CN117356709A - 黑钻苹果萃取物用于制备调理肌肤状态组合物的用途 - Google Patents

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Abstract

一种黑钻苹果萃取物的用途，其是用于制备调理肌肤状态组合物，其中黑钻苹萃取物是以水为溶剂提取自苹果Malus pumila的果实而得。

Description

黑钻苹果萃取物用于制备调理肌肤状态组合物的用途
技术领域
本发明涉及一种黑钻苹果萃取物，特别是关于黑钻苹果萃取物用于制备改善肌肤状态的组合物的用途。
背景技术
黑钻苹果演化自海拔3100公尺的西藏林芝市，由于日间高强度紫外线照射，以及昼夜温差大的特殊温度变化，这导致苹果变种以适应此地区气候的过度变化。黑钻苹果变种适应了这些外部环境的巨大变化并变种出其独特的外观颜色。
发明内容
黑钻苹果变种的外表面由红转为紫黑色，其活性成分也产生变化。有鉴于此，为了开发黑钻苹果更多层面的应用，故而提出一种黑钻苹果萃取物用于制备调理肌肤状态的组合物的用途。
在一些实施例中，本发明提供一种黑钻苹果萃取物的用途，其是用于制备调理肌肤状态组合物，黑钻苹果萃取物是以水提取苹果植株Malus pumila的全果实而得。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于促进肌肤细胞粒线体活性。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于促进皮肤纤维细胞增生。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于促进皮肤伤口愈合。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于促进皮肤胶原蛋白含量提升。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于促进皮肤弹力蛋白含量提升。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于促进皮肤玻尿酸含量提升。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于减少皮肤皱纹量。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于提升皮肤含水量。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物为食品组合物，且食品组合物内至少包含黑钻苹果萃取物3克/日。
综上所述，任一实施例的黑钻苹果萃取物可用以制备调理肌肤状态的组合物。在一些实施例中，黑钻苹果萃取物可具有下列至少一种作用：促进肌肤细胞粒线体活性、促进皮肤纤维细胞增生、促进皮肤伤口愈合、促进皮肤胶原蛋白含量提升、促进皮肤弹力蛋白含量提升、促进皮肤玻尿酸含量提升、减少皮肤皱纹量、提升皮肤含水量。
附图说明
图1是一实施例的黑钻苹果萃取物促进粒线体活性测试结果图。
图2是一实施例的黑钻苹果萃取物促进皮肤纤维细胞增生测试结果图。
图3是一实施例的黑钻苹果萃取物促进皮肤伤口愈合测试显微摄影。
图4是一实施例的黑钻苹果萃取物促进皮肤伤口愈合测试结果图。
图5是一实施例的黑钻苹果萃取物提升皮肤胶原蛋白含量测试结果图。
图6是一实施例的黑钻苹果萃取物提升皮肤弹力蛋白含量测试结果图。
图7是一实施例的黑钻苹果萃取物提皮肤玻尿酸含量测试结果图。
图8是人体测试的平均肌肤皱纹量测试结果图。
图9是人体测试的平均皮肤含水量测试结果图。
具体实施方式
如本文所用「黑钻苹果」是指产自海拔3000公尺的苹果植株的果实，果实外观呈现明显的深紫至黑色，苹果植株的学名为Malus pumila。
在一些实施例中，果实为全果实。在一些实施例中，全果实包括果皮、果肉、果核(子房壁)及种子。
在一些实施例中，提取黑钻苹果萃取物所使用的黑钻苹果可以是新鲜的黑钻苹果、干燥的黑钻苹果或是冷冻的黑钻苹果。在一些实施例中，干燥可以是风干、日晒干燥、荫干或冷冻干燥。
在一些实施例中，提取黑钻苹果萃取物所使用的黑钻苹果可为完整、或是经剁碎、切丁、切片、碾磨、研磨或其他方式等改变原物料之大小及实体完整性的物理处理程序后的黑钻苹果。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物是经水萃步骤制得黑钻苹果萃取液。水萃步骤以水为溶剂，在特定温度下经过特定时间进行萃取以制得黑钻苹果萃取液。在一些实施例中，特定温度是指90℃～80℃之间。在一实施例中，特定温度是85±5℃。在一实施例中，特定温度是85℃。在一些实施例中，特定时间是指60分钟到80分钟。在一些实施例中，特定时间是指60分钟。
在一些实施例中，水萃步骤中，水与黑钻苹果的重量比例为15～5：1。举例而言，水：黑钻苹果为10：1。于此，若溶剂过少或特定时间过短，则萃取效率将会明显下降；若特定时间过长，则萃取物中的有效成分可能会产生降解。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物是经水萃步骤与过滤步骤制得黑钻苹果萃取液。其中，过滤步骤是指将经水萃步骤后的黑钻苹果萃取物再以筛网或离心等方式进行过滤，藉以去除黑钻苹果萃取物内的固形物的步骤。举例而言，将黑钻苹果萃取液以400网目(mesh)的筛网进行过滤以制得黑钻苹果萃取液。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物是经水萃步骤、过滤步骤与浓缩步骤制得黑钻苹果萃取液。其中，浓缩步骤是指将经水萃步骤或水萃步骤与过滤步骤后的黑钻苹果萃取物去除多余的水份，藉以减少黑钻苹果萃取物的存放体积的步骤。举例而言，可以采用浓缩机(厂牌/型号：BUCHI–Rotavapor R-100)，在60℃下进行减压浓缩至溶液的白利糖度值(Degrees Brix)为10±0.5时停止浓缩制得黑钻苹果萃取液。在另一些实施例中，可于50～82℃下进行减压浓缩。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物是经水萃步骤、过滤步骤、浓缩步骤与调整步骤制得黑钻苹果萃取液。其中，调整步骤是指添加苹果酸将黑钻苹果萃取物调整到pH 2.7±1.0的步骤。在一些实施例中，苹果酸是DL-苹果酸(羟基丁二酸)。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物有效使用量为3克/天。
在一些实施例中，本发明提供一种黑钻苹果萃取物的用途，其是用于制备调理肌肤状态组合物。于此，调理肌肤状态是指促进肌肤细胞粒线体活性、促进皮肤纤维细胞增生、促进皮肤伤口愈合、促进皮肤胶原蛋白含量提升、促进皮肤弹力蛋白含量提升、促进皮肤玻尿酸含量提升、减少皮肤皱纹量、提升皮肤含水量其中至少一种。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于促进肌肤细胞粒线体活性。于此，以JC-1聚集能力作为粒线体活性之指标，在膜电位正常的健康粒线体中，JC-1以多聚体(polymer)形式存在，而当粒线体膜电位降低时，JC-1会变成单体(monomer)，其可当作粒线体活性评估的指标。粒线体为细胞的能量制造工厂，粒线体活性会受到外在环境伤害而下降，例如若肌肤长期受到UV光照射会导致粒线体DNA突变而降低其活性，如能促进粒线体活性则可以提升细胞代谢率与生长率，进而修复皮肤。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于促进皮肤纤维细胞增生。于此，皮肤纤维母细胞的增生则有利于维持表皮的厚度及紫外线屏障功能，亦可补充皮肤细胞外基质中的组成及维持真皮的更新。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于减少皮肤皱纹量。于此，所述皮肤皱纹量的量测是以可见光(白光)拍摄高分辨率之肌肤图像，并以软件根据皱纹之长度与深度进行分析计算而得。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于提升皮肤含水量。于此，所述皮肤含水量的量测基于电容的原理进行测量。当水分含量发生变化时，皮肤的电容值亦发生变化，故可通过测定皮肤电容值，分析皮肤表面的含水量。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于促进皮肤弹力蛋白含量提升。在一些实施例中，黑钻苹果萃取物是透过促进弹力蛋白合成相关基因表现量以达到提升弹力蛋白量的效果。在一些实施例中，弹力蛋白合成相关基因包含弹力蛋白(Elastin,ELN)基因和人类纤维母细胞原纤维蛋白质(Fibrillin-1，FBN1)基因。
ELN基因为弹力蛋白(Elastin,ELN)的基因。其中，弹力蛋白(ELN蛋白)可与弹性蛋白结合。因此，透过观察ELN基因的表现，可观察蛋白质在肌肤的表现量。并且，当蛋白质的含量提高，皆有利于提高肌肤的弹性。
FBN1蛋白质是一种存在于细胞外基质的醣蛋白，会形成微丝使得缔结组织具有弹性。当FBN1蛋白质在真皮层的表现减少时，会影响真皮层的微丝数量。并且，由于微丝会提供轨道主导弹性纤维的集合，因此当FBN1蛋白质的含量减少时，会影响弹性纤维的集合与合成，进而影响肌肤弹性。
在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于增加玻尿酸的含量。在一些实施例中，黑钻苹果萃取物系是透过提升玻尿酸合成相关基因表现量以达到提升肌肤保湿的效果。在一些实施例中，玻尿酸合成相关基因可为玻尿酸合成酶(hyaluronan synthase,HAS)基因。其中，玻尿酸合成酶基因包括玻尿酸合成酶2(Hyaluronan synthase 2,HAS2)基因、玻尿酸合成酶3(Hyaluronan synthase 3,HAS3)基因或其组合。后续简称为HAS2基因及HAS3基因。于此，玻尿酸也可称为透明质酸。在一些实施例中，黑钻苹果萃取物用于改善肌肤润泽感。
在一些实施例中，前述之组合物可为保健品或保健食品。在一些实施例中，前述之组合物是非医疗目的的保健品或保健食品，换言之，此保健品或保健食品包含有效使用量的黑钻苹果萃取物。
在一些实施例中，前述之保健组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于经肠道或口服的投药剂型。这些投药剂型包括，但不限于：锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似之物。
在一些实施例中，前述之保健组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于非经肠道地(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这些投药剂型包括，但不限于：注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)以及类似之物。在一些实施例中，该保健组合物可以一选自于由下列所构成之群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。
在一些实施例中，保健组合物可进一步包含有被广泛地使用于食品制造技术之食品可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，食品上可接受的载剂可包含下列的试剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些试剂的选用与数量是落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。
在一些实施例中，食品上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成之群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。
在一些实施例中，前述之保健组合物可为可食用组合物。在一些实施例中，此可食用组合物可以制成食品产品或可为食品添加物(food additive)，意即藉由现有技术方法于食材制备时添加而制得食品产品，或是于食品产品的制作过程中添加。于此，食品产品可以是与可食性材料配制成供人类或动物摄食的产品。
在一些实施例中，食品产品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。
范例一：黑钻苹果萃取物的制备
首先，采用中国生产的切片风干黑钻苹果的全果实为原料，全果实包括果皮、果肉、果核(子房壁)及种子。
接着进行水萃步骤，以水为溶剂，将水加热达到85±5℃(即特定温度)之后，投入黑钻苹果原料。其中，黑钻苹果原料与水以1：10的重量比例。意即，将黑钻苹果与水混合后维持85±5℃下萃取60分钟(即特定时间)后得到初萃液。
后续，进行过滤步骤，待初萃液冷却至室温后，再将初萃液以400网目的筛网过筛后取其滤液。
之后，进行浓缩步骤，取上述滤液，利用浓缩机(厂牌/型号：BUCHI–Rotavapor R-100)，在设定温度60±5℃下进行减压浓缩至溶液的白利糖度值(Degrees Brix)为10±0.5时停止浓缩得到浓缩液。
最后，进行调整步骤，取上述浓缩液添加适量的DL-苹果酸调整到pH2.7即为黑钻苹果萃取物。
范例二：黑钻苹果萃取物促进皮肤纤维细胞增生测试
本例以流式细胞仪评估人类皮肤纤维母细胞CCD-966sk经黑钻苹果萃取物处理后，其粒线体活性的变化。
所用材料与仪器，如下：
细胞株：人类皮肤纤维母细胞CCD-966sk(后续简称皮肤纤维细胞，寄存编号BCRC60153)。
细胞培养基：最低限度基本培养基(minimum essential medium，简称MEM培养基)(购自Gibco，产品编号11095080)额外添加成分使其含有10vol％胎牛血清(后续简称FBS)(购自Gibco，产品编号10437-028)、1％青霉素-链霉素(购自Gibco，产品编号15140122)、1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate，购自Gibco，产品编号11360-070)、1.5g/L碳酸氢钠(sodium bicarbonate，购自Sigma，产品编号S5761-500G)及0.1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid solution，购自Gibco，产品编号11140050)所配制而成。
磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)：购自Gibco。
粒线体膜电位侦测套组(BDTM MitoScreen(JC-1)kit，型号551302)。其中，粒线体膜电位侦测套组具有JC-1染料(冻干)及10X分析缓冲液。于使用前，以1X PBS将10X分析缓冲液稀释10倍，以形成1X分析缓冲液。加入130μL DMSO至JC-1染剂(冻干)中，以形成JC-1储备溶液。然后，再以1X分析缓冲液稀释JC-1储备溶液，以形成JC-1工作试剂(JC-1workingsolution；即JC-1粒线体特异性染剂)。稀释倍率为JC-1储备溶液比1X分析缓冲液为1：100。
胰蛋白酶：10X Trypsin-EDTA(购自Gibco，产品编号15400-054)。
流式细胞仪：购自BD Accuri公司。
CO2培养箱：购自ASTEC，产品编号SCA-165DS。
测试流程：
测试将会分为实验组以及空白组(未添加黑钻苹果萃取物的组别)二组进行，各组分别进行二重复试验：
将皮肤纤维细胞以每孔1×105个的方式，接种于每孔含2mL细胞培养基之6孔培养盘中于CO2培养箱(环境含5％CO2并且温度为37℃)中培养24小时以待细胞贴附。
接着，将培养盘的各孔中的培养基更换成2mL实验培养基。其中，实验组的实验培养基为含有1mg/mL的范例一制得的黑钻苹果萃取物的细胞培养基，空白组的实验培养基为单纯的细胞培养基(即不含黑钻苹果萃取物)。
将培养盘置于CO2培养箱中培养24小时(环境含5％ CO2并且温度为37℃)。
移除培养盘中的实验培养基并以1mL的1X PBS溶液润洗2次。
将200μL胰蛋白酶加至每孔中并在暗处反应5分钟。反应后，添加细胞培养基终止反应。将各孔中之皮肤纤维细胞与细胞培养基收集至分别对应的1.5mL离心管内，并将含有皮肤纤维细胞与细胞培养基之离心管以400xg离心5分钟。
于离心后移除上清液，再以1X PBS溶液润洗1次，再以400xg离心5分钟。
于离心后移除各离心管中的上清液并加入100μL的JC-1工作试剂至各离心管并且充分混合后，在避光静置15分钟。
15分钟后，将各离心管以400xg离心5分钟。
于离心后，移除各离心管中的上清液、以1mL的1X PBS溶液回溶各试管中的细胞沉淀物并以400xg离心5分钟。
于离心后，移除各离心管中的上清液、以1mL的1X PBS溶液回溶各离心管中的细胞沉淀物并以400xg离心5分钟。
于离心后，移除各离心管中的上清液、以500μL的添加有2％ FBS的1X PBS重新悬浮细胞，以得到待测细胞液。
以流式细胞仪量(设定激发光：488nm；散射光：527nm&590nm)测各孔的待检测皮肤纤维细胞液中细胞粒线体的膜电位，以进行粒线体活性分析。因实验系进行二重复，故将各组的二重复实验之结果平均以得平均值，然后以空白组的平均值为100％之相对JC-1聚集量，将实验组的平均值换算为相对JC-1聚集量，如图1所示。
于此，空白组与实验组的测量结果之间的统计学显著差异是以学生t检验(student t-test)统计分析得到。(图式中「*」代表在与空白组比较下其p值小于0.05、「**」代表在与空白组比较下其p值小于0.01，以及「***」代表在与空白组比较下其p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。
参阅图1，其为经黑钻苹果萃取物处理之实验组与未经处理之空白组之JC-1聚集相对量比较直方图。可知，在空白组的皮肤纤维细胞并未经过任何处理，也就是指其在正常的生理代谢情况下，设定其粒线体活性为100％。相对于空白组，实验组之相对JC-1聚集量约为176.05％。换言之，与空白组相较之下，实验组的皮肤纤维细胞的粒线体活性提升76.05％。显示黑钻苹果萃取物可提升皮肤纤维细胞之粒线体活性，而达到提升皮肤纤维细胞活性之效果。
范例三：黑钻苹果萃取物促进皮肤纤维细胞增生测试
本例以酵素免疫分析仪(ELISA reader)评估人类皮肤纤维母细胞CCD-966sk经黑钻苹果萃取物处理后，其细胞数量的变化。
所用材料与仪器，如下：
细胞株：人类皮肤纤维母细胞(human fibroblast cells，CCD-996SK)(后续简称皮肤纤维细胞，寄存编号BCRC 60153)。
细胞培养基：最低限度基本培养基(minimum essential medium，简称MEM培养基)(购自Gibco，产品编号11095080)额外添加成分使其含有10vol％胎牛血清(后续简称FBS)(购自Gibco，产品编号10437-028)、1％青霉素-链霉素(购自Gibco，产品编号15140122)、1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate，购自Gibco，产品编号11360-070)、1.5g/L碳酸氢钠(sodium bicarbonate，购自Sigma，产品编号S5761-500G)及0.1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid solution，购自Gibco，产品编号11140050)所配制而成。
细胞增殖酵素结合免疫吸附分析法相关试剂(购自罗氏Roche，型号11647229001)，包括：浓度10μM的溴化脱氧尿苷试剂(Bromodeoxyuridine,后续称BrdU试剂)、细胞固定溶液(FixDenat)、1XPBS缓冲液、抗BrdU-POD工作溶液(又称抗体偶联物antibody conjugate)。
测试流程：
以每孔3000个细胞殖入96孔盘，并于37℃下培育2小时后，将细胞分为三组，分别为空白组、阳性对照组及实验组。每孔添加10μL的BrdU试剂和1mg/mL的测试样品后，培养24小时得到各组培养液。
其中，空白组不添加任何测试样品，实验组添加有1mg/mL范例一所制得的黑钻苹果萃取物，阳性对照组添加10％的胎牛血清。
各组培养液去除上清液后，加入200μL的细胞固定溶液，室温下处理30分钟。
去除细胞固定溶液后，使用1XPBS洗涤一次。接着加入每孔100μL的抗BrdU-POD工作溶液，室温下处理90分钟。
之后，去除抗BrdU-POD工作溶液后，使用200到300μL的洗涤液充份冲洗三次后，去除洗涤液再加入100μL的底物溶液(substrate solution)，室温下处理15分钟。
接者，每孔加入25μL的1M的H2SO4并处理10分钟，之后在300rpm的振动器上振动1分钟。
最终，并于450nm的波长下以ELISA读取仪读取各孔的吸光值(OD450nm)。经过吸光值的比较换算并乘回稀释倍数，在设定空白组的细胞数量为100％时，换算实验组的细胞数量，结果如图2所示。
于此，所得结果利用Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显著差异，如图2所示(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。
请参阅图2。相较于空白组(即其相对细胞数量视为100％)，实验组的相对皮肤纤维细胞数量为225.93％。换言之，实验组的相对皮肤纤维细胞增生数量相对于空白组明显多达二倍以上。由此可知，黑钻苹果萃取物能有效促进皮肤纤维细胞增生，而皮肤纤维母细胞会分泌胶原蛋白，更有助于提升肌肤的支撑及弹性。于此，阳性对照组出现正常增生的预期结果，则可排除实验操作上的误失。
范例四：黑钻苹果萃取物促进伤口愈合的测试
于此，培养人类皮肤纤维细胞单层(cell monolayer)后再以尖锐物于细胞单层创造伤口，以测定细胞经黑钻苹果萃取物处理后其伤口的愈合变化状态。基于创伤发生时为了修补伤口并避免感染，会产生显著的细胞迁移效应，于此，采用伤口愈合试验(Woundhealing assay)这是观察细胞迁移(Cell migration)的典型试验之一。
所用材料与仪器，如下：
细胞株：人类皮肤纤维母细胞CCD-966sk(后续简称皮肤纤维细胞，寄存编号BCRC60153)。
细胞培养基：90％的添加有「Earle’s平衡盐」最低限度基本培养基(minimumessential medium(Eagle)in Earle's BSS)额外添加成分使其含有0.1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid solution)、1.5g/L碳酸氢钠(sodium bicarbonate)、1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)以及10％胎牛血清(后续简称FBS)(购自Gibco)所配制而成。
薄膜细胞培养皿：又称插入式细胞培养盘或插入式细胞培养容器(Culture-Insert well)(SPLInsertTM)。
测试流程：
先将薄膜细胞培养皿置入24孔盘的各孔内，再将皮肤纤维细胞以1.5×105cells/well的密度种入各孔，添加细胞培养基后于37℃下培育过夜以形成细胞单层(cellmonolayer)。
将薄膜细胞培养皿从24孔盘的各孔中移除后，在各孔中能观察到细胞单层上有一道大小大致相同的细胞间隙，除去细胞培养基并以使用1XPBS洗涤一次。
将润洗后的皮肤纤维细胞分为三组(下述流程每组进行三重复)，并添加实验培养基，然后先利用显微镜(ZEISS)及摄像机取得细胞影像以观察及记录皮肤纤维细胞的迁移距离(即0小时的间隙面积(T0))，再于37℃下额外培养6个小时。并且，以0小时的间隙面积(T0)做为初始的伤口面积，如图3所示，以此时的状态作为基础水平(即第0小时)。
于此，实验组的实验培养基为添加范例一制得的黑钻苹果萃取物之2mL细胞培养基(即黑钻苹果萃取物的最终浓度为1mg/mL)。空白组的实验培养基为单纯的2mL细胞培养基(即不含黑钻苹果萃取物)。阳性对照组的实验培养基为额外添加10％FBS的2mL细胞培养基(不含黑钻苹果萃取物)。
在培养第6小时使用显微镜观察并记录伤口状态影像进行初步观察，此时取得的伤口状态影像如图3所示。空白组的伤口大小在第0小时与第6小时并无肉眼可见的区别，而实验组与阳性对照组的伤口大小具有肉眼可见的缩小，显示可排除实验操作上的误失，继续进行观察。
后续持续于37℃下培养16小时后，再使用显微镜观察并记录伤口状态影像，将影像以Image J软件分析迁移百分比(migration area)，并以空白组的细胞愈合率为100％为基础，换算得到实验组的细胞愈合率，如图4所示。
于此，所得结果利用Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显著差异，如图4所示(图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。
请参阅图4。相较于空白组(即其相对细胞数量视为100％)，实验组的相对皮肤纤维细胞愈合率148.91％。换言之，实验组的相对皮肤纤维细胞增生数量相对于空白组明显多达48.91％。由此可知，黑钻苹果萃取物能有效促进皮肤纤维细胞的伤口愈合。于此，阳性对照组出现正常愈合的预期结果，则可排除实验操作上的误失。
范例五：黑钻苹果萃取物促进胶原蛋白分泌测试
所用材料与仪器，如下：
细胞株：人类皮肤纤维母细胞CCD-966Sk(Human skin fibroblast CCD-966Sk)，取自美国标准生物品收藏中心(简称ATCC)保存编号Cat.CRL-1881，以下简称皮肤纤维细胞。
细胞培养基：为添加有10％的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，产品编号10437-028)、1％的青霉素-链霉素(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco公司，产品编号15140122)及1mM的丙酮酸钠(sodium pyruvate，Gibco公司，产品编号11360-070)的最低限度必需培养基(Minimum essential medium，简称MEM，以下称MEM培养基)(Gibco公司，产品编号11095080)。
可溶性胶原蛋白检测套组(Biocolor公司；编号产品编号S1000)。
溶剂：1XDPBS(Gibco公司，产品编号14200-075)。
二氧化碳培养箱(ASTEC公司，产品编号14200-075)。
测试流程：
首先，以2×104个皮肤纤维细胞的密度植入至24孔细胞培养盘中，于37℃下的二氧化碳培养箱中培养24小时。待纤维母细胞贴附于细胞培养盘的底部后，以1XDPBS清洗一次。
将皮肤纤维细胞分为实验组及空白组。各孔加入500μL实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养48小时。
其中，实验组的测试培养基为含有0.125％的范例一中所得到的黑钻苹果萃取物的细胞培养基。空白组的实验培养基为单纯的细胞培养基。
收集1mL的上述各组的产品编号，并以可溶性胶原蛋白检测套组处理以形成各组的待测溶液，接着以分光亮度计测量其在555nm下之各组吸光值，测试结果如图5所示。
于此，显示的胶原蛋白分泌量采相对倍率呈现，其中使用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。
请参阅图5。将空白组的数值视为100％。相较于空白组，实验组的胶原蛋白的相对分泌量为468.65％，具有统计学上的显著差异。可知，黑钻苹果萃取物能显著促进人类皮肤纤维母细胞大量分泌胶原蛋白，并显著的提高达正常分泌的四倍以上。由此可知，黑钻苹果萃取物能使人类肌肤细胞能有效地分泌胶原蛋白，进而改善肌肤状态。
范例六：黑钻苹果萃取物对促进弹力蛋白分泌测试
材料与仪器：
细胞株：人类皮肤纤维母细胞CCD-966Sk(Human skin fibroblast CCD-966Sk)，取自美国标准生物品收藏中心(简称ATCC)保存编号Cat.CRL-1881，以下简称皮肤纤维细胞。
细胞培养基：90％的添加有Earle’s平衡盐的最低限度基本培养基(minimumessential medium(Eagle)in Earle's BSS)额外添加成分使其含有0.1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid solution)、1.5g/L碳酸氢钠(sodium bicarbonate)、1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)以及10％胎牛血清(后续简称FBS)(购自Gibco)所配制而成。
RNA萃取试剂套组，购自Genemark公司。
III反转录酶，购自Invitrogene公司。
ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，购自Thermo Fisher Scientific公司。
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)Kit，购自KAPA Biosystems公司，产品编号KK4600。
测试流程：
将皮肤纤维细胞以每孔1×105个的密度，接种于每孔含2mL的培养基的6孔培养盘中，并在37℃下培养24小时。
于培养后，将皮肤纤维细胞分为以下二组：空白组、实验组。其中，空白组的培养液不含任何萃取物，实验组的培养液含有0.5mg/mL的范例一制得的黑钻苹果萃取物。各组进行三重复，并于37℃下，培养24小时。
移除培养后的空白组、实验组的培养液，并以PBS进行润洗。
于润洗后，以RNA萃取试剂套组的细胞裂解液破开各组的HPEK-50细胞的细胞膜，以形成细胞溶液。
使用RNA萃取试剂套组分别萃取各组的细胞溶液内的RNA。
每组取2000纳克(ng)所萃取出的RNA作为模板，藉由III反转录酶将萃取出的RNA反转录为相应的cDNA。
使用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以KAPA SYBR FAST qPCRMaster Mix(2X)Kit及表1的组合引子将cDNA分别进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)，以观察空白组及实验组的HPEK-50细胞的各种目标基因的表现量及其解链曲线(meltingcurve)。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环。
使用方法测定目标基因的相对表现量。所谓相对表现量定义为实验组之目标基因的RNA表现量相对于空白组之同一基因的RNA表现量的倍数变化。/>方法以TBP基因的循环阈值作为内部对照之参考基因的循环阈值(Ct)，按照以下公式计算倍数变化：
△Ct＝Ct实验组之目标基因/空白组之目标基因-CtGAPDH
△△Ct＝△Ct实验组之目标基因-△Ct空白组之目标基因
表1
引子名称 序列编号 序列
ELN-F SEQ ID NO:1 GCTAAGGCAGCCAAGTATGG
ELN-R SEQ ID NO:2 CACCTGGGACAACTGGAATC
FBN1-F SEQ ID NO:3 TTTAGCGTCCTACACGAGCC
FBN1-R SEQ ID NO:4 CCATCCAGGGCAACAGTAAGC
于此，空白组与实验组的测量结果之间的统计学显著差异是以学生t检验(student t-test)统计分析得到。(图式中「*」代表在与空白组比较下其p值小于0.05、「**」代表在与空白组比较下其p值小于0.01，以及「***」代表在与空白组比较下其p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。
测试结果请参阅图6。在空白组的皮肤纤维细胞并未经过任何处理，也就是指其在正常的生理代谢情况下，设定其基因的表现量为1倍。相对于空白组，ELN基因实验组(黑钻苹果萃取物)的ELN基因的表现量为2.62倍，而FBN1基因实验组(黑钻苹果萃取物)的FBN1基因的表现量为1.89倍。
由此可知，黑钻苹果萃取物能明显提升ELN基因与FBN1基因的表现量，以达到提升弹力蛋白量的效果。
范例七：黑钻苹果萃取物对促进玻尿酸相关基因表现测试
材料与仪器：
人类皮肤纤维母细胞CCD-966Sk(Human skin fibroblast CCD-966Sk)，取自美国标准生物品收藏中心(简称ATCC)保存编号Cat.CRL-1881，以下简称皮肤纤维细胞。
细胞培养基：90％的添加有Earle’s平衡盐的最低限度基本培养基(minimumessential medium(Eagle)in Earle's BSS)额外添加成分使其含有0.1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid solution)、1.5g/L碳酸氢钠(sodium bicarbonate)、1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)以及10％胎牛血清(后续简称FBS)(购自Gibco)所配制而成。
RNA萃取试剂套组，购自Genemark公司。
III反转录酶，购自Invitrogene公司，产品编号18080-044。
ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，购自Thermo Fisher Scientific公司。
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X)Kit，购自KAPA Biosystems公司，产品编号KK4600。
测试流程：
将皮肤纤维细胞以每孔1×105个的密度，接种于每孔含2mL的培养基的6孔培养盘中，并在37℃下培养24小时。
于培养后，将HPEK-50细胞分为以下二组：空白组、实验组。其中，空白组的培养液不含任何萃取物，实验组的培养液含有1mg/mL的范例一制得的黑钻苹果萃取物。各组进行三重复，并于37℃下，培养24小时。
移除培养后的空白组、实验组的培养液，并以PBS进行润洗。
于润洗后，以RNA萃取试剂套组的细胞裂解液破开各组的HPEK-50细胞的细胞膜，以形成细胞溶液。
使用RNA萃取试剂套组分别萃取各组的细胞溶液内的RNA。
每组取2000纳克(ng)所萃取出的RNA作为模板，藉由III反转录酶将萃取出的RNA反转录为相应的cDNA。
使用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system，以KAPA SYBR FAST qPCRMaster Mix(2X)Kit及表2的组合引子将cDNA分别进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)，以观察空白组及实验组的HPEK-50细胞的各种目标基因的表现量及其解链曲线(meltingcurve)。定量实时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个循环。
使用方法测定目标基因的相对表现量。所谓相对表现量定义为实验组之目标基因的RNA表现量相对于空白组之同一基因的RNA表现量的倍数变化。/>方法以TBP基因的循环阈值作为内部对照之参考基因的循环阈值(Ct)，按照以下公式计算倍数变化：
△Ct＝Ct实验组之目标基因/空白组之目标基因-CtGAPDH
△△Ct＝△Ct实验组之目标基因-△Ct空白组之目标基因
表2
引子名称 序列编号 序列
HAS2-F SEQ ID NO:5 AAGAACAACTTCCACGAAAAGGG
HAS2-R SEQ ID NO:6 GGCTGGGTCAAGCATAGTGT
HAS3-F SEQ ID NO:7 CGCAGCAACTTCCATGAGG
HAS3-R SEQ ID NO:8 AGTCGCACACCTGGATGTAGT
空白组与实验组的测量结果之间的统计学显著差异是以学生t检验(student t-test)统计分析得到。(图式中「*」代表在与空白组比较下其p值小于0.05、「**」代表在与空白组比较下其p值小于0.01，以及「***」代表在与空白组比较下其p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著)。
测试结果请参阅图7。在空白组的皮肤纤维细胞并未经过任何处理，也就是指其在正常的生理代谢情况下，设定其基因的表现量为1倍。相对于空白组，HAS2基因实验组(黑钻苹果萃取物)的HAS2基因的表现量为4.35倍，而HAS3基因实验组(黑钻苹果萃取物)的HAS3基因的表现量为1.82倍。
由此可知，黑钻苹果萃取物能明显提升HAS2基因与HAS3基因的表现量，藉以提升肌肤玻尿酸含量。
范例八：黑钻苹果萃取物的人体测试
受试者：8位受试者。其中，各受试者为年满20岁之成年人。
测试项目：肌肤皱纹量及肌肤含水量。
其中，肌肤皱纹量(Wrinkles)：使用美国Canfield所贩卖之VISIA高阶数字肤质检测仪进行检测，透过高分辨率之相机镜头对同一受试者在饮用前与饮用后的面部肌肤，尤其是眼周的区域进行拍摄，藉由标准白光照射、检测皮肤细纹的变化，即可检测纹理位置并得到一数值，可代表皮肤的平滑程度。于量测后，将控制组的皱纹量表现量作为基准(即控制组的之皱纹量的相对表现率为100％)，计算实验组的皮肤皱纹量的相对表现率(％)。
其中，肌肤含水量(Hydration)：使用购自德国Courage+Khazaka electronic公司之肌肤含水量检测探头CM825(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)对同受试者的面部肌肤进行检测。该检测探头系基于电容的原理进行测量。当水分含量发生变化时，皮肤的电容值亦发生变化，故可通过测定皮肤电容值，分析皮肤表面的含水量。
测试方式：
令8位受试者每日食用包含3克的范例一所制得的黑钻苹果萃取物的饮品，并且连续食用4周，其他饮食作息不改变。
于食用前(即第0周)所测得的数据称为空白组，食用4周后(即第4周)所测得的数据称为实验组。
测试结果：
下面图式中显示的以所有受试者的平均值，并以第0周的数据为基础视为100％，换算得各组别相对值。其中，使用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异，以得到其p值。并且，于图中，以「*」是指其p值小于0.05。
请参阅图8。经过4周的每日服用黑钻苹果萃取物后，8位实验组受试者的平均肌肤皱纹从第0周的100％(空白组)减少到90.3％(实验组)。
请参阅图9。经过4周的每日服用黑钻苹果萃取物后，8位实验组受试者的平均肌肤含水量从第0周的100％(空白组)提升到113.4％(实验组)。
综上所述，任一实施例的黑钻苹果萃取物可用以制备调理肌肤状态的组合物。在一些实施例中，黑钻苹果萃取物可具有下列至少一种作用：促进肌肤细胞粒线体活性、促进皮肤纤维细胞增生、促进皮肤伤口愈合、促进皮肤胶原蛋白含量提升、促进皮肤弹力蛋白含量提升、促进皮肤玻尿酸含量提升、减少皮肤皱纹量、提升皮肤含水量。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种黑钻苹果萃取物的用途，其特征在于，其是用于制备调理肌肤状态的组合物，该黑钻苹果萃取物是以水为溶剂提取自苹果Malus pumila植株的全果实。
2.如权利要求1所述的用途，其中该黑钻苹果萃取物促进肌肤细胞粒线体活性。
3.如权利要求1所述的用途，其中该黑钻苹果萃取物促进皮肤纤维细胞增生。
4.如权利要求1所述的用途，其中该黑钻苹果萃取物促进皮肤伤口愈合。
5.如权利要求1所述的用途，其中该黑钻苹果萃取物促进皮肤胶原蛋白含量提升。
6.如权利要求1所述的用途，其中该黑钻苹果萃取物促进皮肤弹力蛋白含量提升。
7.如权利要求1所述的用途，其中该黑钻苹果萃取物促进皮肤玻尿酸含量提升。
8.如权利要求1所述的用途，其中该黑钻苹果萃取物减少皮肤皱纹量。
9.如权利要求1所述的用途，其中该黑钻苹果萃取物提升皮肤含水量。
10.如权利要求1至9中任一项所述的用途，其中该组合物为一食品组合物，且该组合物内至少包含该黑钻苹果萃取物3克/日。
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