TWI838919B - 黃金百香果發酵物用於改善肌膚狀態及抗光老化的用途 - Google Patents
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Abstract
一種黃金百香果發酵物用於製備改善肌膚狀態或抗光老化的組合物的用途，其中黃金百香果發酵物是將黃金百香果萃取液依序以酵母菌、乳酸菌及醋酸菌進行發酵5日至10日所製得，且黃金百香果萃取液是由黃金百香果（
Passiflora ligularis）經水提取後所得。
Description
本發明關於一種百香果發酵物，特別是涉及一種以酵母菌、乳酸菌、醋酸菌依序發酵黃金百香果（
Passiflora ligularis）所製得的黃金百香果發酵物，其具有提高肌膚彈性、使細胞回春、提升肌膚光澤、抗光老化、抵抗及防禦紫外光A（UVA）等用途。
由微生物發酵的食品具有更易於消化、香味增加、儲藏時間提升等優勢。例如：泡菜、納豆、水果醋等等都是廣受歡迎的發酵食品。
發酵飲品也愈來愈受到消費者的喜愛。發酵飲品常以乳品、蔬菜、水果、豆類、草藥等為原料基底，再經由不同種類的微生物作用而製得。
為了使植物相關產品對身體健康助益有科學驗證的基礎，植物的活性成分分析及功效評估成為產品開發的重點項目。因此，多元且具功效的發酵產品即成為主要研究開發項目之一。有鑑於此，本發明提供一種黃金百香果發酵物用於改善肌膚狀態及抗光老化的用途，其藉由將相較於一般的百香果具有更多活性成分的黃金百香果（
Passiflora ligularis）以酵母菌、乳酸菌、醋酸菌三種菌依序發酵來製得黃金百香果發酵物，進而以其製備改善肌膚狀態及/或抗光老化的組合物。
在一些實施例中，一種黃金百香果發酵物用於製備改善肌膚狀態的組合物的用途，其中黃金百香果發酵物是將黃金百香果萃取液依序以酵母菌、乳酸菌及醋酸菌進行發酵5日至10日所製得，且黃金百香果萃取液是由黃金百香果（
Passiflora ligularis）經水提取後所得。
在一些實施例中，改善肌膚狀態為提高肌膚彈性、使細胞回春、提升肌膚光澤或其組合。
在一些實施例中，黃金百香果發酵物具有提升肌膚彈力蛋白含量的能力。
在一些實施例中，黃金百香果發酵物具有提升肌膚膠原蛋白含量的能力。
在一些實施例中，一種黃金百香果發酵物用於製備抗光老化的組合物的用途，其中黃金百香果發酵物是將黃金百香果萃取液依序以酵母菌、乳酸菌及醋酸菌進行發酵5日至10日所製得，且黃金百香果萃取液是由黃金百香果（
Passiflora ligularis）經水提取後所得。
在一些實施例中，黃金百香果發酵物具有提升抗光老化基因的表現量的能力。
在一些實施例中，抗光老化基因為泛素樣蛋白5（
Ubl-5）基因。
在一些實施例中，黃金百香果發酵物具有抵抗及防禦紫外光A（UVA）的能力。
在一些實施例中，黃金百香果萃取液是以黃金百香果、葡萄糖與水混合後於95℃下提取0.5小時至1小時所製得。
綜上所述，在任一實施例的黃金百香果發酵物的用途中，以黃金百香果（
Passiflora ligularis）製得的黃金百香果發酵物具有改善肌膚狀態及抗光老化的功能。其中，黃金百香果發酵物是以將黃金百香果萃取液依序以酵母菌、乳酸菌及醋酸菌進行發酵5日至10日所製得。在一些實施例中，黃金百香果發酵物能促進彈力蛋白及膠原蛋白生成以提高提高肌膚彈性並使細胞回春。在一些實施例中，黃金百香果發酵物能提升肌膚光澤。在一些實施例中，黃金百香果發酵物能抗光老化並具有抵抗及防禦紫外光A（UVA）的能力。
以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。
於下列實施方式的說明中，除非另有相關說明，則「%」符號是指重量百分比。
黃金百香果（
Passiflora ligularis），又稱甜百香果、大果西番蓮或西番蓮，屬於藤蔓植物，通常生長在熱帶和亞熱帶地區。黃金百香果的果實外皮通常是黃色光滑的，果肉呈現黃色凝膠狀。黃金百香果（
Passiflora ligularis）與一般百香果（
Passiflora edulis）不同的是，其味道甜而不酸，並帶有芳香。黃金百香果富含有鉀，磷，鐵和鈣等礦物質，且相較一般的百香果含有更豐富的類胡蘿蔔素（β-胡蘿蔔素）、多酚、檞皮素、維生素A及維生素C，因而具有抗氧化、抗發炎和增強免疫系統等特性。
首先，將黃金百香果原料與萃取溶劑以一定比例混合後，於特定溫度下加熱一特定時間以得到黃金百香果提取液。其中，黃金百香果原料可為黃金百香果（
Passiflora ligularis）的去皮後的果實（即果肉；下稱黃金百香果）經打碎處理後的黃金百香果顆粒；萃取溶劑可以為水。在一些實施例中，特定溫度可為80℃-100℃，而特定時間可為0.5小時-1小時。在一些實施例中，黃金百香果原料與萃取溶劑的混合比例為1：6。
在一些實施例中，打碎處理是指將黃金百香果（
Passiflora ligularis）的去皮果實打碎成粒徑12mm以下的黃金百香果顆粒以作為黃金百香果原料。
在一些實施例中，將黃金百香果原料以水在95℃提取0.5小時至1小時以得到黃金百香果萃取液，且黃金百香果原料與水的料水比（即重量比）為1-3：3-20。舉例來說，黃金百香果原料與水的重量比為1：6。在另一些實施例中，黃金百香果萃取液是以黃金百香果原料、葡萄糖與水混合後於95℃下提取0.5小時至1小時所製得。其中，葡萄糖的添加量為黃金百香果原料及水總重的3%。
於此，特定比例的萃取溶劑與待萃物（如，黃金百香果顆粒）或特定的萃取時間可明顯提升萃取效率；且特定的萃取時間可避免萃取時間過長造成萃取物中的有效成分可能產生降解。
接著，黃金百香果萃取液冷卻至溫度低於38℃後置入發酵槽內，並於黃金百香果萃取液依序加入複數菌種進行發酵5日-10日以得到黃金百香果發酵物。其中，複數菌種包括酵母菌（yeast）、乳酸菌（Lactic acid bacteria）及醋酸菌（
Acetobacter）。舉例來說，酵母菌可以為啤酒酵母（
Saccharomyces cerevisiae）、乳酸菌可以為鼠李糖乳桿菌（
Lactobacillus rhamnosus），而醋酸菌可以為乙酸醋酸菌（
Acetobacter aceti）。
在一些實施例中，使用複數菌種依序進行發酵的順序為：以酵母菌發酵1日至2.5日後，接著以乳酸菌發酵1日至3日後，再以乙酸醋酸菌發酵3日至10日。
首先，於黃金百香果萃取液中加入0.1%至0.4%的啤酒酵母（購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心（BCRC），寄存編號BCRC20271）並在28℃至37℃下發酵1日至2.5日，以得到第一初發酵液。舉例來說，第一初發酵液是將0.1%的啤酒酵母加入至黃金百香果萃取液中並於30℃下發酵1日所得。於此，透過先添加酵母菌可以使培養液發酵以產生酒精，且酒精有利提取出黃金百香果提取液的有效成份。在一些實施例中，第一初發酵液的pH值小於3.1，且其糖度（Degrees Brix，°Bx）約為5±1°Bx。
接著，於第一初發酵液中加入0.03%至0.06%的鼠李糖乳桿菌TCI366（購自BCRC，寄存編號BCRC910942）並在28℃至37℃下發酵1日至3日，以得到第二初發酵液。舉例來說，第二初發酵液是將0.05%的鼠李糖乳桿菌TCI366加入至第一初發酵液中並在30℃下發酵1日所得。於此，透過添加鼠李糖乳桿菌TCI366可以使得第一初發酵液內的葡萄糖被進一步消耗而降低糖度並且產生乳酸，以降低第一初發酵液的pH值；於此，降低第一初發酵液的pH值有利於進一步提取黃金百香果的其他不同有效成分。在一些實施例中，第二初發酵液的pH值小於3.5，且其糖度約為4±1°Bx。
然後，於第二初發酵液中加入5%至10%的乙酸醋酸菌（購自BCRC，寄存編號BCRC11688）並在28℃至37℃下發酵3日至10日，以得到初發酵液。舉例來說，初發酵液是將10%的乙酸醋酸菌加入至第二初發酵液中並在30℃下發酵5日所得。於此，透過添加醋酸菌可以使得第二初發酵液內的酒精被消耗，而進一步再降低葡萄糖的含量。在一些實施例中，初發酵液的pH值小於3.5，且其糖度為約為3.5±1°Bx。
接著，將初發酵液經多個處理程序以得到黃金百香果發酵物。具體而言，處理程序可以為但不限於減壓濃縮、過濾、調整糖度、殺菌等一項或多項處理步驟。
在一些實施例中，將初發酵液在55℃至65℃下進行減壓濃縮並以特定目數（mesh）的網孔的濾網過濾以得到發酵原液，並調整發酵原液的糖度後以得到黃金百香果發酵物。在另一些實施例中，可以調換過濾及減壓濃縮的先後順序，即先將初發酵液以特定目數的網孔的濾網過濾後再進行減壓濃縮以得到發酵原液。舉例來說，前述濃縮方式可以採取在60℃下進行減壓濃縮，而前述過濾方式可以是以200目數的濾網進行過濾。
在一些實施例中，透過減壓濃縮及過濾（二處理程序的順序可調換）所得到的發酵原液，其糖度約為2°Bx，且其PH值小於3.5。
在一些實施例中，調整發酵原液的糖度以得到完成黃金百香果發酵物。舉例來說，發酵原液的糖度可是透過添加寡糖至發酵原液，進而使發酵原液的糖度達到26±2°Bx以形成為黃金百香果發酵物。於此，寡糖係指由3至10個單醣分子聚合而成的低聚糖。其中，寡糖可為果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、異麥芽寡糖等等。其中，所添加的寡糖可以為但不限於含40%-70%異麥芽寡糖的寡糖溶液。
在一些實施例中，黃金百香果發酵物的多酚含量高於黃金百香果全果汁或果肉的多酚含量。舉例來說，黃金百香果發酵物包含265μg/mL的多酚含量，高於黃金百香果全果汁（具有225μg/mL的多酚含量）及果肉（具有173μg/mL的多酚含量）。也就是說，透過發酵製程可提高黃金百香果發酵物所含有的多酚含量，並提高黃金百香果的效性。
在一些實施例中，利用三種菌種依序進行發酵所得的黃金百香果發酵物高於同時用三種菌種進行發酵的所得的黃金百香果發酵物。也就是說，透過特定發酵流程所得的黃金百香果發酵物具有更多的效性成分。
在一些實施例中，黃金百香果發酵物具有提升肌膚彈力蛋白含量的能力。彈力蛋白在肌膚中扮演鞏固膠原蛋白和彈力纖維結構的功能，以維持肌膚的彈力。若肌膚所含有彈力蛋白含量降低，將會使肌膚彈性下降並形成皺紋。因此，透過服用黃金百香果發酵物可以提高肌膚彈力蛋白含量，以鞏固肌膚彈力。
在一些實施例中，黃金百香果發酵物具有提升肌膚膠原蛋白含量的能力。膠原蛋白存在於肌膚真皮層，與彈力纖維合力架構一個網狀的支撐體，並提供真皮層安定而有力的支撐以維持結締組織的濕度與彈性，可使肌膚光滑透亮。因此，透過服用黃金百香果發酵物可以提高肌膚膠原蛋白含量，使細胞回春。
在一些實施例中，黃金百香果發酵物具有提升肌膚光澤（Brightness）亮度的能力，以提高肌膚的亮度。
基此，黃金百香果發酵物具有提高肌膚彈性、使細胞回春、提升肌膚光澤等能力，進而可改善肌膚狀態。也就是說，黃金百香果發酵物具有改善肌膚狀態的能力。
在一些實施例中，黃金百香果發酵物具有提升抗光老化基因的表現量。舉例來說，抗光老化基因為泛素樣蛋白5（
Ubl-5）基因。由於陽光中的紫外線刺激自由基（ROS）的產生，使肌膚容易老化，導致光老化的一系列基因啟動，同時也會造成DNA損傷，增加皮膚癌的風險。因此，透過服用黃金百香果發酵物可以顯著提高抗光老化基因中
Ubl-5基因的表現量，進而可從基因層面開始抵抗老化肌膚。
在一些實施例中，黃金百香果發酵物具有抵抗及防禦紫外光A（UVA）的能力。UVA佔紫外線中約95%的比例，且UVA的波長介於320 nm至400 nm，屬於較長的波長，可穿透表皮進而傷害真皮層細胞，並促使肌膚老化、鬆弛及黑色素沉澱。因此，透過服用黃金百香果發酵物可有效提升在UVA刺激下的細胞存活率。也就是說，服用黃金百香果發酵物可提高肌膚細胞對紫外光傷害的抵抗能力，進而使肌膚持續閃耀。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的黃金百香果發酵物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服的、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation） 或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，前述之醫藥品可更包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、或含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為食用產品。換言之，食用產品包含特定含量的黃金百香果發酵物。在一些實施例中，食用產品可為一般食品、保健食品或膳食補充品。
在一些實施例中，前述之食用產品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於口服的劑型。在一些實施例中，前述之一般食品可為食用產品本身。在一些實施例中，一般食品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）或調味料。
在一些實施例中，所得的黃金百香果發酵物可進一步作為食品添加物（food additive），以製得含有植物發酵液黃金百香果發酵物的食品組合物。於此，能藉由習知方法於原料製備時添加任一實施例的黃金百香果發酵物，或是於食品的製作過程中添加任一實施例的黃金百香果發酵物，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食用產品（即食品組合物）。
在一些實施例中，前述組合物的使用劑型可以為液態或固態（例如，粉包或錠劑）。舉例來說，透過將液態的黃金百香果發酵物進行冷凍乾燥處理即可得固態的黃金百香果發酵物。
在一些實施例中，前述組合物的使用量為8mL/日的液態的黃金百香果發酵物（即，黃金百香果發酵液）。
以下，本文中使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示，各組之間的差異以學生t檢驗（student’s t-test）進行分析。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
例
1
：黃金百香果發酵物的製備方法
首先，將購自南投埔里的黃金百香果（
Passiflora ligularis）的去皮果實（即帶籽果實）打碎處理為粒徑12mm以下的黃金百香果顆粒，以作為黃金百香果原料使用。將黃金百香果原料與水以1:6的重量比進行混合，並且加入佔二者總重3%的葡萄糖。接著，將黃金百香果原料、葡萄糖與水混合後於95℃下提取0.5小時以得到黃金百香果萃取液。
待黃金百香果萃取液冷卻至溫度低於38℃後，冷卻後的黃金百香果萃取液即可作為後續發酵程序的黃金百香果培養液使用。
於黃金百香果培養液中加入0.2%的啤酒酵母（
Saccharomyces cerevisiae，購自BCRC，寄存編號BCRC20271）並於30℃靜置培養1日以形成第一初發酵液。於此，第一初發酵液的pH值小於3.1，且其糖度約為5±1°Bx。
接著，於第一初發酵液中加入0.06%的鼠李糖乳桿菌TCI366（購自BCRC，寄存編號BCRC910942）並在30℃下發酵1日以形成第二初發酵液。於此，第二初發酵液的pH值小於3.5，且其糖度約為4±1°Bx。
於第二初發酵液加入5%的乙酸醋酸菌（
Acetobacter aceti；購自BCRC，寄存編號 BCRC11688），並於30℃靜置培養5日以形成初發酵液。於此，初發酵液的pH值小於3.5，且其糖度約為3.5±1°Bx。
接著，將初發酵液於60℃進行減壓濃縮，並於減壓濃縮後以孔徑200目數的篩網進行過濾，以得到發酵原液。於此，發酵原液的糖度約為2°Bx，且其pH值小於3.5。然後，以30%的異麥芽寡糖及蘋果酸調整發酵原液的糖度為26±2°Bx且pH值為3.2±0.5，即可得到後續實驗所使用的黃金百香果發酵物。
例
2
：總多酚含量測試（不同黃金百香果產品）
秤取1mg的沒食子酸（Gallic acid）置於10mL的容量瓶中，然後以水（H
2O）定量至10mL，以得到沒食子酸的儲備溶液（stock solution）。將沒食子酸的儲備溶液稀釋10倍，即100μL的沒食子酸的儲備溶液加900μL的水，以得到100μg/mL的沒食子酸的初始溶液（即含100ppm的沒食子酸）。然後，依據下表1配置0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、及100μg/mL的沒食子酸的標準溶液，並分別取100μL之各濃度的標準溶液至玻璃試管中。加入500μL之福林酚試劑（Folin-Ciocalteu's phenol reagent，購自Merck）至各玻璃試管內與標準溶液混合均勻並靜置3分鐘後，再加入400μL的7.5%的碳酸鈉混合均勻後反應30分鐘以得到標準反應溶液。取200μL之標準反應溶液至96孔板中，並測量其在750nm下的吸光值，以獲得標準曲線。
表1
| 標準溶液 （μg/mL） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 初始溶液（μL） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 水（μL） | 100 | 80 | 60 | 40 | 20 | 0 |
分別將例1所製備的黃金百香果原料（即黃金百香果顆粒，其作為對照組1）、黃金百香果全果果汁（即黃金百香果全果切塊後打成汁液，其作為對照組2）和例1所製備的黃金百香果發酵物（其作為實驗組）作為待測樣本。於此，黃金百香果原料代表黃金百香果去皮的帶籽果肉、黃金百香果全果果汁代表黃金百香果果汁，而黃金百香果發酵物則代表黃金百香果發酵產品，藉以進行黃金百香果的果肉、果汁與發酵產品的多酚含量比較。
將各待測樣本以水稀釋5倍後取100mL到離心管中。接著，加入500μL的福林酚試劑至玻璃試管中與樣本混合均勻並靜置3分鐘後，再加入400μL的7.5%碳酸鈉混合均勻後反應30分鐘以得到待測反應溶液。將裝有待測反應溶液的玻璃試管進行震盪以確保無氣泡後，取200μL的待測反應溶液至96孔板中，並測量待測反應溶液於750nm下的吸光值。
接著，利用標準曲線與內插法將待測反應溶液的吸光值換算成總多酚含量，如圖1所示。
請參見圖1。作為對照組1的黃金百香果原料的總多酚含量為173μg/mL、作為對照組2的黃金百香果全果果汁的總多酚含量為225μg/mL，而作為實驗組的黃金百香果發酵物的總多酚含量為265μg/mL。也就是說，實驗組相較於對照組1提高了1.53倍（約1.5倍），且相較於對照組2提高了1.18倍（約1.2倍）。基此，將黃金百香果進行萃取後發酵，可顯著提高其活性成分含量，並提升黃金百香果產品的效性。因此，當受體（如，人）服用黃金百香果發酵物後，相較於服用黃金百香果果肉或黃金百香果全果果汁，均可攝取較多的活性成分，並顯著提升受體（如，人）體內的抗氧化活性。
例
3
：總多酚含量測試（不同發酵製程）
所使用測試方法及測試溶劑如例2所示，故不在贅述。於此，所使用的待測樣本為作為控制組的一次發酵黃金百香果發酵物，及作為實驗組的例1所製備的黃金百香果發酵物（即三次發酵黃金百香果發酵物）。
一次發酵黃金百香果發酵物的製備流程如下：將依例1記載方法所製備的黃金百香果萃取液，同時加入0.2%的啤酒酵母（
Saccharomyces cerevisiae，購自BCRC，寄存編號BCRC20271）、0.06%的鼠李糖乳桿菌TCI366（購自BCRC，寄存編號BCRC910942）及5%的乙酸醋酸菌（
Acetobacter aceti；購自BCRC，寄存編號 BCRC11688）並於30℃下發酵7日以得到一次出發酵液，並將一次初發酵液於60℃進行減壓濃縮，並於減壓濃縮後以孔徑200目數的篩網進行過濾，以得到一次發酵原液。接著，以30%的異麥芽寡糖及蘋果酸調整一次發酵原液的糖度為26±2°Bx且pH值為3.2±0.5，即可得到作為控制組的一次發酵黃金百香果發酵物。
將二組待測樣本經例2測試流程處理為待測反應溶液後，測量其於750nm下的吸光值，並利用標準曲線與內插法將待測反應溶液的吸光值換算成總多酚含量，如圖2所示。
請參見圖2。作為控制組的一次發酵黃金百香果發酵物的總多酚含量為227.96ppm，而作為實驗組的黃金百香果發酵物的總多酚含量為261.15ppm。也就是說，實驗組相較於控制組提高了1.15倍。基此，利用三種菌株並依序對黃金百香果進行發酵，可顯著提高其活性成分含量，並提升黃金百香果產品的效性。因此，當受體（如，人）服用特定製程所製得的黃金百香果發酵物後，相較於服用一次發酵的黃金百香果發酵物，可攝取較多的活性成分，並顯著提升受體體內的抗氧化活性。
例
4
：彈力蛋白實驗
於此，所使用的細胞培養基（以下稱MEM培養基）是由90體積%的最低限度基本培養基（Minimum essential medium；品牌Gibco，編號11095080）、10體積%胎牛血清蛋白（fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco，編號10437-028）、1%的抗生素-抗黴菌素（Antibiotic-Antimycotic）（Gibco公司，編號15240-062）及1 mM丙酮酸鈉（sodium pyruvate，品牌：Gibco，編號11360-070）所配製而成。所使用的細胞株為人類肌膚成纖維細胞（CCD-966Sk cell，品牌：ATCC®，CRL-1881），以下稱CCD-966Sk細胞。
將CCD-966Sk細胞以每孔1×10
5個的數量接種於每孔含2毫升MEM培養基之6孔培養盤中，並於37℃下培養24小時。於此，將培養的CCD-966Sk細胞分為三個組別，其分別為實驗組、控制組及空白組。接著，更換各組別的MEM培養基為對應的實驗培養基。然後，將實驗組及對照組於37℃下培養48小時並於培養後進行彈力蛋白含量的檢測。空白組則於更換完實驗培養基後即進行彈力蛋白含量的檢測。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.25體積%的例1所製備的黃金百香果發酵物的MEM培養基。控制組的實驗培養基為含有0.25體積%的例2所製備的黃金百香果全果果汁的MEM培養基。空白組的實驗培養基為單純MEM培養基（即，不含黃金百香果發酵物物的MEM培養基）。
在彈力蛋白含量的檢測中，以彈性蛋白檢測套組（Fastin™ Elastin Assay kit，品牌：Biocolor）處理各組CCD-966Sk細胞後，以酵素免疫分析儀（ELISA Reader，品牌：BioTek）設定波長513nm來檢測三組CCD-966Sk細胞的彈力蛋白含量，如圖3所示。其中，將未以實驗培養基培養24小時的空白組量測到的相對彈力蛋白含量視為100%。
請參閱圖3，相較於空白組，實驗組的相對彈力蛋白含量為118%，而控制組的相對彈力蛋白含量為78%。換言之，實驗組的彈力蛋白相對分泌量相較於空白組明顯提高1.18倍，並相較於控制組明顯提高1.51倍。並且，實驗組的相對彈力蛋白含量比控制組的相對彈力蛋白含量提高51%，代表以黃金百香果發酵物處理48小時後的CCD-966Sk細胞可顯著分泌出更多的彈力蛋白。由此可知，黃金百香果發酵物具有促進細胞合成彈力蛋白的功能，進而可減少肌膚塌陷及減少皺紋顯現。此外，控制組的實驗可顯示若是以黃金百香果全果果汁處理CCD-966Sk細胞則其細胞合成彈力蛋白的功能下降。
基此，黃金百香果發酵物具有促進細胞合成彈力蛋白的功能。當受體（如，人）服用後，能促進受體的肌膚細胞生成彈力蛋白，進而提升肌膚彈性、減少肌膚塌陷與皺紋，延緩肌膚老化。
例
5
：膠原蛋白分泌實驗
於此，所使用的細胞培養基（以下稱MEM培養基）是由90體積%的最低限度基本培養基（Minimum essential medium；品牌Gibco，編號11095080）、10體積%胎牛血清蛋白（fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco，編號10437-028）、1%的抗生素-抗黴菌素（Antibiotic-Antimycotic）（Gibco公司，編號15240-062）及1 mM丙酮酸鈉（sodium pyruvate，品牌：Gibco，編號11360-070）所配製而成。所使用的細胞株為CCD-966Sk細胞。
首先，取2x10
4個CCD-966Sk細胞至每孔含有0.5毫升MEM培養基的24孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。待CCD-966Sk細胞貼附於細胞培養盤的底部後，以1XDPBS（Dulbecco's phosphate-buffered saline，Gibco公司，Cat. 14200-075）清洗一次。
將CCD-966Sk細胞分為實驗組、控制組及空白組。移除各組別的MEM培養基並更換為每孔0.5mL實驗培養基，然後置於37℃下分別接續培養48小時。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.25體積%的例1中所得到的黃金百香果發酵物的MEM培養基。控制組的實驗培養基為含有0.25體積%的例2中所得到的黃金百香果全果果汁的MEM培養基。空白組的實驗培養基為單純的MEM培養基（即不含黃金百香果發酵物）。
收集1mL的各組的實驗培養基，並以可溶性膠原蛋白檢測套組（品牌：Biocolor；編號： S1000）處理以形成各組的待測溶液。接著，以分光光度計測量各組的待測溶液在555nm下之各組吸光值，並使用 Excel 軟體中的 student t-test 進行統計分析，如圖4所示。
請參閱圖4。將空白組的數值視為100%。相較於空白組，實驗組的膠原蛋白的相對分泌量為123%，而控制組的膠原蛋白的相對分泌量為120%。換言之，實驗組能顯著促進CCD-966Sk細胞分泌膠原蛋白，並顯著的提高23%。
由此可知，當受體（如，人）服用黃金百香果發酵物時，其肌膚細胞能有效地分泌膠原蛋白，進而改善受體肌膚，使受體的肌膚具有彈性及保持濕度，並使受體的肌膚有效回春。
例
6
：抗光老化基因實驗
於此，所檢測抗光老化相關基因為
Ubl-5基因（Gene ID:59286）。所使用的細胞培養基為添加10%（v/v）胎牛血清（Gibco；Cat.10437-028）之Eagle最低限度基本培養基（minimum essential medium (Eagle), MEM (Eagle)）（Gibco，產品編號11095080）。其中，Eagle最低限度基本培養基是由Eagle平衡鹽溶液（Eagle’s balance slat soultion，Eagle’s BSS）額外添加成分使其含有1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate）、1.5 g/L的碳酸氫鈉（sodium bicarbonate）及0.1 mM的非必需胺基酸（non-essential amino acid solution）所配製而成。所使用的細胞株為CCD-966Sk細胞。
首先，取1.5x10
5個CCD-966Sk細胞至每孔含有2mL的細胞培養基的24孔細胞培養盤中，於37℃下培養24小時。接著，將CCD-966Sk細胞分為實驗組、對照組、控制組及空白組。並且，待實驗組及對照組的CCD-966Sk細胞貼附於細胞盤養盤後，於二組的細胞培養基中分別加入二組的待測樣品，並於37℃下處理24小時。於此，實驗組的待測樣品為0.25體積%的例1製備的黃金百香果發酵物，而對照組的待測樣品為0.25體積%的例2製備的黃金百香果全果果汁。
於24小時後，將四組均更換為新鮮的細胞培養基，並將除空白組之外的另外三組的培養盤放入紫外線鏈結箱（Cleaver Scientific；Cat. CL-508），以12 J/cm
2的UVA照射1小時。於此，前述UVA條件會造成細胞半數致死量（Lethal Dose, 50%; LD50）。
照射UVA後，去除各組上清液，並利用1X DPBS洗去培養盤中細胞殘骸，搖晃後再並去除1X DPBS。接著，加入RNA萃取試劑套組（購自Geneaid公司，台灣，Lot No. FC24015-G）中的細胞裂解液，進行後續RNA萃取過程。
收集各組的CCD-966Sk細胞，並以RNA萃取試劑套組萃取出各組的RNA。接著，各組取1000奈克（ng）的RNA作為模板，透過SuperScript
®III反轉錄酶（購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051）將RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlus
TM即時PCR系統（ABI StepOnePlus
TMReal-Time PCR system（Thermo Fisher Scientific公司，美國））、KAPA SYBR FAST（購自Sigma公司，美國，編號38220000000）及表2的引子（SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2）對各組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction）以觀察CCD-966Sk細胞內抗老化相關基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95°C反應20秒，接著95°C反應3秒，60°C反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-ΔCt方法進行基因定量，如圖5所示。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量基因的mRNA表現量，進而推斷基因編碼的蛋白質的表現量。
表2
| 目標基因 | 引子名稱 | 序列編號 | 引子序列 |
| Ubl-5 | Ubl-5-F | SEQ ID NO:1 | TCCTAGCGTTAACTGCGACC |
| Ubl-5-R | SEQ ID NO:2 | CTAGCTGGAGCTCGAATCGC |
於表2中，F為順向引子（Forward primer），而R為反向引子（Reverse primer）。
請參閱圖5。將空白組的
Ubl-5基因的相對表現量視為1.00，其代表無受UVA照射傷害的正常CCD-966Sk細胞表現的
Ubl-5基因表現量。控制組則代表受UVA照射傷害的CCD-966Sk細胞表現的
Ubl-5基因表現量，其為0.81，顯示經UVA照射後CCD-966Sk細胞所表現的
Ubl-5基因表現量有所下降。對照組則代表受UVA照射傷害但之後以黃金百香果萃取物處理的CCD-966Sk細胞，其CCD-966Sk細胞的
Ubl-5基因的相對表現量為0.81，代表黃金百香果萃取物並無法促進
Ubl-5基因表現量上升。然而，相較於空白組、控制組及對照組，實驗組的Ubl-5基因的相對表現量為1.1，代表經黃金百香果發酵物處理的CCD-966Sk細胞表現的
Ubl-5基因表現量有所提升。因此，當受體（如，人）服用黃金百香果發酵物時能提高
Ubl-5基因的表現量，進而使受體具有抗光老化的能力並有助於受體預防光老化。
例
7
：細胞存活率實驗
於此，所使用的細胞培養基是由90體積%的最低限度基本培養基（Minimum essential medium；品牌Gibco，編號11095080）、10體積%胎牛血清蛋白（fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco，編號10437-028）、1%的青黴素-鏈黴素（品牌：Gibco，編號15140122）、1 mM的丙酮酸鈉（sodium pyruvate，品牌：Gibco，編號11360-070）、1.5 g/L的碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，品牌：Sigma，編號S5761-500G ）及0.1 mM的非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，品牌：Gibco，編號11140050）所配製而成。所使用的細胞株為CCD-966Sk細胞。
首先，取5x10
3個CCD-966Sk細胞至每孔含有200μL的細胞培養基的96孔細胞培養盤中，並放入CO
2培養箱中於37℃下培養24小時。
接著，將CCD-966Sk細胞分為實驗組、控制組及空白組。並且，待實驗的CCD-966Sk細胞貼附於細胞盤養盤後，於實驗組的細胞培養基中加入0.25體積%的例1製備的黃金百香果發酵物。
於24小時後，將三組均更換為新鮮的細胞培養基，並將除空白組之外的另外二組的培養盤放入紫外線鏈結箱（Cleaver Scientific；Cat. CL-508），以12 J/cm
2的UVA照射1小時。於此，前述UVA條件會造成細胞半數致死量（Lethal Dose, 50%; LD50）。空白組則未經UVA照射處理。
接著，加入15 μL/孔的MTT溶液至各組實驗培養基中，並於37℃作用4小時。然後移除各組實驗培養基，並加入50μl/孔的DMSO（ECHO；產品編號DA1101-000000-72EC），並將96孔細胞培養盤放置於軌道震盪器上搖晃10分鐘。於此，所使用的MTT溶液是將MTT（Amresco；產品編號0793）以1XDPBS配置而成，其最終濃度為4 mg/mL。
於反應後，取下各組CCD-966Sk細胞並分別以分光光度計測得其O.D.570的數值。並且，以下列公式計算各組CCD-966Sk細胞的細胞存活率，並使用Excel軟體中的student t-test進行統計分析，如圖6所示。於圖6中，「#」是與空白組比較，且「##」代表p＜0.01；「*」代表與控制組比較，且「*」代表p＜0.05。
公式：細胞存活率（%）=（O.D.待測組別/O.D.空白組） x 100%。其中，待測組別為空白組、控制組及實驗組，且空白組的細胞存活率（%）視為100%。
請參見圖6。將空白組代表無受UVA照射傷害的正常CCD-966Sk細胞正常的存活率，並將其細胞存活率（%）視為100%。控制組則代表受UVA照射傷害的CCD-966Sk細胞的存活率，其為86%，顯示經UVA照射後CCD-966Sk細胞後導致部分細胞死活，細胞存活率因此下降。實驗組的則代表受UVA照射傷害但之後以黃金百香果發酵物處理的CCD-966Sk細胞，其細胞存活率為89%。由此可知，相較於控制組，實驗組的細胞存活率有所上升，代表黃金百香果發酵物能有效地提升在UVA刺激下的細胞存活率。換言之，黃金百香果發酵物具有幫助受體（如，人）抵抗或防禦紫外光的傷害，進而使肌膚持續閃耀。
例
8
：人體實驗
於此，採自身對照方式進行，並且比較10位受試者服用含有黃金百香果發酵物的飲品前後之膚況變化。其中，所使用的飲品每瓶含有8mL的例1所得的黃金百香果發酵物。
測試方式：10位受試者每日服用一瓶含有8mL的黃金百香果發酵物的飲品，連續服用4週，並於服用前（第0週）、服用4週後（第4週）進行肌膚光澤度檢測。其中，10位受試者的年齡為20歲以上，且為欲提升膚況者。於此，飲品由含有8mL的黃金百香果發酵物、0.01mL檸檬酸及41.99mL的水組成，總重50mL。
所使用的檢測儀器為肌膚光澤度檢測探頭Glossymeter GL200（C+K Multi Probe Adapter System, Germany）是由照射到肌膚表面的光的直接反射和散反射來反映的。
判斷方式：當測量數值越高，說明肌膚越具有光澤。
請參考圖7。將10位受試者於第0週量測到的肌膚光澤度之平均數值視為100%。相較於第0週，第4週量測到的肌膚光澤度之平均數值視為106.3%。換言之，在連續服用4週的含有8mL的黃金百香果發酵物的飲品後，10位受試者的肌膚光澤度之平均數值提升了6.3%。並且，10位受試者有7位對於肌膚光澤度明顯感到改善，代表改善人數比例為70%。此外，10位受試者中的一位受試者於第0週及第4週時對肌膚光澤度進行攝影，其光澤度照片如圖8所示。較於第0週（圖8左圖），第4週（圖8右圖）所拍攝到的受試者肌膚較為亮白而不泛紅，且肌膚明顯更有光澤。由此可知，服用含有黃金百香果發酵物的組合物可提高受體（如，人）的肌膚光澤度，並有效提亮肌膚。
綜上所述，根據本發明任一實施例的黃金百香果發酵物的用途，黃金百香果發酵物可用以製備改善肌膚狀態（例如提高肌膚彈性、使細胞回春、提升肌膚光澤）及抗光老化（例如抵抗及防禦紫外光）的組合物。其中，黃金百香果發酵物是將黃金百香果（
Passiflora ligularis）以水於95℃萃取1小時後再以複數菌種（酵母菌、鼠尾草乳桿菌、醋酸菌）依序進行發酵5日至10日所製得。在一些實施例中，黃金百香果發酵物具有提升光老化基因（例如
Ubl-5基因）的表現量、抵抗紫外光傷害、提升肌膚彈力蛋白含量、提升肌膚膠原蛋白含量等功能，進而有效地改善肌膚狀態（例如使肌膚有彈性、保濕及光澤等）並可抵抗紫外光具抗光老化之功效。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是不同黃金百香果產物的總多酚含量的數據結果圖；
圖2是不同發酵製程所製得的黃金百香果發酵物的總多酚含量的數據結果圖；
圖3是相對彈力蛋白含量的實驗數據結果圖；
圖4是相對膠原蛋白含量的實驗數據結果圖；
圖5是Ubl-5基因相對表現倍率的實驗數據結果圖；
圖6是細胞存活率的實驗數據結果圖；
圖7是10位受試者於第0週及第4週時的平均肌膚光澤/亮度的數據量化分析圖；以及
圖8是10位受試者之一於第0週及第4週時的肌膚光澤/亮度照片。
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Claims (10)
- 一種黃金百香果發酵物用於製備改善肌膚狀態的組合物的用途，其中該黃金百香果發酵物是將黃金百香果萃取液在28℃至37℃下依序以0.1%至0.4%的寄存編號為BCRC20271的啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)進行發酵1日至2.5日、以0.03%至0.06%的寄存編號為BCRC910942的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)進行發酵1日至3日及以5%至10%的寄存編號為BCRC11688的乙酸醋酸菌(Acetobacter aceti)進行發酵3日至10日所製得，且該黃金百香果萃取液是由黃金百香果(Passiflora ligularis)經水提取後所得。
- 如請求項1所述之用途，其中該黃金百香果萃取液是以該黃金百香果、葡萄糖與該水混合後於95℃下提取0.5小時至1小時所製得。
- 如請求項1所述之用途，其中該改善肌膚狀態為提高肌膚彈性、使細胞回春、提升肌膚光澤或其組合。
- 如請求項1所述之用途，其中該黃金百香果發酵物具有提升肌膚彈力蛋白含量的能力。
- 如請求項1所述之用途，其中該黃金百香果發酵物具有提升肌膚膠原蛋白含量的能力。
- 一種黃金百香果發酵物用於製備抗光老化的組合物的用途，其中該黃金百香果發酵物是將黃金百香果萃取液在28℃至37℃下依序以0.1%至0.4%的寄存編號為BCRC20271的啤酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)進行發酵1日至2.5日、以0.03%至0.06%的寄存編號為BCRC910942的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)進行發酵1日至3日及以5%至10%的寄存編號為BCRC11688的乙酸醋酸菌(Acetobacter aceti)進行發酵3日至10日所製得，且該黃金百香果萃取液是由黃金百香果(Passiflora ligularis)經水提取後所得。
- 如請求項6所述之用途，其中該黃金百香果萃取液是以該黃金百香果、葡萄糖與該水混合後於95℃下提取0.5小時至1小時所製得。
- 如請求項6所述之用途，其中該黃金百香果發酵物具有提升抗光老化基因的表現量的能力。
- 如請求項8所述之用途，其中該抗光老化基因為泛素樣蛋白5(Ubl-5)基因。
- 如請求項6所述之用途，其中該黃金百香果發酵物具有抵抗及防禦紫外光A(UVA)的能力。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163257131P | 2021-10-19 | 2021-10-19 | |
| US63/257,131 | 2021-10-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202317166A TW202317166A (zh) | 2023-05-01 |
| TWI838919B true TWI838919B (zh) | 2024-04-11 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102599497A (zh) | 2012-03-10 | 2012-07-25 | 柳州市金臣科技有限公司 | 百香果发酵液及其制作方法 |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102599497A (zh) | 2012-03-10 | 2012-07-25 | 柳州市金臣科技有限公司 | 百香果发酵液及其制作方法 |
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