CN111973647A - 金银花发酵物的制备方法及其改善皮肤外观与抗老化的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物提取物领域，尤其是关于金银花发酵物的制备方法及其改善皮肤外观与抗老化的用途。本发明提供一种用于推迟老化的金银花发酵物及其制备方法，所述金银花发酵物是将金银花经由溶剂萃取所得的金银花萃取物，再将所述金银花水萃取物经由酵母菌、乳酸菌、及醋酸菌依序进行三阶段发酵而获得。本发明还提供一种金银花发酵物用于制备提升抗老化能力的组合物的用途。本发明的制备方法能提升金银花萃取物中总多酚的含量、还原活性、抗氧化活性、清除醣化终产物的能力、且能显著提升皮肤细胞中SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、及Ubl‑5基因的表现量，并同时降低PARP2基因的表现量。

Description

金银花发酵物的制备方法及其改善皮肤外观与抗老化的用途
技术领域
本发明涉及植物提取物领域，尤其是关于金银花发酵物的制备方法及其改善皮肤外观与抗老化的用途。
背景技术
表皮层为皮肤的最外层，由外往内依序为角质层、颗粒层、有棘层及基底层，表皮层主要由基底层中未分化的圆柱型角质细胞持续向上进行分化形成，此过程称为角质化。角质细胞内含水量高，随着细胞向上代谢分化，角质细胞形状会逐渐变成扁平状，且细胞核及胞器开始退化萎缩，并在角质层形成不具细胞核与胞器的死细胞。表皮层的主要功能为使皮肤保水，并形成皮肤屏障以抵御各种外来伤害，其中表皮层最外层由一弱酸性的皮脂膜以及如砖墙结构的角质层所构成，此屏障能锁住皮肤的水分和油脂、抵抗皮肤表面病菌入侵，及对抗外界异物及紫外光等伤害，对人体有非常重要的保护作用。
表皮层中的角质层，其角质细胞虽然为死细胞，但其主要成分为角蛋白(keratin)，角蛋白能吸收水分使皮肤保持湿润，角质细胞也会分泌如玻尿酸等物质作为细胞间质，以维持表皮层皮肤屏障的结构完整，以防止皮肤水分散失及形成完整防护。当皮肤接触过冷或过热的环境以及照射紫外光等刺激，会导致角质细胞无法维持正常的代谢循环，且皮肤保水能力也会下降，并导致皮肤表皮层屏障受损，让皮肤变得粗糙、干燥脱屑、脆弱易受刺激、敏感泛红，因此角质层的健康与保水能力对于抵御外来伤害着实非常重要。
然而，随着年纪渐长皮肤会逐渐地老化(Ageing)，皮肤老化形成原因与过程非常地复杂，且牵涉了无数的生理现象，其中紫外线伤害、自由基伤害、胶原蛋白减少、细胞更新减缓、异常细胞的出现、皮肤脂肪减少、细胞间质缺乏、细胞生长休止、荷尔蒙下降等是较常见的因素。但截至目前为止，市售的皮肤抗老化产品大多只能着手在增加抗氧化活性，并无法直接且有效地改善或推迟皮肤老化的发生。
醣化终产物(Advanced Glycation End Products,AGEs)是一群高度氧化的化合物，因此被认为是一种糖毒素(Glycotoxin)，研究显示醣化终产物会与细胞表面的接受器结合，而改变其结构与功能，并促使细胞的氧化压力与发炎反应增加，更与糖尿病、动脉硬化及肾脏慢性疾病等的形成关系密不可分。而除了人体正常代谢过程中会产生醣化终产物外，许多加工食品中也会含有醣化终产物，研究也已指出避免从食物摄取醣化终产物，能有助于推迟慢性疾病与老化的进展。
综合上面所述，为了改善因角质细胞受损、保水能力下降、以及皮肤老化所导致皮肤变得脆弱、易敏等问题，开发一种能直接且有效地改善或推迟皮肤老化发生，同时又能有效维持角质细胞的正常生理代谢、维持角质层结构完整的组合物、及增加抗醣化活性的有效成分组成的，着实有其必要性。
发明内容
缘此，本发明的一目的在提供一种用于推迟老化的金银花发酵物，其是将一金银花经由一溶剂萃取所得的金银花萃取物，再将该金银花水萃取物经由一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、一乳酸菌(Lactobacillus plantarum)、及一醋酸菌(Acetobacter aceti)依序进行三阶段发酵而获得。
本发明的另一目的在提供一种如前所述的金银花发酵物用于制备提升皮肤细胞中超氧化物歧化酶3(Superoxide dismutase 3,SOD3)基因、帕金森氏症少年蛋白(Parkinson juvenile disease protein,Parkin)基因、自噬作用相关基因1 (Autophagy-related gene 1,Atg1)基因、Ubl基因系泛素样蛋白5(Ubiquitin-like protein 5,Ubl-5)基因、及抑制皮肤细胞中蛋白质聚(ADP-核糖)聚合酶2 (Poly(ADP-Ribose)Polymerase 2,PARP2)基因表现量的组合物的用途。
本发明的又一目的在提供一种金银花发酵物用于制备一提升抗老化能力的组合物的用途。
本发明的另一目的在提供一种金银花发酵物的制备方法，是包含：将一金银花经由一溶剂萃取所得的金银花萃取物，再将该金银花萃取物经由一酵母菌 (Saccharomycescerevisiae)、一乳酸菌(Lactobacillus plantarum)、及一醋酸菌(Acetobacter aceti)依序进行三阶段发酵而获得。
在本发明的一实施例中，根据降低铁氧化的能力(Ferric reducing antioxidantpower,FRAP)的比色法，该金银花发酵物还原铁离子(Fe3+)的能力相当于300-400μg/mL抗坏血酸还原铁离子(Fe3+)的能力。
在本发明又的一实施例中，该金银花发酵物是进一步提升抗氧化活性和提升抗醣化活性。
在本发明的又一实施例中，该金银花发酵物是促进SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、及Ubl-5基因的表现量；并是抑制PARP2基因的表现量。
在本发明的又一实施例中，该金银花发酵物是提升皮肤细胞中NAD+的浓度、维持细胞中分解老废蛋白质的正常机能、增进细胞中废物降解、增进细胞中自噬作用的正常运作、提升修护DNA损伤的能力、及/或促进粒线体代谢的活性。
在本发明的又一实施例中，该金银花发酵物是提升抗氧化活性、提升还原活性、提升抗醣化活性、及/或提升总多酚含量。
在本发明的又一实施例中，该金银花发酵物的有效浓度为至少0.5％(v/v)。
在本发明的另一实施例中，该金银花萃取物是以水为溶剂萃取该金银花所获得；且该金银花及水是以1:10-20(w/w)比例混合；该酵母菌的添加量为 0.01-0.5％(w/w)；该乳酸菌的添加量为0.01-0.25％(w/w)；该醋酸菌的添加量为3-10％(w/w)；且该酵母菌、该乳酸菌、及该醋酸菌的发酵时间比为1-2.5:1-3: 3-10。
本发明将金银花萃取物以酵母菌、乳酸菌、及醋酸菌进行三段式发酵所得的金银花发酵物，能藉由该微生物发酵制程显著提高本发明金银花发酵物中总多酚的含量、显著提高本发明金银花发酵物的还原活性、显著提高本发明金银花发酵物于皮肤细胞的抗氧化活性、显著提升本发明金银花发酵物清除醣化终产物的能力、且能显著提高本发明金银花发酵物提升细胞中SOD3基因、Parkin 基因、Atg1基因、及Ubl-5基因表现量，并同时降低PARP2基因表现量的能力；以达到增强抗氧化及抗醣化的功效，有助于推迟慢性疾病与老化的进展，且能提升细胞中NAD+的浓度、维持细胞中分解老废蛋白质的正常机能、增进细胞中废物降解、及增进细胞中自噬作用的正常运作、并能提升修护DNA损伤、及促进粒线体代谢的活性，以延长细胞的寿命，达到抗老化的功效。因此，本发明的金银花发酵物可用于制备改善皮肤外观及抗老化的组合物的用途，且该组合物是一医药品、一保养品、或一食品，可藉由口服、涂抹等方式给予一个体。
以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1为本发明的一实施例的三段式发酵方法提升金银花发酵物中总多酚的功效的柱形图；
图2为本发明的一实施例的金银花发酵物还原活性的功效的柱形图；
图3为本发明的一实施例的金银花发酵物于提升皮肤细胞抗氧化活性的功效的柱形图；**p<0.01；
图4为本发明的一实施例的金银花发酵物抗醣化活性的功效的柱形图；
图5为本发明的一实施例的金银花发酵物提升SOD3基因表现量的效果的柱形图；*p<0.05；**p<0.01；
图6为本发明的一实施例的金银花发酵物提升Parkin基因表现量的效果的柱形图；*p<0.05；**p<0.01；
图7为本发明的一实施例的金银花发酵物提升Atg1基因表现量的效果的柱形图；*p<0.05；**p<0.01；
图8为本发明的一实施例的金银花发酵物降低PARP2基因、及提升Ubl-5 基因表现量的效果的柱形图；*p<0.05；**p<0.01。
具体实施方式
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，个此之间的差异以学生t检验(student's t-test)分析。
金银花又称忍冬、银藤、二宝藤、蜜桷藤、通灵草、甜藤等别名。金银花的花成对生长，子房相连，夏秋开花，花初开为白色，后转为黄色，随着时间的增加会逐渐变黄，因有白色与黄色混杂其间故称为金银花，采其花苞晒干，即为中药材的金银花，俗称忍冬花。有解毒、退火、消炎的功效。
如本文中所使用的，用语「金银花发酵物」意为金银花与溶剂以1:10-20 (w/w)比例经一特定时间与温度萃取而得的金银花萃取物，再以酵母菌、乳酸菌、及醋酸菌依序进行一三段式发酵而获得，其中该酵母菌的添加量为 0.01-0.5％(w/w)；该乳酸菌的添加量为0.01-0.25％(w/w)；该醋酸菌的添加量为 3-10％(w/w)。
本文所述的「有效浓度」是表示能有效提高还原活性、抗氧化活性、清除醣化终产物的能力、提升细胞中SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、及Ubl-5 基因表现量，并同时降低PARP2基因表现量所需本发明的金银花发酵物的浓度。有效浓度依所作用的对象而可能不同，但可藉由例如剂量递增试验(dose escalation)以实验决定其有效浓度。
依据本发明，有关萃取的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，有关微生物发酵反应的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)以及类似物。
依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂 (excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂 (lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。
依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。
依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂 (liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆 (serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve) 以及绷带(bandage)。
依据本发明，该外部制剂是藉由将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。
依据本发明，该基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶 (petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin) 以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如
Figure RE-GDA0002441494280000061
974P(
Figure RE-GDA0002441494280000062
974P)、微结晶纤维素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂 (anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，保养品可进一步包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含有一或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansingproducts)等。
依据本发明，保养品亦可与一或多种选自于下列的已知活性的外用剂 (externaluse agents)一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸 (tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、抗发炎剂 (anti-inflammatoryagents)、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[诸如芦荟萃取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂 (antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。
依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。
本发明提供一种金银花发酵物用于改善皮肤外观及抗老化的用途，本发明的金银花发酵物是将金银花与溶剂以1:10-20(w/w)比例经一特定时间与温度萃取而得的金银花萃取物，再以酵母菌、乳酸菌、及醋酸菌依序进行三段式发酵而获得，其中该酵母菌为BCRC20271的菌株、该乳酸菌为BCRC910805的菌株、该醋酸菌为BCRC11688的菌株。本发明的金银花发酵物可有效提高还原活性、抗氧化活性、清除醣化终产物的能力、提升细胞中SOD3基因、Parkin 基因、Atg1基因、及Ubl-5基因表现量，并同时降低PARP2基因表现量。
同时，本发明用于改善皮肤外观及抗老化的组合物，亦可包含一有效量的金银花发酵物及一医药上可接受的载体，该组合物是一医药品、一保养品、或一食品。
以下将详细说明本发明金银花发酵物的详细制备方法、本发明三段式发酵方法提升该金银花发酵物中总多酚的功效的测试、本发明三段式发酵方法提升该金银花发酵物还原活性的功效的测试、该金银花发酵物提升皮肤细胞抗氧化活性的功效的测试、本发明三段式发酵方法提升该金银花发酵物抗醣化活性的功效的测试、及该金银花发酵物调控SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、PARP2 基因、及Ubl-5基因表现量的功效的测试，以证实本发明的金银花发酵物具有提高还原活性、抗氧化活性、清除醣化终产物的能力、提升细胞中SOD3基因、 Parkin基因、Atg1基因、及Ubl-5基因表现量，并同时降低PARP2基因表现量的功效，有助于推迟慢性疾病与老化的进展，且能提升细胞中NAD+的浓度、维持细胞中分解老废蛋白质的正常机能、增进细胞中废物降解、及增进细胞中自噬作用的正常运作、并能提升修护DNA损伤、及促进粒线体代谢的活性，以延长细胞的寿命，达到抗老化的功效。
实施例1 本发明的金银花发酵物的制备方法
在本发明一实施例中，将金银花的花与水、醇、或醇水混合物的萃取溶剂以1:10-20(w/w)的比例均匀混合，萃取溶剂较佳为水，并于50-100℃下同时灭菌萃取0.5-1.5小时后，根据总重量加入5-10％(w/w)的葡萄糖后，得到一金银花萃取物，再将该金银花萃取物冷却至室温供后续三段式发酵使用，以下列三种菌依序进行发酵：酵母菌、乳酸菌、醋酸菌，此三种菌的发酵顺序无法前后对调，且其发酵时间比为1-2.5:1-3:3-10。在本发明一较佳实施例中，首先于该萃取溶液中植入0.01-0.5％(w/w)的酵母菌(Saccharomycescerevisiae，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC20271)，于25-35℃下进行前发酵1-2.5天，实际时间视发酵状态而异。接着直接植入0.01-0.25％(w/w)的乳酸菌(Lactobacillus plantarum TCI028，专利寄存于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC910805)，于25-35℃下进行后发酵1-3天，实际时间视发酵状态而异。接着再直接植入3-10％(w/w)的醋酸菌(Acetobacter aceti，购买于生物资源保存与研究中心，中国台湾，编号为BCRC11688)，于25-35℃下进行深层发酵3-10天，实际时间视发酵状态而异；其中，该乳酸菌TCI028是已于中国台湾专利申请号第106145146号完成专利寄存。最后在不移除此三种菌的情况下，使用设定的糖度范围2-4°、pH<4、酒精<5％等规格，如检验符合该规格，则判定发酵完成并得到发酵液。接着，将该发酵液于45-70℃进行减压浓缩，并以200-400mesh的网筛进行过滤，再添加40-70％异麦芽寡糖调整规格后，于95-105℃下加热70-90分钟进行灭菌，即得到本发明的金银花发酵物。
实施例2 本发明三段式发酵方法提升金银花发酵物中总多酚的功效
本发明的一实施例为进行本发明的三段式发酵方法提升金银花发酵物中总多酚的功效的测试实验，因此使用Folin-Ciocalteu比色法测定代测物中的总多酚含量；该测定法是利用多酚的抗氧化特性来进行，试剂中磷钨酸 (Phosphotungstic acid)及磷钼酸(Phosphomolybdic acid)被多酚类还原(由Mo6+变为Mo5+)后会生成蓝色化合物(750nm的吸光值)，而该蓝色化合物的深浅与总多酚含量呈正比，因此可用于定量代测物中总多酚的含量。
首先，将没食子酸(Gallic acid，购自Sigma，美国，编号为G7384)作为标准品以制作标准曲线，精密称取10.0g的没食子酸置于10mL的容量瓶中，再加入ddH2O至总体积达10mL，并完成没食子酸的标准品(Gallic acid stock, 1000μg/mL)，接着先将该标准品稀释10倍至浓度为100μg/mL(100μL的 Gallic acid stock和900μL的ddH2O，未使用完的没食子酸的标准品储存于 -20℃下)，接着将该100μg/mL的没食子酸进行系列稀释成0、20、40、60、 80、及100μL/mL的没食子酸(如表一所示)，并分别取100μL的各浓度的标准溶液至10mL的玻璃试管中，再加入500μL的Folin-Ciocalteu的酚试剂(购自Merck，德国，编号为1.09001.0100)混合均匀并静置3分钟后，加入400μL 的7.5％的碳酸钠(Sodiumcarbonate，将7.5g的无水碳酸钠定量至100mL的 ddH2O中，其中该无水碳酸钠是购自Sigma，美国，编号为31432，)均匀混合后静置反应30-60分钟，较佳为30分钟，再以震荡(Vortex)混合静置至确定无气泡后，取出200μL的各管反应溶液置于96孔培养板中，并测量其于750nm 的吸光值，以绘制标准溶液的回归曲线公式。
表一、系列稀释没食子酸标准品的配方
Figure RE-GDA0002441494280000101
接着，分别取100μL的实施例1所述的金银花萃取物、及本发明的金银花发酵物于10mL的玻璃试管中，再分别加入500μL的Folin-Ciocalteu的酚试剂混合均匀并静置3分钟后，加入400μL的7.5％的碳酸钠均匀混合后静置反应30-60分钟，较佳为30分钟，再以震荡(Vortex)混合静置至确定无气泡后，取出200μL的各管反应溶液置于96孔培养板中，测量其于750nm的吸光值，并以上述的标准溶液的回归曲线公式，以内差法算出浓度后，再回乘稀释倍数以取得原本金银花萃取物、及本发明的金银花发酵物中总多酚的浓度。
本发明的三段式发酵方法提升本发明的金银花发酵物中总多酚的功效的测试结果如图1所示。金银花水萃取物仅含有853.75μg/mL的总多酚含量，本发明的金银花发酵物中总多分含量却显著的高达1131.92μg/mL，为金银花水萃取物的1.34倍。此结果显示，本发明的三段式发酵方法可显著提高本发明金银花发酵物中总多酚的含量，以达到提升功效成份，增强保健抗氧化功效的目的。
实施例3 本发明三段式发酵方法提升金银花发酵物还原活性的功效
本发明的一实施例为进行本发明的三段式发酵方法提升本发明的金银花发酵物还原活性的功效的测试实验，因此使用降低铁氧化的能力(Ferric reducing antioxidantpower,FRAP)的比色法，以测定待测物的抗氧化能力；其中，是利用具有还原活性的待测物能够将铁离子(Fe3+)还原成亚铁离子(Fe2+)，而溶液颜色回由红褐色转变为绿色，而该绿色化合物的深浅与还原能力呈正比，因此可用于定量代测物的还原活性。
首先，利用已知具有还原活性的抗坏血酸制作标准曲线。精密秤取10mL 的L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid,Vit C,维他命C，购自Sigma，美国，编号 A5960-25g)，置于10mL的容量瓶中，再加入ddH2O制定量至10mL，配置为1 mg/mL的L-抗坏血酸。接着，取1mL配好的L-抗坏血酸置于10mL的容量瓶中，再加入ddH2O制定量至10mL，配置为1μg/mL的L-抗坏血酸，并将该100μg/mL 的L-抗坏血酸进行系列稀释成0、10、20、40、60、80、及100μL/mL的L-抗坏血酸(如表二所示)，并分别取250μL的各浓度的标准溶液至试管中，再各加入 250μL的磷酸盐缓冲溶液(以无水磷酸二氢钠(NaH2PO4，购自J.T.Baker，编号3828-01)及磷酸氢二钠(Na2HPO4，购自Sigma，编号04270)以1:1比例混合所配制而成)以震荡仪(Vortex)混合均匀后，加入250μL的1％的赤血盐 (Potassium ferricyanide,K3Fe(CN)，购自Sigma，编号244023)以震荡仪混合均匀后，于50℃水浴槽中加热20分钟，再加入250μL的10％的三氯醋酸 (Trichloroacetic acid,TCA,CCl3COOH，购自J.T Baker，编号0414-01)以震荡仪混合均匀后，以300g离心10分钟，并注意取出时不要摇晃，接着取出300μL 的各管反应溶液的上清液，在加入300μL的ddH2O及120μL的1％的氯化铁 (FeCl3，购自Alfa Aesar，编号A16231)以震荡仪混合均匀后反应10分钟，并测量其于700nm的吸光值，以绘制标准溶液的回归曲线公式。
表二、系列稀释L-抗坏血酸标准品的配方
浓度(μg/mL) 0 10 20 40 60 80 100
L-抗坏血酸 0μL 10μL 20μL 40μL 60μL 80μL 100μL
接着，分别取25μL的实施例1所述的金银花萃取物、及本发明的金银花发酵物于10mL的玻璃试管中，以ddH2O稀释十倍(1:10稀释)，再分别加入250μL 的磷酸盐缓冲溶液以震荡仪混合均匀后，加入250μL的1％的赤血盐以震荡仪混合均匀后，于50℃水浴槽中加热20分钟，再加入250μL的10％的三氯醋酸以震荡仪混合均匀后，以300g离心10分钟，并注意取出时不要摇晃，接着取出 300μL的各管反应溶液的上清液，在加入300μL的ddH2O及120μL的1％的氯化铁以震荡仪混合均匀后反应10分钟，并测量其于700nm的吸光值，再以上述的标准溶液的回归曲线公式，以内差法算出浓度后，再回乘稀释倍数以取得原本金银花萃取物、及本发明的金银花发酵物的还原能力。
本发明的三段式发酵方法提升本发明的金银花发酵物还原活性的功效的测试结果如图2所示。金银花水萃取物仅含有138.19单位的还原活性，本发明的金银花发酵物的还原活性却显著的高达376.67单位，为金银花水萃取物的 2.73倍。此结果显示，本发明的三段式发酵方法可显著提高本发明金银花发酵物的还原活性，以达到提升功效成份，增强保健抗氧化功效的目的。
实施例4 本发明的金银花发酵物提升皮肤细胞抗氧化活性的功效
本发明的一实施例以人类皮肤纤维母细胞(Human skin fibroblast, CCD-966sk)进行本发明的金银花发酵物于提升皮肤细胞抗氧化活性的功效的测试。其中，该人类皮肤纤维母细胞购自美国典型培养物保藏中心
Figure RE-GDA0002441494280000121
细胞编号为CRL-1881，该细胞是培养于含有10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Gibco，美国)以及90％的Minimum Essential Medium(MEM，购自 Gibco，美国)的培养液中，其中含有1mM的丙酮酸钠(Sodium pyruvate，购自 Gibco，美国)以及1％的青霉素/链霉素(penicillins/streptomycin，购自Gibco，美国)。
首先，将1×105个人类皮肤纤维母细胞种植于含2mL的上述培养液的6孔培养盘中，并于37℃培养24小时后，在不扰动细胞的情况下，移除细胞培养液，并以1倍的磷酸盐缓冲溶液(1xPhosphate buffered saline,1xPBS)冲洗细胞后移除，接着将细胞分成以下四组：(1)仅加入细胞培养液处理2小时的空白控制组、(2)加入500μM的H2O2(购自Sigma，美国)处理2小时的控制组，(3)以2 mg/mL金银花萃取物预处理1小时再以500μM的H2O2处理1小时的比较组、及(4) 以2mg/mL本发明的金银花发酵物预处理1小时再以500μM的H2O2处理1小时的实验组。接着，于各组分别加入5μg/mL的DCFH-DA于37℃处理15分钟，再以500μM的H2O2于37℃处理细胞1小时后，以1mL的1倍的磷酸盐缓冲溶液清洗细胞两次，并加入200μL胰蛋白酶(Trypsin)在黑暗中反应5分钟，使细胞由培养盘上脱落，加入适当的培养液终止反应，并将细胞连同培养液收集至1.5mL离心管，以400g离心5分钟后移除上清液，再以1mL的1xPBS冲洗细胞一次后，再以400g离心10分钟后并除上清液，以1mL的1xPBS重新悬浮细胞，并加入2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA，购自Sigma，美国，编号SI-D6883-50MG，5mg/mL保存于DMSO中)标记细胞，并使用流式细胞仪检测细胞于激发波长450-490nm、放射波长510-550nm的荧光数值。再利用Excel软件进行student t-test以决定两个样本群体之间是否在统计上具有显著差异。
2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)是一种稳定的非极性化合物，可自由通透细胞膜，当DCFH-DA进入细胞后，会被细胞内的脂质酶水解，形成具有极性的2’,7’-dichlorodihydrofluorescin(DCFH)，停留在细胞内无法出來，而细胞内的活性氧类物质(Reactive Oxygen Species,ROS)与 DCFH产生氧化还原反应形成2’,7’-dichlorofluorescin(DCF)，以450-490nm 波长激发后，会产生的綠色荧光可以被于510-550nm波长被侦测出，因此侦测经DCFH-DA处理的细胞的荧光强度，能反映细胞内活性氧物质的含量。
本发明的三段式发酵方法提升本发明的金银花发酵物于提升皮肤细胞抗氧化活性的功效的测试结果如图3所示。经H2O2处理过的空白控制组及控制组，可分别测得9.9％及15.1％的人类皮肤纤维母细胞中含有ROS，显示H2O2确实可诱导皮肤细胞的氧化压力；经金银花水萃取物处理后，仅能使含有ROS的人类皮肤纤维母细胞降为2.8％；而经本发明的金银花发酵物作用后，能够显著的使含有ROS的人类皮肤纤维母细胞降为1.1％。此结果显示，本发明的三段式发酵方法可显著提高本发明金银花发酵物于皮肤细胞的抗氧化活性，以达到提升功效成份，增强保健抗氧化功效的目的。
实施例5 本发明三段式发酵方法提升金银花发酵物抗醣化活性的功效
本发明的一实施例为进行本发明的三段式发酵方法提升金银花发酵物抗醣化活性的功效的测试实验以抑制D-果糖(D-fructose)使牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)产生醣化的效率，进行醣化活性的定量；抗醣化能够抑制非酵素褐变，以避免体内功能性蛋白质的变性。首先，分别取0.25mL稀释为 20％(v/v)的金银花水萃取物或本发明金银花发酵物，二者分别为对照组及实验组，并以及0.25mL的水作为控制组，接着该三组各加入0.25mL的含有0.06％的NaN3的60mg/mL的BSA溶液(以200mM的磷酸钠缓冲液配置，pH7.4)中，并与0.25mL的1.5M的D-果糖(以200mM的磷酸钠缓冲液配置，pH7.4)溶液均匀混合，再取0.1mL的混合溶液于激发光360nm、放射光460nm下测定荧光值，以此为反应前的零点，并取0.45mL的混合溶液于50℃下培养24小时后，取出 0.1mL测定荧光值，以此为反应的终点。并以等量的3mM的氨基胍 (Aminoguanidine,AG，以200mM的磷酸盐缓冲液配置，pH7.4)回溶溶剂至相等体积以作为正对照组，其中已知Aminoguanidine(AG)具有抑制醣化作用的功效。最后，以下列公式计算清除醣化终产物(AGEs)能力的效率，以代表其抗醣化作用的活性。
Figure RE-GDA0002441494280000141
本发明的三段式发酵方法提升本发明的金银花发酵物抗醣化活性的功效的测试结果如图4所示，其中以控制组为100％。金银花水萃取物仅能降低2.1％醣化终产物的形成，而本发明的金银花发酵物却能显著降低的高达33.61％醣化终产物的形成，为金银花水萃取物的16倍。此结果显示，本发明的金银花发酵物具有强效的抑制醣化反应的活性，本发明的三段式发酵方法可显著提升本发明金银花发酵物清除醣化终产物的能力，有助于推迟慢性疾病与老化的进展。
实施例6 本发明金银花发酵物调控基因表现量的功效
本发明的一实施例以人类初代皮肤角质细胞HPEK-50进行本发明的金银花发酵物调控SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、PARP2基因、及Ubl-5基因表现量的功效的测试；其中，该HPEK-50细胞是购自CELLnTEC公司(瑞士)，且培养于无血清的角质细胞培养液(Keratinocyte-SFM)，该细胞培养液是购自Gibco公司(美国)，编号为#17005042，并于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
首先，将1.5x105个人类初代皮肤角质细胞培养于每孔含有2mL上述培养液的6孔培养盘中，于37℃培养16-18小时，接着将细胞分成以下三组：(1)仅加入细胞培养液的控制组、(2)加入0.125％金银花水萃取物的比较组、及(3)加入0.125％本发明的金银花发酵物的实验组，并将该三组分别于37℃下作用48 小时后，测试各组人类初代皮肤角质细胞中目标基因的表现量。首先，将该三组的细胞以细胞裂解液(RB buffer，购自Geanaid公司，中国台湾，Cat No. RBD300)回收细胞后，使用RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)分别收集该三组细胞内的总RNA，接着利用
Figure RE-GDA0002441494280000152
III 反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取RNA 为模板，并以表三的组合引物及反转录酶进行反转录作用，以产生该些基因的 mRNA所相应的cDNA产物，接着利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自 Sigma公司，美国，编号38220000000)将该三组反转录后产物分别以表三的组合引物进行定量实时聚合酶连锁反应(Quantitative real-time polymerasechain reaction,qPCR)试验，条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环。用以定量该二组人类初代皮肤角质细胞中SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、 PARP2基因、及Ubl-5基因的mRNA的表现量，其中定量数值是取由阈值循环数 (Ct)，而目标基因的mRNA相对量是推导自方程式2-ΔΔCt，其中ΔCT＝CT比较组或实验组目标基因/控制组目标基因-CT TBP(TATA结合蛋白，TATA-binding protein)；ΔΔCT＝CT比较组或实验组目标基因-CT控制组目标基因；各组中各基因的fold change则为2-ΔΔCt。接着，再利用Excel 软件决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值<0.05；**p值<0.01； ***p值<0.001)。
表三、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物
Figure RE-GDA0002441494280000151
Figure RE-GDA0002441494280000161
Parkin基因所编码的蛋白质为一种存在于泛素-蛋白酶体系 (Ubiquitin-proteasome system)中的酵素，并作为蛋白质分解的调节剂，已知该基因的突变与帕金森氏症有关，且先前研究亦指出增加该基因的表现量能够推迟细胞的老化作用，因此被认为与细胞的老化作用相关。
Atg基因为与自噬作用相关的基因，其所编码的蛋白质会参与细胞中废物降解、及循环的自噬作用，先前研究指出该基因的过量表现，能够延长小鼠的寿命，因此被认为与细胞的老化作用相关。
先前研究已指出和年老的小鼠相比，年轻的小鼠体内含有较多的NAD+；且增加年老小鼠体内的NAD+浓度，能使其生理状况更为年轻，因此NAD+被认为与推迟个体老化相关，研究结果已知Ubl-5基因及SOD3基因所编码的蛋白质与调节NAD+相关。
PARP2基因所编码的蛋白质聚(ADP-核糖)聚合酶2(Poly(ADP-Ribose)Polymerase 2)的为NAD+为受质，主要功能为催化二磷酸腺苷-核醣 (ADP-ribose)以形成poly(ADP-ribose)的聚合物(简称为PAR)。当细胞中DNA 产生结构上的破坏时，PARP-2会因为DNA单股或是双股断裂而被活化，因此被视为DNA损伤的传感器，且PARP-2活化后会影响粒线体活性，进而调控细胞能量代谢，因此，PARP和粒线体相关疾病以及老化等现象亦有重要关联。
本发明的三段式发酵方法提升本发明的金银花发酵物于提升SOD3基因表现量的测试结果如图5所示。人类初代皮肤角质细胞经金银花水萃取物处理后，仅能提升SOD3基因表现量达控制组的1.1倍；而本发明的金银花发酵物能显著提升SOD3基因表现量达控制组的1.5倍。此结果显示本发明的三段式发酵方法可显著提高本发明金银花发酵物提升皮肤细胞中SOD3基因的表现量的能力，以提升皮肤细胞中NAD+的浓度，达到皮肤抗老化的功效。
本发明的三段式发酵方法提升本发明的金银花发酵物于提升Parkin基因表现量的测试结果如图6所示。人类初代皮肤角质细胞经金银花水萃取物处理后，仅能提升Parkin基因表现量达控制组的1.2倍；而本发明的金银花发酵物能显著提升Parkin基因表现量达控制组的1.4倍。此结果显示本发明的三段式发酵方法可显著提高本发明金银花发酵物提升皮肤细胞中Parkin基因的表现量的能力，能够维持细胞中蛋白质分解的正常机能的运作，具有预防细胞老化的功效。
本发明的三段式发酵方法提升本发明的金银花发酵物于提升Atg1基因表现量的测试结果如图7所示。人类初代皮肤角质细胞经金银花水萃取物处理后，仅能提升Atg1基因表现量达控制组的1.0倍；而本发明的金银花发酵物能显著提升Atg1基因表现量达控制组的1.3倍。此结果显示本发明的三段式发酵方法可显著提高本发明金银花发酵物提升皮肤细胞中Atg1基因的表现量的能力，能够增进细胞中废物降解、及循环的自噬作用，以延长细胞的寿命，达到细胞抗老化的功效。
本发明的三段式发酵方法提升本发明的金银花发酵物于降低PARP2基因、及提升Ubl-5基因表现量的测试结果如图8所示。人类初代皮肤角质细胞经金银花水萃取物处理后，仅能降低PARP2基因表现量达控制组的0.85倍，并仅能提升Ubl-5基因表现量达控制组的1.0倍；而本发明的金银花发酵物能显著降低 PARP2基因表现量达控制组的0.75倍，并能显著提升Ubl-5基因表现量达控制组的1.1倍。此结果显示本发明的三段式发酵方法可有效提升本发明金银花发酵物降低皮肤细胞中PARP2基因的表现量及提升Ubl-5基因表现量的能力，能够以提升皮肤细胞中NAD+的浓度，并提升修护DNA损伤及促进粒线体代谢的活性，以达到皮肤抗老化的功效。
综上所述，本发明将金银花萃取物以酵母菌、乳酸菌、及醋酸菌进行三段式发酵所得的金银花发酵物，能藉由该微生物发酵制程显著提高本发明金银花发酵物中总多酚的含量、显著提高本发明金银花发酵物的还原活性、显著提高本发明金银花发酵物于皮肤细胞的抗氧化活性、显著提升本发明金银花发酵物清除醣化终产物的能力、且能显著提高本发明金银花发酵物提升细胞中SOD3 基因、Parkin基因、Atg1基因、及Ubl-5基因表现量，并同时降低PARP2基因表现量的能力；以达到增强抗氧化及抗醣化的功效，有助于推迟慢性疾病与老化的进展，且能提升细胞中NAD+的浓度、维持细胞中分解老废蛋白质的正常机能、增进细胞中废物降解、及增进细胞中自噬作用的正常运作、并能提升修护 DNA损伤、及促进粒线体代谢的活性，以延长细胞的寿命，达到抗老化的功效。因此，本发明的金银花发酵物可用于制备改善皮肤外观及抗老化的组合物的用途，且该组合物是一医药品、一保养品、或一食品，可藉由口服、涂抹等方式给予一个体。
Figure ISA0000199712130000011
Figure ISA0000199712130000021
Figure ISA0000199712130000031
Figure ISA0000199712130000041
Figure ISA0000199712130000051
Figure ISA0000199712130000061
Figure ISA0000199712130000071

Claims (14)

1.一种用于推迟老化的金银花发酵物，其是将金银花经由溶剂萃取所得的金银花萃取物，再将所述金银花水萃取物经由酵母菌、乳酸菌、及醋酸菌依序进行三阶段发酵而获得。
2.根据权利要求1所述的金银花发酵物，其特征在于，根据降低铁氧化的能力的比色法，所述金银花发酵物还原铁离子的能力相当于300-400μg/mL抗坏血酸还原铁离子的能力。
3.根据权利要求1所述的金银花发酵物，其特征在于，所述金银花发酵物进一步提升抗氧化活性和提升抗醣化活性。
4.根据权利要求1所述的金银花发酵物，其特征在于，所述金银花发酵物是促进超氧化物歧化酶3基因、帕金森氏症少年蛋白基因、自噬作用相关基因1基因、及Ubl基因系泛素样蛋白5基因的表现量；并抑制蛋白质聚聚合酶2基因的表现量。
5.根据权利要求1所述的金银花发酵物，其特征在于，所述金银花发酵物提升皮肤细胞中NAD+的浓度、维持细胞中分解老废蛋白质的正常机能、增进细胞中废物降解、增进细胞中自噬作用的正常运作、提升修护DNA损伤的能力、及/或促进粒线体代谢的活性。
6.一种权利要求1中所述的金银花发酵物用于制备提升皮肤细胞中SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、与Ubl-5基因表现量，及抑制PARP2基因表现量的组合物的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述金银花发酵物提升皮肤细胞中NAD+的浓度、维持细胞中分解老废蛋白质的正常机能、增进细胞中废物降解、增进细胞中自噬作用的正常运作、提升修护DNA损伤的能力、及/或促进粒线体代谢的活性。
8.一种金银花发酵物用于制备提升抗老化能力的组合物的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述金银花发酵物是提升抗氧化活性、提升还原活性、提升抗醣化活性、及/或提升总多酚含量。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的用途，其特征在于，所述金银花发酵物的有效浓度为至少0.5％(v/v)。
11.一种金银花发酵物的制备方法，包含：将一金银花经由一溶剂萃取所得的金银花萃取物，再将所述金银花萃取物经由酵母菌、乳酸菌、及醋酸菌依序进行三阶段发酵而获得。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述金银花萃取物是以水为溶剂萃取所述金银花所获得；且所述金银花及水是以1∶10-20(w/w)比例混合。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述酵母菌的添加量为0.01-0.5％(w/w)；所述乳酸菌的添加量为0.01-0.25％(w/w)；所述醋酸菌的添加量为3-10％(w/w)。
14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述酵母菌、所述乳酸菌、及所述醋酸菌的发酵时间比为1-2.5∶1-3∶3-10。
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