对应的引子对为KRT10-F与KRT10-R,TBP基因对应的引子对为TBP-F与 TBP-R。
表2
引子名称 | 序列编号 | 序列 |
KRT1-F | SEQ ID NO:1 | AGAGTGGACCAACTGAAGAGT |
KRT1-R | SEQ ID NO:2 | ATTCTCTGCATTTGTCCGCTT |
KRT10-F | SEQ ID NO:3 | TCCTACTTGGACAAAGTTCGGG |
KRT10-R | SEQ ID NO:4 | CCCCTGATGTGAGTTGCCA |
TBP-F | SEQ ID NO:5 | TATAATCCCAAGCGGTTTGC |
TBP-R | SEQ ID NO:6 | GCTGGAAAACCCAACTTCTG |
实验结果
参照图3,其为经本发明葛仙米藻汁液处理之实验组与未经本发明葛仙米藻汁液处理之控制组之保湿相关基因相对表现量之直方图。(图式中「*」代表 p值小于0.05,「**」代表p值小于0.01,以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时,代表统计上的差异越显着)。
由所述图可知,实验组之KRT1基因相对表现量约为125%,KRT10基因相对表现量则约为156%。换言之,与控制组相较之下,实验组的角质细胞中的保湿相关基因KRT1基因与KRT10基因分别提升25%与56%,且均达统计学上之显着差异。由此可知,本案之葛仙米藻汁液有防止肌肤水分过度散失,增强保湿度,进而改善肌肤外观之功能。
[范例五]抑制脂肪堆积功效试验
脂肪细胞内以油滴(Lipid droplet)的形式贮存脂肪。基此,本次试验分析染色后的油滴,以观察细胞内油滴的数量,藉以确认脂肪堆积的状态。后续,再将染剂溶出并分析以作为量化的数值指标。
本次试验采用小鼠骨髓基质细胞(后续简称OP9细胞),OP9细胞购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection,)之OP9 细胞株(ATCC CRL-2749)。
首先,取24孔培养盘将每孔接种8×104个OP9细胞及500μL培养基 (Medium),培养基其中包含90%之MEMAM(Minimum Essential Medium Alpha Medium,购自Gibco,美国)细胞培养液、20%之胎牛血清(Fetal Bovine Serum,购自Gibco,美国,Cat#10437-028),且加入0.1%之青霉素/链霉素 (Penicillin-streptomycin,购自Gibco,美国),在37℃下培养7天。此7天的细胞培养期间每隔3天更换培养基。7天后,以显微镜(ZEISS;放大倍率400x) 观察细胞内油滴形成,藉以确认细胞已完全分化为脂肪细胞。
然后,将分化完成的脂肪细胞分为二组:实验组与控制组。
实验组:依照每孔2000μL培养基含有1.25μL由范例一所制备之葛仙米藻汁液的比例(即,浓度为0.0625%)将所述葛仙米藻汁液添加至含分化后的培养基中,在37℃下培养7天。在7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
控制组:不作任何处理,即不额外添加其他化合物至含分化后的脂肪细胞的分化培养基中,在37℃下培养7天。此7天的细胞处理期间每隔3天更换培养基。
接下来,依据下列步骤进行红油O的染色。于7天细胞处理后,将培养基移除,以1mL之磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗脂肪细胞两次,再加入1mL之10%甲醛并于室温下反应30分钟以固定脂肪细胞。接着移除甲醛后以1mL之PBS轻轻地清洗脂肪细胞两次,接着于每孔细胞内加入1mL之60%异丙醇,反应1分钟后,移除异丙醇并加入1mL之油红O作用溶液与脂肪细胞反应,于室温下反应1小时,接着移除与脂肪细胞作用的油红 O作用溶液并迅速地以1mL之60%异丙醇进将脂肪细胞行脱色5秒钟,再使用显微镜观察并拍摄细胞,如图5所示。
参考图5。实验组经由葛仙米藻汁液的处理之后可见油滴数量(深色点之数量)明显少于控制组。换言之,在脂肪细胞的成长过程中,经由葛仙米藻汁液的作用可以有效降低脂肪细胞堆积油脂。
后续,将染色后的各组再依下列步骤进行红油O的定量。加入100%异丙醇于染色之细胞中,并置于振荡器上反应10分钟以溶解油滴,接着取100μL 至96孔培养盘中,以测量ELISA读取仪(BioTek)读取各组之OD510nm读值。其中,利用Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显着差异,如图4所示(图式中「*」代表p值小于0.05,「**」代表 p值小于0.01,以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时,代表统计上的差异越显着)。
参考图4。将控制组的脂肪油滴含量视为1(即100%)时,实验组的脂肪油滴含量为71.9%。意即经由葛仙米藻汁液处理之后能显着地减少28.1%的脂肪堆积量。此结果显示,葛仙米藻汁液能有效阻断脂肪细胞的增大,以减少脂肪细胞中油滴的含量,而达到抑制脂肪堆积功效。
[范例六]脂肪分解相关基因试验
材料与仪器
1.细胞株:小鼠骨髓基质细胞OP9(以下简称为OP9细胞,购自BCRC,编号6566)。
2.培养基:含有20%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(GIBCO公司,编号10438-026,美国)、1%抗生素-抗霉菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司,编号15240-062)的α-最低限度必需培养基(α-Minimum essential medium,简称α-MEM)(Gibco公司,编号12000-022)。
3.RNA提取试剂套组(购自Geneaid公司,中国台湾,Lot No.FC24015-G)。
5.测量目标基因引子,其中包含ATGL基因、LIPE(HSL)基因,另包括内部控制组(m-ACTB基因)。
7.ABI StepOnePlusTM实时PCR系统(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司,美国))。
8.葛仙米藻汁液:由本案范例一所述之制备方式所得之葛仙米造汁液。
实验步骤
细胞培养的实验流程如下:
于此,培养基采用含有20%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(GIBCO公司,编号10438-026,美国)及1%抗生素-抗霉菌素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco 公司,编号15240-062)的α-最低限度必需培养基(α-Minimum essential medium,简称α-MEM)(Gibco公司,编号12000-022)的培养基。
首先,取1.5x105个小鼠骨髓基质细胞至每孔含有2毫升上述培养基的六孔细胞培养盘中,于37℃下培养24小时;将每孔培养后的小鼠骨髓基质细胞依据下列测试条件分为控制组以及实验组(共二组)来处理每孔培养后的小鼠骨髓基质细胞。
实验组:每毫升培养液含有0.625μL范例一之方式制备而成之葛仙米藻汁液汁液的比例(即,浓度为0.0625vol%)制得含汁液的培养液,将OP9细胞更换为含汁液的培养液中继续培养。
控制组:不作任何处理,即不额外添加其他化合物至含有培养后的OP9细胞的培养液中。
实验组与控制组于培养6小时后,将培养后的实验组、对照组与控制组细胞以RNA提取试剂套组的细胞裂解液分别破细胞膜以形成二组的细胞溶液。
聚合酶连锁反应的实验流程如下:
1.使用RNA提取试剂套组分别收集二组细胞溶液内之RNA。
3.后续利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system,以及KAPA SYBR FAST将二组反转录后产物分别以表2之组合引子进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction),以观察实验组和控制组的HPEK-50细胞的基因的表现量。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应1秒,60℃反应20秒,总共40 个循环,并使用2-ΔCt方法进行基因定量。于此,藉由cDNA进行定量实时反转录聚合酶连锁反应可间接定量各基因的mRNA表现量,进而推断各基因编码的蛋白质的表现量。
4.尔后,使用2-ΔΔCt方法测定目标基因的相对表现量。所谓相对表现量定义为实验组之一目标基因相对于控制组或对照组之同一基因的RNA表现量倍数变化。所述方法以m-ACTB基因的循环阈值作为内部对照之参考基因的循环阈值(Ct),按照以下公式计算倍数变化:
△Ct=Ct实验组之目标基因/控制组或对照组之目标基因-Ctm-ACTB
△△Ct=△Ct实验组之目标基因-△Ct控制组之目标基因
倍数变化=2-ΔΔCt平均值
最终,利用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差,并在Excel软件中以单尾Student t-test分析是否具有统计上显着差异(*p值<0.05;**p值<0.01;***p 值<0.001)。其中,ATGL基因对应的引子对为ATGL-F与ATGL-R,LIPE基因对应的引子对为LIPE-F与LIPE-R,m-ACTB基因对应的引子对为m-ACTB-F 与m-ACTB-R。
表3
引子名称 | 序列编号 | 序列 |
ATGL-F | SEQ ID NO:7 | GGATGGCGGCATTTCAGACA |
ATGL-R | SEQ ID NO:8 | CAAAGGGTTGGGTTGGTTCAG |
LIPE-F | SEQ ID NO:9 | TGGCACACCATTTTGACCTG |
LIPE-R | SEQ ID NO:10 | TTGCGGTTAGAAGCCACATAG |
m-ACTB-F | SEQ ID NO:11 | GGCTGTATTCCCCTCCATCG |
m-ACTB-R | SEQ ID NO:12 | CCAGTTGGTAACAATGCCATGT |
实验结果
参照图6,其为经本发明葛仙米藻汁液处理之实验组与未经本发明葛仙米藻汁液处理之控制组之脂肪分解相关基因相对表现量之直方图。(图式中「*」代表p值小于0.05,「**」代表p值小于0.01,以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时,代表统计上的差异越显着)。
由所述图可知,实验组之ATGL基因相对表现量约为273%,LIPE基因相对表现量则约为1891%。换言之,与控制组相较之下,实验组的OP9细胞中的脂肪分解相关基因ATGL基因与LIPE基因分别提升18.9倍与2.7倍,且均达统计学上之显着差异。由此可知,本案之葛仙米藻汁液有促进脂肪分解,藉以达到减脂之功能。
[范例7]肌肤光泽人体实验-以内服方式使用葛仙米藻汁液
使用样品:含本发明之葛仙米藻汁液之饮品50g/瓶(以水以及本发明之葛仙米藻汁液所配制成每50g的饮品中含有4g的葛仙米藻汁液,即占8%)。其中,此葛仙米藻汁液系由实施例1之方法所制备而成。其糖度为5。
受试者人数:8位25-60岁之受试者。
实验方式:受试者每日饮用一瓶含本发明之葛仙米藻汁液之饮品(每瓶含有4g的葛仙米藻汁液),共饮用28日(即4周)。并于开始饮用前(脸部已清洁,第0周)以及饮用14及28日后,进行肌肤光泽度检测,纪录脸部肌肤之数值。(于饮用前、后进行检测时,受试者所在的测试区域的温度与湿度为一致,以减少外界的温湿度等因素会对皮肤所造成的影响)。
肌肤光泽度检测:
使用德国Courage+Khazaka electronic公司之肌肤光泽度检测探头Glossymeter GL200(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)对同一受试者在饮用前与饮用后的面部肌肤进行检测。所述仪器是由照射到皮肤表面的光的直接反射和散反射来进行测试与计算。当测量数值越高,说明皮肤越具有光泽。
实验结果:
请参阅图7。所述图系受试者在饮用含本案葛仙米藻汁液之饮品2周及4 周后之皮肤状态之平均改善百分比,而改善之人数比例占达受试人数之100%。其中,饮用4周后,肌肤光泽度改善16.2%。由此可见,本发明之葛仙米藻汁液具提升肌肤光泽之用途。
[范例8]减重减脂人体实验-以内服方式使用葛仙米藻汁液
使用样品:含本发明之葛仙米藻汁液之饮品50g/瓶(以水以及本发明之葛仙米藻汁液所配制成每50g的饮品中含有4g的葛仙米藻汁液,即占8%)。其中,此葛仙米藻汁液系由实施例1之方法所制备而成。其糖度为5。
受试者人数:8位25-60岁之受试者。
实验方式:受试者每日饮用一瓶含本发明之葛仙米藻汁液之饮品(每瓶含有4g的葛仙米藻汁液),共饮用28日(即4周)。并于开始饮用前(第0周) 以及饮用14及28日后,依据不同检测项目,使用对应的仪器及测量方式,纪录体重与体脂之数值。(于饮用前、后进行检测时,受试者之饮食与运动习惯均保持不变,以避免影响检测之结果)。
体重与BMI检测:
使用体重机TANITA四肢与躯干体组成计,型号BC-545F。对同一受试者在饮用前与饮用后进行测量,并透过BMI公式(BMI=体重(kg)/身高2(m2)) 获得BMI值。
体脂检测:
使用体脂测量仪器TANITA四肢与躯干体组成计,型号BC-545F进行全身体脂测量以及躯干体脂测量。
实验结果:
请参阅图8及图9。其分别为受试者在饮用含本案葛仙米藻汁液之饮品2 周及4周后之体重与BMI之平均变化量。其中,改善之人数比例占达受试人数之87.5%。饮用4周后,受试者体重显着减轻0.6公斤,BMI降低0.4。
请参阅图10及图11。其分别为饮用含本案葛仙米藻汁液之饮品2周及4 周后之全身体脂量与躯干体脂之平均变化量(以百分比计算)。其中,改善之人数比例占达受试人数之87.5%。饮用4周后,受试者全身体脂减少0.7%,躯干体脂有效减少0.9%。由此可见,本发明之葛仙米藻汁液具减肥、减重以及减体脂之功效。
当然,本发明还可有其它多种实施例,在不背离本发明精神及其实质的情况下,熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形,但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
序列表
<110> 百岳特生物技术(上海)有限公司
<120> 葛仙米藻汁液用于减脂及美肌的用途
<130> 2136--TW-UT0001
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (10)
1.一种葛仙米藻汁液用于制备一减脂的用途,其特征在于,且所述葛仙米藻汁液是以一含水的溶剂对一葛仙米藻提取所得。
2.一种葛仙米藻汁液用于制备一减脂的用途,其特征在于,且所述葛仙米藻汁液的白利糖度值为5.0以上。
3.一种葛仙米藻汁液用于制备一改善肌肤外观的用途,其特征在于,且所述葛仙米藻汁液是以一含水的溶剂对一葛仙米藻提取所得。
4.一种葛仙米藻汁液用于制备一改善肌肤外观的用途,其特征在于,且所述葛仙米藻汁液的白利糖度值为5.0以上。
5.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述葛仙米藻汁液是通过提升脂肪分解相关基因以达到所述减脂的功效。
6.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述葛仙米藻汁液是通过抑制及/或减缓脂肪堆积以达到所述减脂的功效。
7.如权利要求3或4所述的用途,其特征在于,所述葛仙米藻汁液是通过维持角质结构紧密完善及/或防止肌肤水分散失以达到所述改善皮肤外观的功效。
8.如权利要求3或4所述的用途,其特征在于,所述葛仙米藻汁液是通过提升肌肤保湿相关基因的表现量以达到所述改善皮肤外观的功效。
9.如权利要求1或3所述的用途,其特征在于,所述葛仙米藻汁液的提取时间为50℃~100℃,且所述溶剂与所述葛仙米藻的比例为5:1至20:1。
10.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述组合物为医药组合物、食品组合物或保健食品组合物。
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