KR102245702B1 - 셀렌을 포함하는 조성물 및 미토콘드리아 기능장해와 관련된 질병 또는 상태의 치료와 예방을 위한 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 셀렌(예를 들어, 셀렌 강화 효모 및 이로부터 얻어지거나 유도되는 셀렌 함유 화합물)을 포함하는 조성물 및 비만, 당뇨병 및 관련 상태를 치료하고, 억제하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다. 특히, 본원은 셀렌 강화 효모(예를 들어, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모)를 포함하는 조성물, 이의 내부에 존재하고/하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물, 및 미토콘드리아 활성과 기능(예를 들어, 골격근과 간에서)을 대상(예를 들어, 당뇨병, 비만 및 관련 상태에 대한 치료 및/또는 예방 요법으로서)에서 향상시키기 위한 이의 사용 방법을 제공한다.

Description

셀렌을 포함하는 조성물 및 미토콘드리아 기능장해와 관련된 질병 또는 상태의 치료와 예방을 위한 이의 용도{COMPOSITIONS COMPRISING SELENIUM AND USE OF SAME FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF DISEASE OR CONDITIONS ASSOCIATED WITH MITOCHONDRIAL DYSFUNCTION}

관련 출원(들)에 대한 상호 참조

본원은 PCT 국제특허출원으로서 2014. 3. 14자로 출원되고, 2013. 3. 15자 출원된 미국특허출원 제61/788,133호를 우선권 주장하며, 이의 개시 내용을 본원에서 전적으로 참조로서 원용한다.

본원의 분야

본원은 셀렌(예를 들어, 셀렌 강화 효모(selenium enriched yeast) 및 이로부터 얻어지거나 유도되는 셀렌 함유 화합물)을 포함하는 조성물 및 미토콘드리아 기능장해를 치료하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다. 특히, 본원은 셀렌 강화 효모(예를 들어, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모)를 포함하는 조성물, 이의 내부에 존재하고/하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물, 및 미토콘드리아 기능부전에 관련된 질병 또는 상태를 치료하기 위한 이의 사용 방법을 제공한다.

미토콘드리아로서 알려진 소기관은 고등 생물의 세포에서 주요 에너지원이다. 미토콘드리아는 폭넓은 세포 호흡의, 산화 및 대사 공정의 직접 및 간접 생화학적 제어를 제공한다. 이들은 전자전달쇄(ETC, electron transport chain) 활성을 포함하며, 이는 아데노신 삼인산(ATP, adenosine triphosphate)의 형태로 대사 에너지를 생성하는 산화적 인산화를 구동하고, 또한 세포 내 칼슘 항상성에서 주요한 미토콘드리아 역할의 기초가 되고 있다.

미토콘드리아 호흡은 내부 미토콘드리아 막 위에서 일어나며, 전자전달계를 통해 전자의 플로(flow)에 의해 달성되며, 이 계는 ATP 합성을 위한 부위로서 역할하는 추가 복합체(복합체 V)와 함께 4개의 복합체(복합체 I, II, III, 및 IV)을 함유한다. 임의 복합체의 활성에 대한 장애 또는 감소는 전자 플로를 방해하며, 미토콘드리아 호흡 기능장해를 일으킬 수 있다(예를 들어, Schildgen et al, Exp Hematol 2011;39:666-67510,11; Arthur et al, Mol Neurodegener 2009;4:37 참조). 미토콘드리아 대사 기능장해의 분석은 산소 전극 분석에 의해 검측될 수 있다(예를 들어, Chance and Williams, J Biol Chem 1955;217:383-393 참조). 분석에 의해 미토콘드리아 호흡 기능의 근본적인 이해를 가능하게 하였다. 미토콘드리아 호흡 기능부전(예를 들어, 세포사 유발, 반응성 산소 종 생성, 산화 DNA 손상 증가, 자식작용 증가, 미토콘드리아 막 전위 상실(예를 들어, 이상한 복합체 I 발현 및/또는 활성을 통해) 및 관련된 ATP 생성 감소)과 다수의 질병과 상태(예를 들어, 당뇨병, 비만, 알츠하이머병을 포함하여 노화 관련 신경퇴화, 뇌졸중, 인슐린 저항, 죽상경화증, 등) 사이의 관련성은 광범위하게 입증되었다(예를 들어, Miquel et al, Exp Gerontol 1980;15:575-591; McLean et al, Pharmacol Rev 2004;56:163-184; Kujoth et al, Science 2005;309:481-484; Guarente, Cell 2008; 132:171-176; Lopez-Lluch et al, Exp Gerontol 2008;43:813-819; Shigenaga et al, Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91: 10771-10778; Schaefer et al, Biochim Biophys Acta 2004; 1659: 115-120 참조).

본원은 셀렌(예를 들어, 셀렌 강화 효모 및 이로부터 얻어지거나 유도되는 셀렌 함유 화합물)을 포함하는 조성물 및 미토콘드리아 기능장해를 치료하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다. 특히, 본원은 셀렌 강화 효모(예를 들어, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모)를 포함하는 조성물, 이의 내부에 존재하고/하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물, 및 미토콘드리아 기능부전에 관련된 질병 또는 상태를 치료하기 위한 이의 사용 방법을 제공한다.

따라서 일부 실시형태에서, 본원은 단리된 셀렌 함유 화합물을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 셀렌 함유 화합물은 2,3-DHP-셀레노시스테인-시스테인, N-아세틸셀레노시스테인-셀레노호모시스테인, 메틸티오셀레노글루타티온, 2,3-DHP-셀레노시스테인-셀레노시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-시스테인일글리신, 2,3-DHP-셀레노시스테인-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노호모시스테인-시스테인일글리신, 셀레노메틸-셀레노글루타티온, 셀레노글루타티온-시스테인, 글루타티온-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-γ-글루타모일시스테인, 디-2,3-DHP-셀레노시스테인, N-아세틸시스테인-셀레노글루타티온, 셀레노글루타티온-셀레노시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-2,3 DHP 셀레노호모시스테인, 글루타티온-N-아세틸셀레노호모시스테인, 글루타티온 -셀레노시스테인일글리신, γ-글루타모일 셀레노시스테인-γ-글루타모일 시스테인, γ-글루타모일시스테인-2,3-DHP-셀레노시스테인, 글루타티온-2,3-DHP-셀레노시스테인, 글루타티온-2,3-DHP-셀레노호모시스테인, 디-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-γ-글루타모일시스테인, 셀레노글루타티온-2,3-DHP-셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-2,3-DHP-셀레노호모시스테인, 셀레노글루타티온-티오-2,3-DHP-셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-글루타티온, 셀레노디글루타티온, 디-셀레노글루타티온, 티오-디셀레노글루타티온, 메틸 데히드로호모시스테인, 셀레노메티오닌, 셀레노호모란티오닌, N-아세틸셀레노시스타티오닌, 데히드록시 5'-메틸셀레노아데노신, N-아세틸시스테인-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노란티오닌, 에틸셀레노아데노신, N-프로피오닐셀레노시스타티오닌, 2,3-DHP-셀레노시스타티오닌, 메틸셀레노글루타티온, γ-글루타모일셀레노시스타티오닌, 및 셀레노글루타티온으로부터 선택된다.

본원의 일부 실시형태에서, 셀렌 함유 화합물은 셀레노(히드록실)-셀레노펜-(3'-데옥시-아데노신), N-아세틸시스테인-셀레노호모시스테인, 알릴셀레노아데노실 호모시스테인, 셀레노-아데노실 호모시스테인, 셀레노-히드록시 아데노실 호모시스테인, 셀레노 아데노신, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀레녹시드, 아데노실-히드록시 셀레녹시드, 에틸 셀레노아데노신, 셀레노-(히드록시)-셀레노펜-(3'-데스옥시-아데노신), 아데노실-히드록시 셀레녹시드, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀레녹시드 및 이들의 조합을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

실시형태들에서, 조성물은 메틸 셀레노 아데노신, 셀레노(히드록실)-셀레노펜-(3'-데옥시-아데노신), N-아세틸시스테인-셀레노호모시스테인, 알릴셀레노아데노실 호모시스테인, 셀레노-아데노실 호모시스테인, 셀레노-히드록시 아데노실 호모시스테인, 셀레노 아데노신, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀레녹시드, 아데노실-히드록시 셀레녹시드, 에틸 셀레노아데노신, 셀레노-(히드록시)-셀레노펜-(3'-데스옥시-아데노신), 아데노실-히드록시 셀레녹시드, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀레녹시드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 화합물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 화합물 메틸셀레노아데노신을 포함한다. 실시형태들에서, 1 이상의 화합물은 단리되고/되거나 정제된다. 실시형태들에서, 조성물은 세포에서 미토콘드리아 기능을 증가시키거나 피루브산 탈수소효소 복합체의 활성을 증가시키는데 유용하다.

본원의 일부 실시형태에서, 셀렌 함유 화합물은 셀렌 함유 펩티드를 포함한다. 셀렌 펩티드를 포함하는 화합물의 예는 MVAEAEK, DYMGAAK, YMGAAK, ELQDIANPIMSK, NQAAMNPSNTVFDAK, NFTPEQISSMVLGK, NFTPEQISSMVLGK, MVSEAEK, PEVQGDMK, ELQDIANPIMSK, AMSSR, VQGSVIGIDLGTTNSAVAIMEGK, AAAEGPMK, LTGMAFR, PFVSNDYAAYMVK, AFGIEEGLMTTVHSLTATQK, PFITNDYAAYMFK, PGMVVTFAPAGVTTEVK, VETGVIKPGMVVTFAPAGVTTEVK, AAATAAMTK, SIVPSGASTGVHEALEMR, WMGK, SIVPSGASTGVHEALEMR, AMPQK, AAMAK, HVGDMEIR, VIEEPITSETAMK, VLQALEEIGIVEISPK, LPAASLGDMVMATVK, AGMTTIVR, AGMTTIVR, MLMPK, TMGAK, MNAGR, TYENMK, MGHDQSGTK, GEAIMAPK, Ac-MNVFGK, AMEVVASER, IVMR, MA(I/L)R, AMXAK, DLETLTMHTK, LVMR, VMR, LTGMAFR, SRPNVEVVALNDPFITNDYAAYMFK, 및 VINDAFGIEEGLMTTVHSLTATQK를 포함하나, 이들에 한정되지 않으며, 여기서 각 펩티드 단편은 셀렌 분자를 함유하고, 미토콘드리아 기능장해와 관련된 질병 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에서 이의 용도를 포함한다.

본원은 또한 대상(subject)에게 셀렌(예를 들어, 본원에서 기재한)을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 대상의 미토콘드리아 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 미토콘드리아 활성을 증가시키는 것은 미토콘드리아 ATP 생성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미토콘드리아 활성을 증가시키는 것은 미토콘드리아 물질대사를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미토콘드리아 활성을 증가시키는 것은 대상에서(예를 들어, 대상의 골격근, 간, 피질 또는 난소 조직에서) 반응성 산소 종 생성을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 미토콘드리아 활성 증가는 대상에서(예를 들어, 대상의 골격근 및/또는 간 조직에서) 향상된 글루코오스 물질대사를 얻는다. 일부 실시형태에서, 증가한 미토콘드리아 활성은 증가한 미토콘드리아 복합체 I 활성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 증가한 미토콘드리아 기능은 대상의 골격근에 존재하는 미토콘드리아에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 증가한 미토콘드리아 기능은 대상의 간에 존재하는 미토콘드리아에서 발생한다.

일부 실시형태에서, 셀렌을 포함하는 조성물은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모, 셀레노에테르, 디펩티드 및/또는 트리펩티드를 함유하는 SeCys 복합체(conjugate), 셀로놀, 및 셀레녹시드로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 셀렌 함유 성분은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모로부터 얻어지거나 유도된다. 실시형태들에서, 셀렌 함유 성분은 SeCys 또는 SeMet 펩티드, 셀렌 함유 아데노실 분자, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 실시형태에서, 셀렌 함유 화합물은 메틸셀레노아데노신 또는 류신-발린-셀레노메티오닌-아르기닌이다.

실시형태들에서, 세포에서 미토콘드리아 기능을 증가시키는 방법은 단리된 5' 메틸셀레노아데노신, LVSe-MR 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유효량은 조성물에 노출되지 않은 세포와 비교하여 세포에서 미토콘드리아 기능을 증가시킨다.

다른 실시형태들에서, 세포에서 피루브산 탈수소효소 복합체를 증가시키는 방법은 5' 메틸셀레노아데노신을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유효량은 조성물에 노출되지 않은 세포와 비교하여 세포에서 피루브산 탈수소효소 복합체의 활성을 증가시킨다.

일부 실시형태에서, 대상은 미토콘드리아 기능장해와 관련된 질병 또는 상태가 있거나 이러한 위험이 있다. 본원은 미토콘드리아 기능장해와 관련된 질병 또는 상태의 형태에 의해 한정되지 않는다. 실제로, 본원의 조성물과 방법은 다양한 질병과 상태(예를 들어, 본원에서 개시한 것들)에 대한 용도를 알아낸다. 일부 실시형태에서, 대상은 심근병증이 있다. 일부 실시형태에서, 대상은 근감소증이 있다. 일부 실시형태에서, 대상은 근육 단백질 손실이 있다.

본원은 추가로 셀렌(예를 들어, 본원에서 기재한)을 포함하는 조성물의 유효량을 글루코오스 물질대사 증가를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상에서 글루코오스 물질대사를 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 투여로 대상에서 미토콘드리아 활성 증가를 얻는다. 일부 실시형태에서, 향상된 글루코오스 물질대사는 대상의 골격근에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 향상된 글루코오스 물질대사는 간에서 일어난다.

본원은 대상에게 셀렌(예를 들어, 본원에서 기재한)을 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 변경된 미토콘드리아 기능과 관련된 질병 또는 상태가 있는 대상을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 투여로 대상에서 미토콘드리아 활성을 증가시키고, 이로써 질병 또는 상태에 대해 대상을 치료한다.

본원은 셀렌을 포함하는, 투여된 조성물에 의해 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 셀렌을 포함하는 조성물은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원은 셀렌 강화 효모(예를 들어, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모)로부터 제조되는 셀렌 함유 분획(fraction)의 용도와 투여를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 셀렌을 포함하는 조성물은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 수용성 분획을 포함한다. 일부 실시형태에서, 셀렌을 포함하는 조성물은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 수 불용성 분획을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상에게 투여되는, 셀렌을 포함하는 조성물은 셀렌 강화 효모의 추출물을 포함하는 단일, 액상(예를 들어, 산성 조건 하 가용성(제1 pH(예를 들어, pH 1.85)에서 추출되고/되거나 침전되는 가용성 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 가용성 셀레노당단백질)의 분획, 제2 pH(예를 들어, pH 3.0)에서 침전되는 제2 분획, 제3 pH(예를 들어, pH 4.0)에서 침전되는 제3 분획, 및 제4 pH(예를 들어, pH 6.0)에서 침전되는 제4 분획))을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원은 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 셀렌 강화 효모(예를 들어, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모)부터 얻어지거나 유도되는) 또는 이의 유도체의 용도와 투여를 제공한다. 본원은 사용되는, 1 이상의 셀렌 함유 화합물에 의해 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 1 이상의 셀렌 함유 화합물은 본원에서 기재한, 셀레노에테르, 디펩티드 및/또는 트리펩티드를 함유하는 SeCys 복합체, 셀로놀 또는 셀레녹시드(또는 이들의 유도체), 셀렌 함유 단백질 및/또는 셀렌 함유 펩티드이다.

예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상에게 투여되는(예를 들어, 본원의 방법에서) 셀렌 함유 성분을 포함하는 조성물은 2,3-DHP-셀레노시스테인-시스테인, N-아세틸셀레노시스테인-셀레노호모시스테인, 메틸티오셀레노글루타티온, 2,3-DHP-셀레노시스테인-셀레노시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-시스테인일글리신, 2,3-DHP-셀레노시스테인-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노호모시스테인-시스테인일글리신, 셀레노메틸-셀레노글루타티온, 셀레노글루타티온-시스테인, 글루타티온-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-γ-글루타모일시스테인, 디-2,3-DHP-셀레노시스테인, N-아세틸시스테인-셀레노글루타티온, 셀레노글루타티온-셀레노시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-2,3 DHP 셀레노호모시스테인, 글루타티온-N-아세틸셀레노호모시스테인, 글루타티온 -셀레노시스테인일글리신, γ-글루타모일 셀레노시스테인-γ-글루타모일 시스테인, γ-글루타모일시스테인-2,3-DHP-셀레노시스테인, 글루타티온-2,3-DHP-셀레노시스테인, 글루타티온-2,3-DHP-셀레노호모시스테인, 디-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-γ-글루타모일시스테인, 셀레노글루타티온-2,3-DHP-셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-2,3-DHP-셀레노호모시스테인, 셀레노글루타티온-티오-2,3-DHP-셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-글루타티온, 셀레노디글루타티온, 디-셀레노글루타티온, 티오-디셀레노글루타티온, 메틸 데히드로호모시스테인, 셀레노메티오닌, 셀레노호모란티오닌, N-아세틸셀레노시스타티오닌, N-아세틸시스테인-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노란티오닌, N-프로피오닐셀레노시스타티오닌, 2,3-DHP-셀레노시스타티오닌, 메틸셀레노글루타티온, γ-글루타모일셀레노시스타티오닌, 또는 셀레노글루타티온 중 1 이상을 포함한다.

실시형태들에서, 셀렌 함유 화합물은 데히드록시 5'-메틸셀레노아데노신, 셀레노(히드록실)-셀레노펜-(3'-데옥시-아데노신), 에틸셀레노아데노신, 알릴셀레노아데노실 호모시스테인, 셀레노-아데노실 호모시스테인, 셀레노-히드록시 아데노실 호모시스테인, 셀레노 아데노신, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀로녹시드, 아데노실-히드록시 셀레녹시드, 에틸 셀레노아데노신, 셀레노-(히드록시)-셀레노펜-(3'-데스옥시-아데노신), 또는 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀레녹시드 중 1 이상을 포함한다.

일부 실시형태에서, 대상에게 투여되는(예를 들어, 본원의 방법에서) 셀렌을 포함하는 조성물은 1 이상의 단백질 또는 펩티드 단편을 포함하며, 여기서 단백질 또는 펩티드의 1 이상의 아미노산 잔기 내에 존재하는 1 이상의 황 분자는 셀렌 분자에 의해 치환된다. 본원은 특정 셀렌 함유 단백질 또는 펩티드에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상에게 투여되는, 셀렌을 포함하는 조성물은 펩티드의 1 이상의 아미노산 잔기 내에 존재하는 1 이상의 황 분자가 셀렌 분자에 의해 치환되는 1 이상의 펩티드 단편을 다음으로부터 포함한다: ELQDIANPIMSK, NQAAMNPSNTVFDAK, NFTPEQISSMVLGK, NFTPEQISSMVLGK, MVSEAEK, PEVQGDMK, ELQDIANPIMSK, AMSSR, VQGSVIGIDLGTTNSAVAIMEGK, AAAEGPMK, LTGMAFR, PFVSNDYAAYMVK, AFGIEEGLMTTVHSLTATQK, PFITNDYAAYMFK, PGMVVTFAPAGVTTEVK, VETGVIKPGMVVTFAPAGVTTEVK, AAATAAMTK, SIVPSGASTGVHEALEMR, WMGK, SIVPSGASTGVHEALEMR, AMPQK, AAMAK, HVGDMEIR, VIEEPITSETAMK, VLQALEEIGIVEISPK, LPAASLGDMVMATVK, AGMTTIVR, AGMTTIVR, MLMPK, TMGAK, MNAGR, TYENMK, MGHDQSGTK, GEAIMAPK, Ac-MNVFGK, AMEVVASER, IVMR, MA(I/L)R, AMXAK, DLETLTMHTK, LVMR, VMR, LTGMAFR, SRPNVEVVALNDPFITNDYAAYMFK, 및 VINDAFGIEEGLMTTVHSLTATQK.

일부 실시형태에서, 조성물(예를 들어, 약학 조성물)은 2 이상(예를 들어, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 또는 50 이상)의 상이한 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 본원에서 기재한 화합물들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원은 특정 용도(예를 들어, 결합할 때 원하는 수준의 생물 활성(예를 들어, 자극 및/또는 억제 활성을 나타내는)에 맞춰진 2 이상(예를 들어, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 또는 50 이상)의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 단리되거나, 화학적으로 합성되거나, 재조합된 셀렌 함유 화합물)의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다.

예를 들어, 일부 실시형태에서, 2 이상의 셀렌 함유 화합물의 조합을 포함하는 제1 조성물은 근육 조직에서 미토콘드리아 활성(예를 들어, ATP 생성 및/또는 호흡)을 향상시키는데 사용되며, 반면에 2 이상의 상이한 셀렌 함유 화합물의 조합을 포함하는 제2 조성물(예를 들어, 제1 조성물과 다른 생물 활성을 나타내는)은 간 조직에서 미토콘드리아 활성을 변경하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 2 이상의 셀렌 함유 화합물을 포함하는 조성물은 개체의 특정 유전자 프로파일(예를 들어, 특정 유전자 또는 단백질을 표적으로 삼는)로 맞춰진다.

효모 추출물 또는 분획은 유사한 방식으로 개체에서 특정 질병 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위해 맞춰질 수 있다. 이러한 방식으로, 맞춤 제제(custom formulation)는 치료가 필요한 개체 대상을 위해 개발된다. 일부 실시형태에서, 본원의 셀렌을 포함하는 조성물을 투여하는 대상은 미토콘드리아 기능장해와 관련되는 상태 또는 질병이 있거나 이러한 위험이 있다. 본원은 미토콘드리아 기능장해의 위험이 있거나 기능장해가 있는 대상의 형태에 의해 한정되지 않는다. 실제로, 본 기술에서는 미토콘드리아 기능장해에 유전적으로 걸리기 쉬운 대상을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 다양한 대상이 미토콘드리아 기능장해에 위험이 있거나 기능장해가 있다는 사실을 잘 알고 있다.

실시형태들에서, 대상은 심근병증, 근감소증, 또는 근 단백질 상실을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 상태 또는 질병이 있다.

일 실시형태에서, 근 세포의 단백질 함량을 증가시키는 방법은 근 세포에 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유효량은 근 세포에서 단백질을 증가시킨다. 다른 실시형태에서, 근감소증을 치료하는 방법은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모를 포함하는 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유효량은 근감소증의 증상을 개선한다.

실시형태들에서, 심근병증을 치료하는 방법은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모를 포함하는 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유효량은 심근병증의 증상을 개선한다.

또 다른 양태에서, 본원은 심근 세포, 골격근 세포, 및/또는 간 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위해(예를 들어, 증가시키거나 감소시키기 위해) 제공된다.

다른 실시형태들에서, 심근 세포에서 전사 활성을 조절하는 방법은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모를 포함하는 조성물의 유효량을 심근 세포에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유효량은 심근 세포에서 NFATc2/c3 및/또는 Foxo3 전사 활성을 조절하는데 효과적이다. 추가 실시형태들에서, NFATc2/c3 전사 활성은 조성물에 노출되지 않은 근세포와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모와 접촉된 심근 세포에서 감소한다. 다른 실시형태들에서, NFATc2/c3의 인산화는 조성물에 노출되지 않은 근세포와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모와 접촉된 심근 세포에서 증가한다. 실시형태들에서, Foxo3 전사 활성은 조성물에 노출되지 않은 근세포와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모와 접촉된 심근 세포에서 증가한다.

실시형태들에서, 심근 세포에서 유전자 발현을 감소시키는 방법은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모를 포함하는 조성물의 유효량을 심근 세포에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유효량은 Myh7, Ankrd1, Lcn2, pS6K1, 및 이들의 조합의 발현을 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 심근 세포에서 유전자 발현을 증가시키는 방법은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모를 포함하는 조성물의 유효량을 심근 세포에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유효량은 조성물에 노출되지 않은 심근 세포와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모와 접촉된 심근 세포에서 Atm, Gadd45g, Gsk3b, UCP2, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현을 증가시킨다.

다른 실시형태들에서, 골격근 세포에서 1 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 방법은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모를 포함하는 조성물의 유효량을 골격근 세포에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유효량은 조성물에 노출되지 않은 골격근 세포와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모와 접촉된 골격근 세포에서 미오스타틴(myostatin), Avcr2b, mTOR, S6K1, Gsk3b, Fxbo32, Trim 63, 및 Nr2f2 중 1 이상 또는 전체의 발현을 감소시킨다. 실시형태들에서, 골격근 세포에서 1 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 방법은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모를 포함하는 조성물의 유효량을 골격근 세포에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유효량은 조성물에 노출되지 않은 골격근 세포와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모와 접촉된 골격근 세포에서 Prkaa2, Myf6, Des, 및 PGCla 중 1 이상 또는 전체의 발현을 증가시킨다.

다른 실시형태들에서, Nr2F2로 이루어진 군에서 선택되는 유전자의 발현은 셀렌 결핍 사료를 급식한 동물의 간 세포에서 유전자 발현과 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모가 있는 사료를 급식한 동물의 간 세포에서 증가한다.

다른 실시형태들에서, 세포에서 미토콘드리아 기능을 증가시키는 방법은 단리된, 5' 메닐셀레노아데노신, LVSe-MR 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 유효량은 조성물에 노출되지 않은 세포와 비교하여 세포에서 미토콘드리아 기능을 증가시킨다. 다른 실시형태들은 단리된 5' 메틸셀레노아데노신을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 세포에서 피루브산 탈수소효소 복합체를 증가시키는 방법을 포함하며, 여기서 유효량은 조성물에 노출되지 않은 세포와 비교하여 세포에서 피루브산 탈수소효소 복합체의 활성을 증가시킨다.

본원의 추가 실시형태들에서, 메틸셀레노아데노신, 셀레노(히드록실)-셀레노펜-(3'-데옥시-아데노신), N-아세틸시스테인-셀레노호모시스테인, 알릴셀레노아데노실 호모시스테인, 셀레노-아데노실 호모시스테인, 셀레노-히드록시 아데노실 호모시스테인, 셀레노 아데노신, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀로녹시드, 아데노실-히드록시 셀레녹시드, 에틸 셀레노아데노신, 셀레노-(히드록시)-셀레노펜-(3'-데스옥시-아데노신), 아데노실-히드록시-셀레녹시드, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀레녹시드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 단리된 화합물을 포함하는 조성물이 제공된다. 실시형태들에서, 단리된 화합물은 메틸셀레노아데노신이다. 다른 실시형태들에서, 조성물은 세포에서 미토콘드리아 기능을 증가시키는데 사용하기 위한 것이다.

일부 실시형태에서, 대상에게 투여되는, 셀렌을 포함하는 조성물의 양은 미토콘드리아 기능장해 및/또는 이와 관련된 질병 또는 상태의 진행을 늦추거나, 중단하거나 역행하는 것이 필요한 대상에서 독성을 최소화하면서 이를 행하는 유효량이다. 일부 실시형태에서, 본원의 셀렌(예를 들어, 유기 셀렌(예를 들어, 셀렌화(selenized) 효모(예를 들어, SEL-PLEX) 또는 여기에 존재하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물)을 포함하는 조성물은 1일당 대상에게 25 내지 800 ㎍의 셀렌을 제공하도록 1일 용량으로 투여된다(예를 들어, SEL-PLEX는 대상에게 매일 25 내지 800 ㎍의 셀렌을 제공하는 방식으로 대상에게 투여된다). 그러나 본원은 이대로 한정되지 않는다. 실제로, 일부 실시형태에서, 본원의 셀렌을 포함하는 조성물은 1일당 대상에게 25 미만(예를 들어, 24, 23, 22, 21, 20, 또는 그 이하) 또는 800 초과(예를 들어, 825, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 또는 그 이상) ㎍ 사이에 제공하도록 1일 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 셀렌(예를 들어, 유기 셀렌(예를 들어, 셀렌화 효모(예를 들어, SEL-PLEX)))은 1일당 200 내지 500 ㎍의 1일 용량으로 투여된다. 다른 실시형태들에서, 셀렌은 1일당 200 내지 400 ㎍의 1일 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 셀렌(예를 들어, 유기 셀렌(예를 들어, 셀렌화 효모(예를 들어, SEL-PLEX)))의 단일 용량은 1일 1회 투여된다. 다른 실시형태들에서, 2, 3, 4, 이상의 용량이 매일 투여된다. 일부 실시형태에서, 1일 용량은 25-75 ㎍의 셀렌이다. 다른 실시형태들에서, 1일 용량은 200 ㎍의 셀렌(예를 들어, 유기 셀렌(예를 들어, 셀렌화 효모(예를 들어, SEL-PLEX)))이다.

본원은 또한 미토콘드리아 기능장해의 치료가 필요한 대상에게 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 수용성 분획, 및 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 수 불용성 분획으로 이루어진 군에서 선택되는 셀렌을 포함하는 조성물; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 미토콘드리아 기능장해를 치료하는 방법을 제공한다.

본원은 또한 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 유효량을 미토콘드리아 기능장해와 관련된 질병 또는 상태의 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 미토콘드리아 기능장해와 관련된 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다.

도 1은 샘플의 완전 가용화를 가능하게 하는 연속 추출 과정과 본원의 일 실시형태에 대한 개별 분획에서 셀레노메티오닌의 측정을 도시한다.
도 2는 음이온 교환 HPLC-ICP-MS에 의해 셀렌(Se) 농후 효모에서 셀레노메티오닌의 측정을 도시한다. 삽화는 SEC-ICP-MS에 의한 소화(digestion)의 완료 증거를 보여준다(고분자량 분획과 칼럼으로부터 정량적 회수물에서 Se가 존재하지 않는다).
도 3은 본원의 일 실시형태에 따라 셀렌화 효모에 존재하는 수용성 및 수 불용성 분획을 얻고, 확인하기 위한 전형적인 방법을 도시한다.
도 4는 셀렌 대사 물질에 대한 HPLC-ICP-MS를 도시한다. (a) 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)-ICP-MS; (b) 이온 쌍 (HFBA) 역상 HPLC-ICO-MS.
도 5는 수 추출물의 사이즈 배제-ICP MS 크로마토그램을 도시한다(76Se-진한 회색 라인, 77Se-흑색 라인, 78Se 옅은 회색 라인).
도 6은 SUPERDEX 펩티드 칼럼 후 수 추출물의 사이즈 배제-ICP MS 크로마토그램을 도시한다(76Se-진한 회색 라인, 77Se-흑색 라인, 78Se 옅은 회색 라인).
도 7은 샘플의 SEC 펩티드 크로마토그램을 도시한다: a) 수 추출물, b) 분리된 피크 I, c) 트립신에 의해 분해된 피크 I, d) 프로테아제에 의해 분해된 수 추출물; 흑색 라인-80Se, 옅은 회색 라인 78Se, 진한 회색 라인-77Se.
도 8은 a) 도 7a의 수 추출물의 펩티드 크로마토그램 및 b) 도 7a에 도시된 SEC 칼럼으로부터 58분에 용출한 피크의 역상(RP) 크로마토그램을 도시한다.
도 9는 질량 분석 및 오르비트랍(Orbitrap)과 연결한 역상 크로마토그래피를 사용하여 도 8b에 도시한 SEC 칼럼으로부터 58분에 용출한 셀레노 화합물의 동정을 도시한다.
도 10은 용출 순서로 존재한 셀렌 농후 효모의 수용성 추출물의 아분획(sub-fraction)의 역상 HPLC-ICP MS를 도시한다. 아분획 1-10이 도시된다.
도 11은 샘플의 아분획 8에서 확인된 셀렌 함유 펩티드의 질량 분석을 도시한다.
도 12는 트립신 소화 물질의 아분획의 크로마토그램을 도시한다. 아분획 1-10이 도시된다.
도 13은 셀렌 강화 효모로부터 수용성 추출물의 아분획에 대한 트립신 소화물(thryptic digestate)에서 발견된 셀렌 함유 펩티드의 리스트를 도시한다(MW-분자량, Z-이온화 상태).
도 14는 SELPLEX a) 전체 샘플 및 b) 분리된 분획의 역상 ICP MS 크로마토그램에 존재한 셀렌 함유 화합물의 양이온 교환 HPLC-ICP MS 프로파일을 도시한다.
도 15는 질량 분석과 오르비트랍을 사용하여 SELPLEX에서 확인된 셀렌 함유 화합물의 리스트를 도시한다.
도 16은 산성 매질(상부 패널) 및 염기성 매질(하부 패널)에서 용출되는 개별 SPE 분획에서 셀렌 종의 분자량(SEC-ICP MS) 프로파일을 도시한다.
도 17은 효모 단백질 추출물의 트립신 소화에 대한 SEC 분별을 도시한다.
도 18은 개별 SEC 분획의 프로파일을 도시한다.
도 19는 샘플 L09-4531의 블럿(blot)과 블럿 피스(piece) 번호 VI과 VII에 대한 RP ICP MS 크로마토그램을 도시한다.
도 20은 블럿 샘플 추출물(수 불용성)에서 발견된 셀렌 함유 화합물의 전형적인 MS 스펙트럼을 도시한다.
도 21은 블럿 샘플의 ID 겔 전기영동, HPLC 분석 전 블럿 소화, ICP MS 분석 및 블럿 샘플의 MS/MS(오르비트랍) 분석을 사용하여 셀렌 강화 효모의 수 불용성 추출물로부터 확인된 셀렌 함유 펩티드의 리스트를 제공한다.
도 22는 13월령 PolG 마우스에서 Myh7과 Ankrd1을 포함하는 높은 비대 표지 유전자가 있는 심장 비대를 도시한다. (A) 13-14월령 PolG 마우스로부터 확대된 심장 크기와 심근 세포. 사진을 다이(Dai) 외 그의 공동 연구가(2010)로부터 채택한다. (B) 13월령 PolG 심장에서 높은 Myh7과 Ankrd1 발현(진한 막대). 발현 수준을 Actb mRNA에 의해 표준화하였고, 평균±SEM(n=6)로서 표시하였다. 2월령 PolG 심장에서 이들의 발현(옅은 막대)과 비교할 때, ^* P<0.01.
도 23은 실시간 PCR 및 웨스턴 블럿 분석에 의해 셀렌을 셀렌 농후 효모의 형태로 투여한 마우스로부터 마우스 심근에서 비대 표지 Myh7과 Ankrd1의 감쇠 발현을 도시한다. A. 실시간 PCR에 의해 대조(SD) 및 처리된(SP) 어리고, 나이 든 PolG 마우스에서 Myh7 mRNA(상부 패널)의 심장 발현, 및 웨스턴 블럿 분석에 의해 대조(SD) 및 처리된(SP) 더 나이 든 PolG 마우스의 Myh7 단백질(중간 패널)의 심장 발현. 상대 Myh7 단백질 발현(각 샘플에서 Actb 단백질에 의해 표준화됨)이 하부 패널에 도시되어 있다. B. 대조(SD) 및 처리된(SP) 어리고, 나이 든 PolG 마우스에서 Ankrd1 mRNA(상부 패널)의 심장 발현, 및 대조(SD) 및 처리된(SP) 더 나이 든 PolG 마우스에서 Ankrd1 단백질(중간 패널)의 심장 발현. 정량적인 Myh7 단백질 발현(각 샘플에서 Actb 단백질에 의해 표준화됨)이 하부 패널에 도시되어 있다. A와 B 둘 다에 대해, 데이터는 마우스의 표시된 수의 평균±sem으로서 표시된다. 동일한 연령에서 대조에 대해 ^* P<0.05, ^** P<0.01.
도 24는 셀렌 농후 효모의 형태로 셀렌 투여를 통해 마우스 심장에서 Nfat 신호 전달의 조절을 도시한다. A. 심장 비대에서 Cn/Nfat 신호 전달의 개략도. Nfat 활성은 칼시뉴린; S6K와 Gsk3b를 포함한 경로에 의해 조절된다. 회색 문자는 셀렌 농후 효모의 형태로 셀렌에 의해 조절되는 본원의 실시형태들의 진행 중 수행된 실험 동안 확인된 심장에서 분자 타깃을 나타낸다. B. 13월령에서 대조(SD) 및 처리된(SP) 마우스로부터 심장에서 Cn-A, pNfatc2, Gsk3b 및 pS6K1의 웨스턴 블럿 분석. C. 웨스턴 블럿에서 pNfatc2, Gsk3b 및 pS6K1 단백질 수준(Actb 또는 튜블린에 의해 표준화됨)의 정량적 분석. C에서, 데이터는 그룹당 4마리 마우스의 평균±sem으로서 표시된다. ^* P<0.05, ^** P<0.01.
도 25는 셀렌을 셀렌 농후 효모의 형태로 함유하는 사료를 374일간 투여한 PolG 마우스에서 항 비대 유전자인, Foxo3의 향상된 심장 발현을 도시한다. (A). polG 심장에서 우세한 Foxo3 발현, 및 대조(SD) PolG 마우스와 비교하여 처리된(SP) PolG 마우스에서 높은 심장 Foxo3 발현을 보여주는 Foxo류 멤버 유전자의 QRT-PCR. (B-C). 374일간 셀렌(SP) 처리 후 polG 마우스의 심장에서 높은 Foxo3 단백질 수준. A와 C에서, 데이터는 마우스의 표시된 수의 평균±sem으로서 표시된다. SD 대조에 대해 ^* P<0.05.
도 26은 PolG 마우스에서 mRNA 수준에서 Atm과 Gadd45g 발현의 조절을 도시한다. A. PolG 마우스에서 심장 Atm 발현의 연령 의존 감소, 및 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여를 통해 이러한 감소의 중지를 보여주는 QRT-PCR. B. 374일간 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여 처리 후 PolG 마우스에서 높은 Gadd45g mRNA 발현. 데이터는 그룹당 마우스의 표시된 수의 평균±sem으로서 표시된다. 막대그래프에서 상이한 문자는 ANOVA 분석 이어서 스튜던트 티 검정(Student's t-test)에 의해 측정된 중요한 차이를 나타낸다.
도 27은 QRT-PCR에 의해 PolG 심장에서 셀렌 처리에 의한 Ucp1-3 mRNA 발현의 조절을 도시한다. 데이터는 그룹당 마우스의 표시된 수의 평균±sem으로서 표시된다. 대조에서 Ucp2 발현과 비교할 때 ^** P<0.01.
도 28은 PolG 마우스에서 심장 Lcn2 발현의 연령 의존 증가 및 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여를 통해 연령 의존 증가 발현의 억제를 보여주는 QRT-PCR을 도시한다. 데이터는 6마리 마우스의 평균±sem으로서 표시된다. 막대그래프에서 상이한 문자는 ANOVA 분석 이어서 스튜던트 티 검정에 의해 측정된 중요한 차이를 나타낸다.
도 29는 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(SP, SELPLEX)의 형태로 셀렌으로 보충되거나 셀렌으로 보충되지 않은(SD) 사료를 3개월간 급식한 정상 마우스로부터 골격근에서 높은 총 단백질 수준을 도시한다. 데이터는 그룹당 마우스의 표시된 수의 평균±sem으로서 표시된다. 데이터는 그룹당 마우스의 표시된 수의 평균±sem으로서 표시된다. P<0.01.
도 30은 셀레노메티오닌(SM)의 형태로 셀렌에 의해 보충되거나, 아셀렌산나트륨(SS)의 형태로 셀렌에 의해 보충된 대조 사료 또는 셀렌으로 보충되지 않은 사료와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(SP)의 형태로 셀렌에 의해 보충된 사료에 의해 3개월간 급식한 정상 마우스의 골격근에서 단백질 합성에 대한 단백질 신장에 관련된 유전자의 높은 발현의 존재를 나타내는 마이크로어레이(microarray) 분석으로부터 얻어진 데이터를 도시한다. 데이터는 평균±sd(n=6)으로서 표시된다.
도 31은 셀레노메티오닌(SM)의 형태로 셀렌에 의해 보충되거나, 아셀렌산나트륨(SS)의 형태로 셀렌에 의해 보충된 대조 사료 또는 셀렌으로 보충되지 않은 사료와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(SP)의 형태로 셀렌에 의해 보충된 사료에 의해 3개월간 급식한 정상 마우스의 골격근에서 단백질 합성(Gsk3b, mTor, S6K1)에 관련된 분자의 감소한 발현 및 단백질 합성(Prkaa2)에 대한 주요 신호 전달 분자의 향상된 발현의 존재를 나타내는 마이크로어레이 분석으로부터 얻어진 데이터를 도시한다. 데이터는 평균±sd(n=6)으로서 표시된다.
도 32는 셀레노메티오닌(SM)의 형태로 셀렌에 의해 보충되거나, 아셀렌산나트륨(SS)의 형태로 셀렌에 의해 보충된 대조 사료 또는 셀렌으로 보충되지 않은 사료와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(SP)의 형태로 셀렌에 의해 보충된 사료에 의해 3개월간 급식한 정상 마우스의 골격근에서 위축 유전자 Trim63 및 Fbxo32에 대한 상당히 감소한 발현을 도시한다. 데이터는 평균±sd(n=6)으로서 표시된다.
도 33은 셀레노메티오닌(SM)의 형태로 셀렌에 의해 보충되거나, 아셀렌산나트륨(SS)의 형태로 셀렌에 의해 보충된 대조 사료 또는 셀렌으로 보충되지 않은 사료와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(SP)의 형태로 셀렌에 의해 보충된 사료에 의해 3개월간 급식한 정상 마우스의 골격근에서 Acvr2b의 상당히 감소한 발현을 도시한다. 데이터는 평균±sd(n=6)으로서 표시된다.
도 34는 셀레노메티오닌(SM)의 형태로 셀렌에 의해 보충되거나, 아셀렌산나트륨(SS)의 형태로 셀렌에 의해 보충된 대조 사료 또는 셀렌으로 보충되지 않은(SD) 사료와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(SP)의 형태로 셀렌에 의해 보충된 사료에 의해 3개월간 급식한 정상 마우스의 골격근에서 분화된 근 부수체(줄기)의 높은 발현을 도시한다. 데이터는 평균±sd(n=6)으로서 표시된다.
도 35는 본원의 실시형태의 개발 중 수행된 실험 동안 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 여기에 존재한 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 셀렌이 투여되는 대상에서 총 골격근 단백질 질량을 증가시키는 이에 의해 조절되는 경로의 여러 비제한적인 예를 도시한다.
도 36은 대조(Exp 1, 셀렌 보충 무, Exp 2, 셀레노메티오닌으로 보충)와 비교하여 셀렌 강화 효모(Exp 4)의 형태로 셀렌이 투여된 마우스의 골격근에서 MAP2K2의 감소한 발현을 도시한다. 아셀렌산나트륨(Exp 3)은 또한 마우스의 골격근에서 MAP2K2의 발현을 감소시켰다.
도 37은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌이 투여된 대상은 피질 조직에서 그리고 비복근 조직에서 FTO 유전자의 상당히 감소한 수준을 나타냈다는 사실을 보여준다. Exp 1은 대조(SD) 마우스에서 FTO 발현을 나타내며, Exp 2는 셀레노메티오닌 급식 마우스에서 FTO 발현을 나타내고, Exp 3은 아셀렌산나트륨 급식 마우스에서 FTO 발현을 나타내며, Exp 4는 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(SELPLEX) 급식 마우스에서 FTO 발현을 나타낸다.
도 38은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(SP)의 형태로 셀렌의 투여가 대조 대상(SD)과 비교하여 골격근에서 PGC1-α 발현의 상당한 향상 및 Nr2F2 발현의 상당한 감소를 얻었다는 사실을 보여준다. ^*p<0.05.
도 39는 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(SP)의 형태로 셀렌의 투여가 대조 대상(SD)과 비교하여 간에서 PGC1-α 발현의 상당한 향상 및 Nr2F2 발현의 상당한 감소를 얻었다는 사실을 보여준다. ^*p<0.05.
도 40은 (A) 대조(C), LVSe-MR(C₂₂H₄₄N₇O₅Se)(#6) 및 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅0₃Se)(#9)의 존재 하에 3개의 상이한 호흡 상태(ATP 합성(상태 III), 복합체 I 의존(NADH-구동) 최대 호흡 용량(상태 Vfccp), 및 복합체 II(FADH-구동) 의존 최대 호흡 용량(상태 Vsucc)을 포함)에서 측정한 미토콘드리아 산소 소비 속도(OCR) 파라미터를 도시한다. (B)는 셀렌 함유 펩티드 LVSe-MR은 대조와 비교하여 상태 III(7.7%), 상태 V_FCCP(13.3%) 및 상태 V_succ(9.6%) 증가시켰다는 사실을 보여준다. 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se)(#9)은 옥시섬(oxytherm)을 사용한 대조와 비교하여 상태 III(29.9%), 상태 V_FCCP(17.3%) 및 상태 V_succ(15.3%) 증가시켰다.
도 41은 0, 50, 500, 및 1000 십억당부(PPB, prat per billion)의 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se)(#9) 존재 하에 미토콘드리아 효소 활성(PDHC 활성, 복합체 I 활성, 및 복합체 IV 활성)을 도시한다.

정의

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효모" 및 "효모 세포"는 세포벽, 세포막 및 세포 내 성분이 있는 균계로 분류되는 진핵 미생물을 의미한다. 효모는 특이한 분류 또는 계통발생 집단화를 형성하지 않는다. 현재 약 1,500 종이 알려져 있으며; 모든 효모 종 중 1%만이 기술되었다고 평가된다. 용어 "효모"는 흔히 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae)와 동의어로 취하지만, 효모의 계통발생 다양성은 자낭균문과 담자균문 둘 다에서 이들의 배치에 의해 제시된다. 출아 효모("진정 효모")는 효모균목(Saccharomycetales)으로 분류된다. 일부 효모 종은 이분열에 의해 생식하지만, 대부분의 효모 종은 출아에 의해 무성 생식한다. 일부 종은 가성 균사, 또는 가 균사로서 알려진 일련의 연결 출아 세포의 형성을 통해 다세포로 되지만, 효모는 단세포이다. 효모 크기는 종에 따라 크게 달라질 수 있으며, 일부 효모는 40 ㎛ 이상 도달할 수 있지만, 전형적으로 직경 3-4 ㎛로 측정된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 모두 공유 "펩티드 결합"에 의해 연결되는 아미노산의 일차 서열을 의미한다. 일반적으로, 펩티드는 소수 아미노산, 전형적으로 2-50개 아미노산으로 이루어지며, 단백질보다 더 짧다. 용어 "폴리펩티드"는 펩티드와 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 합성이며, 한편 다른 실시형태에서, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 또는 천연이다. 합성 펩티드는 시험관 내 인공 수단에 의해 제조되는(즉, 생체 내에서 생산되지 않았던) 펩티드이다.

용어 "샘플" 및 "시편"은 이들의 가장 넓은 의미로 사용되며, 임의의 원료로부터 얻어지는, 샘플 또는 시편을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플"은 동물(인간을 포함)로부터 얻어지는 생물학적 샘플을 의미하는데 사용되며, 유체, 고체, 조직, 및 기체를 포함한다. 본원의 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 뇌척수액(CSF, cerebrospinal fluid), 장액, 오줌, 침, 혈액, 및 혈장, 혈청 등과 같은 혈액 제제를 포함한다. 그러나 이들 예는 본원에 의한 용도를 발견하는 샘플 형태를 한정하는 것으로 해석되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "셀렌 강화 효모" 및 "셀렌화 효모"는 무기 셀렌 염을 함유하는 배지에서 배양되는 임의 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae))를 의미한다. 본원은 사용되는 셀렌 염에 의해 한정되지 않는다. 실제로, 아셀렌산나트륨, 셀렌산나트륨, 아셀렌산코발트 또는 셀렌산코발트를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 다양한 셀렌 염이 본원에서 유용하다고 예상된다. 유리 셀레노메티오닌(예를 들어, 세포 또는 효모와 관련되지 않는)이 또한 셀렌 강화 효모용 셀렌 원으로서 사용될 수 있으며, 그 이유는 효모가 이러한 형태의 셀렌을 포함하기 때문이다. 배양 중에, 셀렌과 황 사이의 화학적 유사성 때문에, 효모는 세포 내에서 통상 황 함유 유기 화합물인 것에서 황 대신에 셀렌을 포함한다. 이러한 효모 제제에서 셀렌 함유 화합물은 폴리펩티드/단백질에 포함되는 형태로 존재할 셀레노메티오닌이다. 이러한 제제에서 셀레노메티오닌의 형태로 존재하는 총 세포 셀렌의 양은 달라질 것이지만, 10 내지 100%, 20-60%, 50-75% 및 60 내지 75%일 수 있다. 셀렌화 효모 제제에서 유기 셀렌의 나머지는 대부분 셀레노메티오닌 생합성을 위한 경로에서 중간체로 구성된다. 이들은 셀레노시스테인, 셀레노시스타티오닌, 셀레노호모시스테인 및 셀레노-아데노실셀레노메티오닌을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 완성 생성물에서 잔류 무기 셀렌 염의 양은 일반적으로 아주 낮다(예를 들어, <2%). 그러나 본원은 이러한 퍼센트에 의해 한정되지 않으며, 그 이유는 이 퍼센트보다 더 많거나(예를 들어, 2 내지 70%) 적게(예를 들어, 0.1 내지 2%) 함유하는 제제가 또한 본원에 의해 포함되기 때문이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "SELPLEX"는 효모의 성장 속도에 대한 셀렌 염의 유해 작용을 최소화하고, 세포 유기 물질로 무기 셀렌의 최적 혼합을 가능하게 하는 방식으로 증가량의 사탕수수 당밀과 셀렌 염을 제공하는 유가(fed-batch) 배양으로 배양되는 건조된, 비생존 셀렌 강화 효모(예를 들어, 기탁번호 CNCM I-3060의 사카로마이세스 세레비시아에, Collection Nationale De Cultures De Microorganisms(CNCM)(프랑스 파리 파스퇴르 연구소))를 의미한다. 잔류 무기 셀렌을 제거하고(예를 들어, 활기찬 세척 공정을 사용하여), 총 셀렌 함량 2%를 초과하지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유기 셀렌"은 셀렌이 황을 치환하는 임의 유기 화합물을 의미한다. 따라서 유기 셀렌은 효모에 의해 생합성 되는 임의의 이러한 화합물을 의미할 수 있거나, 이것은 화학적으로 합성되는 유리 유기 셀레노 화합물을 의미할 수 있다. 후자의 예는 유리 셀레노메티오닌이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "무기 셀렌"은 일반적으로 임의 셀렌 염(예를 들어, 아셀렌산나트륨, 셀렌산나트륨, 아셀렌산코발트 및 셀렌산코발트)을 의미한다. 또한 다양한 다른 무기 셀렌 원(예를 들어, 머크(Merck) 인덱스에 열거한 것들 참조)이 있다. 셀렌화 효모는 아셀렌산나트륨, 셀렌산나트륨, 아셀렌산코발트, 셀렌산코발트, 셀렌산, 아셀렌산, 브롬화셀렌, 염화셀렌, 육불화셀렌, 산화셀렌, 옥시브롬화셀렌, 옥시염화셀렌, 옥시불화셀렌, 황화셀렌, 사브롬화셀렌, 사염화셀렌 및 사불화셀렌을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 무기 셀렌 원을 사용하여 생성될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "셀렌 화합물", "셀렌 함유 화합물" 및 "셀렌 함유 성분"은 생체이용가능한 셀렌 원을 제공할 수 있는 셀렌을 함유하는 임의 화합물을 의미한다. 셀렌 화합물은 무기 화합물, 예컨대 아셀렌산염과 셀렌산염을 함유하는 미네랄, 및 유기 화합물 예컨대 셀레노에테르, 디펩티드와 트리펩티드를 함유하는 SeCys의 복합체, 셀로놀, 셀레녹시드, 셀렌 함유 단백질 및 펩티드, 셀렌을 함유하는(예를 들어, 내부에서 황을 치환하는) 아미노산(예를 들어, 이소류신, 알라닌, 류신, 아스파라긴, 리신, 아스파르테이트, 메티오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 글루타메이트, 트레오닌, 글루타민, 트립토판, 글리신, 발린, 프롤린, 세린, 티로신, 아르기닌, 히스티딘) 또는 이들의 2가 또는 4가 셀렌 화합물, 셀렌 강화 효모 또는 분획, 및 본원에서 기재한 셀렌 함유 분자를 포함할 수 있다. 셀렌 화합물은 효모 또는 식물 추출물로서 얻을 수 있거나 상업적 합성으로부터 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, 셀렌 화합물은 혈장 또는 조직액으로 신체에 의해 쉽게 흡수되는 생체이용가능한 셀렌 원을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 셀렌 함유 화합물은 셀렌 강화 효모 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 분자이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "산화적 스트레스"는 예를 들어 분자 산소를 사용하는 대사 과정의 부산물로서 생성되는, 산소 라디칼(예를 들어, 초과산화물 음이온(O₂ ^-), 히드록시 라디칼(OH), 및 과산화수소(H₂O₂))의 세포 독성 작용을 의미한다(예를 들어, Coyle et al, Science 262:689-695 (1993) 참조).

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주", "대상" 및 "환자"는 인간 및 비인간 동물(예를 들어, 개, 고양이, 소, 말, 양, 가금류, 어류, 갑각류, 등)을 포함하나, 이들에 한정되지 않는, 연구되거나, 분석되거나, 시험하거나, 진단되거나 치료되는 임의 동물을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주", "대상" 및 "환자"는 달리 지시되지 않는 한, 상호 교환하여 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체 내"는 생물 유기체 내에서 일어나는, 생존 유기체 내에서 수행되는 연구 및/또는 실험을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시험관 내"는 생존 유기체 밖의 인공 환경을 의미하고, 유기체 내에서 통상 일어날 것이지만, 인공 환경에서 일어나게 하는 생물 공정 또는 반응을 의미한다. 시험관 내 환경은 시험관과 세포 배양체로 포함될 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

용어 "웨스턴 블럿", "웨스턴 이뮤노블럿", "이뮤노블럿" 및 "웨스턴"은 막 지지체 위에 고정된 단백질(들), 폴리펩티드 또는 펩티드의 면역학적 분석을 의미한다. 단백질은 처음에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(즉, SDS-PAGE)에 의해 분해되어 단백질을 분리하고, 이어서 단백질을 겔로부터 고체 지지체, 예컨대 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막으로 전달한다. 그 후 고정된 단백질을 관심 있는 항원에 대해 반응성이 있는 항체에 노출시킨다. 항체(즉, 일차 항체)는 특히 일차 항체에 결합하는 이차 항체의 사용에 의해 검출된다. 이차 항체는 전형적으로 착색된 반응 생성물의 생성에 의해 항원 항체 복합체의 가시화를 가능하게 하거나 발광 효소 반응(예를 들어, ECL 제제, 아머샴(Amersham))에 촉매 작용하는 효소에 접합한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "ELISA"는 효소 결합 면역흡착 검정법(또는 EIA)을 의미한다. 다수의 ELISA 방법과 응용 분야가 본 기술에서 알려져 있으며, 많은 참고 문헌(예를 들어, Crowther, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)," Molecular Biomethods Handbook에서, Rapley et al. (eds.), pp. 595-617, Humana Press, Inc., Totowa, N.J. (1998); Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 11, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994) 참조)에 기재되어 있다. 추가로, 다수의 상용되는 ELISA 시험 시스템이 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리포터 제제"(reporter reagent), "리포터 분자", "검출 기질"(detection substrate) 및 "검출 제제"는 항원에 결합하는 항체의 검출 및/또는 정량화를 가능하게 하는 제제에 관해서 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 리포터 제제는 항체에 접합한 효소에 대한 발색 기질이다. 항체 효소 복합체에 적합한 기질의 첨가로 비색 또는 형광 신호를 생성한다(예를 들어, 관심 있는 항원에 접합한 항체의 결합 후). 다른 리포터 제제는 방사성 화합물을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 이 정의는 또한 검출 시스템의 일부로서 비오틴과 아비딘계 화합물(예를 들어, 뉴트라비딘(neutravidin) 및 스트렙타비딘(streptavidin)을 포함하나, 이들에 한정되지 않는)의 사용을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "신호"는 일반적으로 반응, 예를 들어, 항원에 항체의 결합이 일어났다는 것을 나타내는 임의 검출가능한 공정에 관해 사용된다. 방사능, 형광 또는 비색 제품/제제의 형태에서 신호는 모두 본원에 의한 용도를 발견할 것으로 예상된다. 본원의 다양한 실시형태에서, 신호는 정성적으로 평가되며, 반면에 대체 실시형태에서, 신호는 정량적으로 평가된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "고체 지지체"는 항체, 항원, 및 다른 시험 성분을 부착하는 임의의 고체 또는 고정 물질에 관해 사용된다. 예를 들어, ELISA 방법에서, 마이크로리터 플레이트의 벽은 고체 지지체를 제공한다. 고체 지지체의 다른 예는 현미경 슬라이드, 커버슬립(coverslip), 비드(bead), 입자, 세포 배양체 플라스크, 및 많은 다른 적합한 제품을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상에서 조직 특성화"는 조직 샘플의 1 이상의 특성에 대한 동정을 의미한다. 일부 실시형태에서, 조직은 본원에서 상세히 설명되는 다양한 유전자의 발현, 또는 이의 결핍에 대한 동정에 의해 특성화된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 발현을 특이하게 검출할 수 있는 제제(들)"는 본원에서 상세히 설명되는 다양한 유전자의 발현을 검출할 수 있거나 이에 충분한 제제를 의미한다. 적합한 제제의 예는 mRNA 또는 cDNA에 특이하게 혼성화할 수 있는 핵산 프로브(probe), 및 항체(예를 들어, 단일클론 또는 다클론 항체)를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 유리하거나 원하는 결과에 영향을 미치는데 충분한 조성물(예를 들어, 셀레늄을 포함하는 - 예를 들어, SELPLEX)의 양을 의미한다. 유효량은 1 이상의 투여, 적용 또는 용량으로 투여될 수 있으며, 특정 제제 또는 투여 경로로 한정되는 것이 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여" 및 "투여하는"은 약물, 전구 약물, 또는 다른 작용제를 제공하는 행위, 또는 대상(예를 들어, 대상 또는 생체 내, 시험관 내, 또는 생체 외 세포, 조직, 및 기관)에게 치료 요법(예를 들어, 본원의 조성물)을 제공하는 행위를 의미한다. 인체에 대한 전형적인 투여 경로는 눈(안내), 구강(경구), 피부(국소 또는 경피), 코(비강), 폐(흡입), 구강 점막(구강내), 귀, 직장, 질, 주사(예를 들어, 정맥 내, 피하, 종양 내, 복강 내, 등) 등을 통한 것일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동시 투여" 및 "동시 투여하는"은 대상에게 적어도 2종의 작용제(들)(예를 들어, SEL-PLEX 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 1 이상의 셀레늄 함유 화합물) 및 1 이상의 다른 작용제(예를 들어, 치료) 또는 요법의 투여를 의미한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 작용제 또는 요법의 동시 투여는 동시 발생적이다. 다른 실시형태에서, 제1 작용제/요법을 제2 작용제/요법 전에 투여한다. 통상의 기술자는 사용되는 다양한 작용제 또는 요법의 제제 및/또는 투여 경로는 다를 수 있다는 사실을 이해한다. 동시 투여의 적합한 용량은 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제 또는 요법을 동시 투여하는 경우, 각 작용제 또는 요법을 이들의 단독 투여에 적합한 것보다 더 적은 용량으로 투여한다. 따라서 동시 투여는 작용제 또는 요법의 동시 투여가 잠재적으로 유해한(예를 들어, 독성) 작용제(들)의 필요한 용량을 낮추는 실시형태 및/또는 2종 이상의 작용제의 동시 투여가 다른 작용제의 동시 투여를 통해 작용제 중 하나의 유리한 효과에 대해 대상의 감작화를 얻는 실시형태에서 특히 바람직하다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료" 또는 문법상 동의어는 질병 증상의 개선 및/또는 반전을 포함한다. 본원의 스크리닝 방법에서 사용될 때 질병과 관련되는 임의 파라미터에서 개선을 야기하는 화합물은 이로써 치료 화합물로서 확인될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질병에 위험이 있는"(예를 들어, 비대형 심근병증, 당뇨병, 암, 등에 위험이 있는)은 특정 질병(예를 들어, 비대형 심근병증, 당뇨병, 암, 등)에 걸리기 쉬운 대상(예를 들어, 인간)을 의미한다. 이러한 소인은 유전적(예를 들어, 질병, 예컨대 유전성 질환에 걸리는 특정 유전적 경향)일 수 있거나, 다른 요인(예를 들어, 고혈압, 연령, 체중, 환경 조건, 환경에 존재하는 유해 화합물에 대한 노출)으로 인한 것일 수 있다. 따라서 본원은 임의의 특정 위험으로 한정되지 않는 것을 의도하거나, 본원이 임의의 특정 질병으로 한정되지 않는 것을 의도한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질병에 걸리는"(예를 들어, 비대형 심근병증, 당뇨병, 암, 등에 걸리는)은 특정 질병(예를 들어, 비대형 심근병증, 당뇨병, 암, 등)에 걸리는 대상(예를 들어, 인간)을 의미한다. 본원이 임의의 특정 징후 또는 증상으로 한정되지 않는 것을 의도하거나, 질병으로 한정되지 않는 것을 의도한다. 따라서 본원은 대상이 특정 질병에 관련되는 적어도 일부의 증거(예를 들어, 징후와 증상)를 나타내는 임의 범위의 질병(예를 들어, 아임상적 징후로부터 발병 단계의 질병까지)에 걸리는 대상을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질병" 및 "병태"는 정상 기능의 성능을 차단하거나 변형시키는 생존 동물 또는 이의 임의 기관 또는 조직의 정상 상태의 임의 장애와 관련되는 상태, 징후 및/또는 증상을 기재하는데 상호 교환하여 사용되며, 환경 요인(예컨대 영양불량, 산업 재해, 또는 기후)에 대한, 특정 감염 인자(예컨대, 벌레, 세균, 또는 바이러스)에 대한, 유기체의 고유 결함(예컨대 다양한 유전적 이상)에 대한, 또는 이들 및 다른 요인의 조합에 대한 반응일 수 있다.

용어 "화합물"은 질병, 병, 아픔, 또는 신체 기능의 장애를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있는, 임의의 화학 물질, 약제, 약물, 등을 의미한다. 화합물은 공지되고, 잠재적인 치료 화합물 둘 다 포함한다. 화합물은 본원의 스크리닝 방법을 사용하여 스크리닝함으로써 치료제인 것으로 결정될 수 있다. "공지된 치료 화합물"은 이러한 치료에서 효과적인 것으로 알려진(예를 들어, 동물 시험을 통해 또는 인간에게 투여에 의한 경험 전에) 치료 화합물을 의미한다. 환언하면, 공지된 치료 화합물은 질병(예를 들어, 신경변성 질병)의 치료에 효과가 있는 화합물로 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키트"(kit)는 제제와 다른 물질의 조합에 관해 사용된다. 키트는 영양물 및 약물과 같은 제제 및 투여 수단을 포함할 수 있다고 예상된다. 용어 "키트"가 제제 및/또는 다른 물질의 특정 조합으로 한정되지 않는 것을 의도한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "독성의"는 대상, 세포, 또는 조직에 대해 독성 물질의 투여 전에 동일한 세포 또는 조직과 비교하여 임의의 유해한 또는 해로운 작용을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학 조성물"은 조성물을 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외 진단 또는 치료 용도에 특히 적합하게 하는, 불활성 또는 활성 담체와 활성제(예를 들어, SEL-PLEX 및/또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 1 이상의 셀렌 함유 화합물을 포함하는 조성물)의 조합을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는" 또는 "약리적으로 허용되는"은 대상에게 투여될 때, 부 반응, 예를 들어, 독성, 알레르기, 또는 면역 반응을 실질적으로 생성하지 않는 조성물을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "국소로"는 피부 및 점막 세포와 조직의 표면(예를 들어, 치조, 구강, 혀, 저작, 또는 비 점막, 및 중공 기관 또는 체강을 따라 늘어서 있는 다른 조직과 세포)에 본원의 조성물의 적용을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 인산염 완충 식염 용액, 물, 에멀션(예를 들어, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀션), 및 다양한 형태의 습윤제, 임의 및 전체 용매, 분산매, 코팅, 라우릴황산나트륨, 등장제 및 흡수 지연제, 붕괴제(예를 들어, 감자 전분 또는 전분글리콜산나트륨), 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는, 임의의 표준 약학 담체를 의미한다. 조성물은 또한 안정화제와 방부제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예에 대해 참조(예를 들어, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. (1975), 본원에서 참조로서 원용함).

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 타깃 대상(예를 들어, 포유동물 대상, 및/또는 생체 내 또는 생체 외 세포, 조직, 또는 기관)에서 생리적으로 허용되는, 본원의 화합물의 임의 염(예를 들어, 산 또는 염기와 반응에 의해 얻어지는)을 의미한다. 본원의 화합물에 대한 "염"은 무기 또는 유기 산 및 염기로부터 유도될 수 있다. 산의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산, 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 다른 산, 예컨대 옥살산이 그 자체가 약학적으로 허용되지 않는다면, 본원의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용되는 산 부가염을 얻는데 중간체로서 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다.

염기의 예는 알칼리 금속(예를 들어, 나트륨) 수산화물, 알칼리 토금속(예를 들어, 마그네슘) 수산화물, 암모니아, 및 식 NW₄ ⁺(여기서 W는 C_{1 -4} 알킬이다)의 화합물 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

염의 예는 아세트산염, 아디프산염, 알긴산염, 아스파르트산염, 벤조산염, 벤젠설폰산염, 중황산염, 부티르산염, 시트르산염, 캄포르산염, 캄포르설폰산염, 사이클로펜탄프로피온산염, 디글루콘산염, 도데실황산염, 에탄설폰산염, 푸마르산염, 플루코헵탄산염, 글리세로인산염, 헤미황산염, 헵탄산염, 헥산산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 2-히드록시에탄설폰산염, 락트산염, 말레산염, 메탄설폰산염, 2-나프탈렌설폰산염, 니코틴산염, 옥살산염, 팔모산염(palmoate), 펙틴산염, 과황산염, 페닐프로피온산염, 피크르산염, 피발산염, 프로피온산염, 숙신산염, 타르타르산염, 티오시안산염, 토실산염, 운데칸산염, 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 염의 다른 예는 적합한 양이온 예컨대 Na⁺, NH₄ ⁺, 및 NW₄ ⁺(여기서 W는 C_{1 -4} 알킬기이다), 등과 화합되는 본원의 화합물의 음이온을 포함한다. 치료 용도를 위해, 본원의 화합물에 대한 염은 약학적으로 허용되는 것으로서 예상된다. 그러나 약학적으로 허용되지 않는 산과 염기의 염은 또한 예를 들어 약학적으로 허용되는 화합물의 제조 또는 정제에서 용도를 발견할 수 있다.

치료 용도를 위해, 본원의 화합물에 대한 염은 약학적으로 허용되는 것으로서 예상된다. 그러나 약학적으로 허용되지 않는 산과 염기의 염은 또한 예를 들어 약학적으로 허용되는 화합물의 제조 또는 정제에서 용도를 발견할 수 있다.

"단리된 올리고뉴클레오티드" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"에서처럼 핵산과 관련하여 사용될 때 용어 "단리된"은 하나 이상의 성분 또는 혼입 물질이 통상적으로 이의 천연 원에 관련되어 있는 하나 이상의 성분 또는 혼입 물질로부터 확인되고, 분리되는 핵산 서열을 의미한다. 단리된 핵산은 이것이 특성상 발견되는 것과 상이한 형태 또는 세팅(setting)으로 존재한다. 대조적으로, 단리되지 않은 핵산은 특성상 이들이 존재하는 상태로 발견되는 DNA와 RNA와 같은 핵산이다. 예를 들어, 소정의 DNA 서열(예를 들어, 유전자)은 인접하는 유전자에 근접하여 숙주 세포 염색체에서 발견되며; RNA 서열, 예컨대 특정 단백질을 코딩하는 특정 mRNA 서열이 다수의 단백질을 코딩하는 다수의 다른 mRNA와의 혼합물로서 세포에서 발견된다. 그러나 소정의 단백질을 코딩하는 단리된 핵산은 예로서 소정의 단백질을 통상 발현하는 세포에서 이러한 핵산을 포함하며, 여기서 핵산은 천연 세포의 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 있거나, 달리 특성상 발견되는 것과 상이한 핵산 서열에 의해 측면에 위치한다. 단리된 핵산, 올리고뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 단백질을 발현하는데 사용될 경우, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 적어도 센스(sense) 또는 코딩 가닥(즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥일 수 있다)을 함유할 것이지만, 센스 가닥과 안티센스(anti-sense) 가닥(즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥일 수 있다)을 둘 다 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "정제된" 또는 "정제하는 것"은 샘플로부터 성분(예를 들어, 오염물)의 제거를 의미한다. 예를 들어, 항체는 오염 비면역 글로불린 단백질의 제거에 의해 정제되며; 이들은 또한 타깃 분자에 결합하지 않는 면역 글로불린의 제거에 의해 정제된다. 비면역 글로불린 단백질의 제거 및/또는 타깃 분자에 결합하지 않는 면역 글로불린의 제거는 샘플에서 타깃 반응성 면역 글로불린의 퍼센트를 증가시킨다. 또 다른 예에서, 재조합 폴리펩티드는 세균 숙주세포에서 발현되며, 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질의 제거에 의해 정제되고; 재조합 폴리펩티드의 퍼센트는 이로써 샘플에서 증가한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "고성능 액체 크로마토그래피" 및 용어 "HPLC"는 화합물을 분리하는 액체 크로마토그래피의 형태를 의미한다. 화합물을 용액에 용해시킨다. 한 플러그(plug)의 샘플 혼합물을 칼럼 위에 주입함으로써 화합물을 분리한다. HPLC 기구는 이동 상의 저장소, 펌프, 주입기, 분리 칼럼, 및 검출기를 포함한다. 칼럼 유출물에서 검체의 존재는 굴절률에서 변화, 설정 파장에서 UV-VIS 흡수, 적합한 파자에 의한 여기 후 형광, 또는 전기 화학 반응을 정량적으로 검출함으로써 기록된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "주사 전자 현미경법" 및 용어 "SEM"은 래스터 주사 패턴(raster scan pattern)에서 전자의 고 에너지 빔에 의해 샘플 표면을 주사함으로써 샘플 표면을 이미지화하는 전자 현미경의 형태를 의미한다. 전자는 샘플의 표면 지형, 조성 및 전기 전도도와 같은 다른 특성에 대한 정보를 포함하는 신호를 생성하는 샘플을 구성하는 원자와 상호 작용한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "고화제"는 물질을 이의 현재 형태로 "고정하거나", 안정화하거나, 그렇지 않으면 보존하여 물질을 분해하거나 그렇지 않으면 변하는 것을 방지하기 위해 한 물질을 또 다른 물질에 고정할 수 있는 화학 약품을 의미한다. 흔히, 고화제는 샘플을 제조하기 위해 주사 전자 현미경법(SEM)에 사용된다. 일차 고화제: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "일차 고화제"는 물질을 "고정하는데" 사용되는 제1 고화제를 의미한다. 이차 고화제: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이차 고화제"는 물질을 "고정하는데" 사용되는 제2 고화제를 의미한다. 삼차 고화제: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "삼차 고화제"는 물질을 "고정하는데" 사용되는 제3 고화제를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "검체"는 원자, 분자, 원자 및/또는 분자의 집단화, 물질, 또는 화학 성분을 의미한다. 검체는 그 자체로 그리고 그 자신에 의해 측정될 수 없으며, 오히려, 검체의 양태 또는 특성(물리적, 화학적, 생물학적, 등)은 분석 과정, 예컨대 HPLC를 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, "체어"(chair)(검체-성분)를 그 자체로 그리고 그 자신에 의해 측정할 수 없으나, 체어의 높이, 폭, 등을 측정할 수 있다. 비슷하게, 미코톡신을 측정할 수 없으나, 이의 농도에 관련되는 미코톡신 형광을 측정할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "신호"는 일반적으로 반응이 일어난 것을 나타내는 임의의 검측가능한 공정(예를 들어, 항원에 항체의 결합)에 관해 사용된다. 신호는 정성적으로 및 정량적으로 평가될 수 있다. "신호"의 형태에 대한 예는 방사성 신호, 형광 신호 또는 비색 제품/제제 신호를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체이용률"은 유기체에 이용가능하거나 전신 순환에 도달하는 분자 또는 성분의 분율을 의미한다. 분자 또는 성분이 정맥 내로 투여될 때, 이의 생체이용률은 100%이다. 그러나 분자 또는 성분이 다른 경로를 통해(예컨대 경구로) 투여될 때, 이의 생체이용률이 감소한다(불완전 흡수와 초회 통과 대사로 인해).

본원의 상세한 설명

전자 이동 쇄(ETC) 아래로 전자의 이동을 통해 얻어지는 에너지는 양성자를 미토콘드리아 매트릭스로부터 막간 공간으로 펌핑하는데 사용되며, ΔΨ로 불리는, 미토콘드리아 내막(IMM) 전체에 걸쳐 전기화학 양성자 기울기를 생성한다. 이러한 전기화학 양성자 기울기는 ATP 합성 효소(ATP-아제)가 효소를 통해 매트릭스로 돌아가게 H⁺의 플로를 사용하게 하여 아데노신이인산(ADP)과 무기 인산염으로부터 ATP를 생성한다. 4개의 막 결합 복합체가 미토콘드리아에서 확인되었다. 각각 내막에 내장되어 있는 막 관통 구조이다. 이들 중 3개는 양성자 펌프이다. 구조는 지용성 전자 전달체와 수용성 전자 전달체에 의해 전기적으로 접속되어 있다. 복합체 I(NADH 조효소 Q 환원 효소; I로 표지)은 크레브스 회로 전자 전달체 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)로부터 전자를 수용하고, 이들을 조효소 Q(유비퀴논(UQ))로 이동시키고, 조효소는 또한 복합체 II(숙신산 탈수소 효소; (II))로부터 전자를 수용한다. UQ는 전자를 복합체 III(시토크롬 bc₁ 복합체; (III))로 이동시키고, 이 복합체는 이들을 시토크롬 c(cyt c)로 이동시킨다. cyt c는 전자를 복합체 IV(시토크롬 c 산화 효소; (IV))로 이동시키고, 복합체는 전자와 수소 이온을 사용하여 분자 산소를 물로 환원한다.

복합체 I(NADH 탈수소 효소, 또한 NADH:유비퀴논 산화환원 효소로 불림)에서 2개의 전자가 NADH로부터 제거되어 지용성 전달체, 유비퀴논(Q)으로 전달된다. 환원 생성물, 유비퀴놀(QH₂)은 막 내에서 자유롭게 확산하고, 복합체 I은 막 전체에 걸쳐 4개의 양성자(H⁺)의 위치를 바꾸며, 따라서 양성자 기울기를 생성한다. 복합체 I은 산소로 조기 전자 누출이 일어나는 주요 부위 중 하나이며, 따라서 유해한 초과산화물의 생성에 대한 주요 부위 중 하나이다. 따라서 복합체 III과 함께, 이것은 전자 전달 쇄에 의해 생성되는 대부분의 반응성 산소 종(주로 초과산화물 라디칼)을 생성한다. 유전적 돌연변이와 별개로, 미토콘드리아 기능장해는 주로 이의 부 구성 요소에 대해 반응성 산소 종(ROS)에 의해 원인이 된 손상으로부터 일어난다고 생각된다(예를 들어, Kirkinezos and Moraes, 2001 참조). 실제로, 노화 과정과 대사 질병(예를 들어, 2형 당뇨병)의 발병은 ROS 유발 세포 손상에 기인한다는 넓은 합의가 존재한다. 미토콘드리아는 세포 내에서 ROS의 일차 생산자이며, 이러한 특징은 이들이 또한 ROS에 의해 원인이 된 손상과 소위 산화적 스트레스를 겪는 제1 소기관이라는 사실을 의미한다(예를 들어, Kaneto et al., 2012 참조). 상당수의 미토콘드리아 질병은 특히 복합체 I 기능장해 또는 기능부전에 연관된다.

전자의 경로는 다음과 같이 발생한다: NADH는 플라빈 모노뉴클레오티드를 2 전자 1 단계로 FMNH₂로 환원함으로써 NAD⁺로 산화된다. 그 후 FMNH₂는 1 전자 2 단계로 세미퀴논 중간체를 통해 산화된다. 따라서 각 전자는 FMNH₂로부터 Fe-S 클러스터로, Fe-S 클러스터로부터 유비퀴논(Q)으로 이동한다. 제1 전자의 이동은 Q의 자유 라디칼(세미퀴논) 형태를 얻고, 제2 전자의 이동은 세미퀴논 형태를 유비퀴놀 형태, QH₂로 환원한다. 이 과정 중에, 4개의 양성자가 미토콘드리아 매트릭스로부터 막간 공간으로 위치를 바꾼다.

복합체 II(숙신산 탈수소 효소)에서 추가 전자는 숙신산염으로부터 유래하는 퀴논 풀(Q)로 전달되고, (FAD를 통해) Q로 이동한다. 복합체 II는 4개의 단백질 서브유닛(subunit)을 포함한다: SDHA, SDHB, SDHC, 및 SDHD. 다른 전자 도너(예를 들어, 지방산 및 글리세롤 3-인산)는 또한 전자를 Q로 안내한다(FAD를 통해).

복합체 III(시토크롬 bc ₁ 복합체)에서, Q 사이클은 양성자의 비대칭 흡수/방출에 의해 양성자 기울기에 기여한다. 2개의 전자는 QH₂로부터 Q_O 부위에서 제거되며, 연속으로 막간 공간 내에 위치한 수용성 전자 전달체인, 시토크롬 c의 2 분자로 전달된다. 2개의 다른 전자는 연속으로 단백질 전체에 걸쳐 유비퀴논의 퀴논 부분이 퀴놀로 환원되는 Q_i 부위로 이동한다. 양성자 기울기는 Q_O 부위에서 2회의 퀴놀(4H+4e^-) 산화에 의해 형성되어 Q_i 부위에서 한 퀴놀(2H+2e^-)을 형성한다(총 6개의 양성자가 위치를 바꾼다: 2개의 양성자는 퀴논을 퀴놀로 환원하고, 4개의 양성자는 2개의 유비퀴놀 분자로부터 방출된다).

때로 시토크롬 A3으로 불리는, 복합체 IV(시토크롬 c 산화 효소)에서, 4개의 전자는 시토크롬 c의 4개 분자로부터 제거되어 분자 산소(O₂)로 이동하고, 2개의 물 분자를 생성한다. 동시에, 4개의 양성자가 미토콘드리아 매트릭스로부터 제거되며(비록 2개만이 막 전체에 걸쳐 위치를 바꾸지만), 양성자 기울기에 기여한다. 시토크롬 c 산화 효소의 활성은 시안화물에 의해 억제된다.

전자 전달 쇄와 산화적 인산화는 내부 미토콘드리아 막 전체에 걸쳐 양성자 기울기에 의해 연결된다. 미토콘드리아 매트릭스로부터 양성자의 유출은 전기화학 기울기(양성자 기울기)를 생성한다. 이러한 기울기는 산화적 인산화를 통해 ATP를 만드는데 F_oF₁ ATP 합성 효소 복합체에 의해 사용된다. ATP 합성 효소는 때로 전자 전달 쇄의 복합체 V로서 기재된다. ATP 합성 효소의 F_O 성분은 양성자 플럭스(flux)에게 미토콘드리아 매트릭스로 되돌아가게 제공하는 이온 채널로서 작용한다. 이러한 플럭스는 전자 전달체(NAD⁺ 및 Q)의 산화 형태의 생성 동안 발생하는 자유 에너지를 방출한다. 자유 에너지는 복합체의 F₁ 성분이 촉매 작용하는 ATP 합성을 구동하는데 사용된다.

따라서 복합체 I(NADH:유비퀴논 산화환원 효소)은 미토콘드리아 호흡 쇄에서 제1 효소이다. 이것은 NADH로부터 당과 지방의 산화에 의해 생성되는 에너지를 추출하며, 미토콘드리아 내막 전체에 걸쳐 전위차 또는 전압으로 에너지를 가둔다. 전위차는 ATP의 합성에 동력을 공급하는데 사용된다. 복합체 I이 세포에서 에너지 생산의 중심이므로, 이의 기능부전은 광범위한 신경근 질환을 초래한다. 이들 중 일부는 미토콘드리아 게놈의 돌연변이에 기인하지만, 다른 것들은 복합체 I의 활성 감소, 또는 반응성 산소 종의 생성 증가로부터 유래한다.

비인슐린 의존(II형) 당뇨병(DM)은 골격근, 간과 지방에서 췌장 β-세포 기능으로 인한 인슐린 분비 결함과 결합하여 골격근, 간 및 지방에서 인슐린 저항성을 특징으로 하는 질병이다. 인슐린 저항성은 II형 당뇨병의 주요한 특징이다. 예를 들어, 대부분의 II형 당뇨병 환자는 인슐린 저항성이 있다고 알려져 있다. 비슷하게, II형 당뇨병 환자의 후손에서 인슐린 저항성은 질병의 후기 발생에 대한 가장 좋은 예측 인자이다(예를 들어, Warram et al, 1990 참조). 인슐린 저항성을 줄이는 개입은 또한 당뇨병의 발달을 방지한다. 미토콘드리아 기능은 췌장 베타 세포로부터 정상의 글루코오스 자극성 인슐린 분비에 대해 필요하다.

골격근과 간은 글루코오스 항상성의 유지에서 2개의 주요 인슐린 반응성 기관이다. 인슐린 저항 상태로 이들 기관의 전이는 II형 당뇨병이 있는 환자에서 보인 글루코오스 대사 변화의 대부분을 설명한다(예를 들어, Lowell and Shulman, 2005 참조). 이들 2 기관 중에서, 골격근은 인슐린 저항성 발생에서 생기는 결과 면에서 더 중요하다. 이는 골격근이 1일 섭취 글루코오스의 80 내지 90%를 처리하거나 대사한다고 밝혀졌기 때문이다(예를 들어, DeFronzo et al., 1985 참조).

미토콘드리아 산화적 인산화(OXPHOS) 유전자가 전당뇨병 및 당뇨병 개체에서 건강한 대조와 비교하여 발현 감소를 나타내고, 이들 유전자가 많은 경우에 전사 보조 활성화 인자 증식 인자 활성화 수용체 감마 보조 활성화 인자 1-알파(PGC1-α, 예를 들어, Mootha et al., 2003 참조)의 타깃이라는 사실이 게놈 광범위 발현 해석에 의해 입증되었다. 이들 연구에서, OXPHOS 유전자에 대한 전형적인 발현 감소는 크지 않지만(대략 20%) 매우 일관되어 있었고, 연구된 유전자의 89%는 정상 글루코오스 내성이 있는 개체에 비해 불충분한 글루코오스 내성 또는 II형 당뇨병이 있는 개체에서 더 낮은 발현을 나타냈다.

근육에서 OXPHOS 활성을 높이는 약물 또는 작용제가 2형 당뇨병에 대해 가치 있는 치료법으로서 존재한다는 사실이 본 기술에서 일반적으로 이해되고, 확인된다. 이러한 가설을 지지하기 위해, 유산소 운동이 미토콘드리아 활성과 숫자를 증가시키고, OXPHOS 유전자 발현을 촉진함에 따라 당뇨병을 치료하기 위한 가장 좋은 비약물적 개입이라고 오랫동안 알려져 왔다.

2형 당뇨병 외에, 미토콘드리아 기능장해와 관련된 다수의 질병과 상태가 존재한다. 미토콘드리아가 고등 생물의 세포에서 주요 에너지원이므로, 미토콘드리아는 폭넓은 세포 호흡, 산화 및 대사 과정의 직접 및 간접 생화학적 조절을 제공한다. 이들은 전자 전달 쇄(ETC) 활성을 포함하며, 이 활성은 산화적 인산화를 구동하여 아데노신 삼인산(ATP)의 형태로 대사 에너지를 생성하며, 또한 세포 내 칼슘 항상성에서 주요한 미토콘드리아 역할에 기초가 된다.

성장 세포에서 에너지 생성의 이들 역할 외에, 미토콘드리아(또는 적어도 미토콘드리아 구성물)는 또한 세포 자연사로서 알려진, 세포 예정사(PCD, programmed cell death)에 관여한다(예를 들어, Newmeyer et al, Cell 1994, 79:353-364; Liu et al, Cell 1996, 86: 147-157 참조). 세포 자연사는 신경계의 정상 발생에 필요하고, 면역계의 적절한 기능에 필요하다. 더구나, 일부 병상은 불충분하거나 과도한 수준의 세포 자연사(예를 들어, 각각 암과 자가 면역 질병, 및 후자의 경우에 뇌졸중 손상 및 알츠하이머병에서 신경변성)와 관련되어 있다고 생각된다. 세포 자연사에서 미토콘드리아의 역할은 입증되었다(예를 들어, Green and Reed, science, 1998, 281:1309-1312; Green, Cell, 1998, 94:695-698; 및 Kramer, Nature Medicine, 1997, 3:614-620 참조). ETC의 임의 단계에서 장해를 포함하나 이에 한정되지 않는, 변경되거나 불완전한 미토콘드리아 활성은 세포와 조직을 손상할 가능성이 있는 고 반응성 자유 라디칼의 생성을 초래할 수 있다. 이들 자유 라디칼은 반응성 산소 종(ROS) 예컨대 초과산화물, 퍼옥시아질산염 및 히드록실 라디칼, 및 세포에 독성일 수 있는 잠재적으로 다른 반응성 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 산소 자유 라디칼 유도 지질 과산화는 중추 신경계(CNS) 손상 예컨대 다수의 변성 질병에서 발견되는 손상에서, 및 허혈(예를 들어, 뇌졸중)에서 확립된 발병 메커니즘이다.

자유 라디칼 매개 조직 손상 외에, 미토콘드리아 자체에 악영향을 미치는 미토콘드리아 기능장해에서 생기는 반응성 자유 라디칼에 노출에 대해 적어도 2개의 유해 결과가 있다. 첫째, 자유 라디칼 매개 손상은 ETC의 단백질 중 1 이상을 불활성화할 수 있다. 둘째, 자유 라디칼 매개 손상은 "투과성 전이"(PT, permeability transition) 또는 "미토콘드리아 투과성 전이"(MPT)로 칭한 미토콘드리아 붕괴(collapse)를 초래할 수 있다. 미토콘드리아 기능에 대해 일반적으로 인정된 이론에 따라, 그리고 본원에서 기재한 바와 같이, 적절한 ETC 호흡 활성은 커플링된 화학 삼투 메커니즘에 의해 내부 미토콘드리아 막에서 전기화학 전위의 유지를 필요로 한다. 자유 라디칼 산화 활성은 이러한 막 전위를 분산시킬 수 있으며, 이로써 ATP 생합성을 방지하고, 활기찬 생화학 에너지원의 생성을 중지한다. 추가로, 미토콘드리아 단백질 예컨대 시토크롬 c는 투과성 전이 후 미토콘드리아를 유출할 수 있으며, 세포 자연사 또는 세포 예정사로서 알려진 유전적으로 예정된 세포 자살 순서를 유도할 수 있다.

미토콘드리아 관련 질병(예를 들어, 기능장해 미토콘드리아에 의해 원인이 된)은 또한 자유 라디칼 산화 이외의 메커니즘에 의해 미토콘드리아 막 전기화학 전위의 상실에 관련될 수 있으며, 투과성 전이는 미토콘드리아 유전자, 유전자 산물 또는 관련 다운스트림 매개체(downstream mediator) 분자 및/또는 미토콘드리아 외 유전자, 유전자 산물 또는 관련 다운스트림 매개체에 대한 직접 또는 간접 작용으로부터, 또는 다른 기지 또는 미지 원인으로부터 기인할 수 있다. 따라서 미토콘드리아 전위의 상실은 변성 질병을 포함하여, 변경된 미토콘드리아 기능과 관련된 질병 및 노화와 관련된 질병/상태(예를 들어, 암, 심혈관 질환과 심부전, 2형 당뇨병, 알츠하이머병과 파킨슨병, 지방간 질환, 백내장, 골다공증, 근육 피로, 수면장해 및 염증 질환 예컨대 건선, 관절염 및 대장염)의 진행에서 중대 이벤트일 수 있다.

심근병증

핵 코딩된 DNA 중합효소 c(POLG)는 동물 세포 미토콘드리아에서 유일하게 알려진 DNA 중합효소이다. 인간의 POLG 유전자에서 돌연변이는 안근 마비, 백내장, 진행성 근 무력, 파킨슨증, 조기 난소 부전, 남성 불임, 청력 손실(노인성 난청), 및 심 기능장해를 포함하여, 다양한 증상과 관련된 다수의 질병에 연결되어 있다(예를 들어, Kujoth et al, PLoS Genetics, 2007. 3(2) 참조). PolG^{( D257A )} 마우스 모델은 12 주에 미토콘드리아에 코딩된(mitochondrially encoded) 복합체의 호흡 기능에서 진행성 감소를 나타내며, 산소 소비 감소와 ATP 생성 감소를 초래한다(예를 들어, Kujoth et al, PLoS Genetics, 2007. 3(2) 참조). PolG 마우스는 13-14월령에서 확대된 심장 크기와 심근 세포에 의해 표시되는 현저한 심장 비대가 있는 촉진된 심장 노화 표현형을 나타낸다고 보고되었다(예를 들어, Dai et al 2010, Kujoth et al, 2005 및 도 25a 참조).

비대형 심근병증(HCM)은 심장 질환의 가장 흔한 일유전자 유전형이며, 35세보다 어린 개인에서 돌연 심장사의 가장 흔한 원인이다(예를 들어, Frey et al, Nat Rev Cardiol, 2012. 9(2): p. 91-100 참조). HCM에 대한 근거인 유전적 돌연변이는 특성화가 잘 되었고, 다수의 돌연변이가 근절 단백질, 예컨대 미오신-7(또한 심근 β-미오신 중쇄; MYH7로서 알려짐)을 코딩한다(예를 들어, Frey et al, Nat Rev Cardiol, 2012. 9(2): p. 91-100 참조).

심장 안키린(ankyrin) 반복 단백질(CARP)은 ANKRD1 유전자에 의해 코딩되며, ANKRD1 유전자와 CARP 핵 인자의 발현은 좌심실 비대, 인간의 심부전, 확장성 심근병증(DCM), 및 아드리아마이신 유발 심근병증에 관련되어 있다(예를 들어, Duboscq-Bidot et al, Archives of Cardiovascular Diseases, 2009. 102, Supplement 1(0): p. S73 참조). 입증된 표현형과 일관하여, 심장 비대 마커 Myh7과 Ankrd1의 연령 의존 발현은 POLG 어린 마우스와 비교하여 POLG 나이 든 마우스의 심장 조직에서 증가하였다.

따라서 본원의 실시형태의 개발 동안 수행된 실험 내내 생성된 실험 데이터에서는 PolG 마우스 라인이 심장 비대에 대한 우수한 실험 모델이었음이 결정되었다. 예를 들어, PolG 마우스가 심장 노화와 비대(예를 들어, 유전적 및 단백질 수준에서)에 관련되는 특정 분자의 분석/시험을 허용한 심장 노화의 생존 동물 모델을 제공하였다는 사실이 알려지고, 결정되었다. 더구나, PolG 모델이 심장 노화와 비대(예를 들어, 유전적 및 단백질 수준에서)에 관련된 특정 분자를 변경하는 화합물의 평가와 특성화를 허용하였다는 사실을 또한 알아냈다. 따라서 일부 실시형태에서, 본원은 13-14월령에서 확대된 심장 크기와 심근 세포에 의해 표시되는 현저한 심장 비대를 나타내는 PolG 마우스를 1 이상의 화합물에 노출시키는 단계 및 심장 크기 또는 심근 세포의 변화 및/또는 시험 화합물의 존재 하에 비대형 심근병증에 관련되는 분자의 발현을 검출하는 단계(예를 들어, 시험 화합물이 제공되지 않는 동물(예를 들어, 대조 물질을 투여하는)과 비교하여)를 포함하는 시험 화합물을 동정하는 방법(예를 들어, 비대형 심근병증의 치료 및/또는 예방을 위해)을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시험 화합물"은 질병, 병, 아픔, 또는 신체 기능의 장애를 치료하거나 예방하거나, 그렇지 않으면 샘플의 생리적 또는 세포 상태를 변경하는데 사용될 수 있는, 임의의 화학 물질, 약제, 약물, 등을 의미한다. 시험 화합물은 공지되고, 잠재적인 치료 화합물 둘 다 포함한다. 시험 화합물은 본원의 스크리닝 방법을 사용하는 스크리닝에 의해 치료제라고 결정될 수 있다. "공지된 치료 화합물"은 이러한 치료 또는 예방에 효과적이라고 알려진(예를 들어, 동물 시험을 통해 또는 인간에게 투여에 의한 경험 전에) 치료 화합물을 의미한다. 일부 실시형태에서, 시험 화합물은 단일 약물 후보이다.

본원은 셀렌(예를 들어, 셀렌 강화 효모 및 이로부터 얻어지거나 유도되는 셀렌 함유 화합물)을 포함하는 조성물 및 심근병증을 치료하고, 억제하기 위한 이의 사용 방법을 제공한다. 특히, 본원은 셀렌 강화 효모(예를 들어, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는)를 포함하는 조성물, 이의 내부에 존재하고/하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물, 및 대상에서 심장 비대를 치료하고, 억제하기 위한(예를 들어, 심근병증에 대한 치료 및/또는 예방 요법으로서) 이의 사용 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원은 셀렌 강화 효모(예를 들어, SELPLEX)를 포함하는 조성물, 이의 내부에 존재하고/하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물, 및 비대 단백질 미오신 중쇄 베타(Myh7) 및/또는 심장 안키린 반복 단백질(Ankrd1)의 발현을 억제하거나 감쇄하기 위한(예를 들어, 심근 비대에 대한 치료 및/또는 예방 요법으로서) 이의 사용 방법을 제공한다. 본원을 실시하는데 메커니즘의 이해가 필요하지 않지만, 그리고 본원이 임의의 특정 작용 메커니즘으로 한정되지 않지만, 일부 실시형태에서, 셀렌은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하는 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 대상에게 투여될 때, 전사 인자 Foxo3을 조절하여 Myh7과 Ankrd1 분자의 발현을 억제한다(예를 들어, 이로써 심근 비대를 억제한다).

본원의 실시형태의 개발 중에 수행되는 실험에서는 셀렌 강화 효모(예를 들어, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모)가 대상에게 투여될 때, 비대 단백질 미오신 중쇄 베타(Myh7)와 심장 안키린 반복 단백질(Ankrd1)의 축적을 억제하고, 이로써 심장 근육 노화와 비대를 억제하고/하거나 예방한다는 사실을 밝혀냈고, 제시하였다. 본원을 실시하는데 메커니즘의 이해가 필요하지 않지만, 그리고 본원이 임의의 특정 작용 메커니즘으로 한정되지 않지만, 일부 실시형태에서, 셀렌은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하는 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 대상에게 투여될 때, Nfat 신호 전달을 조절한다(예를 들어, Nfatc2/3의 인산화를 증가시킴으로써 유전자 전사에 관련된 핵 Nfatc2/3 활성을 감소시킨다(예를 들어, 이로써 비대 단백질 Myh7과 Ankrd1의 심장 축적을 억제한다)).

본원의 실시형태의 개발 중에 수행된 추가 실험에서는 셀렌이 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하는 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 대상에게 투여될 때, pS6K1의 심장 발현을 상당히 줄인다(예를 들어, 이로써 심장 근육 노화와 비대를 억제하고/하거나 줄인다)는 것을 밝혀냈고, 제시하였다.

Atm/Gadd45 신호 전달은 심근뿐만 아니라 골격근에서 모두 세포 주기 정지와 DNA 수복에 중요한 경로이다. 대조 및 셀렌 처리 PolG 마우스로부터 심장에서 Atm과 Gadd45 발현을 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 동안 실험을 수행하였다. PolG 마우스 심장에서 Atm 발현의 연령 의존 감소가 있었다는 사실이 밝혀졌다. 그러나 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여하면 PolG 마우스에서 Atm 발현의 연령 의존 감소를 없앴다. 추가로, Atm의 다운스트림 타깃인 심장 Gadd45의 발현은 셀렌이 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 투여된 PolG 마우스에서 상당히 상향 조절되었다. 본원을 실시하는데 메커니즘의 이해가 필요하지 않지만, 그리고 본원이 임의의 특정 작용 메커니즘으로 한정되지 않지만, 일부 실시형태에서, 셀렌은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하는 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 대상(예를 들어, 고령 대상)에게 투여될 때, 심장 조직에서 Atm의 연령 관련 발현 감소를 중화하고/하거나 없앤다(예를 들어, 이로써 Atm의 다운스트림 분자(예를 들어, Gadd45)의 발현을 증대하고/하거나 향상시키고/시키거나 DNA 손상에 대한 심근 세포의 보호를 통해 심장의 건강을 개선한다(예를 들어, 이로써 심근 비대(예를 들어, 고령 대상에서)를 억제하고/하거나 예방한다)).

미토콘드리아(MT)에서 분리(uncouple) 단백질(Ucp)은 열 발생과 미토콘드리아 전위 또는 완전성의 유지를 위해 중요하다. Ucp2의 손실은 더 짧은 수명과 미토콘드리아에서 반응성 산소 종(ROS)의 높은 생성을 야기한다고 입증되었다. 본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험에서는 Ucp2가 심근에서 발현되는 주요 Ucp라고 밝혀졌고, 제시하였다. 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여하면 Ucp1 또는 Ucp3 발현을 변경하지 않았으나, Ucp2 발현은 셀렌 처리 PolG 마우스에서 상당히 증가하였다. 본원을 실시하는데 메커니즘의 이해가 필요하지 않지만, 그리고 본원이 임의의 특정 작용 메커니즘으로 한정되지 않지만, 일부 실시형태에서, 셀렌은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하는 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 대상(예를 들어, 고령 대상)에게 투여될 때, 심장에서 Ucp2의 발현을 상향 조절한다(예를 들어, 이로써 반응성 산소 종 생성을 억제한다(예를 들어, 이로써 DNA 손상에 대한 심근 세포의 보호를 통해 심장의 건강을 개선한다(예를 들어, 이로써 심근 비대(예를 들어, 고령 대상에서)를 억제하고/하거나 예방한다))).

Lcn2는 심부전의 바이오마커(biomarker)이며, 심근 수축을 위해 중요하다. 인간이 나이가 들 때, 심장은 심근 세포가 확대되고, 근 세포 수축성이 줄어들면서 단단해지며, 둘 다 심부전과 심장 비대의 원인을 유발한다. 대조 및 셀렌 처리 PolG 마우스로부터 심장에서 Lcn2 발현을 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. Lcn2 발현에서 상당하고, 극적인 증가가 고령의 PolG 심장에서 밝혀졌다. 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여하면 대조와 비교하여 나이 든 PolG 마우스에서 Lcn2 발현의 상당한 감소를 얻었다는 관찰은 더욱더 놀라운 일이었다. 이들 결과는 셀렌 처리 polG 심장에서 증가한 pNfat2/3 수준(예를 들어, 유전자 전사에서 Nfat 활성의 불활성화)에 관해 본원에서 개시한 다른 결과를 지지한다. 추가로, Lcn2가 Nfat 타깃임이 입증되었다. 따라서 본원을 실시하는데 메커니즘의 이해가 필요하지 않지만, 그리고 본원이 임의의 특정 작용 메커니즘으로 한정되지 않지만, 일부 실시형태에서, 셀렌은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하는 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 대상(예를 들어, 고령 대상)에게 투여될 때, 심장 조직에서 Lcn2의 연령 관련 발현 향상을 중화하고/하거나 없앤다(예를 들어, 이로써 심근 비대(예를 들어, 고령 대상에서)를 억제하고/하거나 예방한다).

따라서 바람직한 실시형태에서, 본원은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 수용성 분획(예를 들어, 본원에서 기재한) 또는 이의 수 불용성 분획(예를 들어, 본원에서 기재한) 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어진 1 이상의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 본원에서 기재한))의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 제공하며, 이 조성물은 대상에서 비대 단백질의 심장 발현을 줄이는데(예를 들어, 심장 비대를 예방적으로 또는 치료적으로 처치하기 위해) 사용된다(예를 들어, 심장 비대 및/또는 심근 두께와 비교하여 셀렌을 포함하는 조성물을 투여한 대상에서 심근의 비후에 관련된 분자의 발현 및/또는 셀렌을 포함하는 조성물을 받지 않은 대조 대상에서 심근의 비후에 관련된 분자의 발현을 억제하도록).

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본원은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 수용성 분획(예를 들어, 본원에서 기재한) 또는 이의 수 불용성 분획(예를 들어, 본원에서 기재한) 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어진 1 이상의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 본원에서 기재한))의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 제공하며, 이 조성물은 대상에 투여가 심근의 비후에 관련된 분자의 발현을 예방하는데(예를 들어, 셀렌을 포함하는 조성물을 받지 않은 대조 대상의 심장 비대의 존재 또는 중증도와 비교하여 셀렌을 포함하는 조성물을 투여한 인간 또는 동물 대상에서 심장 비대를 예방하도록) 사용된다. 본원은 대상에서 예방적으로 또는 치료적으로 처치된 심근병증의 형태에 의해 한정되지 않는다. 실제로, 본원의 조성물 및 방법은 비대형 심근병증(예를 들어, 가족성 비대형 심근병증, 심근경색, 또는 판막성 심장병(예를 들어, 판막의 점액종성 변성, 유두 근 기능장해 또는 류마티스열에 관련)으로 인해), 확장성 심근병증, 구속형 심근병증, 및 부정맥원성 우심실 심근병증(ARVC)을 포함하나, 이들에 한정되지 않는, 비대 단백질의 심장 발현의 감소에서 이익을 얻는, 임의 심근병증의 예방 및/또는 치료 요법에서 용도를 찾는다.

본원을 실시하는데 메커니즘의 이해가 필요하지 않지만, 그리고 본원이 임의의 특정 작용 메커니즘으로 한정되지 않지만, 바람직한 실시형태에서, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 수용성 분획(예를 들어, 본원에서 기재한) 또는 이의 수 불용성 분획(예를 들어, 본원에서 기재한) 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어진 1 이상의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 본원에서 기재한))의 형태로 셀렌의 투여는 비대 단백질(예를 들어, 베타(β)-미오신 중쇄 및/또는 안키린 반복 단백질)의 심장 발현을 감소시키며, 이로써 심근 노화와 비대를 억제하고/하거나 예방한다. 비제한적인 일 실시형태에서, 셀렌 강화 효모 및/또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어지는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물을 대상에게 투여한 비대 단백질(예를 들어, 베타(β)-미오신 중쇄 및/또는 안키린 반복 단백질)에 대한 대상의 심장 발현에서 감소는 대상에서 유전자 전사에 관련한 심장 핵 Nfatc2/3 활성 감소를 통해 얻어진다. 또 다른 비제한적인 실시형태에서, 셀렌 강화 효모 및/또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어지는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물을 대상에게 투여한 비대 단백질(예를 들어, 베타(β)-미오신 중쇄 및/또는 안키린 반복 단백질)에 대한 대상의 심장 발현에서 감소는 대상에서 심장 리보솜 단백질 키나제(pS6K1) 발현 및/또는 활성의 감소를 통해 일어난다.

일부 실시형태에서, 셀렌 강화 효모 및/또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어지는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물을 대상에게 투여한 비대 단백질(예를 들어, 베타(β)-미오신 중쇄 및/또는 안키린 반복 단백질)에 대한 대상의 심장 발현에서 감소는 대상에서 포크헤드 박스(forkhead box) O3(foxo3)의 향상된 심장 발현 및/또는 활성을 통해 얻어진다.

일부 실시형태에서, 셀렌 강화 효모 및/또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어지는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물을 대상에게 투여한 비대 단백질(예를 들어, 베타(β)-미오신 중쇄 및/또는 안키린 반복 단백질)에 대한 대상의 심장 발현에서 감소는 대상에서 립칼린(lipcalin)-2(Lcn2)의 연령 관련된, 향상된 심장 발현의 감소 또는 제거를 통해 일어난다.

본원은 본원의 조성물과 방법으로 투여한 대상의 형태에 의해 한정되지 않는다. 실제로, 심장 비대의 진행이 느려지게 보이는 대상, 심장 비대의 진행이 중단되는 대상 및 심장 비대의 진행이 반전되는 대상을 포함하나, 이들에 한정되지 않는, 다양한 대상이 본원의 조성물과 방법으로 투여로부터 이점을 발견한다. 대상에서 심장 비대의 진행을 느리게 하는 비제한적인 예는 대상에서 비대 단백질의 심장 발현을 줄이는데 효과적인 양으로(예를 들어, 셀렌을 포함하는 조성물을 받지 않는 대조 대상과 비교하여) 셀렌 강화 효모 및/또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어지는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물의 투여를 통해 대상의 비대 단백질(예를 들어, 베터(β)-미오신 중쇄 및/또는 안키린 반복 단백질)의 심장 발현을 줄이는 것이다.

대상은 심장 비대의 징후, 증상 또는 다른 징후를 나타낼 수 있거나, 심장 비대의 징후, 증상 또는 다른 징후를 나타낼(예를 들어, 현재 심장 비대의 징후, 증상 또는 다른 징후를 나타내지 않지만, 심장 비대 위험이 큰 유전적 소인으로 의학적으로 진단되는) 위험이 있을 수 있다(예를 들어, 유전적으로 걸리기 쉽다). 다른 실시형태에서, 대상은 심근병증(예를 들어, 비대형 심근병증(예를 들어, 가족성 비대형 심근병증, 심근경색, 또는 판막성 심장병(예를 들어, 판막의 점액종성 변성, 유두 근 기능장해 또는 류마티스열에 관련), 등으로 인해), 확장성 심근병증, 구속형 심근병증, 및 부정맥원성 우심실 심근병증(ARVC))이 있거나 위험이 있다.

유전자 발현의 변화는 처리 대상 대 미처리 대상에서 mRNA 발현 수준을 비교함으로써 검출될 수 있다. 프라이머, 및 프로브는 확인가능한 서열에 기초하여 얻어지고, 설계될 수 있다. 프라이머 또는 프로브는 전형적으로 약 200, 150, 100, 75, 50, 25, 15, 10 또는 5 뉴클레오티드 또는 5 내지 200에서 임의 정수의 뉴클레오티드이다. 프라이머 또는 프로브는 하기에 제시한 서열을 가진 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 특이하게 하이브리드화 한다(hybridize). 프라이머 또는 프로브는 리포터 분자에 의해 검출가능하게 표지될 수 있다.

본원에서 개시한 유전자에 대한 핵산과 단백질 서열은 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 전형적인 서열을 표 1에 제시한다.

근감소증

골격 근육량의 연령 관련 상실인, 근감소증은 점진적인 동작 둔화를 유발하는 근육량과 질의 저하, 강도와 힘에서 감소, 노쇠 및 낙상 위험 증가를 특징으로 한다. 근감소증은 기준 그룹의 평균 아래 2 표준편차 미만인 충수 골격 근육량(kg/키²(㎡))으로서 정의되었다(예를 들어, Baumgartner et al. (Am J Epidemiol 1998; 147:755-63; 149: 1161) 참조). 근감소증의 유병률에 대한 추정치는 60세 이상의 성인에서 13% 내지 24% 범위이고, 80세 이상의 인간에서 50%를 초과한다. 성장 호르몬 분비는 중간 사춘기로부터 계속해서 감소하며, 성장 호르몬은 근육량을 증가시킨다고 알려져 있다. 성장 호르몬 결핍이 있는 환자는 근육량을 감소시켰고, 지방량을 증가시켰다. 성장 호르몬 대체물은 근육량을 증가시키며, 지방량의 감소를 유도한다.

근육 조직 재생에 관련되는 정상 메커니즘은 처음에 위성 세포의 점증을 포함한다. 근육 위성 세포는 성숙 근섬유의 기저판과 근섬유초 사이에 위치하는 근원성 전구체의 분명한 계통이다(예를 들어, Bischoff, 1994; Grounds and Yablonka-Reuveni, 1993 참조). 재생 사이클 동안, 위성 세포는 활성화되어 근섬유로부터 재생 부위로 이동하여 근모세포를 생성한다. 대부분의 증식 근모세포는 근관으로 분화한다. 근관은 성숙하여 근 섬유에 통합된다. 근관으로 분화하지 않는 근모세포는 근섬유로 복귀하여 위성 세포 집단을 복원한다.

근육 재생 사이클은 인간과 동물 수명 내내 연속으로 일어난다(예를 들어, 쇠약하거나 손상된 근육 조직을 대체하기 위해). 신체가 노화함에 따라 근육 재생 사이클은 효율적이지 못하게 된다. 근육량과 성능의 감소를 초래하는 근감소증은 정상적인 노화와 관련된다. 골격근은 노화 중에 자체를 재생할 수 있도록 유지되지만, 노령의 근육에서 미지의 인자는 근육 위성 세포 활성화, 증식 및 분화에 대해 지지하지 않는 환경을 조성하며, 근육 조직의 순손실을 초래한다(예를 들어, Greenlund and Nair, 2003 참조). 간세포 성장 인자(HGF), 섬유모세포 성장 인자(FF) 및 메카노(Mechano) 성장 인자(MGF)를 포함하여, 일부 성장 인자는 위성 세포 활성화를 조절함으로써 근육 재생에 긍정적으로 영향을 미친다고 알려졌다(Floss et al, 1997; Miller et al, 2000, Goldspink and Harridge; 2004).

본원은 셀렌(예를 들어, 셀렌 강화 효모 및 이로부터 얻어지거나 유도되는 셀렌 함유 화합물)을 포함하는 조성물 및 근감소증을 치료하고, 억제하기 위한 이의 사용 방법을 제공한다. 특히, 본원은 셀렌 강화 효모(예를 들어, SELPLEX)를 포함하는 조성물, 이의 내부에 존재하고/하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물, 및 대상에서 골격 근육량을 증가시키고/시키거나 유지하기 위한 이의 사용 방법(예를 들어, 근감소증에 대한 치료적 및/또는 예방적 요법으로서)을 제공한다. 본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험에서는 셀렌 강화 효모(예를 들어, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모)가 대상에 투여될 때 골격근 단백질 합성을 향상시키며, 또한 골격근에서 프로테아좀(proteasome) 단백질 분해를 억제한다는 사실을 밝혀냈고, 제시하였다. 대상에 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 투여로 또한 골격근 위성(줄기) 세포를 활성화하였다. 더구나, 대상에 셀렌 강화 효모의 투여로 칼시뉴린의 발현을 활성화하였고, 이로써 골격근에서 비대 유전자 발현을 촉진하였다.

따라서 바람직한 실시형태에서, 본원은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어진 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 제공하며, 이 조성물은 대상에서 근감소증을 치료하는데(예를 들어, 셀렌을 포함하는 조성물을 받지 않는 대조 대상의 근육량과 비교하여 셀렌을 포함하는 조성물을 투여한 인간 또는 동물 대상에서 근육량을 증가시키고/시키거나 유지하도록) 사용된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 본원은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어진 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 제공하며, 이 조성물은 대상에서 근감소증을 예방하는데(예를 들어, 셀렌을 포함하는 조성물을 받지 않는 대조 대상의 근육량과 비교하여 셀렌을 포함하는 조성물을 투여한 인간 또는 동물 대상에서 근육량을 증가시키고/시키거나 유지하도록) 사용된다.

본원을 실시하는데 메커니즘의 이해가 필요하지 않지만, 그리고 본원이 임의의 특정 작용 메커니즘으로 한정되지 않지만, 일부 실시형태에서, 셀렌 강화 효모 및/또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어진 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 투여한 대상에서 총 단백질 질량의 증가는 단백질 합성의 자극 및/또는 단백질 분해의 억제에 기인한다. 비제한적인 일 실시형태에서, 셀렌(2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물의 형태로)을 투여한 대상에서 총 단백질 질량의 증가는 Gsk3β 및/또는 Ampk 발현을 조절하고, mTOR/MAPK/S6K1 신호 전달을 변경하며, 따라서 골격근에서 단백질 합성을 향상시키는, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모에 존재한 셀렌 함유 화합물의 능력에 기인한다. 본원을 실시하는데 메커니즘의 이해가 필요하지 않지만, 그리고 본원이 임의의 특정 작용 메커니즘으로 한정되지 않지만, 일부 실시형태에서, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어진 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 셀렌은 비대 유전자 발현을 자극하고(예를 들어, 칼시뉴린과 단백질 신장 인자), 이로써 단백질 합성을 증가시키며, 골격근의 위축에 효과가 있다.

또 다른 비제한적인 실시형태에서, 셀렌 강화 효모 및/또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물을 투여한 대상에서 총 단백질 질량의 증가는 단백질 합성에 대한 미오스타틴/Acvr 신호 전달의 억제 효과를 감소시키는(예를 들어, 이로써 근감소증을 억제하고/하거나 골격근 비대를 유도하는) 것으로부터 유래하는 향상된 단백질 합성을 통해 얻어진다. 일부 실시형태에서, 셀렌 강화 효모 및/또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물을 투여한 대상에서 총 단백질 질량의 증가는 골격근 위성 세포의 활성화를 통해 얻어진다. 일부 실시형태에서, 셀렌 강화 효모 및/또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물을 투여한 대상에서 총 단백질 질량의 증가는 신호 전달 분자 칼시뉴린 및/또는 NFAT의 자극을 통해 얻어진다.

본원을 실시하는데 메커니즘의 이해가 필요하지 않지만, 그리고 본원이 임의의 특정 작용 메커니즘으로 한정되지 않지만, 일부 실시형태에서, 셀렌(2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로)을 투여한 대상에서 단백질 분해의 억제와 골격근 위축의 예방은 mTOR의 발현 감소 결과로서 위축 유전자 Trim63 및 Fbxo32의 발현을 감소시키고/약화시키고, 및/또는 Foxo 전사 인자에 관련한 활성을 약화시키는, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모에 존재하는 셀렌 함유 화합물의 능력에 기인한다.

따라서 일부 실시형태에서, 본원은 근감소증의 치료 방법으로서 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어지는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물의 유효량을 이러한 치료가 필요한 대상(예를 들어, 인간 또는 동물 대상)에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원은 대상에서 골격근 위성 세포의 활성화를 증가시키는 방법에서 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어지는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원은 대상에서 단백질 합성에 대해 미오스타틴 및/또는 Acvr 억제를 감소시키는 방법에서 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어지는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원은 대상(예를 들어, 대상에서 골격 근육량을 증가시키기 위해)에서 미오스타틴/Acvr 신호 전달을 억제하는(예를 들어, 미오스타틴 및/또는 Acvr(예를 들어, Acvr2b)의 발현에 대한 하향 조절을 통해) 방법에서 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어지는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.

유전자 발현의 변화는 악티노마이신 b(Act b)와 같은 기준 유전자와 비교하여 mRNA 발현 수준을 결정함으로써 또는 면역 분석과 같은 분석을 사용하여 단백질의 증가 수준을 검출함으로써 검출될 수 있다. 프라이머, 및 프로브는 본원에서 기재한 유전자에 대해 하기에 제시한 전형적인 기준 서열에 기초하여 얻어지고, 설계될 수 있다. 이러한 단백질 및 핵산 서열은 공개적으로 이용가능하다. 프라이머 또는 프로브는 전형적으로 약 200, 150, 100, 75, 50, 25, 15, 10 또는 5 뉴클레오티드 또는 5 내지 200에서 임의 정수의 뉴클레오티드이다. 프라이머 또는 프로브는 하기에 제시한 서열을 가진 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 특이하게 하이브리드화 한다. 프라이머 또는 프로브는 리포터 분자에 의해 검출가능하게 표지될 수 있다. 이러한 표지는 알렉사 플로어(Alexa flour), 비오틴, FAM, TAMRA, HEX, NED, ROX, 등을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어지는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물의 유효량을 대상(예를 들어, 대상에서 근감소증을 치료하기 위해)에게 투여하는 것을 포함하는 근육량을 유지하거나 증가시킬 필요가 있는 대상에서 근육량을 유지하거나 증가시키는 방법을 제공한다.

본원은 골격근 유지 및/또는 증가를 요구하는 대상의 형태에 의해 한정되지 않는다. 상기에 기재한 바와 같이, 정의된 근감소증은 어린 기준 그룹의 평균 아래 2 표준편차 미만인 충수 골격 근육량(kg/키²(㎡))이다(t-스코어). t-스코어는 전형적으로 dxa(이중 에너지 x선 흡수 측정법) 또는 유사하고, 재현성 있는 측정 수단에 의해 대상의 축 방향 골격 근육량을 측정함으로써 결정된다. 축 방향 골격 근육량의 측정은 대상의 진행(본원에서 기재한 대상을 치료하는 방법의 사용 전, 동안 및/또는 후에)을 주시하여 치료가 골격 근육량 감소를 둔화하거나, 방지하거나, 반전시키는 지를 알아내는데 사용될 수 있다.

본원의 한 목적은 근감소증의 진행을 둔화하는 것, 이의 진행을 중지하는 것, 및 이를 부분적으로 반전시키는 것을 포함하여 근감소증을 치료하고/하거나 억제하는 것이다. 근감소증의 진행을 둔화하는 것의 예는 대상이 -1.5의 t-스코어로부터 -2로 나아갈 시간 길이를 바꾸는 것이다(예를 들어, 이러한 진행이 통상 5년이 걸릴 것이라면, 본원에서 사용되는 치료는 이러한 변화를 10년으로 둔화시킬 수 있다). 부분 반전의 예는 t-스코어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 이상의 단위를 감소시키는 것을 포함한다(예를 들어, -2의 t-스코어로부터 -1.9, -1.8, -1.7, -1.6, -1.5, -1.4, -1.3, -1.2, -1.1, 등의 t-스코어로 이동한다). 근감소증을 치료하는 것은 또한 근감소증의 발병을 지연시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 50세의 전형적인 남성은 55세까지 근감소증의 징후를 보이기 시작할 것이라면, 본원에 따른 치료는 발병을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년, 또는 그 이상을 지연시킬 수 있다. 따라서 근감소증을 치료하는 것은 아직 근감소증으로 진단되지 않았지만, 발현하는 근감소증에 취약하거나 취약할 것으로 예상되는 대상을 치료하는 것을 포함한다. 취약하거나 취약하다고 예상되는 대상의 비제한적인 예는 또한 글루코코르티코이드 스테로이드를 포함하는 호르몬 요법으로 투여되는 대상, 신경변성 질환이 있는 대상, 만성 감염증이 있는 대상, AIDS가 있는 대상, 만성 염증 상태가 있는 대상 및 암이 있는 대상을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

본원의 조성물과 방법에서 이익을 얻는 다른 대상은 근육량 손실을 겪고 있지만 일상생활의 행위를 방해하고/하거나 대상이 독립생활을 영위하는 것을 막는(예를 들어, 곧 개호 생활을 필요로 할 수 있는 환자) 상태를 겪지 않는 대상을 포함한다.

예를 들어, 본원의 조성물과 방법에서 이익을 얻는 대상은 3, 2.9, 2.8, 2.7, 2.6, 2.5, 2.4, 2.3, 2.2, 2.1, 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0, -0.1, -0.2, -0.3, -0.4, -0.5, -0.6, -0.7, -0.8, -0.9, -1.0, -1.1, -1.2, -1.3, -1.4, -1.5, -1.6, -1.7, -1.8, -1.9, -2.0, -2.1, -2.2, -2.3, -2.4, -2.5, -2.6, -2.7, -2.8, -2.9, -3.0, -3.1, -3.2, -3.3, -3.4, -3.5, -3.6, -3.7, -3.8, -3.9, -4.0, -4.1, -4.2, -4.3, -4.4, -4.5, -4.6, -4.7, -4.8, -4.9, -5.0, -5.1, -5.2, -5.3, -5.4, -5.5, -5.6, -5.7, -5.8, -5.9, 및 -6.0으로부터 그러나 이에 한정되지 않는 t 스코어가 있는 대상을 포함한다. 그러나 본원은 이대로 한정되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원의 조성물과 방법에서 이익을 얻는 대상은 3보다 크거나 -6.0 미만인 t 스코어가 있는 대상을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원의 조성물과 방법에서 이익을 얻는 대상은 연령이 40-45, 45-50, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80-85, 85-90, 또는 그이상인 대상을 포함한다. 그러나 본원은 이대로 한정되지 않는다. 예를 들어, 본원의 조성물과 방법에서 이익을 얻는 대상은 연령이 40세보다 더 어린 대상(예를 들어, 암이 있는 대상, 신경변성 질환이 있는 대상, 만성 염증 질환이 있는 대상, 등)을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 본원은 근감소증을 치료하는 방법으로서 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 얻어지는 1 이상의 셀렌 함유 화합물의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물의 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 대상(예를 들어, 인간 또는 동물 대상)에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.

비만, 2형 당뇨병, 및 관련 상태

근감소증과 비만은 선진국에서 기대 수명과 건강관리 비용에 대한 영향이 증대하는 2개의 독립적인 아직 상호 연결되는 상태이다. 증가한 지방량과 줄어든 근육량의 조합은 "근감소성 비만"으로서 언급된다(예를 들어, Parr, E., Maturitas, 2013. 74: p. 109-113 참조). 비만은 골격근에서 단백질 합성을 줄이고, 아미노산 통합을 방지하는 지방량과 지질 축적 증가를 촉진함에 따라 근감소증을 악화시킨다(예를 들어, Parr, E., Maturitas, 2013. 74: p. 109-113 참조). 다음에, 골격 근육량이 전신 글루코오스 처리와 인슐린 감수성에서 기본적인 역할과 함께 대사 건강에 결정적이므로, 근감소증은 비만을 악화시킨다(예를 들어, Parr, E., Maturitas, 2013. 74: p. 109-113 참조). 근감소증 외에, 비만은 흔히 II형 당뇨병, 고혈당증, 등과 같은 다른 대사 질환과 연관된 부작용이다. 유전적 소인과 비만 관련 분자의 발현은 또한 기여 인자라는 사실이 잘 이해되고 있다.

비만은 선진국에서 기대 수명과 건강관리 비용에 대한 영향이 증대하고 있다(예를 들어, Parr, E., Maturitas, 2013. 74: p. 109-113 참조). 비만은 II형 당뇨병, 고혈당증 대사 증후군, 인슐린 저항성 및 기타 다수와 같은 일부 대사 질환과 관련되어 있다. 유전적 특징과 비만 증가와 관련되는 특정 유전자의 발현은 이들 상태에 기여하는 역할을 한다는 사실이 이해된다.

이러한 한 예는 또한 "비만 유전자"로서 언급된 지방량과 비만 관련 유전자(FTO)이다. FTO는 어린이와 성인에서 증가한 체질량 지수 및 비만에 대한 소인과 강력하게 연관되어 있다(예를 들어, Gulati et al, PNAS, 2013. 110(7): p. 2557-2562 참조). FTO 유전자는 편재적으로 발현되지만, 뇌에서, mRNA 수준은 해마, 소뇌 및 시상하부 내에서 특히 높으며, 식품 섭취, 전신 대사 및 비만의 조절에서 뇌 FTO의 잠재적인 역할을 제안하고 있다(예를 들어, Church, PLoS Genetics, 2009 참조).

본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 추가 실험은 대상에 셀렌의 투여가 FTO의 발현을 변경할 수 있는지를 알아내기 위해 실시되었다. 실시예 2에서 기재한 동물 모델을 사용하여, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 대상은 대조 대상과 비교하여 피질 조직(배수 변화(fold change) = -1.70)에서뿐만 아니라 비복근 조직(배수 변화 = -3.33)에서도 상당히 감소한 수준의 FTO 유전자 발현을 나타냈다고 확인되었다.

2형 당뇨병이 있는 대상에서 증가한 FTO 발현과 감소한 미토콘드리아 산화적 기능 사이에 강한 연관성이 존재한다(예를 들어, Bravard et al, 2011 참조). 셀렌 강화 효모로부터 동정하고, 단리된 일부 셀렌 함유 화합물은 복합체 I 또는 II 의존 기질을 사용하여 최대 호흡 용량 증가뿐만 아니라 미토콘드리아 ATP 합성 능력 증가로 미토콘드리아 생체 에너지 요법을 상당히 개선하는 것으로 발견되었다. 따라서 본원은 일부 실시형태에서 셀렌(본원에서 기재한(예를 들어, 실시예 1에서), 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 수용성 분획, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 수 불용성 분획, 셀렌 강화 효모의 추출물(예를 들어, 산성 조건 하에 가용성), 가용성 셀레노당단백질, 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 셀렌 강화 효모(예를 들어, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모)로부터 얻어지거나 유도되는) 또는 이들의 유도체, 단리되거나 합성된 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 셀레노에테르, SeCys 함유 디펩티드 및/또는 트리펩티드의 복합체, 셀로놀 또는 셀레녹시드(또는 이들의 유도체)), 셀렌 함유 단백질 및/또는 셀렌 함유 펩티드)를 포함하는 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것(예를 들어, 이로써 미토콘드리아 ATP 생성을 향상시키고, 미토콘드리아 호흡을 증가시키며, 글루코오스 대사를 증가시키고/시키거나, 비만과 관련된 분자(예를 들어, FTO)의 발현을 감소시킨다)을 포함하는 대상(예를 들어, 당뇨병이 있는 대상 및/또는 비만 대상)의 치료 방법을 제공한다.

대상에게 셀렌의 투여가 대상의 간 및/또는 골격근에서 OXPHOS 활성을 변경할 수 있는 지(예를 들어, 2형 당뇨병에 대한 치료법으로서)를 연구하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 또한 실험을 수행하였다. 본원의 실시형태의 개발 중에 생성된 실험상의 데이터로부터 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여가 대조 대상과 비교하여 골격근에서 PGC1-α 발현의 상당한 향상을 얻었다는 사실을 발견했다.

PGC1-α는 골격근에서 미토콘드리아 활성을 향상시키는 강력한 전사 보조 활성화 인자이다. 그러나 골격근 외의 조직에서 높은 PGC1-α 수준의 발현은 대상에서 유해한 및/또는 해로운 작용이 있을 수 있다. 예를 들어, 간에서, PGC1-α는 이것이 골격근에서 수행하는 역할과 상이한 역할을 수행한다. 특히, 간에서 높은 PGC1-α 수준은 글루코오스를 대사할 수 없는, 인슐린 감수성이 부족한 당뇨병 대상에서 일어나는 매우 바람직하지 못한 이벤트인, 글루코오스 신생 합성(글루코오스 생성; 예를 들어 Liang and Ward, 2006 참조) 증가를 유발한다.

의외로, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여가 대조 대상과 비교하여 간에서 PGC1-α 발현의 상당한 감소를 얻었다는 사실이 발견되었다. 이러한 발견은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여가 대조 대상과 비교하여 골격근에서 PGC1-α 발현의 상당한 향상을 얻었다는 관찰에 근거하여 놀라운 일이었다. 따라서 일부 실시형태에서, 본원은 대상에서 동시에 PGC1-α 발현을 감소시키면서 대상의 골격근에서 PGC1-α 발현을 향상시키는 방법(예를 들어, 이로써 대상에게 골격근에서 향상된 글루코오스 대사와 처리(예를 들어, 향상된 OXPHOS를 통해) 및 간에서 억제된 글루코오스 생성을 제공한다)에서 사용하기 위한 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 1 이상의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 실시예 1에 기재한))를 포함하는 조성물을 제공한다.

또한 Nr2F2(핵 수용체 아과 2, 그룹 F, 멤버 2)로서 알려진 COUP-TFII(COUP 전사 인자 2)는 PGC1-α의 추정 직접 저해제이다(예를 들어, Lin et al., 2011 참조). 셀렌을 포함하는 조성물을 투여한 대상에서 Nr2F2의 발현을 분석하기 위해 실험을 수행하였다. 다시, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여가 대조 대상과 비교하여 골격근에서 Nr2F2 발현의 상당한 감소를 얻었고, 반면에 대조와 비교하여 간 조직에서 Nr2F2의 상당한 향상이 있었다는 사실을 발견한 것은 놀라운 일이었다. 따라서 본원은 대상의 다수 조직(예를 들어, 골격근 조직과 간 조직)에서 글루코오스 항상성을 조절하는데 사용하기 위한, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 1 이상의 수용성 분획 또는 이의 1 이상의 수 불용성 분획 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 1 이상의 셀렌 함유 화합물(실시예 1 참조))의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물의 유용성에 관한 제1 증거를 제공한다.

따라서 본원은 일부 실시형태에서, 대상(예를 들어, 2형 당뇨병이 있는 대상)의 치료(치료적으로 또는 예방적으로) 방법으로서 대상의 간에서 PGC1-α 발현을 동시에 감소시키면서 대상의 골격근에서 PGC1-α 발현을 향상시키기 위해(예를 들어, 이로써 대상의 골격근에서 글루코오스 대사 및/또는 처리를 향상시키고, 대상의 간에서 글루코오스 생성을 억제시키는) 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 1 이상의 수용성 분획 또는 이의 1 이상의 수 불용성 분획 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 본원을 실시하는데 메커니즘의 이해가 필요하지 않지만, 그리고 본원이 임의의 특정 작용 메커니즘으로 한정되지 않지만, 일부 실시형태에서, 대상의 간에서 글루코오스 생성의 동시 억제와 함께 대상의 골격근에서 글루코오스 대사/처리의 향상은 대상에 투여될 때, 대상의 골격근에서 Nr2f2의 발현을 감소시키고(예를 들어, 이로써 골격근에서 PGC1-α 발현을 향상시키고), 대상의 간에서 Nr2f2의 발현을 향상시키는(예를 들어, 이로써 간에서 PGC1-α 발현을 감소시키는) 셀렌의 능력을 통해 일어난다.

본원은 또한 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 투여를 통해 간 특이 미토콘드리아 활성을 우선적으로 그리고 차별적으로 조절하는 것이 가능하며, 반면에 아셀렌산셀렌 또는 셀레노메티오닌은 효과가 꽤 적었다는 것을 제공한다. 따라서 본원은 대상에게 셀렌(예를 들어, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모, 아셀렌산나트륨, 등)의 투여가 글루코오스 연소(glucose-burning)(OXPHOS) 유전자의 간 특이 발현 및/또는 글루코오스 대사를 끌어내는데/향상시키는데 사용될 수 있다는 것을 제공한다. 따라서 일부 실시형태에서, 본원은 셀렌(예를 들어, 셀렌 강화 효모(예를 들어, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는) 또는 이의 1 이상의 수용성 분획 또는 이의 1 이상의 수 불용성 분획 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 1 이상의 셀렌 함유 화합물, 아셀렌산나트륨, 등)의 이를 필요로 하는 대상(예를 들어, 2형 당뇨병 대상)에게 투여를 통해 대상의 간에서 글루코오스 이용을 향상시키는 방법을 제공한다.

본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험에서는 본원에서 기재한 셀렌 조성물을 투여한 대상의 간에서 OXPHOS 유전자 발현의 증가가 대조와 비교하여 발현에서 현저하기는 하지만, 그다지 크지 않은 증가(약 20-25%)를 나타냈다는 사실을 입증하였다. 이러한 증가는 인슐린 저항성 및 당뇨병 대상에서 보인 입증되고, 상응하는 유전자 발현 감소와 일치한다(예를 들어, Mootha et al, 2004 참조). 따라서 일부 실시형태에서, 본원의 조성물과 방법은 대상에서 2형 당뇨병을 치료하는데 사용된다(예를 들어, 본원을 실시하는데 메커니즘의 이해가 필요하지 않지만, 그리고 본원이 임의의 특정 작용 메커니즘으로 한정되지 않지만, 일부 실시형태에서, 본원은 간 특이 미토콘드리아 활성을 증가시키는(예를 들어, 2형 당뇨병 대상에서 관찰된 미토콘드리아 활성 감소를 복원하는) 조성물과 방법을 제공한다).

본원의 실시형태의 개발 중에 실시예 1에서 동정한 특이 셀렌 함유 화합물이 생물 활성(들)을 소유했는지를 알아내기 위해(예를 들어, 셀렌 함유 화합물이 생물 활성을 나타낼 것인 지 및/또는 셀렌 함유 화합물이 효모 세포의 속박물(constraint) 및/또는 다른, 셀렌 비함유, 세포 성분으로부터 단리되고, 정제되면 생물 활성이 더 클(또는 더 적을) 수 있는지를 알아내기 위해) 추가 실험을 수행하였다. 실시예 1에서 셀렌 강화 효모로부터 동정한, 다수의 가장 풍부한 셀렌 함유 화합물과 분자를 합성하였다.

실험들 중 한 주안점은 실시예 1에 기재한 바와 같이 셀렌 강화 효모에 존재하는 총 셀렌의 25%까지 구성한 수용성 추출물에 있었다. 수용성 추출물 유래 셀렌 함유 화합물이 대상에 의한 소비와 이의 장관 통과 시 셀렌 강화 효모로부터 유리되고/소화될 첫 번째일 것으로 가정하였다. 또한 상기에 실시예 1에 기재한 바와 같이, 컴퓨터 지원 예측 모델링을 사용하여 셀렌 강화 효모에 존재하는 셀렌 함유 단백질을 동정하였다. 더구나, 실험에서는 소화 효소(예를 들어, 트립신)의 작용에 의해 유리되는 소형의, 셀렌 함유 펩티드를 동정하였다.

분석과 특성화를 위해 다수의 셀렌 함유 화합물을 생성하였다. 개별 셀렌 함유 화합물이 미토콘드리아 생체 에너지 요법에 대해 만약에 있다면 어떤 전위 효과가 있었는지를 측정하기 위해, 분리된 미토콘드리아를 사용하여 셀렌 함유 화합물을 직접 시험하였다. 셀렌 함유 화합물 중 일부는 호흡의 세 상태 모두에서 미토콘드리아 활성에서의 양의 증가 및 증가한 미토콘드리아 생체 에너지 프로파일을 나타냈다. 따라서 본원은 셀렌 함유 화합물(예를 들어, LVSe-MR(C₂₂H₄₄N₇O₅Se), 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se), 셀레노아데노실호모시스테인(C₁₄H₂₀N₆O₅Se) 및 실시예 1에서 동정한 다른 화합물)의 동정과 특성화 및 대상(예를 들어, 미토콘드리아 활성/생체 에너지를 조절할 필요가 있는 대상(예를 들어, 2형 당뇨병 대상))에서 미토콘드리아 활성/생체 에너지를 조절하는데 사용하기 위한, 이를 함유하는 조성물을 제공한다.

예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원은 본원에서(예를 들어, 실시예 1에서(예를 들어, 상태 또는 질병(예를 들어, 비만, 당뇨병, 인슐린 저항성, 대사 증후군, 만성 염증(예, 간, 지방 조직, 등의) 간 지방증, 등)의 치료용 의약의 제조에서 사용하기 위한)) 기재한 셀렌 함유 화합물을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원은 미토콘드리아 활성(예를 들어, 골격근 특이 또는 간 특이 미토콘드리아 활성)을 증가시키기 위해(예를 들어, 대상에서 향상된 글루코오스 대사를 얻는) 본원에서(예를 들어, 실시예 1에서) 기재한 셀렌 함유 화합물을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상(예를 들어, 비만 대상)의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원은 미토콘드리아 활성(예를 들어, 골격근 특이 또는 간 특이 미토콘드리아 활성)을 증가시키기 위해 본원에서(예를 들어, 실시예 1에서) 기재한 셀렌 함유 화합물을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상(예를 들어, 당뇨병 대상)의 치료 방법을 제공한다. 본원을 실시하는데 메커니즘의 이해가 필요하지 않지만, 그리고 본원이 임의의 특정 작용 메커니즘으로 한정되지 않지만, 일부 실시형태에서, 대상에서 미토콘드리아 활성(예를 들어, 골격근 특이 또는 간 특이 미토콘드리아 활성)을 증가시키는 것은 미토콘드리아에서 ATP 합성을 증가시킴으로써 일어난다. 일부 실시형태에서, 대상에서 미토콘드리아 활성(예를 들어, 골격근 특이 또는 간 특이 미토콘드리아 활성)을 증가시키는 것은 호흡 용량(예를 들어, 최대 호흡 용량(예를 들어, 복합체 I 또는 II 의존 기질을 사용하여))을 증가시킴으로써 일어난다.

또 다른 놀라운 결과는 특정 셀렌 함유 화합물이 미토콘드리아에 의해 배양될 때 미토콘드리아 활성 향상 특성을 나타냈지만, 이는 다수의, 동정하고, 특성화한 다른 셀렌 함유 화합물에 대한 경우에 그렇지 않았다는 사실이었다. 예를 들어, 일부 셀렌 함유 화합물은 미토콘드리아 활성에 대해 부정적 영향을 나타냈다. 특히, 전체 구조에서 일부 유사성을 공유하는 일부 셀렌 함유 화합물이 미토콘드리아 활성을 변경하는 능력에 관해 대단히 상이한 생물 특성을 나타냈다는 사실을 발견하는 것은 놀라운 일이었다. 예를 들어, 글루타밀셀레노시스테인(C₁₆H₂₆N₂₄O₁₀Se₂)(#10)은 비록 그 전체 구조가 ATP 합성을 17.3% 증가시킨 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se)(#9)과 유사하고/크게 다르지 않더라도 ATP 합성(상태 III)을 거의 19% 감소시켰다. 이는 셀렌 강화 효모에 존재하는 이들 2종의 셀렌 함유 화합물 사이에 미토콘드리아 활성에 대한 작용에서 36% 초과 변동폭이다.

본원의 셀렌 함유 조성물 중 일부가 미토콘드리아 복합체 I의 활성을 향상시키는 능력을 나타냈다는 사실로 인해, 미토콘드리아 자극이 셀렌 함유 화합물에 의한 유해 반응성 산소 종(ROS)의 제거를 통해 일어날 수 있는지를 알아내기 위해 실험을 수행하였다. 따라서 셀렌 함유 화합물의 항산화능을 평가하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다.

셀렌 함유 화합물 중 일부는 항산화 능력을 소유하고/나타낸다는 사실을 발견하였다. 더구나, 셀렌 함유 화합물 중 일부는 부가적이거나 다소 상승적인, 다소 상반되는, 또는 상승적인(예를 들어, 산소 라디칼 포집 능력 면에서) 항산화 능력을 소유한다/나타낸다.

본원의 실시형태의 개발 중에 생성된 데이터와 정보는 유일하고, 전례가 없는 결과이다. 특히, 본원은 미토콘드리아 기능장해 또는 기능부전(예를 들어, 당뇨병(예를 들어, II형 당뇨병), 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병성 심근병증, 등에 관련된)의 치료(예를 들어, 예방적 및/또는 치료적 요법)를 위한 신규 조성물과 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원은 조합되어 바람직한, 특이 미토콘드리아 활성 향상 능력을 포함하는 조성물을 생성하는, 2종 이상의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 셀렌 강화 효모의 수용성 분획, 셀렌 강화 효모의 수 불용성 분획, 셀렌 강화 효모에 존재하고/하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물)을 포함하는 조성물을 제공한다.

예를 들어, 일부 실시형태에서, 조성물(예를 들어, 약학 조성물)은 2 이상(예를 들어, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 또는 50 이상)의 별개 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 본원에서 기재한 화합물들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원은 특정 용도를 위해 맞춰지는(예를 들어, 조합될 때, 생물 활성(예를 들어, 자극 및/또는 억제 활성)의 원하는 수준을 나타내는), 2 이상(예를 들어, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 또는 50 이상)의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 단리되거나, 화학적으로 합성되거나, 재조합 셀렌 함유 화합물) 조합을 포함하는 조성물을 제공한다.

예를 들어, 일부 실시형태에서, 2 이상의 셀렌 함유 화합물의 조합을 포함하는 제1 조성물은 근육 조직에서 미토콘드리아 활성(예를 들어, ATP 생성 및/또는 글루코오스 대사)을 향상시키는데 사용되며, 반면에 2 이상의 상이한 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 제1 조성물과 상이한 생물 활성을 나타내는)의 조합을 포함하는 제2 조성물은 간 조직에서 미토콘드리아 활성(예를 들어, ATP 생성 및/또는 글루코오스 대사)을 변경하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원은 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 실시예 1에서 동정한)을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원은 대상에서 PDHC 효소 활성을 증가시키고/시키거나 미토콘드리아 복합체 I 활성을 증가시키는 방법으로서 이를 필요로 하는 대상(예를 들어, II형 당뇨병 대상)에게 미토콘드리아 복합체 I 및/또는 PDHC 활성을 증가시키는(예를 들어, 이로써 대상에서(예를 들어, 골격근 및/또는 간에서) 미토콘드리아 호흡을 증가시키는) 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 실시예 1에서 기재한)을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

일부 실시형태에서, 셀렌(예를 들어, 본원에서 기재한(예를 들어, 실시예 1에서), 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 수용성 분획, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 수 불용성 분획, 셀렌 강화 효모의 추출물(예를 들어, 산성 조건 하에 가용성), 가용성 셀레노당단백질, 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 셀렌 강화 효모(예를 들어, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모)로부터 얻어지거나 유도되는) 또는 이들의 유도체, 단리되거나 합성된 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 셀레노에테르, 디펩티드 및/또는 트리펩티드를 함유하는 SeCys의 복합체, 셀로놀 또는 셀레녹시드(또는 이들의 유도체)), 셀렌 함유 단백질 및/또는 셀렌 함유 펩티드)을 포함하는 조성물의 약학 유효량을 단독으로 또는 또 다른 작용제와 조합하여 비만 또는 인슐린 저항성과 관련된 상태가 있는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 투여는 상태의 1 이상의 증상에서 감소 또는 제거, 상태의 1 이상의 증상에 대한 중증도 증가 예방, 및/또는 추가 질병 또는 상태의 감소, 예방, 또는 제거 중 1 이상을 야기한다.

특정 실시형태에서, 인슐린 저항성은 대상의 지방 세포, 간 세포, 또는 근육 세포에 있다. 특정 실시형태에서, 인슐린 저항성은 대상이 불충분한 글루코오스 대사를 갖게 한다. 추가 실시형태에서, 본원의 셀렌 함유 조성물의 투여는 대상의 글루코오스 대사의 증가를 야기한다(예를 들어, 지방 세포, 간 및/또는 골격근에 의해). 일부 실시형태에서, 글루코오스 대사의 증가는 미토콘드리아 ATP 합성, 미토콘드리아 호흡, 및/또는 인슐린 수용체 신호 전달 증가에 기인한다.

특정 실시형태에서, 본원의 셀렌 함유 조성물의 투여는 대상의 체지방 감소를 야기한다(예를 들어, 대상의 지방 세포의 크기 및/또는 수가 감소한다). 특정 실시형태에서, 투여는 대상이 적어도 10 파운드(예를 들어, 10, 15, 20, 35, 60, 100, 200 파운드 이상)를 상실하게 한다. 일부 실시형태에서, 투여는 대상의 체중에서 적어도 5% 감소(예를 들어, 적어도 7%, 10%, 20%, 30%, 50%, 75% 이상 감소)를 야기한다. 일부 실시형태에서, 치료되는 상태는 비만이다. 다른 실시형태에서, 치료되는 상태는 당뇨병(예를 들어, II형 또는 I형과 II형 둘 다)이다. 추가 실시형태에서, 처리되는 상태는 인슐린 저항성이다.

일부 실시형태에서, 대상은 비만, 당뇨병, 및 인슐린 저항성과 같은 상태에 걸려 있거나 걸릴 위험이 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 글루코오스 대사 증가, 체지방 감소, 체지방 증가 결여, 인슐린 수용체 신호 전달 증가, 증가한/향상된 미토콘드리아 활성, 간에서 만성 염증의 감소 또는 예방, 지방 조직에서 만성 염증의 감소 또는 예방, 간 지방증의 감소 또는 예방, 대사 에너지 소비의 촉진, 유리 지방산 순환 감소, 및/또는 콜레스테롤 감소의 경과를 얻는다.

본원에서 제공되는 방법과 약학적으로 허용되는 조성물에 의해 치료될 수 있는 상태와 병태는 비만, 당뇨병, II형 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성 증후군, 지질 대사 상태, 및 간 지방증 질환(또한 지방간 질환으로 언급됨)을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 지방간 질환은 지방간 단독(지방증) 내지 염증과 관련한 지방간(지방성 간염) 범위일 수 있다.

생식 능력

본원에서 제공되는 방법과 약학적으로 허용되는 조성물에 의해 치료될 수 있는 상태와 병태는 비만, 당뇨병, II형 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성 증후군, 지질 대사 상태, 및 간 지방증 질환(또한 지방간 질환으로 언급됨)을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 지방간 질환은 지방간 단독(지방증) 내지 염증과 관련한 지방간(지방성 간염) 범위일 수 있다.

고령의 모성 연령(≥35세)에서 아이를 가지는 최근의 사회 패턴은 건강관리 서비스를 위한 수요에 점점 더 영향을 주었다. 감소한 생식 능력 외에, 35세 이상의 여성은 출산 합병증과 이상에 대한 위험성이 높다(예를 들어, Noda et al, Biology of Reproduction, 2012. 86(1): p. 1-8 참조). 미국에서 수행한 연구에서는 고령의 모성 연령은 사산에 관련한 가장 만연한 위험 요인 중 하나이었고, 높은 비율의 산과적 개입에도, 고령의 여성은 조산, 제왕절개, 및 저 출생체중(LBW)의 비율이 높다고 결론지었다(예를 들어, Noda et al, Biology of Reproduction, 2012. 86(1): p. 1-8 참조).

더구나, 비만 및 당뇨병과 같은 기존의 모체 의학적 상태는 자간전증 및 임신성 당뇨병과 같은 임신 관련 모체 합병증을 증가시킴에 따라 고령의 모성 연령과 함께 증가한다(예를 들어, Hoque, M., Advanced maternal age and outcomes of pregnancy: A retrospective study from South Africa. 2012 참조). 비만은 여성의 배란을 감소시킬 뿐만 아니라, 이것은 규칙적으로 배란하는 여성의 임신 기회를 상당히 줄인다. 모체 비만의 마우스 모델은 또한 난모세포 미토콘드리아에서 반응성 산소 종(ROS) 생성 증가뿐만 아니라 높은 발생률의 방추체 이상을 나타냈다(예를 들어, Mills et al, Obstetrics, Gynaecology & Reproductive Medicine, 2011. 21(4): p. 107-111 참조). 난모세포가 당뇨병 모체에 노출되는 독성 상태(예를 들어, ROS 증가)는 상당한 미토콘드리아 손상을 유발한다(예를 들어, Shaum, Maturitas, 2013 참조). 추가로, 당뇨병의 마우스 모델은 과립막 세포 자연사와 난모세포 성숙 부전에서 증가를 나타냈다(예를 들어, Shaum, Maturitas, 2013 참조). 이들 및 다른 동물 모델 연구에서는 비만과 당뇨병에서 난모세포 기능장해에 대한 역할을 강조하였다.

비만, 당뇨병, 및 생식 능력 사이의 연계는 진행 중인 비만 만연, 당뇨병의 유행, 및 35세 이상 여성의 출산 지연 경향을 가정하면 특히 우려된다(예를 들어, Chang et al, Endocrinology, 2005. 146(5): p. 2445-53 참조).

최근의 데이터에서는 노화 과정에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 점 돌연변이와 결실의 축적 및 미토콘드리아에 대한 중심적 역할을 제안하고 있다. 기능부전 미토콘드리아와 후속 저 ATP 생성은 난모세포 질을 악화시키는 주요 요인 중 하나이다(예를 들어, Bentov et al, Fertility and Sterility 2013. 99(1) 참조). 미토콘드리아 복제와 증식의 과정 중에, 난모세포는 이들의 미토콘드리아 집단을 상당히 증폭하고, 단연코 가장 큰 수의 미토콘드리아와 임의 세포의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 카피를 가진다.

난소 기능부전이 있는 여성의 난모세포는 정상의 난소 프로파일을 가진 여성보다 더 작은 mtDNA 카피 수를 포함한다고 보고되었다. 흥미롭게도, 고령의 개체의 표현형 특징과 유사한 표현형 특징을 조기에 발현하는 암컷 mtDNA 돌연변이 유발 인자 마우스(POLG, 본원에서 기재함)는 생식 능력에서 심한 감소를 겪으며, 수컷에 여러 달 동안 노출되었음에도 20 주령 후 임신할 수 없었다(예를 들어, Yu et al, J Cell Physiol, 2010. 3: p. 672-80 참조). 이들, 및 다른 연구에서는 생식 노화는 난모세포의 우선적 선택의 결과가 아니라, 오히려 노화 과정의 영향 및 더 구체적으로는 미토콘드리아의 기능에 대한 노화 영향이라고 나타냈다.

높은 수준의 반응성 산소 종(ROS)은 mtDNA 손상에 강하게 관련되어 있으며, 세포 ROS의 약 90%는 복합체 I과 III에서 미토콘드리아에 의해 생성된다.

난포액에서 ROS의 수준은 체외 수정의 성공을 예상하는데 사용될 수 있으며, 복수에서 ROS의 높은 수준은 임의의 다른 명백한 원인이 없는 일부 여성의 불임 원인인 것으로 생각된다(예를 들어, Trifunovic et al, Nature, 2004. 429(6990): p. 417-423 참조). 추가로, 기초 총 항산화 능력(TAC) 수준은 난모세포가 성공적으로 수정된 난포에서 더 높다고 알려졌다(예를 들어, Cupta et al, Reprod Fertil Dev, 2011. 23(5): p. 673-80 참조).

따라서 일부 실시형태에서, 본원은 생식 능력을 향상시키고/시키거나 유지하는(예를 들어, 난모세포(예를 들어, 노령 난모세포)에서) 조성물과 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 셀렌(예를 들어, 본원에서 기재한 셀렌 함유 화합물)을 포함하는 조성물을 생식 능력을 유지하거나 향상시키는 유효량으로 이를 필요로 하는 대상(예를 들어, 임신을 원하는 대상)에게 투여한다. 본원은 또한 일부 실시형태에서, 생식 능력의 유지 및/또는 향상을 위한 의약 또는 영양 보충제의 제조에서 셀렌(예를 들어, 본원에서 기재한)을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원의 조성물과 방법은 난모세포 질, 양, 및/또는 기능성을 개선하는데(예를 들어, 반응성 산소 종의 감소 및/또는 총 항산화 능력의 증가를 통해(예를 들어, 미토콘드리아 내에서)) 사용된다.

따라서 본원은 세포의 미토콘드리아의 기능장해가 원인인 징후 또는 증상을 나타내는 질병을 포함하여 다양한 미토콘드리아 질환이 본원의 조성물과 방법을 사용하여 치료될 수 있다는 것을 제공한다. 미토콘드리아 질환의 예는 미토콘드리아 뇌근병증, 젓산증, 및 뇌졸중양 발작(MELAS로 지칭함), 만성 진행성 외안근 마비, 불규칙 적색 섬유와 관련한 미오클로누스(myoclonus) 간질; 후쿠하라(Fukuhar) 증후군, 레베르(Leber)병, 레이(Leigh) 뇌병 및 피어슨(Pearson)병을 포함하나, 이들에 한정되지 않으며, 널리 알려져 있다.

일부 실시형태에서, 본원은 대상에서 골격근 대사 또는 골격근 에너지 항상성, 또는 간 대사 또는 간 에너지 항상성을 조절하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 셀렌(예를 들어, 본원에서 기재한)을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여한다. 대상에서 골격근 대사 또는 골격근 에너지 항상성을 조절하는 방법은 이를 필요로 하는 대상에게 미토콘드리아 활성(예를 들어, 본원에서 기재한 바와 같이)을 조정하는 셀렌(예를 들어, 본원에서 기재한)을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본원의 조성물과 방법은 또한 간 및/또는 근육 활성에 대한 특정 약물의 작용을 상쇄하는데(예를 들어, 화학요법 약물(예를 들어, 암 및/또는 자가 면역 질환을 치료하는데 사용되는)에 의한 치료 동안 및/또는 후에) 사용될 수 있다. 본원의 조성물과 방법은 또한 건강한 대상의 능력(예를 들어, 신체 능력)을 향상시키는데 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 셀렌(예를 들어, 본원에서 기재한)을 포함하는 조성물은 대상에서 미토콘드리아 기능 및/또는 활성을 증가시키기 위해(예를 들어, 미토콘드리아 기능장해와 관련된 상태 또는 질병을 치료(예를 들어, 예방적으로 또는 치료적으로)하기 위해) 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기재한 셀렌을 포함하는 조성물의 투여는 대상에서 미토콘드리아 세포사를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기재한 셀렌을 포함하는 조성물의 투여는 대상에서 반응성 산소 종 생성을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기재한 셀렌을 포함하는 조성물의 투여는 대상에서 저산소증 관련 징후, 증상 또는 상태를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기재한 셀렌을 포함하는 조성물의 투여는 대상에서 미토콘드리아 ATP 생성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에서 기재한 셀렌을 포함하는 조성물의 투여는 대상에서 미토콘드리아 호흡을 증가시킨다.

본원의 조성물과 방법을 사용하여 치료될 수 있는 심혈관 질환은 심근병증 또는 심근염; 예컨대 특발성 심근병증, 대사성 심근병증, 알코올성 심근병증, 약물 유발 심근병증, 허혈성 심근병증, 및 고혈압성 심근병증을 포함한다. 주요 혈관(대혈관 질환) 예컨대 대동맥, 관상동맥, 경동맥, 뇌혈관 동맥, 신동맥, 장골동맥, 대퇴동맥, 및 슬와동맥의 죽상 질환이 또한 본원에서 기재한 조성물과 방법을 사용하여 치료가능하거나 예방가능하다. 치료되거나 예방될 수 있는 다른 혈관계 질환은 신 세동맥, 사구체 세동맥, 신경 맥관, 심 세동맥, 및 눈, 신장, 심장, 및 중추와 말초 신경계의 관련 모세혈관 상에 관련된 질병을 포함한다.

비슷한 방식으로, 본원의 조성물과 방법은 근육 질환을 치료하는데(예를 들어, 예방적으로 및/또는 치료적으로) 사용될 수 있다. 근육 질환은 근디스트로피(muscular dystrophy) 및 근육병을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

본원의 조성물과 방법은 인슐린 저항성 질환(예를 들어, 인슐린 저항성이 원인이 되거나 이에 기여되는 임의 질병 또는 상태)을 치료하는데 사용될 수 있다. 예는 당뇨병, 비만, 대사 증후군, 인슐린 저항성 증후군, 증후군 X, 인슐린 저항성, 고혈압, 고혈압증, 고 혈중 콜레스테롤, 이상지질혈증, 고지혈증, 지질이상증, 뇌졸중, 관상동맥 질환 또는 심근경색을 포함하여 아테롬성 동맥 경화증, 고혈당증, 고인슐린혈증 및/또는 고프로인슐린혈증, 내당능 장애, 인슐린 방출 지연, 관상동맥성 심질환, 협심증, 울혈성 심부전, 뇌졸중을 포함하여, 당뇨병성 합병증, 치매에서 인식 기능, 망막증, 말초 신경병증, 신장병, 사구체신염, 사구체 경화증, 신증후군, 고혈압성 신경화증, 임신 합병증, 여성 생식 건강 저하(예컨대 생리불순, 불임, 불규칙 배란, 다낭성 난소 증후군(PCOS)), 리포디스트로피(lipodystrophy), 콜레스테롤 관련 질환, 예컨대 담석, 담낭염 및 담석증, 통풍, 폐색성 수면 무호흡 및 호흡 문제, 골관절염, 및 골 감소, 예를 들어 골다공증의 예방과 치료를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

본원은 대상에게 투여되는 셀렌의 형태에 의해 한정되지 않는다. 셀렌 원은 합성 또는 천연 원일 수 있으며, 셀렌은 유기 또는 무기일 수 있다. 본원에서 기재한 바와 같이, 그리고 대상에서 치료하고자 했던 타깃에 따라, 다수 형태의 셀렌이 독립적으로 또는 서로 조합하여 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 대상에게 셀렌을 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(예를 들어, SELPLEX)의 형태로 투여한다. 일부 실시형태에서, 본원은 또한 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 셀렌 강화 효모로부터 얻어지거나 유도되는) 또는 이들의 유도체의 사용과 투여를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원은 셀렌 강화 효모로부터 제조된 셀렌 함유 분획의 사용과 투여를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상에게 투여한 셀렌을 포함하는 조성물은 셀렌 강화 효모의 수용성 분획을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상에게 투여한 셀렌을 포함하는 조성물은 셀렌 강화 효모의 수 불용성 분획을 포함한다.

일부 실시형태에서, 대상에 투여한, 셀렌을 포함하는 조성물은 셀렌 강화 효모의 추출물(예를 들어, 산성 조건 하에 가용성(예를 들어, 제1 pH(예를 들어, pH 1.85)에서 추출되고/되거나 침전되는 가용성 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 가용성 셀레노당단백질)의 분획, 제1 pH(예를 들어, pH 3.0)에서 침전되는 제2 분획, 제3 pH(예를 들어, pH 4.0)에서 침전되는 제3 분획, 및 제4 pH(예를 들어, pH 6.0)에서 침전되는 제4 분획))을 포함하는 단일 액상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상에게 투여한, 셀렌을 포함하는 조성물은 2012. 6. 28자 공개되고, 본원에서 전적으로 참조로서 원용하는, 미국특허 출원 공개 제20120164234A1호에 기재된 바와 같이 제조된 셀렌 강화 효모의 추출물을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원은 1 이상의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 셀레노에테르, 디펩티드 및/또는 트리펩티드를 함유한 SeCys의 복합체, 셀로놀과 셀레녹시드(또는 이들의 유도체)), 셀렌 함유 단백질 및/또는 셀렌 함유 펩티드, 이를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법(예를 들어, 본원에서 기재한 바와 같이 인간 및/또는 동물을 위해)을 제공한다(실시예 1 참조).

예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상에게 투여되는(예를 들어, 본원의 방법에서) 셀렌을 포함하는 조성물은 하기 중 1 이상을 포함한다: 2,3-DHP-셀레노시스테인-시스테인, N-아세틸셀레노시스테인-셀레노호모시스테인, 메틸티오셀레노글루타티온, 2,3-DHP-셀레노시스테인-셀레노시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-시스테인일글리신, 2,3-DHP-셀레노시스테인-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노호모시스테인-시스테인일글리신, 셀레노메틸-셀레노글루타티온, 셀레노글루타티온-시스테인, 글루타티온-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-γ-글루타모일시스테인, 디-2,3-DHP-셀레노시스테인, N-아세틸시스테인-셀레노글루타티온, 셀레노글루타티온-셀레노시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-2,3 DHP 셀레노호모시스테인, 글루타티온-N-아세틸셀레노호모시스테인, 글루타티온-셀레노시스테인일글리신, γ-글루타모일 셀레노시스테인-γ-글루타모일 시스테인, γ-글루타모일시스테인-2,3-DHP-셀레노시스테인, 글루타티온-2,3-DHP-셀레노시스테인, 글루타티온-2,3-DHP-셀레노호모시스테인, 디-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-γ-글루타모일시스테인, 셀레노글루타티온-2,3-DHP-셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-2,3-DHP-셀레노호모시스테인, 셀레노글루타티온-티오-2,3-DHP-셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-글루타티온, 셀레노디글루타티온, 디-셀레노글루타티온, 티오-디셀레노글루타티온, 메틸 데히드로호모시스테인, 셀레노메티오닌, 셀레노호모란티오닌, N-아세틸셀레노시스타티오닌, 데히드록시 5'-메틸셀레노아데노신, N-아세틸시스테인-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노란티오닌, 에틸셀레노아데노신, N-프로피오닐셀레노시스타티오닌, 2,3-DHP-셀레노시스타티오닌, 메틸셀레노글루타티온, γ-글루타모일셀레노시스타티오닌, 셀레노글루타티온, 셀레노(히드록실)-셀레노펜-(3'-데옥시-아데노신), N-아세틸시스테인-셀레노호모시스테인, 알릴셀레노아데노실 호모시스테인, 셀레노-아데노실 호모시스테인, 셀레노-히드록시 아데노실 호모시스테인, 셀레노 아데노신, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀레녹시드, 아데노실-히드록시 셀레녹시드, 에틸 셀레노아데노신, 셀레노-(히드록시)-셀레노펜-(3'-데스옥시-아데노신), 아데노실-히드록시 셀레녹시드, 및 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀레녹시드. 일부 실시형태에서, 본원은 셀렌 강화 효모 내에 존재하는 셀렌 함유 화합물을 동정하는 방법(예를 들어, 실시예 1에 기재한 방법)을 제공한다.

일부 실시형태에서, 대상에게 투여되는(예를 들어, 본원의 방법에서), 셀렌을 포함하는 조성물은 1 이상의 단백질 또는 펩티드 단편을 포함하며, 여기서 단백질 또는 펩티드의 1 이상의 아미노산 잔기 내에 존재하는 1 이상의 황 분자는 셀렌 분자에 의해 치환된다. 본원은 특정 셀렌 함유 단백질 또는 펩티드에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 대상에게 투여되는(예를 들어, 본원의 방법에서), 셀렌을 포함하는 조성물은 1 이상의 펩티드 단편을 포함하며, 여기서 펩티드의 1 이상의 아미노산 잔기 내에 존재하는 1 이상의 황 분자는 하기 셀렌 분자에 의해 치환된다: MVAEAEK, DYMGAAK, YMGAAK, ELQDIANPIMSK, NQAAMNPSNTVFDAK, NFTPEQISSMVLGK, NFTPEQISSMVLGK, MVSEAEK, PEVQGDMK, ELQDIANPIMSK, AMSSR, VQGSVIGIDLGTTNSAVAIMEGK, AAAEGPMK, LTGMAFR, PFVSNDYAAYMVK, AFGIEEGLMTTVHSLTATQK, PFITNDYAAYMFK, PGMVVTFAPAGVTTEVK, VETGVIKPGMVVTFAPAGVTTEVK, AAATAAMTK, SIVPSGASTGVHEALEMR, WMGK, SIVPSGASTGVHEALEMR, AMPQK, AAMAK, HVGDMEIR, VIEEPITSETAMK, VLQALEEIGIVEISPK, LPAASLGDMVMATVK, AGMTTIVR, AGMTTIVR, MLMPK, TMGAK, MNAGR, TYENMK, MGHDQSGTK, GEAIMAPK, Ac-MNVFGK, AMEVVASER, IVMR, MA(I/L)R, AMXAK, DLETLTMHTK, LVMR, VMR, LTGMAFR, SRPNVEVVALNDPFITNDYAAYMFK, 및 VINDAFGIEEGLMTTVHSLTATQK.

본원의 다양한 실시형태에서 용도를 발견하는 다른 형태의 셀렌 함유 화합물은 미국특허 제6,911,550호, 제6,197,295호, 제5,221,545호, 6 및 제6,576,233호, 및 미국특허 출원 공개 제20010043925호, 제20050069594호, 및 제20050089530호에 기재되어 있으며, 본원에서 이들 전체를 참조로서 원용한다.

일부 실시형태에서, 조성물(예를 들어, 약학 조성물)은 2 이상(예를 들어, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 또는 50 이상)의 상이한 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 본원에서 기재한 화합물들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원은 특정 용도(예를 들어, 결합할 때 원하는 수준의 생물 활성(예를 들어, 자극 및/또는 억제 활성을 나타내는)에 맞춰진 2 이상(예를 들어, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 또는 50 이상)의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 단리되거나, 화학적으로 합성되거나, 재조합된 셀렌 함유 화합물)의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 2 이상의 셀렌 함유 화합물의 조합을 포함하는 제1 조성물은 근육 조직에서 미토콘드리아 활성(예를 들어, ATP 생성 및/또는 호흡)을 향상시키는데 사용되며, 반면에 2 이상의 상이한 셀렌 함유 화합물의 조합을 포함하는 제2 조성물(예를 들어, 제1 조성물과 다른 생물 활성을 나타내는)은 간 조직에서 미토콘드리아 활성을 변경하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 2 이상의 셀렌 함유 화합물을 포함하는 조성물은 개체의 특정 유전자 프로파일(예를 들어, 특정 유전자 또는 단백질을 표적으로 삼는)로 맞춰진다. 효모 추출물 또는 분획은 유사한 방식으로 개체에서 특정 질병 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위해 맞춰질 수 있다. 이러한 방식으로, 맞춤 제제는 치료가 필요한 개체 대상을 위해 개발된다.

일부 실시형태에서, 본원은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물, 또는 영양 보조 식품(예를 들어, 건강 또는 일반 웰빙을 개선하는 것으로서 촉진되는 비처방전 조성물)의 형태로, 또는 이와 함께, 셀렌 강화 효모 내에 존재하거나 이로부터 얻어지는 1 이상의 셀렌 함유 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다.

추가 실시형태에서, 본원은 셀렌의 1 이상의 형태(예를 들어, 상기에 기재한 바와 같이)를 단독으로 또는 하나 이상의 다른 작용제, 예컨대 항당뇨병약, 지방산(예를 들어, 에이코사펜타에노산(EPA)), 등과 조합하여 포함하며, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 및 물을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 임의의 살균, 생체적합성 약학적 담체로 투여될 수 있는 약학 조성물을 제공한다.

본원의 방법은 대상(예를 들어, 당뇨병이 있는 대상 및/또는 비만 대상)을 치료하는 데에(예를 들어, 예방적 또는 치료적) 용도를 발견한다. 셀렌(예를 들어, SEL-PLEX)을 포함하는 조성물은 대상(예를 들어, 환자)에게 생리적 식염수와 같은 약학적으로 허용되는 담체로 정맥 내로 투여될 수 있다. 화합물의 세포 내 전달을 위한 표준 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, 리포솜을 통한 전달). 이러한 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 셀렌을 포함하는 조성물은 비경구 투여뿐만 아니라 정맥 내 투여, 예컨대 정맥 내, 피하, 근육 내, 및 복강 내 투여에 유용하다.

의술에서 잘 알려져 있듯이, 어느 한 대상에 대한 용량은 환자의 크기, 체 표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간과 경로, 일반 건강, 및 통시에 투여되는 다른 약물과 상호 작용을 포함하여, 많은 요인에 좌우될 수 있다.

따라서 본원의 일부 실시형태에서, 셀렌을 포함하는 조성물 및/또는 제제는 대상에게 단독으로, 또는 다른 형태의 셀렌, 약물, 소형 분자와 조합하여, 또는 부형제(들) 또는 다른 약학적으로 허용되는 담체와 혼합되는 약학 조성물로 투여될 수 있다. 본원의 일 실시형태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 약학적으로 불활성이다. 본원의 또 다른 실시형태에서, 셀렌을 포함하는 조성물은 당뇨병 및/또는 비만의 위험이 있거나, 이를 앓고 있는 개인에게 단독으로 투여될 수 있다. 셀렌(예를 들어, SEL-PLEX 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물, 단독으로 또는 1 이상의 다른 형태의 셀렌과 조합하여)을 포함하는 조성물은 1일 소비를 위한, 영양 음료수 또는 식품(예를 들어, ENSURE, POWERBAR, 등), 종합 비타민, 영양 제품, 식품 등에 첨가될 수 있다.

치료에 의해 변경하려는 타깃에 따라, 약학 조성물은 전신으로 또는 국소로 제제화되고, 투여될 수 있다. 제제화와 투여를 위한 기술은 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences"(Mack Publishing Co, 미국 펜실베이니아 주 이스턴)]의 최신판에서 찾을 수 있다. 적합한 경로는 예를 들어 경구 또는 경점막 투여; 및 근육 내, 피하, 수 내, 지주막하, 심실 내, 정맥 내, 복강 내, 또는 비강 내 투여를 포함하여, 비경구 전달을 포함할 수 있다.

주사를 위해, 본원의 셀렌을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)은 수용액으로, 바람직하게는 생리적으로 적합한 완충액 예컨대 한크스액(Hanks' solution), 링거액(Ringer's solution), 또는 생리적 완충 식염수로 제제화될 수 있다. 조직 또는 세포 투여를 위해, 침투할 특정 배리어(barrier)에 적합한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 본 기술에서 일반적으로 알려져 있다.

다른 실시형태에서, 본원의 약학 조성물은 경구 투여에 적합한 용량으로 본 기술에서 잘 알려진 약학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제제화된다. 이러한 담체는 약학 조성물이 치료할 환자에 의한 경구 또는 경비 섭취를 위해 정제, 환약, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제제화되게 한다.

본원에서 사용하는데 적합한 약학 조성물은 활성 성분(예를 들어, 셀렌 강화 효모 또는 셀렌 함유 화합물)이 의도된 목적을 달성하는 유효량으로 함유되는 조성물을 포함한다. 예를 들어, 바람직한 실시형태에서, 약학 조성물의 유효량은 미토콘드리아 활성(예를 들어, ATP 생성 및/또는 호흡)을 증가시키는 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모, 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물의 양을 포함한다. 유효량은 통상의 기술자의 능력 내에서, 특히 본원에서 제공하는 개시 내용에 비추어 잘 결정된다.

활성 성분 외에 약학 조성물은 활성 화합물을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 용이하게 진행시키는 부형제와 보조제를 포함하는 적합한 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 경구 투여를 위해 제제화된 제제는 정제, 당의정, 캡슐, 또는 액제의 형태일 수 있다.

본원의 약학 조성물은 자체 공지되어 있는 방식(예를 들어, 종래의 혼합, 용해, 과립, 당의정 제조, 분말화, 유화, 캡슐화, 봉입 또는 친액화 공정에 의해)으로 제조될 수 있다.

비경구 투여를 위한 약학 제제는 수용성 형태로 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적합한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비이클은 참기름과 같은 지방 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드, 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 화합물의 용해도를 증가시켜 고 농도 용액의 제조를 가능하게 하는 적합한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다.

경구 사용을 위한 약학 제제는 활성 화합물을 고체 부형제와 배합하고, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하며, 필요하면 정제 또는 당의정 코어를 얻도록, 적합한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공함으로써 얻을 수 있다. 적합한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제 예컨대 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함하여, 당류; 옥수수, 밀, 쌀, 감자, 등으로부터 전분; 셀룰로오스 예컨대 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 또는 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨; 및 아라비아 검 및 트라가칸트 검을 포함하는 검; 및 단백질 예컨대 젤라틴과 콜라겐이다. 필요하다면, 붕괴제 또는 가용화제, 예컨대 가교 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산 또는 이의 염 예컨대 알긴산나트륨이 첨가될 수 있다.

당의정 코어에 적합한 코팅 예컨대 또한 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴(carbopol) 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티탄을 함유할 수 있는 진한 당 용액, 래커 용액, 및 적합한 유기용매 또는 용매 혼합물을 제공한다. 염료 또는 안료는 정제 또는 당의정 코팅에 제품 식별을 위해 또는 활성 화합물의 양을 나타내기 위해 첨가될 수 있다.

경구로 사용되는 약학 제제는 젤라틴으로 제조된 밀어 맞춤(push-fit) 캡슐, 및 젤라틴과 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 코팅으로 제조된 연질, 밀봉 캡슐을 포함한다. 밀어 맞춤 캡슐은 충전제 또는 결합제 예컨대 락토오스 또는 전분, 윤활제 예컨대 탈크 또는 스테아르산마그네슘, 및 임의로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 유동 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 안정화제와 함께 또는 없이 용해되거나 현탁될 수 있다.

본원의 셀렌 함유 조성물을 단독으로 또는 약학적 허용가능한 담체에 제제화하여 제조할 수 있으며, 적합한 용기에 넣을 수 있고, 지시된 상태의 치료를 위해 표지할 수 있다. 셀렌을 포함하는 조성물 또는 제제를 위해, 라벨에 표시된 상태는 당뇨병 및/또는 비만의 예방적 또는 치료적 요법에 관련된 상태 및 미토콘드리아 활성(예를 들어, 골격근 및/또는 간 미토콘드리아 활성)의 자극에서 이점을 얻는 다른 질병 또는 상태의 치료를 포함할 수 있다.

약학 조성물은 염으로서 제공될 수 있으며, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산, 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 많은 산에 의해 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 다른 프로톤성 용매에 더 가용성이 있는 경향이 있다. 다른 경우에, 바람직한 제제는 사용 전에 완충제와 배합되는, 4.5 내지 5.5의 pH 범위에서 1 mM-50 mM 히스티딘, 0.1%-2% 수크로오스, 2%-7% 만니톨 중 동결건조 분말일 수 있다.

본원의 방법에 사용되는 임의 화합물에 대해, 치료 유효 용량은 처음에 세포 배양 검사로부터 추정될 수 있다. 그 후, 바람직하게는, 투여량은 바람직한 혈중 농도 범위를 달성하도록 동물 모델(특히 마우스 모델)에서 제제화될 수 있다.

유효량(예를 들어, 치료 유효 용량)은 대상에서 당뇨병 및/또는 비만과 관련한 징후, 증상 및/또는 상태를 개선하거나 예방하는 양을 의미한다. 이러한 화합물의 독성과 치료 효능은 예를 들어, LD₅₀(집단의 50% 치사 용량) 및 ED₅₀(집단의 50% 치료 유효 용량)을 측정하기 위해, 세포 배양체 또는 실험동물에서 표준 제약 과정에 의해 측정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, 이것은 LD₅₀/ED₅₀ 비로서 표시될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 이들 세포 배양 검사와 추가 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간 사용을 위한 투여량 범위를 제제화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED₅₀을 포함하는 혈중 농도 범위 내에 있다. 투여량은 이러한 범위 내에서 사용되는 제형, 환자의 과민성, 및 투여 경로에 따라 달라진다.

정확한 투여량은 치료될 환자를 고려하여 대상에 의해 또는 의사에 의해 선택될 수 있다. 투여량과 투여는 활성 부분의 충분한 수준을 제공하거나 바람직한 효과(예를 들어, 대상에서 유전자 발현의 변경)를 유지하도록 조정된다. 고려될 수 있는 추가 요인은 질병 상태의 중증도; 환자의 연령, 체중, 및 성별; 다이어트, 투여의 시기와 횟수, 복합약(들), 반응 감도, 및 요법에 대한 내성/반응을 포함한다. 지속성 약학 조성물은 특정 제제의 반감기 및 클리어런스율(clearance rate)에 따라 3 내지 4일마다, 매주, 또는 2주마다 1회 투여될 수 있다. 따라서 본원은 대상에게 본원의 조성물을 투여하는 시간 길이에 의해 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상에게 본원의 조성물을 3-12 개월(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월) 동안 투여하거나/수용한다. 그러나 본원은 이러한 시간 프레임에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상에게 3 개월 미만 동안 또는 12 개월 초과하여(예를 들어, 15, 18, 21, 또는 24 개월, 2.5 년, 3 년, 4 년, 5 년, 6 년, 7 년, 8 년, 9 년, 10 년 이상) 동안 본원의 조성물을 투여하거나/수용한다.

일부 실시형태에서, 본원의 셀렌(예를 들어, 유기 셀렌(예를 들어, 셀렌화 효모(예를 들어, SEL-PLEX) 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물)을 포함하는 조성물은 대상에게 1일 25 내지 800 ㎍의 셀렌을 제공하도록 1일 용량으로 투여된다(예를 들어, SEL-PLEX는 대상에게 매일 25 내지 800 ㎍의 셀렌을 제공하는 방식으로 대상에게 투여된다). 그러나 본원은 이대로 한정되지 않는다. 실제로, 일부 실시형태에서, 본원의 셀렌을 포함하는 조성물은 1일 25 ㎍ 미만(예를 들어, 24, 23, 22, 21, 20, 또는 그 이하)이나 800 ㎍ 초과(예를 들어, 825, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 또는 그 이상) 사이의 셀렌을 대상에게 제공하도록 1일 용량으로 투여된다. 바람직한 실시형태에서, 셀렌(예를 들어, 유기 셀렌(예를 들어, 셀렌화 효모(예를 들어, SEL-PLEX)))은 1일 200 내지 500 ㎍의 1일 용량으로 투여된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 셀렌은 1일 200 내지 400 ㎍의 1일 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 셀렌(예를 들어, 유기 셀렌(예를 들어, 셀렌화 효모(예를 들어, SEL-PLEX)))의 단일 용량이 1일 1회 투여된다. 다른 실시형태에서, 2, 3, 4 이상의 용량이 매일 투여된다(예를 들어, 아침에 한번 및 밤에 한번, 또는 4 내지 6 시간마다 1회). 예를 들어, 일부 실시형태에서, 셀렌은 대상에게 3회 분리, 3회 초과 분리, 2회 분리, 또는 2회 미만 분리 용량으로 투여된다. 일부 바람직한 실시형태에서, 1일 용량은 지속 방출 캡슐로 투여된다. 일부 실시형태에서, 1일 용량은 25-75 ㎍의 셀렌이다. 다른 실시형태에서, 1일 용량은 200 ㎍의 셀렌(예를 들어, 유기 셀렌(예를 들어, 셀렌화 효모(예를 들어, SEL-PLEX)))이다. 일부 실시형태에서, 용량은 특정 연령(예를 들어, 50세보다 어린, 50세보다 많은, 70세보다 어린, 70세보다 많은, 80세보다 어린, 80세보다 많은, 등)의 대상에게 투여를 위해 제제화된다.

본원의 약학 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지에 따라 그리고 치료할 영역에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(눈과 질 및 직장 전달을 포함하는 점막을 포함하여), 폐(예를 들어, 분무기에 의한 것을 포함하여, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 주입에 의해; 기관 내, 비강 내, 표피 및 경피), 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복강 내 또는 근육 내 주사 또는 주입; 또는 두개 내, 예를 들어, 지주막하 또는 심실 내 투여를 포함한다. 셀렌을 포함하는 조성물과 제제는 경구 투여에 특히 유용하다고 생각된다.

국소 투여용 약학 조성물과 제제는 경피 패치, 겔, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 종래의 약학 담체, 수성, 분말 또는 유성 기제, 증점제 등이 사용될 수 있다.

경구 투여용 조성물 및 제제는 분말 또는 과립, 물 또는 비수성 매질 내 현탁액 또는 용액, 캡슐, 사세 또는 정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.

비경구, 지주막하 또는 심실 내 투여용 조성물 및 제제는 또한 완충제, 희석제 및 침투 촉진제, 담체 화합물, 및 다른 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 같으나, 이들에 한정되지 않는 다른 적합한 첨가제를 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.

따라서 일부 실시형태에서, 본원의 약학 조성물은 용액, 에멀션, 및 리포솜 함유 제제를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 이들 조성물은 미리 형성된(preformed) 액체 자기 유화 고체 및 자기 유화 반고체를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다.

본원의 약학 제제는 편리하게도 단위 제형으로 존재할 수 있는데, 제약 산업에서 잘 알려진 종래의 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)와 활성 성분을 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 제제는 액체 담체 또는 미분 고체 담체 또는 둘 다와 활성 성분을 균일하고, 친밀하게 회합시킨 다음, 필요하면 제품을 성형함으로써 제조된다.

따라서 일부 실시형태에서, 본원의 조성물은 정제, 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌제, 및 관장제와 같으나, 이들에 한정되지 않는 임의의 많은 가능한 제형으로 제제화될 수 있다. 본원의 조성물은 또한 수성, 비수성 또는 혼합 매질에서 현탁액으로서 제제화될 수 있다. 수성 현탁액은 예를 들어 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.

본원의 일 실시형태에서 약학 조성물은 발포체(foam)로서 제제화되고, 사용될 수 있다. 약학 발포체는 에멀션, 마이크로에멀션, 크림, 젤리 및 리포솜과 같으나, 이들에 한정되지 않는 제제를 포함한다. 이들 제제는 특성상 기본적으로 유사하지만 성분과 최종 제품의 컨시스턴시(consistency)에서 달라진다.

본원의 조성물은 추가로 약학 조성물에서 종래에 발견되는 다른 부가 성분을 함유할 수 있다. 따라서 예를 들어, 조성물은 추가의, 적합성, 약학적으로 활성인 물질 예컨대, 예를 들어, 가려움 방지약, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제를 함유할 수 있거나, 본원의 조성물의 다양한 제형을 물리적으로 제제화하는데 유용한 추가 물질, 예컨대 염료, 향미제, 보존제, 항산화제, 유백제, 증점제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 그러나 이러한 물질은 첨가될 때 본원의 조성물 중 성분들의 생물 활성을 과도하게 방해하지 않아야 한다. 제제는 살균될 수 있으며, 필요하면 제제의 핵산(들)과 유해하게 상호작용하지 않는 보조제, 예를 들어, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주기 위한 염, 완충제, 착색제, 향료 및/또는 방향족 물질 등과 혼합될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원은 (a) 셀렌(예를 들어, SEL-PLEX 및/또는 이의 내부에 존재하고/하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물)의 1 이상의 형태 및 (b) 1 이상의 다른 작용제(예를 들어, 항당뇨병제, 항산화제, 등)를 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 2 이상의 결합한 작용제는 함께 또는 연속적으로 사용될 수 있다.

본원은 또한 1 이상의 추가 활성제(예를 들어, 항당뇨병제, 항산화제, 등)와 본원에서 기재한 셀렌을 포함하는 화합물의 동시 투여를 포함하는 방법을 포함한다. 실제로, 본원의 셀렌을 포함하는 조성물을 동시 투여함으로써 선행 기술의 요법 및/또는 약학 조성물을 향상시키는 방법을 제공하는 것이 본원의 추가 양태이다. 동시 투여 과정에서, 작용제는 동시에 또는 연속으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 본원에서 기재한 화합물은 다른 활성제(들)(예를 들어, 베타 차단제) 전에 투여된다. 약학 제제와 투여 모드는 상기에 기재한 것들 중 어느 것일 수 있다. 추가로, 2 이상의 동시 투여 작용제는 각각 상이한 모드 또는 상이한 제제를 사용하여 투여될 수 있다.

동시 투여될 작용제 또는 작용제들은 치료되는 상태의 형태에 좌우된다. 예를 들어, 치료되는 상태가 비만일 경우, 추가 작용제는 항비만 약물 또는 감량 약물 등일 수 있다. 치료되는 상태가 당뇨병의 예방 또는 치료일 경우, 추가 작용제는 본 기술에서 알려진 항당뇨병 약물 중 어느 하나일 수 있다. 동시 투여되는 추가 작용제는 현재 임상 사용 중에 있는 작용제들을 포함하나, 이들에 한정되지 않는, 본 기술에서 잘 알려진 임의의 작용제일 수 있다.

본원의 일부 실시형태에서, 항산화제는 본원의 셀렌을 포함하는 조성물 또는 제제와 동시 투여된다. 본원은 사용되는 항산화제의 형태에 의해 한정되지 않는다. 실제로, 알킬화 디페닐아민, N-알킬화 페닐렌디아민, 페닐-α-나프틸아민, 알킬화 페닐-α-나프틸아민, 디메틸 퀴놀린, 트리메틸디히드로퀴놀린, 입체 장해(hindered) 페놀류, 알킬화 히드로퀴논, 히드록실화 티오디페닐 에테르, 알킬리덴비스페놀, 티오프로피오네이트, 금속 디티오카르바메이트, 1,3,4-디머캅토티아디아졸, 유용성 구리 화합물, NAUGALUBE 438, NAUGALUBE 438L, NAUGALUBE 640, NAUGALUBE 635, NAUGALUBE 680, NAUGALUBE AMS, NAUGALUBE APAN, 나우가르드(Naugard) PANA, NAUGALUBE TMQ, NAUGALUBE 531, NAUGALUBE 431, NAUGALUBE BHT, NAUGALUBE 403, NAUGALUBE 420, 아스코르브산, 토코페롤, 알파-토코페롤, 설프히드릴 화합물, 메타중아황산나트륨, N-아세틸-시스테인, 리포산, 디히드로리포산, 락토페린, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 아스코르빌 폴리펩티드, 부틸화 히드록시톨루엔, 레티노이드, 레티놀, 레티닐 팔미테이트, 코토트리엔올, 유비퀴논, 플라보노이드, 이소플라보노이드, 게니스테인(genistein), 디애드제인(diadzein), 레스베라트롤(resveratrol), 포도씨, 녹차, 소나무 껍질, 프로폴리스, IRGANOX, 안티젠(Antigene) P, SUMILIZER GA-80, 베타-카로텐, 리코펜, 비타민 C, 비타민 E, 및 비타민 A를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 다양한 항산화제가 본원에서 유용하다고 예상된다.

실험

하기 실시예는 본원의 바람직한 특정 실시형태 및 양태를 증명하고, 추가로 예시하기 위해 제공되며, 본원을 한정하는 것으로서 해석되지 않는다.

실시예 1

셀렌 강화 효모에서 셀렌 함유 화합물의 동정과 특성화

셀렌(Se)은 인간과 동물 다이어트에서 필수 요소이다. 많은 국가에서 낮은 수준의 Se는 셀렌이 있는 식품과 사료의 보충에 관심이 높아지게 하였다(예를 들어, Rayman, Br. J. Nutr., 92 (2004), p. 557 참조). 셀렌(Se) 농후 배지에서 성장한 효모는 인간과 동물에게 보충을 위한 유기 Se의 원으로서 사용될 수 있다. 보충된 Se의 가장 인기 있는 형태는 셀렌산염 및/또는 아셀렌산염의 존재 하에 성장한 효모이며, 이는 3000 mg Se/kg까지 축적할 수 있다. 1974년 이래 시판되고 있는, Se 농후 효모의 매력은 이 효모의 비교적 저렴한 생산비와 셀레노단백질 합성용 전구체로서 작용하는 셀레노메티오닌(SeMet)의 고 함량 때문이다. Se 농후 효모는 Se 사양 면에서 오랫동안 특성화하기 어려웠던 천연 산물이다. SeMet 농도에 대한 기록된 수치의 변동성; Se 종 면에서 조성의 높은 변동성; 및 동정한 Se 화합물의 합과 전체 Se 농도 사이의 갭을 포함하여, 다수의 문제가 대답 없이 남아 있었다.

이의 불충분한 특성화는 유럽연합이 Directive 2002/46/EC의 허가된 식품 보충제로부터 Se 효모를 배제하게 하였다.

따라서 셀렌 농후 효모의 Se 메타볼롬(metabolome)과 프로테옴(proteome)을 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. 따라서 본원에서 기재한 바와 같이, 본원은 동정과 특성화(예를 들어, 생물 활성)가 이전에 미지의 상태였던 Se 함유 대사 물질과 단백질의 동정과 특성화를 제공한다.

총 Se 측정과 동위체 조성

시판 효모 샘플은 통상적으로 1000 ppm 또는 2000 ppm의 Se를 함유하며, 최대치는 3000 ppm을 초과한다. Se 농후 효모는 모양, 맛 및 냄새에서 정상의 건조된 식품 효모와 구분될 수 없다고 하지만(예를 들어, Schrauzer, Pure Appl. Chem., 78 (2006) 참조), 상이한 제제의 형태는 다를 수 있다. 저 품질의 Se 농후 효모 샘플은 Se⁰ 및 셀렌화물의 형성 결과로 색상이 불그레하거나 갈색을 띤다.

Se 농후 효모에서 Se의 총량에 대한 측정은 간단할 수 있다. 예를 들어, 효모는 핫플레이트 위에서 또는 마이크로파 가열을 사용하여 HNO₃와 H₂O₂의 혼합물로서 소화된다. 이어서 Se 함량은 수소화물 생성(HG) 원자 흡수 분광분석(AAS) 또는 원자 형광 분광분석(AFS)에 의해 측정될 수 있다. 그러나 소화의 완료(용존 탄소 없음)는 필수적이며, 그렇지 않으며 낮은 및/또는 불일치 결과가 얻어진다. 일부 실시형태에서, 유도 결합 플라스마 질량분석(ICP-MS)을 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 용존 탄소에 더 내성인)을 특성화하는데 사용한다. 그러나 ICP-MS가 사용될 때, 사용된 동위체(들)는 최적화된다(예를 들어, 가장 풍부한 ⁸⁰Se 동위체는 더 이전의 사중극 기구에 의한 작업에 적합하지 않으므로, 이것은 사중극 특성화에 사용될 수 없다). 바람직한 실시형태에서, 충돌 가스로서 H₂를 사용하는 충돌 셀이 장착된 기구는 ⁷⁷Se와 ⁷⁸Se에 대한 《M+1》 간섭의 생성을 자극하는데 사용된다. 추가의 바람직한 실시형태에서, He는 충돌 가스로서 사용된다. CRM SELM-1은 품질 관리/보증을 위해 사용될 수 있다.

Se 농후 효모는 흔히 프리믹스(Se로서 3-5 ppm) 및 사료(Se로서 0.3-0. ppm)의 활성 성분으로서 사용된다. 그러나 프리믹스 샘플의 심각한 불균등성은 시장에서 아주 흔하며, 샘플의 전체 소화, 또는 배치 공정 사이에 컨시스턴시를 어렵고, 불가능하게 한다. 예를 들어, HNO₃-H₂O₂ 혼합물로서 핫플레이트 침출한 후 고체 잔류물은 Se를 함유하지 않는 것은 흔한 일이다. 따라서 일부 실시형태에서, ICP-MS 분석이 사용된다(예를 들어, 프리믹스 샘플의 완전한 소화가 가능하지 않거나 불일치하는 경우). 추가로, HG-ICP-다중 집광기(multiple collector)-MS(HG-MC-ICP-MS)에 의한 Se 동위체 조성의 정밀한 측정은 상이한 제조업자 유래 Se 농후 효모에서 동위체 비율(δ⁸²/⁷⁷Se, δ⁸²/⁷⁶Se 및 δ⁸²/⁷⁴Se)에서 상당한 변화를 밝혔다(예를 들어, Far et al, J Anal At Spectrom, 25 (2010) 1695 참조). 동위체 비(상이한 바이오기술에서 생화학적 통합 중에 Se의 상이한 원 또는 상이한 동위체 분별화)에서 변화의 기원에 관한 지식과 이해는 알기 어렵게 남았다.

SeMet 의 측정

올바른 설명인지 아닌지, 총 SeMet 농도는 종래에 Se 농후 효모의 "유기" 특성의 표시로서 언급되었다. SeMet는 단백질의 구성 요소이며, 대부분 물에 불용성이다. 따라서 SeM 함량은 단백질로부터 이의 방출을 통해 측정되었다. 따라서 일부 실시형태에서, 본원은 효모 단백질의 아미노산으로 완전 분해를 유도하는 SeMet의 특성화 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원은 SeMet의 분해를 방지하는(예를 들어, Se의 상실 또는 산화를 얻는) SeMet의 특성화 방법을 제공한다.

이 분야에서 많은 결과는 수 추출물에 존재한 SeMet를 참조하였고, Se 농후 효모에서 SeMet 수준에 대한 혼란에 대체로 책임이 있었다. 혼란은 또한 아미노산 분석에서 사용되는 표준 산 소화 조건(밀폐 앰플에서 120C에 6N HCl)이 너무 가혹에서 제어된 방식으로 SeMet를 보존하지 못한다는 사실에 의해 확대되었다. SeMet의 회수에 2 과정이 사용될 수 있다: 한 과정은 환류 하에 메탄설폰산에 의한 16 h 소화에 기초하며, 다른 한 과정은 프로테아제에 의한 다중 단백질 분해에 기초한다(예를 들어, Mester et al, Anal Bioanal Chem, 385 (2006) p 168 참조). 따라서 일부 실시형태에서 본원은 SeMet 함량의 측정에 관해, 체류 시간과 Se의 존재가 샘플에 존재한 Se-Met의 동정과 순도의 확인을 위한 필요한 파라미터라는 것을 제공한다. 일부 실시형태에서, 역상(RP) 또는 음이온 교환(AE) HPLC-ICP-MS 크로마토그래피 분석이 샘플에서 셀렌 종을 특성화하는데 사용된다.

샘플 소화

본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험에서는 시판 효모 제품이 형태와 질감 면에서 상이하며, 예상보다 훨씬 느리게 SeMet를 회수할 수 있다는 사실을 보여주었다(예를 들어, 기준 물질 분석에 기초하여). 추가로, 본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험에서는 프로테아제 배치 변동성(예를 들어, 이로써 추출 수율의 좋지 않은 재현성을 유발하는)의 존재를 밝혀냈다. 따라서 일부 실시형태에서, 본원은 낮은 회수율의 위험을 최소화하는 단계와 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 오로지 새로 제조되고, 고 활성의 프로테아제를 사용한다. 추가 실시형태에서, 추출을 매번 효소의 새로운 부분으로서 다수 회(예를 들어, 3회) 수행한다. 바람직한 실시형태에서, 최종 추출/추출물은 1% 미만의 Se를 함유한다. 추가 실시형태에서, 샘플의 완전한 가용화는 효소성 분해에 의해 얻어진다. 일부 실시형태에서, 효소성 분해에 의한 샘플의 완전한 가용화가 가능하지 않다면, 셀룰라아제와 헤미셀룰라아제 및 카오트로픽제(chaotropic agent)의 혼합물을 사용하는 연속 추출이 사용되며, 각 추출물에서 SeMet의 부재가 확인된다. 본원은 추출물에서 SeMet의 부재를 확인하는 방법에 의해 한정되지 않는다(예를 들어, Encinar et al., Anal Chem Acta, 500 (2003), 171 참조). 추출 물질 수지 방법과 데이터는 분석 결과를 보충하는데 사용될 수 있다. 본원의 일 양태에 따른 샘플 가용화의 예는 도 1에 도시된다.

본원의 실시형태의 개발 중 수행한 실험에서는 일련의 시판 효모로부터 소화되지 않은 단백질 분해 잔류물을 동정하고, 특성화하였으며, 추가로 셀룰라아제 펙티나아제 혼합물에 의한 추가 처리 후 잔류 SeMet의 존재를 밝혀냈다. 일부 샘플에 대해, 잔류 SeMet는 전형적인 수치가 ~3-5%이었지만 전체 Se의 10%까지 구성하였다. 도데실황산나트륨(SDS)에 의한 잔류물의 처리, 이어서 단백질 분해는 SeMet 수율에서 한 샘플은 15%만큼 컸지만, 전형적으로 2-8%의 추가 증가를 가능하게 하였다. 잔류물(예를 들어 CS₂에 의해 추출가능한 Se⁰)의 존재는 저 품질 효모의 표시이었다.

HPLC -ICP-MS 분석

본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험에서는 효소성 분해 후 얻어진 용액에 존재하는 셀렌 함유 화합물(예를 들어, SeMet를 함유하지만 또한 산화된 SeMet, SeCys의 다른 형태, 상이한 Se 대사 물질, 및 불완전하게 소화된 단백질로서)을 동정하고, 특성화하였다. 불완전하게 소화된 단백질의 존재가 전체 SeMet 농도의 저평가를 유발한다는 사실이 결정되었다. 불완전하게 소화된 단백질은 미세 슬러리에(예를 들어, 이로써 칼럼 필터에 남아 있는) 또는 용액에 존재한다고 확인되었다. 따라서 일부 실시형태에서, 크기 배제 LC-ICP-MS에 의해 소화물을 분석하는 것을 포함하는 검증 단계가 사용된다(예를 들어, 고 분자량 화합물의 부재와 Se 용출의 완료를 확인하기 위해)(예를 들어, 도 2 삽입도 참조).

SeMet는 표준 첨가법을 사용하여 AE-HPLC-ICP-MS(도 2 참조) 또는 RP-HPLC-ICP-MS에 의해 정량화될 수 있다. 크로마토그래피 고정상의 선택은 중요하다(예를 들어, Se 함유 종의 칼럼 위 수착(on-column sorption)으로 인한 상실을 최소화하기 위해). 그러나 셀레노화합물(예를 들어, 셀레노단백질, 셀레노아미노산, 셀레노펩티드, 등)의 동정, 정량화 및 분석은 물질 수지를 동반할 수 있으며, 이는 정량화를 위해 사용되는 피크 전 및 후에 이의 용출을 배제하거나 구성할 수 있다. 이는 셀렌 함유 화합물(예를 들어, SeMet)의 동정과 정량화를 복잡한 일로 만들었다. 동위체 희석 정량화는 부가한 스파이크(spike)가 샘플에서 SeMet와 동일한 방식으로 행동할 것 같지 않았음에 따라 샘플을 적절히 특성화하는 것으로서 간주할 수 없었다(예를 들어, 불완전 소화된 SeMet 함유 종의 불완전 소화와 체류는 부정확한 결과의 주요 원인이었으므로).

또 다른 흔한 오차 원인은 산화된 SeMet의 발생으로 인한 것이었다. SeMet의 일부는 별개 SeMetOx 피크로서 보이며, 이는 SeMet 농도의 저평가를 유발한다. 과정 중에 SeMet의 산화는 산화환원 시약(예를 들어, 디티오트레이톨)의 첨가에 의해 방지될 수 있거나 심지어 반전될 수 있지만 최초에 존재한 SeMet 산화물은 SeMet로 전환될 수 없다.

본원의 실시형태에 진행 중에 수행한 실험에서는 (단일 또는 다중) 반응 검측 모드에서 사용되는 삼중 사중극 MS에 의한 ICP-MS의 대체가 다른 SeMet 형태(예를 들어, ox-SeMet)의 정량화에 대한 선택성과 신뢰성을 병행하여 증가시키는 대안을 제시하는 듯 하다는 것을 나타냈다.

프리믹스 및 사료에서 SeMet 의 측정

프리믹스, 동물 사료 및 보충 정제에서 SeMet의 측정은 Se 농후 효모에서 측정보다 더 어렵다. SeMet의 방출은 프로테아제 저해제로서 작용할 수 있는 일부 첨가제의 존재에 의해 방해받는다. SeMet의 효소 추출 전에 이들 첨가제를 제거하기 위해 추출 단계를 추천한다. 일부 실시형태에서, 동물 사료에서 SeMet 농도가 너무 낮아 추출물에서 직접 측정되지 못하며, 예비 농축을 필요로 한다. 효소 소화물의 동결 건조는 잔류 효소의 동시 예비 농축을 유발하며, 그 결과 매트릭스는 후속 RP-HPLC 또는 AE-HPLC를 혼란하게 한다. 따라서 본원은 동결 건조와 HPLC-ICP-MS 전에 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 저 분자량 Se 분획의 분리를 제공한다.

수용성 Se 함유 화합물 및 대사 물질에 대한 분석

본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험에서는 Se 농후 효모가 효모 균주의 특성치 및 발효 파라미터인 Se 대사 프로파일(셀레노메타볼롬)에 의해 특성화할 수 있다는 것을 나타냈다. 셀레노메타볼롬은 시판하는 제제의 원천에 대해 그리고 생산 과정의 재현성에 대해 지문으로서 작용할 수 있다. 본원에서 기재한 바와 같이, 본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험에서는 셀레노메타볼롬이 1 이상의 Se 함유 화합물을 함유하는(예를 들어, 치료 활성 및/또는 항치료 특성(예를 들어, 독성)을 나타내는) 것을 제공한다. 셀렌화 효모에 존재하는 Se 함유 화합물의 수용성 분획과 수 불용성 분획 둘 다 얻고, 동정하기 위한 본원의 일 실시형태에 따른 전형적인 과정이 도 3에 도시되어 있다.

물에 의한 추출은 15-25%의 Se의 회수를 가능하게 한다고 결정되었다. SEC-ICP-MS에 의해 얻어진 전형적인 크로마토그램(100% 회수)이 도 4a에 도시된다. 수 추출물은 다수 셀렌화(1-7) SIP18, 일셀렌화 HSP12 또는 YMZ 단백질을 포함하여, 슈퍼덱스펩티드(SuperdexPeptide) 칼럼의 공간에서 용출하는 고 분자량 물질, 또는 저 분자량 물질(5-15 kDa)의 수용성 단백질 ~5%를 함유한다. 이들 단백질은 오로지 SeMet로서 존재하는 Se를 함유한다.

따라서 본원은 또한 저 분자량(<1500 Da) 화합물/대사 물질의 형태로 발생하는 잔류 수용성 Se가 효모의 셀레노메타볼롬을 구성한다는 것을 제공한다. 본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험 전에, 이들 대사 물질의 동정과 특성화는 매우 도전적인 과제이었다(예를 들어, 이들 대사 물질은 일렉트로스프레이(electrospray) 삼중 사중극 MS를 사용하여 카시옷(Casiot) 외 그의 공동 연구가에 의해 Se-아데노실-Se-호모시스테인의 처음 공식적 "새로운"(de novo) 동정 이래 일반적으로 알려져 있지 않았다(예를 들어, Casiot et al, Anal Commun, 36 (1999), p 77 참조)). 예를 들어, Se 사양 면에서 수 추출물의 복잡성이 특성화되었고, 도 4b에 도시된다. 도시한 바와 같이, 25개 초과의 상이한 피크를 관찰하였고, 각 피크는 잠재적으로 임의 수의 다른 덜 강한 피크를 숨기고 있다(예를 들어, 각 피크는 1 이상의 상이한 Se 함유 화합물을 나타낸다).

본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험에서는 다음에 효모에서 셀레노메타볼롬에 대한 지식의 상당한 증가를 가능하게 한, 다차원 정제 기술에서 특정 진보 및 MS에서 발달을 이용하였다(도 4 참조). 특히, 더 큰 인트라스캔 다이내믹 레인지(intrascan dynamic range)를 제시하는 FT 오비탈 이온 트랩(orbital ion-trap) 기구의 이용성, 및 정확한 질량 측정에 대해 그리고 다단 단편화에 대한 가능성은 Se 메타볼롬의 동정과 특성화(예를 들어, 각 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 대사 물질, 펩티드, 단백질, 핵산, 및/또는 각각의 전구체)의 동정 및 개별 화합물 및 이의 조합(예를 들어, 본원에서 기재한 바와 같이)의 생물 특성에 대한 특성화)를 용이하게 하는데 사용되었다.

셀렌 강화 효모(Se 농후 효모, 사카로마이세스 세레비시아에)를 얻었고, 특성화하였다. 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich, 프랑스 생 캉땡 팔라비르)로부터 얻어진 LCMS 등급 화학 약품을 사용하였다. Milli-Q 시스템(밀리포(MILLIPORE), 프랑스 귀앙꾸르)을 사용하여 물을 정제하였다. 전형적인 일 과정에서, Se 농후 효모에서 셀렌의 총 농도는 2399 ㎍/g(+/-40)이었다. 0.2 g 샘플을 초음파 조에서 5 ml의 물에 의해 1 시간 추출하였다. 추출물을 4000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 동결 건조하여, 필요하다면 -20℃에서 저장하였다. 수 추출물에서 총 셀렌 농도는 전체 셀렌의 약 30%를 차지하는 756 ㎍이었다. 병행하여 실시한 셀렌 강화 효모의 추가 추출은 또한 농도가 약 170-750 ㎍(전체 셀렌의 약 5-30%에 상응함) 범위인 수 추출물을 생성하였다.

다음에, 수 추출물을 사용하여 크기 배제 ICP MS를 실시하였다. 스콧(Scott) 분무실과 충돌 셀이 장착된 AGILENT 7500ce ICP 질량분석계에 연결된 AGILENT 1200 HPLC 시스템(AGILENT, 일본 도쿄)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피-ICP-MS를 달성하였다. 액체 크로마토그래피를 얼티메이트(Ultimate) 3000 UPLC 펌프(DIONEX, 프랑스 파리)에 의해 실시하였다. 칼럼의 출구를 ESI 이온 공급원이 있는 LTQ30 오르비트랩 벨로스(Orbitrap Velos) 질량분석계(Thermo-Fisher Scientific, 독일 브레멘)에 그리고 스콧 분무실과 충돌 셀이 장착된 AGILENT 7700 ICP-MS에 연결하였다.

5개의 별개 수 추출물의 크기 배제-ICO MS 크로마토그램을 도 5에 도시한다(76Se-진한 회색 라인, 77Se-흑색 라인, 78Se 옅은 회색 라인). Se 농후 효모 추출물의 크로마토그램(도 5, 하부 패널)은 SELPLEX(ALLTECH, Inc., 미국 켄터키 주 렉싱턴))를 사용하여 얻어진 전형적인 패턴을 보여준다. 추가로, 이전의 연구에서 알려지지 않은, 비교적 강한 후 용출(약 66 분에) 피크가 나타났다. 잔류 샘플의 프로파일(도 5, 상부 패널)은 Sel-Plex 프로파일과 상당히 상이하고, 서로 유사하다. 이들은 매우 풍부한 넓은 피크로 두드러지며, 명백히 다수의 종을 함유하고, 크로마토그램 초기에 용출한다. 이러한 관찰 결과, 더 적합한 분리 범위를 가진 크기 배제 칼럼(SUPERDEX 펩티드 칼럼)을 사용한 추가 특성화를 위해 일부 샘플(도 5, 위에서 두 번째 패널, 및 하부 패널)을 선택하였다(각각 도 6, A 및 B). 이전 크로마토그램(도 5, 위에서 두 번째 패널)에 존재한 넓은 피크가 2개로 분리되었고, 이들 각각은 2-3개 숄더(shoulder)가 있었으며, 분자량이 5-1.5 kDa 범위인 매우 풍부한 셀레노화합물의 존재를 보여주었다. 도 5 하부 패널에 도시한 샘플은 또한 약 25 분에 후 용출 피크가 있다는 것이 추가로 확인되었다.

수용성 분획으로부터 셀렌 함유 화합물의 동정과 특성화

상기에 기재한 일련의 실험에서는 최초 효모에 없었던 처리된 샘플에서 큰 분획의 셀렌 함유 화합물(약 1.5-5 kDa)의 존재를 확인하였다. 따라서 이러한 분획을 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다.

관심 분획(임의로 "피크 I"로 칭함)을 크기 배제 크로마토그램(SEC)(도 7a 참조)으로부터 하트 컷(heartcut)하였고, 동결 건조에 의해 예비 농축하였다. 도 7b에 도시한 바와 같이, 이로써 미처리된 효모에 존재하는 다른 Se 화합물이 없는 관심 있는 비손상(intact) 분획의 회수를 가능하게 하였다. 샘플의 SEC 펩티드 크로마토그램이 도 7에 도시된다: a) 수 추출물, b) 분리된 피크 I, c) 트립신에 의해 소화된 피크 I, d) 프로테아제에 의해 소화된 수 추출물; 흑색 라인-80Se, 옅은 회색 라인 78Se, 진한 회색 라인-77Se.

역상 HPLC에 의해 관심 분획을 추가로 분획하려는 일부 연구는 실패하였다. 시험한 RP-HPLC 칼럼에서 회수율은 매우 낮았고, 분리는 좋지 않았다. 따라서 이러한 분획의 단백질 분해 효소 소화(트립신과 프로테아제 XIV)는 분획을 추가로 특성화하고, 내부에 함유된 성분을 동정하려는 노력으로 시도되었다. 도 7c에 도시한 바와 같이, 트립신(아르기닌 및 리신 잔기에서 분해)은 혼합물 중 Se 화합물의 평균 분자량을 감소시켰다. 따라서 본원에서 기재한 바와 같이, 일부 실시형태에서,본원은 Se 농후 효모의 1 이상의 수용성 분획이 역상 HPLC-ICP MS 및/또는 오르비트랩 MS에 의한 셀렌 함유 화합물의 동정 및/또는 특성화 전에 단백질 분해로 소화된다(예를 들어, 트립신, 프로테아제 XIV, 또는 다른 효소에 의해)는 것을 제공한다.

예를 들어, 도 7d에 도시한 바와 같이, 펩티드의 프로테아제 소화는 대개 셀레노메티오닌을 제공한다(도 7d, 큰 흑색 라인 약 27 분). 또한 약 25 분 전에 용출하는 다른 셀렌 함유 화합물이 존재한다.

도 7a에 도시한 SEC 칼럼으로부터 58 분에 용출하는 피크를 단리하고, 정제하며, 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 추가 실험을 수행하였다. 58 분의 크기 배제 크로마토그램 용출 시간에 존재하는 화합물을 동정하기 위해(도 7a 참조), 피크를 분리하고, 농축하였다. 역상 크로마토그래피를 위한 용출 과정을 최적화하였다. 도 7a에 도시한(또한 도 8a에 도시한) SEC 칼럼으로부터 58 분에 용출하는 피크의 RP 크로마토그램은 바로 하나의, 예리하고, 잘 분해된 피크를 보여준다(도 8b 참조). 다음에, 셀레노화합물을 동정하기 위해 질량 분석법을 포함하여 추가의 분석을 수행하였다. 역상 크로마토그래피를 오르비트랩과 결합하였다. 질량 346.04025에서 셀레노화합물을 Se-메틸-Se-아데노신으로 동정하였다(도 9 참조).

셀렌 강화 효모로부터 분리된 수용성 분획에서 셀렌 함유 화합물을 추가로 동정하고, 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다.

수용성 셀렌 화합물의 대략 70%를 함유한, 상기에 기재한 Se 농후 효모로부터 수 추출물(전체 셀렌의 약 30%를 차지하는 756 ㎍을 함유하는)을 사용하였다. 추출물을 농축하고, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 칼럼에 주입하며, 10개의 아분획(도 2a에 도시한 제1의 넓은 피크로부터 출발함)을 균일한 시간 간격으로 수집하였다. 다시, 이들 분획은 원료 효모 수성 추출물에서 존재하지 않은 종을 나타낸다. 각 분획을 2개의 별개 샘플로 분할하였고, 한 샘플은 분획 재현화(dramatization)를 위해 사용하였고, 다른 샘플은 트립신 소화에 의해 처리하였다.

RP C18 칼럼을 사용한 ICP MS(도 10 참조)에 의해 처음에 샘플을 분석하였다. UPLC-오르비트랩 MS 분석을 위해 해상도는 충분하였다.

샘플을 분석하였고, 셀렌 패턴이 있는 아분획 8에 대해 얻어진 170개 화합물의 리스트를 하기 표 2에 제공한다. 추가로, 표 5에서는 이들 화합물의 전형적인 스펙트럼을 제공한다. 소화되지 않은 분획에서 동정한 모든 펩티드는 질량 범위가 1 내지 3.4 kDa이었다. 동정한 셀렌 함유 화합물은 이들이 유도되었던 최초 단백질보다 훨씬 작다. 도 11에서는 샘플의 아분획 8에서 동정한 셀렌 함유 펩티드의 리스트를 제공한다. 따라서 일부 실시형태에서, 본원은 1 이상의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 하기에 기재한, 표 2, 도 11, 도 13 및 도 15에서 동정한), 이를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법(예를 들어, 본원에서 기재한 바와 같이 인간 및/또는 동물 사용을 위해)을 제공한다.

[표 2] 아분획 8에서 발견된 셀렌 함유 화합물의 질량 리스트

아분획을 추가로 특성화하기 위해 또한 실험을 수행하였다. 특히, 아분획의 효소(예를 들어, 트립신) 소화를 수행하고, 이어서 역상 크로마토그래피와 질량분석법(예를 들어, HPLC-ICP MS)을 사용하여 분석하였다(도 12). UPLC-오르비트랩 MS/MS 분석에서는 다수의 셀렌 함유 펩티드의 존재를 나타냈다. 셀렌 함유 펩티드 및 각각의 셀렌 함유 펩티드로부터 유도된 단백질의 동일성을 결정하였고, 도 13에 도시한다.

셀렌 농후 효모의 수용성 분획에서 셀렌 함유 화합물 및/또는 대사 물질의 추가 분석

중간 분자 크기(약 300-1000 Da)의 수용성 유기 셀렌 화합물을 동정과 특성화를 위해 추가 표적으로 삼았다. 독특한 셀레노메타볼롬은 이론적으로 상이한 공급원으로부터 효모의 지문을 구성한다(예를 들어, 시판 제품의 구성 조성에 관한 정보를 제공한다).

수 추출 이어서 분별. 0.2 g의 효모(SEL-PLEX, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모, ALLTECH, Inc., 미국 켄터키 주 렉싱턴)를 5 mL의 물에 의해 초음파 조를 사용하여 1 시간 추출하였다. 추출물을 원심분리하고(2700 g, 10 분), 경사 분리하며, 친액화하고, 냉동고에 저장하였다. 그 후 분말을 0.15 mL의 10 mM 아세트산암모늄 완충액(pH 7.5)에 용해시키고, 원심 분리하였다(14000 g, 15 분). 상층액을 SUPERDEX 펩티드 칼럼(크기 배제 크로마토그래피, SEC)에서 분별하였고; 100 mM 아세트산암모늄(pH 7.5)으로 0.7 mL min^-1에서 용출을 수행하였다. 20 내지 30 분에 용출액을 모아, 동결하고, 친액화하였다. 친액화물(lyophilizate)을 0.15 mL의 물에 용해시키고, 추가 분석 전에 -20℃에서 저장하였다.

HPLC -ICP MS 분석

이전에 물에 용해된, SEC로부터 친액화 샘플을 완충액 A에서 20배 희석하고, 10 μL의 분취량을 양이온 교환 PRP-X200 SCX 칼럼(150 mm x 2.1 mm x lO ㎛; Hamilton, 미국 네바다 주 리노)에 주입하였다. 0.5 mL min^-1로 공급되는 포름산암모늄(완충액 A: 20% 메탄올 중 1 mM 암모늄 및 10 mM 포름산(pH 3), 완충액 B: 20% 메탄올 중 100 mM 암모늄 및 110 mM 포름산(pH 6))에 의해 기울기 용출을 만들었다. 용출액을 그 일부(30%)가 ESI-MS에 공급되고, 나머지(70%)가 폐기물로 되는 방식으로 포스트 칼럼(post-column)에 나누었다. 프로그램은 0-8 min 3% B까지, 8-15 3% B, 15-20 10% B까지, 20-25 100% B까지, 25-38 100% B, 38-40 l00% A까지, 40-52 100% A 4.1.3이었다.

HPLC - ESI MS/MS 동정. 정제된 Se 함유 분획의 양이온 교환 HPLC-ESI MS 온라인 분석을 PRP-X200 SCX 칼럼으로 수행하였다. ICP MS 분석에 대한 것과 동일한 방식으로 기울기 용출을 만들었다. 5 μL의 샘플을 전 희석 없이 분석에 사용하였다. 이온 공급원을 양의 이온 모드로 조작하였다. 최적 세팅은 이온 공급원 전압, 2.60 kV; 모세관 온도, 280℃; 공급원 히터 온도, 120℃; 시스(sheath) 기류, 20; 보조 기류, 5; S 렌즈 RF 수준, 61%; 해상도, 100000이었다. 질량 스펙트럼을 100-1000 m/z 범위로 얻었고, Xcalibur 2.1 소프트웨어(Thermo Scientific)로서 가공하였다. 기구를 50% 아세토니트릴과 0.1% 포름산 용액에 용해된, 카페인, n-부틸아민, Met-Arg-Phe-Ala(MRFA), Ultrama가 1621 및 도데실설폰산나트륨(SDS)의 혼합물로 질량 교정하였다.

사용된 ICP MA와 ESI MS 검출기 시스템 둘 다와 적합성을 고려하여 크로마토그래피 조건을 최적화하였다. 셀렌 함유 화합물의 양이온 교환 HPLC-ICP MS 프로파일은 상당히 많은 수의 피크의 존재를 나타냈다(도 14a 참조). 분리된 분획의 역상 ICP-MS 크로마토그램을 생성하기 위해 실험을 또한 수행하였다(도 14b 참조).

이어서, 동일한 칼럼을 오르비트랩과 결합하고, 셀렌 함유 화합물/대사 물질을 동정하고, 특성화하였다(도 14 참조).

셀렌 강화 효모에 존재하는 셀렌 종을 분별하고, 동정하기 위해 추가의 샘플 제조 단계를 사용하였다. 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피(예를 들어, SUPERDEX 칼럼을 사용하는)를 ICP-MS 전에 사용하였고, 크기 배제 ICP MS를 사용하여 각 분획을 수집하였다(예를 들어, 도 7a 또는 8a에 도시한 각 피크를 포함하는 분획을 수집하고, 분석할 수 있다). 분획의 분석을 본원에서 기재한 과정(예를 들어, 이모드 역상/친수성 이온 상호작용 액체 크로마토그래피 - 일렉트로스프레이 하이브리드 사중극 트랩/오르비탈 트랩 질량분석법, 등)에 따라 수행하였다. 상기 방법을 사용하여 셀렌 강화 효모(SELPLEX)에서 동정한 추가의 셀렌 함유 화합물은 2,3-DHP-셀레노시스테인-시스테인, N-아세틸셀레노시스테인-셀레노호모시스테인, 메틸티오셀레노글루타티온, 2,3-DHP-셀레노시스테인-셀레노시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-시스테인일글리신, 2,3-DHP-셀레노시스테인-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노호모시스테인-시스테인일글리신, 셀레노메틸-셀레노글루타티온, 셀레노글루타티온-시스테인, 글루타티온-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-γ-글루타모일시스테인, 디-2,3-DHP-셀레노시스테인, N-아세틸시스테인-셀레노글루타티온, 셀레노글루타티온-셀레노시스테인, 2,3-DHP-셀레노시스테인-2,3 DHP 셀레노호모시스테인, 글루타티온-N-아세틸셀레노호모시스테인, 글루타티온-셀레노시스테인일글리신, γ-글루타모일 셀레노시스테인-γ-글루타모일 시스테인, γ-글루타모일시스테인-2,3-DHP-셀레노시스테인, 글루타티온-2,3-DHP-셀레노시스테인, 글루타티온-2,3-DHP-셀레노호모시스테인, 디-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-γ-글루타모일시스테인, 셀레노글루타티온-2,3-DHP-셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-2,3-DHP-셀레노호모시스테인, 셀레노글루타티온-티오-2,3-DHP-셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타티온-글루타티온, 셀레노디글루타티온, 디-셀레노글루타티온, 티오-디셀레노글루타티온, 메틸 데히드로호모시스테인, 셀레노메티오닌, 셀레노호모란티오닌, N-아세틸셀레노시스타티오닌, 데히드록시 5'-메틸셀레노아데노신, N-아세틸시스테인-셀레노호모시스테인, 2,3-DHP-셀레노란티오닌, 에틸셀레노아데노신, N-프로피오닐셀레노시스타티오닌, 2,3-DHP-셀레노시스타티오닌, 메틸셀레노글루타티온, γ-글루타모일셀레노시스타티오닌, 셀레노글루타티온, 셀레노(히드록실)-셀레노펜-(3'-데옥시-아데노신), N-아세틸시스테인-셀레노호모시스테인, 알릴셀레노아데노실 호모시스테인, 셀레노-아데노실 호모시스테인, 셀레노-히드록시 아데노실 호모시스테인, 셀레노 아데노신, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀레녹시드, 아데노실-히드록시 셀레녹시드, 에틸 셀레노아데노신, 셀레노-(히드록시)-셀레노펜-(3'-데스옥시-아데노신), 아데노실-히드록시 셀레녹시드, 및 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀레녹시드를 포함하였다. 따라서 일부 실시형태에서, 본원은 1 이상의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 셀레노에테르, 디펩티드 및 트리펩티드를 함유한 SeCys의 복합체, 셀로놀 및 셀레녹시드(예를 들어, 상기리스트에 제공된) 또는 이들의 유도체), 이를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법(예를 들어, 본원에서 기재한 바와 같이 인간 및/또는 동물 사용을 위해)을 제공한다.

수 불용성 화합물과 대사 물질의 동정 및 특성화

SEL-PLEX 제조 분획에서 80-90%의 셀렌은 수 불용성인 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 단백질, 펩티드, 핵산, 등)의 형태로 존재한다고 결정되었다. 따라서 이들 화합물을 추출할 수 있는(예를 들어, 화합물을 동정하며, 특성화하고/하거나 정량화하기 위해 화합물(예를 들어, 원래대로 또는 이로부터 유도된 성분)의 최대량을 추출하는) 방법을 개발하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. 추가로, 일렉트로스프레이에 의해 화합물(예를 들어, 단백질, 펩티드, 분자, 등)의 이온화(예를 들어, 효율적인 이온화) 및/또는 오르비트랩에 의해 분석을 가능하게 하는 정제 공정을 만들기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. 따라서 하기에 기재하는 바와 같이, 50% 초과의 원래 화합물에 대한 추출을 허용하는 방법이 개발되었다. 고상 추출 분별화를 조사하였다. 그러나 단리된 화합물의 순도 저하는 오리비트랩 MS에 의한 분석을 참고하지 못하게 하였다. 유용한 정보를 생성한 다른 공정을 확인하였다. 유익한 결과를 나타낸, 추가의 HPLC 정제 단계가 있고, 없는, 크기 배제 LC 분별화를 시도하였다.

셀렌 종의 추출

샘플에 존재한 대부분의 셀렌 화합물/종(샘플에 따라 전체 Se의 약 70 내지 95%)은 수 불용성이었고, 질량분석법에 의한 분석 전에 이들을 용액으로 이동시키는 맞춤형 과정을 필요로 하였다. 12개의 별개 방법을 시험하고, 비교하였으며, 추출 수율(추출물에서 총 셀렌 대 샘플에서 총 Se 비)을 얻었다. 요오도아세트아미드에 의한 유도체화와 결합한 4% SDS로서 단백질의 추출에 기초한 과정에 대해 약 55%의 최고 회수율을 얻었다. 수용성 종이 전체 Se의 약 15%를 나타내는 SELPLEX 샘플에 대해 최적화를 수행하였다(결과를 하기 표 3에 제시한다).

조건	추출 수율, %
4% SDS, 0.1M 트리스-HCl pH 7.5; 유도체화	55
4% SDS; 0.1M 트리스-HCl pH 7.5	40.2
5% 글리세롤; 2% SDS;0.06M 트리스 pH 8.8	18.9
7M 요소; 0.1M 트리스 pH 7.5	14.3
5M 요소; 0.1M 트리스 pH 7.5	11.4
7M 요소; 3.3% CHAPs	10.9
5M 요소; 0.1M 트리스 pH 7.5	10.6
0.1M 트리스 pH 7.5	3.33
0.09M 트리스 pH 7.5	2.63
5mM MgCl2; 0.1M 트리스 pH 7.5	1.76
30% 에탄올; 0.1M 트리스 pH 7.5	1.16
y-pex	0.61
*물	16.32

추출된 단백질을 아세톤으로 침전시키고, 트립신으로 소화시켰다. 소화된 추출물의 정제는 질량분석법 분석 전에 필요하였다. 특히, 트립신 소화물의 정제는 최적화되었다. 시험한 과정은 산성 및 염기성 조건(하기 표 4 참조)에서 고상 추출 및 예비 크기 배제 크로마토그래피를 포함하였다.

셀렌화 효모 화합물의 트립신 소화물의 고상 추출(SPE) 정제에 사용된 용출 조건

산성 모드	염기성 모드
H2O pH 2.5	H2O pH 10.5
H2O 3% ACN pH 2.5	H2O 3% ACN pH 10.5
H2O 10% ACN pH 2.5	H2O 10% ACN pH 10.5
H2O 20% ACN pH 2.5	H2O 20% ACN pH 10.5
H2O 20% ACN pH 10.5	H2O 20% ACN pH 2.5
H2O 50% ACN pH 10.5	H2O 50% ACN pH 2.5
H2O 80% ACN pH 10.5	H2O 80% ACN pH 2.5

얻어진 결과를 하기 표 5에 요약하며, 개별 분획에서 용출하는 Se의 퍼센트를 나타낸다.

조건	분획에서 Se의 퍼센트
산성 샘플의 물	15%
H2O pH 2.5	11%
H2O 3% ACN pH 2.5	11%
H2O 10% ACN pH 2.5	16%
H2O 20% ACN pH 2.5	18%
H2O 20% ACN pH 10.5	18%
H2O 50% ACN pH 10.5	8%
H2O 80% ACN pH 10.5	3%
염기성 샘플의 물	5%
H2O pH 10.5	10%
H2O 3% ACN pH 10.5	9%
H2O 10% ACN pH 10.5	21%
H2O 20% ACN pH 10.5	43%
H2O 20% ACN pH 2.5	9%
H2O 50% ACN pH 2.5	3%
H2O 80% ACN pH 2.5	0%

개별 분획에서 셀렌 화합물/종의 분자량 분포는 SEC-ICP MS에 의해 확인되었고(도 15 참조), 용출의 완료는 원료 소화물에 대해 얻어진 프로파일과 프로파일의 합의 비교에 의해 확인되었다(도 16 참조). 불행히도, SPE 정제 분획의 순도는 일렉트로스프레이 MS 분석에 대해 불충분하다고 입증되었다. 끝으로, 더 시간 소모적이지만 유용한 물질을 제공하는 예비 크기 배제 크로마토그래피를 선택하였다(도 17 참조). 도 18은 개별 SEC 분획의 프로파일이다. 이 과정은 셀레노메티오닌 후 용출하는 저 분자량 Se 분획의 제거를 가능하게 하였다(예를 들어, 후속 분석에 관련이 없었던).

개별 SEC 분획을 UPLC-오르비트랩 MS/MS에 의해 분석하였고; 일부 셀렌화 펩티드를 동정하였다. 동일성을 확인하는데 이온 교환 HPLC 분별화를 사용할 수 있다.

따라서 일부 실시형태에서, 본원은 수 불용성 셀렌 함유 화합물 및 대사 물질의 동정 또는 특성화를 위한 방법(예를 들어, 요오도아세트아미드에 의한 유도체화와 결합한 4% SDS로서 단백질의 추출, 아세톤에 의한 침전 및 효소 소화(예를 들어, 트립신에 의한), 산성 및 염기성 조건에서 고상 추출을 사용하는 정제, 예비 크기 배제 크로마토그래피, 및 HPLC 분별화와 UPLC-오르비트랩 MS/MS에 의한 분석과 같은 단계를 포함하는)을 제공한다.

1D 겔 전기영동에 의한 수 불용성 셀렌 함유 화합물의 분석

최적화되고, 상기에 기재한 SDS 추출은 SELPLEX로부터 분획을 생성하는데 매우 효율적인 것으로서 확인되었다. 계면활성제의 고 농축물과 적합한 분리 방법(1D 겔 전기영동)을 만들었다. 레이저 절단 주사는 후에 이어서 하트 절단되고, 효소(예를 들어, 트립신) 소화 처리되는, 셀렌 단백질 함량이 큰 겔의 일부에 대한 동정을 허용하였다. 트립신 소화물을 결합한 UPLC-ICP MS와 UPLC-ES MS/MS에 의해 분석하였다. 이 공정은 글리세릴알데히드-3-인산 탈수소효소 3에서 유래하는 화합물 대부분의 동정을 가능하게 하였다. 본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험에서는 SELPLEX에서 발견되는 단백질 글리세릴알데히드-3-인산 탈수소효소 3(35 kDa)이 존재하는 불용성 단백질의 80% 초과를 차지하는 10-15 kDa 단백질/펩티드 혼합물로 배치 처리 중에 분해된다는 것을 확인하였다. 본원의 실시형태의 개발 중에 생성되고, 본원에서 제시된 데이터는 불용성 셀렌 함유 화합물 분획의 제1 동정과 특성화이다.

수 추출

0.1 g의 샘플을 계량하고, 초음파 조에서 1 시간 동안 5 mL의 30 mM 트리스-HCl(pH 7.5)로 2회 세척하였다. 상층액을 원심분리에 의해 분리하고, 분석 전에 동결시켰다. 잔류물을 추가 분석을 위해 취하였다.

수 불용성 단백질의 추출

수 추출 후 잔류물을 0.1M 트리스-HCl 완충액에서 5 mL의 4% SDS 용액으로 세척하였다. 샘플을 초음파 조에서 초음파 프로브를 사용하여 2분간 및 나중에 50 μL의 0.2M DTT의 첨가 후 1 시간 동안 2회 초음파 분쇄하였다. 샘플을 원심분리하고, 분석을 위해 상층액을 취하였다.

겔 전기영동

각 샘플에 대해 4회 평행 분석을 수행한(샘플을 겔에 4개의 상이한 농도로 도입하였다) 전기영동 전 및 후에 SDS 추출물을 단백질 함량에 대해 분석하였다. 나중에 블럿 막에 이동시키기 위해 겔을 이중으로 제조하였다.

HPLC 분석 전 블럿 소화

LA ICP MS에 의한 분석에 기초하여, 겔 샘플(샘플 L09-4531 및 0087-16)을 선택하여 HPLC ICP MS 및 HPLC MS/MS에 의해 분석하였다. 블럿을 도 6과 도 7(상기에 기재한)에 표시한/기재한 바와 같이 가시 밴드(visible band)에 따라 절단하였다. 블럿 피스를 별도 관에 넣고, TRITON X-100/CAN/트리스 완충액으로 추출하며, IAM과 DTT로 유도체화하고, 트립신으로 소화시켰다.

블럿 샘플의 ICP MS 분석

2개의 블럿 라인: 효모 중 하나 및 pH 3에서 소화를 위해 제조된 샘플 중 하나를 선택하여 분석하였다. 기울기 용출 프로그램과 용출액으로서 물/메탄올/포름산 용액을 사용한 C18 페노메넥스(Phenomenex) 칼럼을 사용하여 이들을 분석하였다(도 19 참조). 샘플 L09-4531에 대해 잘라낸 7 밴드로부터, 2개의 대표 크로마토그램을 도 19에 도시하고, 오르비트랩에 의한 분석에 사용하였다.

블럿 샘플의 MS/MS 분석

전체 질량 스펙트럼을 얻었다. 셀렌 함유 화합물을 위한 연구와 이의 동정을 다음과 같이 수행하였다: 셀렌 패턴이 있는, 일, 이중 및 삼중 하전된 화합물을 조사하는데 메트워크스(MetWorks) 소프트웨어를 사용하였다; 위양성(false positive) 동정을 제거하는 노력으로 화합물의 리스트를 수작업으로 검사하였다; 일단 화합물의 리스트를 확인하고, 입증하면, 선택된 물질에 대해 MS2 스펙트럼을 얻기 위해 오르비트랩에 의한 제2 실행을 수행하였다. 기재한 방법에 따라 동정한(및 시퀀싱(sequencing)을 수행한) 5개의 셀렌 함유 화합물에 대한 MS 스펙트럼을 도 20에 제시한다. 효모 샘플의 블럿을 10 부분으로 분할하였다. 10 부분 모두를 ICP MS에 의해 분석하였다. 질량 35 kDa에서 밴드에 상응한 관심 크로마토그램을 샘플 6으로부터 얻었다. 크로마토그램은 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 3으로부터 나온 펩티드를 동정한 이전 블럿으로부터 얻어진 크로마토그램과 매우 유사하였다. 따라서 본원은 pH 3에서 수 불용성 추출물을 제조하는 것이 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 3의 소화를 유도한다는 것을 제공한다.

MS2 분석 시퀀싱을 수작업으로 수행하였다. 서열 데이터를 얻었고, 온라인 프로테옴 데이터베이스(UNIPROT, BLAST, 등)와 비교하고, 조사함으로써 특성화하였다. 도 21은 기재한 방법에 의해 확인된 셀렌 함유 펩티드의 리스트를 제공한다. 동정한 각 셀렌 함유 펩티드는 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소로부터 유도되었다고 결론을 내렸다. 따라서 일부 실시형태에서, 본원은 1 이상의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 도 20과 21에서 동정한), 이를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법(예를 들어, 본원에서 기재한 바와 같이 인간 및/또는 동물 사용을 위해)을 제공한다.

실시예 2

셀렌 함유 조성물은 심근 세포 비대와 노화를 억제한다

재료 및 방법

동물 및 치료.

C57/BL6의 유전적 배경에서 미토콘드리아 DNA 중합효소 감마의 도메인을 코딩하는 엑소뉴클리아제(exonulcease)에서 동형접합 변이를 발현하는 수컷 PolG^{( D257A )} 마우스를 닥터 토마스 에이 프롤라(Dr. Tomas A. Prolla)(위스콘신 대학교, 미국 위스콘신 주 매디슨)가 공급하였다. 마우스를 한 마리씩 가두어 윌리엄 에스 미들톤 기념 퇴역군인국 의료 센터(the William S. Middleton Memorial Veterans Administration Medical Center, 미국 위스콘신 주 매디슨)의 공동 노화 설치류 시설에서 길렀다. 온도와 습도를 일정한 수준으로 유지하였다. 12 시간 주기의 명암을 제공하도록 실내조명을 조절하였다. 마우스에게 물을 제공하고, 4℃에서 암실에 보관했던 실험식을 자유재량으로 급식하였다. 신선한 음식을 공급기에 매주 2회 첨가하였다.

떼어놓은 후 바로, 마우스를 무작위로 세 처리군 중 하나에 배정하였다. 마우스 한 군은 셀렌 농도가 <0.01 mg/kg(SD)인 기초식을 받았고, 제2 군은 SD식과 동일하지만 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모((SP), SELPLEX, ALLTECH, Inc., 미국 켄터키 주 렉싱턴)의 형태로 1.0 mg/kg의 셀렌이 첨가된 식사를 받았다. SP식의 최종 셀렌 농도는 일(1) 백만당부이었다. 사료 프리믹스 중 셀렌 농도는 원자 흡광 분석에 의해 평가하였고(예를 들어, Conolly, Power, Hynes, 2004 참조); 실험식에서, 코반스사(Covance Inc., 미국 위스콘신 주 매디슨)에 의해 평가하였다. 기초 SD식은 15 g/100 g 총 지방, 및 538.6 g/kg 수크로오스, 300 g/kg 토룰라(Torula) 효모, 140 g/kg 옥수수유, 3.0 g/kg DL 메티오닌, 15.4 g/kg 미네랄 믹스(g/kg 식사 기준으로, 탄산칼슘, 2.02; 염화나트륨, 2.6; 시트르산칼륨(일수화물), 7.7; 황산칼륨, 1.82; 산화마그네슘, 0.84; 시트르산제이철, 0.21; 탄산제일망간, 0.12; 탄산아연, 0.056; 황산칼륨크롬, 0.019; 탄산제이구리, 0.011; 요오드산칼륨, 0.0004를 함유하는) 및 3.0 g/kg 비타민 믹스(mg/kg 식사 기준으로, 타르타르산수소콜린, 2800; 니아신, 30; 판토텐산칼슘,16; 피리독신 HCl, 7; 티아민 HCl, 6; 리보플라빈, 6; 폴산, 2; 비오틴, 0.2; 비타민 B-12(만니톨에서 0.1%), 25; dl-α-토코페릴아세테이트(500 ㎍), 100; 비타민 A 팔미테이트(500,000 ㎍), 8; 콜레칼시페롤(500,000 ㎍), 0.4; 필로퀴논, 3을 함유하는)를 함유하였다.

각 치료군으로부터, 60일 후 6마리의 마우스를 희생시켰고, 400일 후 6마리를 희생시켰다(각각 POLG-어린 및 POLG-나이 든으로 언급함). 마우스 양쪽 군을 경추 탈골에 의해 희생시켰고, 조직을 모았다. 적어도 2회 실험을 수행하였다.

조직 제조.

교차 조직 유전자 발현 연구를 위해, 심장, 간, 및 비복근 시편을 모으고, 액체 질소에서 급속 냉동시키며, -80℃에서 보관하였다. 뇌 특이 발현 연구를 위해, 대뇌 피질을 주위 뇌 조직에서 분리하고, 액체 질소에서 급속 냉동시키며, -80℃에서 보관하였다.

RNA 추출.

QIAGENT 티슈 럽터(Tissure Ruptor)(QIAGEN, 미국 캘리포니아 주 발렌시아)를 사용하여 동결된 조직 샘플을 균질화하고, 회사가 추천한 프로토콜 하에 RNEASY 미니 키트(QIAGEN)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 나노드롭(NanoDrop) ND-1000 분광광도계(Thermo Scientific, 미국 델라웨어 주 월밍턴)를 사용하여 단리된 RNA의 완전성과 순도를 평가하였고, AGILENT 2100 바이오어날라이저 시스템(AGILENT Technologies, 미국 캘리포니아 주 산타 클라라)에 의해 추가로 확인하였다. T7-(dT)₂₄ 프라이머 및 T7 RNA 중합효소 프로모터가 있는 GENECHIP 발현 3'-증폭 시약 원 사이클(One-Cycle) cDNA 합성 키트(AFFYMETRIX, 미국 캘리포니아 주 산타 클라라)를 사용하여 정제된 RNA를 이중 가닥 cDNA로 전환하였다. 제조사의 추천 과정에 따라 AFFYMETRIX GENECHIP 발현 3'-증폭 원 사이클 타깃 라벨링 키트(AFFYMETRIX)를 사용하여 이중 가닥 cDNA를 비오틴 표지 cRNA로 전환하였다. GENECHIP 샘플 클린업 모듈(Cleanup Module)을 사용하여 비오틴 표지 cRNA를 세정하였고, 가열(94℃에서 35 분)에 의해 단편화하였다.

마이크로어레이 및 바이오인포매틱스(Bioinformatics) 경로 분석.

표지된 cRNA를 마우스 게놈 MG-430_2.0 GENECHIP 어레이(AFFYMETRIX)에 45℃에서 16 시간 동안 하이브리드화 하였고, 이어서 세척, 스트렙트아비딘-피코에리트린(SAPE) 염색 및 끝으로 GENECHIP 스캐너 3000 7G(AFFYMETRIX)에서 주사하였다. 마이크로어레이 데이터를 유효화하고, 표준화하는데 그리고 통계적 및 유전자 발현 패턴 분석을 수행하는데 GENESRPING GX 12.5(AGILENT)를 사용하였다. 간략하게는, 표준화를 제1 스케일 500의 평균 타깃 강도에 대해 어레이의 프로브셋(probeset)의 강도, 이어서 본 연구의 모든 샘플의 중앙으로 기초 전환에 의해 수행하였다. MAS5에 의해 마이크로어레이에 대한 이의 완전 매치(Pefect Match(PM)) 및 미스 매치(MM) 프로브 디자인을 기준으로 바탕 보정을 수행하였다. 결과를 오해하는 가능성을 최소화하기 위해, 신호 강도가 낮고, 샘플 전체에 걸쳐 AFFYMETRIX MAS5 알고리즘에 의해 '부재'(Absent)로서 표지한 프로브 세트를 추가 분석에서 제외시켰다. P<0.05이고, 신호 강도 배수 변화(FC)>1.2 또는 FC<-1.2에 상응하는 유전자가 상당히 다른 것으로서 정의한 분화구 도표(volcano plot) 방법을 사용하여 다르게 발현된 유전자를 걸렀다.

변경된 전사 프로파일에 의해 표시된 생물학적 테마를 해부하기 위해, 2개의 독립적인 경로 해석법을 적용하였다. 첫째, 식사에 의해 상당히 변경된 생물 과정과 신호 전달 경로를 확인하기 위해 정의된 유전자 세트에서 상당한 변화의 측정을 가능하게 하는 계산법인 유전자 세트 강화의 파라미터 해석(PAGE, parametric analysis of gene set enrichment)을 수행하였다(예를 들어, Kim & Volsky, 2005 참조). 적어도 10개 및 최대 1,000개 유전자가 있고, 레벨 3 이하인 이들 유전자 온톨로지(GO, gene ontology) 텀(term)만을 분석하였다. 식사 Se 상태와 관련된 전사 변경을 특성화하는 기능 클러스터(cluster)를 추가로 확인하기 위해, 인저뉴어티 패스웨이즈 어날리시스 소프트웨어(IPA(Ingenuity Pathways Analysis), Ingenuity Systems, 미국 캘리포니아 주 레드우드 시티)를 사용하여 상당히 변화된 유전자를 추가로 네트워크, 기능 및 표준 경로로 그룹화하였다. 유전자 및 제공된 네트워크, 생물 기능 또는 표준 경로 사이의 관계에 대한 유의성을 결정하는데 피셔의 직접 확률 검정(Fisher's exact test)을 사용하였다.

실시간 PCR 분석:

제조사의 추천 과정에 따라 어플라이드 바이오사이언스(Applied-Bioscience)의 예비 설계된 TAQMAN 프로브와 프라이머(INVITROGEN)를 사용하여 실시간 PCR 분석을 수행하였다. 각 샘플에서 Actb 수준에 의해 데이터를 표준화하였고, 샘플 수의 평균±sem으로서 표시하였다.

총 단백질 측정:

전자저울을 사용하여 심장 조직 중량을 측정한 다음, 기재한 바와 같이 균질화하였다(예를 들어, Lan et al, Biol Reprod, 1998. 58(1): p. 197-206 참조). 제조사 프로토콜에 따라 피어스(Pierce) 660nm 단백질 시험 키트(Thermo Scientific-Pierce Biotechnology, 미국 일리노이 주 록포드)를 사용하여 호모게네이트(homogenate)에서 단백질 수준을 측정하였다. 각 샘플에서 총 단백질 수준을 조직 중량에 의해 표준화하였다.

웨스턴 블럿 분석:

웨스턴 블럿 분석을 위해, 이전에 기재한 바와 같이, SD 처리 또는 SP 처리 PolG 마우스로부터 동일량의 심장 단백질을 SDS-PAGE 겔 분리 처리한 다음, PVDF 막에 이동시켰다(예를 들어, Lan et al, Biol Reprod, 1998. 58(1): p. 197-206; Adhikari et al, Hum Mol Genet, 2010. 19(3): p. 397-410); Reddy et al, Science, 2008. 319(5863): p. 611-3 참조). 막 블럿을 5%(w/v) 소혈청 알부민(Sigma, 미국 미조리 주 세인트 루이스)을 함유한 인산염 완충 식염수에서 봉쇄하고, 이어서 Myh7(Santa Cruz), Ankrdl(Santa Cruz), GSK3P(Cell Signaling), Foxo3a(Cell signaling), 칼시뉴린 A(Abcam), 인산화 NFATc2, 인산화 NFATc3(Santa Cruz), Actb 또는 베타-튜블린(Li-COR)에 대한 특이 항체에 의해 배양하였다. 아머샴의 향상된 화학발광 웨스턴 블로팅 검출 시약(GE healthcare) 또는 형광 표지 이차 항체(LI-COR)를 사용하여 막 블럿 위의 양의 신호를 검출하였다. LI-COR 오디세이(Odyssey) Fc 이미지 시스템을 사용하여 이들 신호의 이미지를 기록하였다. Li-COR 이미지 스튜디오 소프트웨어 또는 NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 단백질 밴드 밀도를 측정한 다음, 각 샘플에서 Actb 또는 베타-튜블린 수준에 의해 표준화하였다. 데이터를 도면 설명에서 정의된 샘플 수의 평균±sem으로서 표시한다. 실험을 적어도 2회 반복하였다.

통계 분석.

실시간 PCR 및 웨스턴 블럿 분석을 위해, 2 그룹 사이의 통계 차이를 결정하는데 스튜던트 t 검정을 수행하였고, 반면에 다중 그룹 중 차이를 결정하는데 일 방향 ANOVA 이어서 스튜던트 t 검정을 수행하였다. 0.05 미만의 p 값을 유의한 것으로 고려하였다.

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여는 고령의 PolG 마우스의 심근에서 Myh7 및 Ankrd1 발현을 억제한다

핵 코딩된 DNA 중합효소 c(POLG)는 동물 세포 미토콘드리아에서 유일하게 알려진 DNA 중합효소이다. 인간 POLG 유전자에서 돌연변이는 안근 마비, 백내장, 진행성 근 무력, 파킨슨증, 조기 난소 부전, 남성 불임, 청력 손실(노인성 난청), 및 심 기능장해를 포함하여, 다양한 증상과 관련된 다수의 질병에 연결되어 있다(예를 들어, Kujoth et al, PLoS Genetics, 2007. 3(2) 참조). PolG^{( D257A )} 마우스 모델은 12 주에 미토콘드리아에 코딩된 복합체의 호흡 기능에서 진행성 감소를 나타내며, 산소 소비 감소와 ATP 생성 감소를 초래한다(예를 들어, Kujoth et al, PLoS Genetics, 2007. 3(2) 참조). PolG 마우스는 13-14월령에서 확대된 심장 크기와 심근 세포에 의해 표시되는 현저한 심장 비대가 있는 촉진된 심장 노화 표현형을 나타낸다고 보고되었다(예를 들어, Dai et al 2010, Kujoth et al, 2005 및 도 22a 참조).

비대형 심근병증(HCM)은 심장 질환의 가장 흔한 일유전자 유전형이며, 35세보다 어린 개인에서 돌연 심장사의 가장 흔한 원인이다(예를 들어, Frey et al, Nat Rev Cardiol, 2012. 9(2): p. 91-100 참조). HCM에 대한 근거인 유전적 돌연변이는 특성화가 잘 되었고, 다수의 돌연변이가 근절 단백질, 예컨대 미오신-7(또한 심근 β-미오신 중쇄; MYH7로서 알려짐)을 코딩한다(예를 들어, Frey et al, Nat Rev Cardiol, 2012. 9(2): p. 91-100 참조).

심장 안키린(ankyrin) 반복 단백질(CARP)은 ANKRD1 유전자에 의해 코딩되며, ANKRD1 유전자와 CARP 핵 인자의 발현은 좌심실 비대, 인간의 심부전, 확장성 심근병증(DCM), 및 아드리아마이신 유발 심근병증에 관련되어 있다(예를 들어, Duboscq-Bidot et al, Archives of Cardiovascular Diseases, 2009. 102, Supplement 1(0): p. S73 참조). 입증된 표현형과 일관하여, 심장 비대 마커 Myh7과 Ankrd1의 연령 의존 발현은 POLG 어린 마우스와 비교하여 POLG 나이 든 마우스의 심장 조직에서 증가하였다(도 22b 참조).

셀렌의 투여로 비대 분자의 발현을 변경할 수 있는지를 결정하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. 비대 마커 미오신 중쇄 베타(Myh7) 및 심장 안키린 반복 단백질(Ankrd1)의 발현은 SD 대조식을 투여한 PolG 나이 든 마우스와 비교할 때 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 농후 효모의 형태로 셀렌을 투여한 PolG 나이 든 마우스에서 하향 조절되었다고 관찰되었다. 이러한 관찰을 확인하기 위해, 정량 실시간(QRT)-PCR을 수행하였고, Myh7(도 23a, 상부 패널)과 Ankrd1(도 23b, 상부 패널)의 발현이 SD 대조식을 투여한 PolG 나이 든 마우스와 비교할 때 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 농후 효모의 형태로 셀렌을 투여한 PolG 나이 든 마우스에서 상당히 하향 조절되었다. Myh7 및 Ankrd1 특이 항체를 사용하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였고, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 PolG 나이 든 마우스에서 심장 Myh7 및 Ankrd1 단백질 수준이 SD 대조식을 급식한 PolG 마우스보다 상당히 더 낮았다(도 23a-b, 하부 패널 참조). 따라서 본원은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하는 1 이상의 셀렌 함유 화합물)가 대상에 투여될 때 비대 단백질 Myh7과 Ankrd1의 축적을 억제한다(예를 들어, 이로써 심근 노화와 비대를 억제하고/하거나 예방한다)는 것을 제공한다.

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여는 PolG 나이 든 마우스에서 NFATs , Gsk3β 및 S6K 의 인산화와 단백질 수준을 조절함으로써 심장 비대를 유발한다고 알려진 신호 전달 경로를 변경한다

칼시뉴린-NFAT 신호 전달은 병리학적 심장 비대 및 심부전에서 활성화된다(예를 들어, Molkentin, Cardiovascular Research, 2004. 63(3): p. 467-475 참조). 칼시뉴린은 원래 형질전환 마우스의 심장에서 이의 과도한 발현을 기초로 비대 신호 전달 인자로서 관여하였다. 칼시뉴린의 활성 돌연변이체를 발현하는 마우스는 2-3 개월 내에 확장성 심부전으로 급속히 진행된 심한 비대 반응(심장 크기에서 2-3배 증가)을 나타냈다(예를 들어, Molkentin, Cardiovascular Research, 2004. 63(3): p. 467-475 참조). Cn 작용의 주요 메커니즘은 시토졸(cytosol)에서 활성화 T 세포의 핵인자(NFAT)의 탈인산화를 자극하는 것이며, 이는 핵에서 비인산화 NFAT의 상승을 얻는다. 핵에서 한 번, NFAT 패밀리 멤버는 T 세포에서 다양한 면역 반응 유전자의 전사 도입에 관여한다(도 24a 참조). 4개의 칼시뉴린 조절 NFAT 전사 인자, NFATc1-c4가 있으며, 각각 오로지 칼시뉴린에 의해 활성화되고, 심근에서 발현된다(예를 들어, Molkentin, Cardiovascular Research, 2004. 63(3): p. 467-475 참조). 따라서 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌이 Cn의 발현을 감소시킬 수 있으며, 따라서 Cn/NFAT 신호 전달을 변경하는지(예를 들어, 심장 비대를 예방하거나 감소시키도록) 결정하기 위해 추가 실험을 수행하였다.

칼시뉴린-A(Cn-A)의 단백질 수준 및 SD 대조식을 급식한 PolG 나이 든 마우스와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 PolG 나이 든 마우스의 심장에서 4개 NFAT 서브유닛(NFATC1, C2, C3 및 C4)의 인산화 상태를 비교하는데 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 도 24b에 도시한 바와 같이, PolG 나이 든 마우스에서 Cn-A 수준은 변경되지 않았으나; 인산화 NFATc2(pNFATc2) 수준은 SD 대조식을 투여한 POLG 나이 든 마우스와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 PolG 나이 든 마우스의 심장에서 높았다(도 24b 및 24c). 인산화 NFATc3의 높은 수준은 또한 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 대상에서 검출되었고, 반면에 인산화 NFATc1 및 C4는 검출되지 않았다.

칼시뉴린의 작용과 NFAT의 핵 수송(nuclear shuttling)은 GSK3β가 NFATc1의 N-말단 조절 도메인을 직접 인산화하므로 이에 의해 길항된다(예를 들어, Crabtree et al., 2002 참조). GSK3β의 발현 증가는 심근 세포 비대 성장을 감소시켰고, 심장에서 구조성 또는 유도성 GSK3β 발현이 생성된 형질전환 마우스에서 활성화 칼시뉴린에 대응하여 심장 비대가 줄어들었다(예를 들어, Molkentin, Cardiovascular Research, 2004. 63(3): p. 467-475 참조). 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여가 심장 GSK3β 수준에 어떤 역할이 있는지 확인하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. 도 24b와 24c에 도시한 바와 같이, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 POLG 나이 든 마우스는 SD 대조식을 투여한 POLG 나이 든 마우스와 비교하여 GSK3β의 심장 발현을 상당히 향상시켰음이 밝혀졌다.

최근 연구에서는 라파마이신의 포유류 타깃(mTor)의 억제와 S6K의 상실 중 후자가 단지 수컷 마우스에서 관찰되지만 마우스 수명을 지속시킬 수 있다는 것을 보여주었다(예를 들어, Selman et al, Science, 2009. 326(5949): p. 140-4); Harrison et al, Nature, 2009. 460(7253): p. 392-5 참조). S6K는 다른 세포에서 GSK3β 활성을 억제한다고 보고되었다(예를 들어, Cohen and Frame, Nat Rev Mol Cell Biol, 2001. 2(10): p. 769-76 참조). 따라서 인산화 S6K(pS6K1), mTor 및 단백질 합성에서 이의 다운스트림 타깃 p4E-BP, 및 PI3K 신호 전달 분자 pPDK1 및 pAkt의 단백질 수준이 SD 대조식을 투여한 POLG 나이 든 마우스와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 헬렌을 투여한 POLG 나이 든 마우스에서 변경되었는지를 시험하기 위해 실험을 수행하였다. pS6K1 수준은 SD 대조식을 투여한 POLG 나이 든 마우스와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 PolG 나이 든 마우스에서 상당히 줄어들었지만, mTOR 또는 다른 인산화 PDK1/Akt/4E-BP는 그렇지 않았다는 것이 밝혀졌다(도 24a 및 24b 참조).

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여는 Foxo3 발현을 증가시키지만, Foxo1 또는 Foxo4 발현을 증가시키지 않는다

최근 연구에서는 포크헤드 박스 전사 인자(Foxo) 패밀리 유전자 Foxo1, Foxo3 및 Foxo4가 심장 비대 및/또는 산화적 스트레스에 대한 생존(survival)에 중요하다는 것을 보여주었다(예를 들어, Ni et al, Circulation, 2006. 114(11): p. 1159-68; Sengupta et al, J Biol Chem, 2011. 286(9): p. 7468-78 참조).

따라서 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여가 Foxo 패밀리 전사 인자에 대해 만약 있다면 어떤 역할이 있는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 실시간 PCR을 사용하여, POLG 마우스의 심장 조직에서 분석된 각 Foxo 유전자의 발현에서 연령 의존 상향 또는 하향 조절이 없었는지 결정되었다. 또한, Foxo1 또는 Foxo4 발현에 대해 중요한 효과가 없었지만, SD 대조식을 투여한 POLG 나이 든 마우스와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 PolG 나이 든 마우스에서 Foxo3(mRNA와 단백질 둘 다) 발현의 상당한 증가가 있었다(도 25 참조). 심장 비대는 Foxo3 삭제 돌연변이체(null mutant) 마우스에서 입증되었지만, Foxo4 삭제 돌연변이체 마우스에서 입증되지 않았다(예를 들어, Ni et al, Circulation, 2006. 114(11): p. 1159-68 참조). 따라서 본원은 Foxo3의 발현 증가가 심장에서 전사 활성을 확실히 제어하도록 작용한다는 것을 제공한다.

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여가 나이 든 PolG 마우스에서 심장 Atm/Gadd45g 신호 전달을 조절한다

Atm/Gadd45 신호 전달은 세포 주기 정지와 DNA 수복에서 중요한 경로이다[13, 14]. SD 대조식을 투여한 POLG 나이 든 마우스와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 PolG 나이 든 마우스의 심장에서 Atm과 Gadd45 발현을 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. QRT-PCR을 사용하여, PolG 마우스 심장에서 Atm 발현의 연령 의존 감소가 있었다는 것이 밝혀졌다(도 26a 참조). 흥미롭게도, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여는 PolG 나이 든 마우스의 심장에서 Atm 발현의 연령 의존 감소를 없앴다(도 26a 참조). 추가로, Atm/Trp53의 다운스트림 타깃(p53, 세포 주기 정지와 DNA 수복에 대한 잘 알려진 종양 억제인자 키)인, 심장 Gadd45의 발현은 SD 대조식을 투여한 POLG 나이 든 마우스와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 PolG 나이 든 마우스에서 상당히 상향 조절되었다(도 26b 참조).

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여는 심근 세포에서 미토콘드리아 Ucp2 를 조절한다

미토콘드리아(MT)에서 분리 단백질은 열 발생과 미토콘드리아 전위 또는 완전성의 유지를 위해 중요하다(예를 들어, Sena et al, Mol Cell, 2012. 48(2): p. 158-67; Krauss et al, Nat Rev Mol Cell Biol, 2005. 6(3): p. 248-61 참조). Ucp2의 손실은 더 짧은 수명과 MT에서 반응성 산소 종(ROS)의 높은 생성을 야기한다고 입증되었다(예를 들어, Andrews et al. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2009. 296(4): p. E621-7; , Andrews et al, Curr Aging Sci, 2010. 3(2): p. 102-12 참조). SD 대조식을 투여한 POLG 나이 든 마우스와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 POLG 나이 든 마우스에서 Ucp1, 2 및 Ucp3 발현을 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. QRT-PCR을 사용하여, Ucp2가 SD 대조식을 투여한 POLG 나이 든 마우스와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 PolG 나이 든 마우스에서 상당히 높았다고 밝혀졌다(도 27 참조).

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여는 심부전의 마커이고 , 심근 수축성에 중요한 분자인 리포칼린( lipocalin ) 2( Lcn2 )의 발현을 하향 조절한다

Lcn2는 심부전의 바이오마커이며, 심근 수축을 위해 중요하다(예를 들어, Yang et al, Am J Transl Res. 4(1): p. 60-71; Xu et al, J Biol Chem. 287(7): p. 4808-17 참조).

인간이 나이가 들 때, 심장은 심근 세포가 확대되고, 근 세포 수축성이 줄어들면서 단단해지며, 둘 다 심부전의 원인을 유발한다. SD 대조식을 투여한 POLG 나이 든 마우스와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 PolG 나이 든 마우스에서 심장 조직의 Lcn2 발현을 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. Lcn2 발현에서 상당하고, 극적인 증가가 QRT-PCR을 사용하여, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 PolG 나이 든 마우스에서 밝혀졌다(도 28 참조). 이러한 관찰은 Lcn2가 NFAT 타깃임에 따라(예를 들어, Gaudineau et al, J Cell Sci, 2012. 125(Pt 19): p. 4475-86 참조) 증가한 pNFAT2/3 수준(예를 들어, 유전자 전사에서 NFAT 활성의 불활성화)에 관해 본원에서 개시한 다른 결과와 일치한다(도 24 참조).

실시예 3

셀렌 함유 조성물은 근감소증을 완화한다

재료 및 방법

동물 및 치료

수컷 C57BL/6J 마우스를 한 마리씩 가두어 윌리엄 에스 미들톤 기념 퇴역군인국 의료 센터(미국 위스콘신 주 매디슨)의 공동 노화 설치류 시설에서 길렀다. 온도와 습도를 일정한 수준으로 유지하였다. 12 시간 주기의 명암을 제공하도록 실내조명을 조절하였다. 마우스에게 물을 제공하고, 실험식을 자유재량으로 급식하였다. 실험식(할란 테클라드(Harlan Teklad, 미국 위스콘신 주 매디슨)에 의해 제조)을 4℃에서 암실에 보관하였고, 신선한 음식을 공급기에 매주 2회 첨가하였다.

마우스 한 군은 셀렌 농도가 <0.01 mg/kg(SD)인 기초식을 받았고, 제2 군은 SD식과 동일하지만 아셀렌산나트륨(SS)의 형태로 1.0 mg/kg의 셀렌이 첨가된 식사를 받았으며, 제3 군은 SD식과 동일하지만 셀레노메티오닌(SM)의 형태로 1.0 mg/kg의 셀렌이 첨가된 식사를 받았고, 제4 군은 SD식과 동일하지만 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모((SP), SELPLEX, ALLTECH, Inc., 미국 켄터키 주 렉싱턴)의 형태로 1.0 mg/kg의 셀렌이 첨가된 식사를 받았다. 각 SS, SM 및 SP식의 최종 셀렌 농도는 일(1) 백만당부이었다. 사료 프리믹스 중 셀렌 농도는 원자 흡광 분석에 의해 평가하였고(예를 들어, Conolly, Power, Hynes, 2004 참조); 실험식에서, 코반스사(미국 위스콘신 주 매디슨)에 의해 평가하였다. 기초 SD식은 15 g/100 g 총 지방, 및 538.6 g/kg 수크로오스, 300 g/kg 토룰라 효모, 140 g/kg 옥수수유, 3.0 g/kg DL 메티오닌, 15.4 g/kg 미네랄 믹스(g/kg 식사 기준으로, 탄산칼슘, 2.02; 염화나트륨, 2.6; 시트르산칼륨(일수화물), 7.7; 황산칼륨, 1.82; 산화마그네슘, 0.84; 시트르산제이철, 0.21; 탄산제일망간, 0.12; 탄산아연, 0.056; 황산칼륨크롬, 0.019; 탄산제이구리, 0.011; 요오드산칼륨, 0.0004를 함유하는) 및 3.0 g/kg 비타민 믹스(mg/kg 식사 기준으로, 타르타르산수소콜린, 2800; 니아신, 30; 판토텐산칼슘,16; 피리독신 HCl, 7; 티아민 HCl, 6; 리보플라빈, 6; 폴산, 2; 비오틴, 0.2; 비타민 B-12(만니톨에서 0.1%), 25; dl-α-토코페릴아세테이트(500 ㎍), 100; 비타민 A 팔미테이트(500,000 ㎍), 8; 콜레칼시페롤(500,000 ㎍), 0.4; 필로퀴논, 3을 함유하는)를 함유하였다.

3개월 동안 상기에 기재한 식사(SD, SM, SS 또는 SP)를 투여한 후, 마우스를 조직 수집 전에 경추 탈골에 의해 희생시켰다.

조직 제조:

교차 조직 유전자 발현 연구를 위해, 심장, 간, 및 비복근 시편을 모으고, 액체 질소에서 급속 냉동시키며, -80℃에서 보관하였다. 뇌 특이 발현 연구를 위해, 대뇌 피질을 주위 뇌 조직에서 분리하고, 액체 질소에서 급속 냉동시키며, -80℃에서 보관하였다.

RNA 추출.

QIAGENT 티슈 럽터(Tissure Ruptor)(QIAGEN, 미국 캘리포니아 주 발렌시아)를 사용하여 동결된 조직 샘플을 균질화하고, 회사가 추천한 프로토콜 하에 RNEASY 미니 키트(QIAGEN)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 나노드롭 ND-1000 분광광도계(Thermo Scientific, 미국 델라웨어 주 월밍턴)를 사용하여 단리된 RNA의 완전성과 순도를 평가하였고, AGILENT 2100 바이오어날라이저 시스템(AGILENT Technologies, 미국 캘리포니아 주 산타 클라라)에 의해 추가로 확인하였다.

T7-(dT)₂₄ 프라이머 및 T7 RNA 중합효소 프로모터가 있는 GeneChip 발현 3'-증폭 시약 원 사이클 cDNA 합성 키트(AFFYMETRIX, 미국 캘리포니아 주 산타 클라라)를 사용하여 정제된 RNA를 이중 가닥 cDNA로 전환하였다. 제조사의 추천 과정에 따라 AFFYMETRIX GeneChip 발현 3'-증폭 원 사이클 타깃 라벨링 키트(AFFYMETRIX)를 사용하여 이중 가닥 cDNA를 비오틴 표지 cRNA로 전환하였다. Genechip 샘플 클린업 모듈을 사용하여 비오틴 표지 cRNA를 세정하였고, 가열(94℃에서 35 분)에 의해 단편화하였다.

마이크로어레이 및 바이오인포매틱스 경로 분석.

표지된 cRNA를 마우스 게놈 MG-430_2.0 GeneChip 어레이(AFFYMETRIX)에 45℃에서 16 시간 동안 하이브리드화 하였고, 이어서 세척, 스트렙트아비딘-피코에리트린(SAPE) 염색 및 끝으로 GeneChip 스캐너 3000 7G(AFFYMETRIX)에서 주사하였다.

마이크로어레이 데이터를 유효화하고, 표준화하는데 그리고 통계적 및 유전자 발현 패턴 분석을 수행하는데 GeneSpring GX 12.5(AGILENT)를 사용하였다. 간략하게는, 표준화를 제1 스케일 500의 평균 타깃 강도에 대해 어레이의 프로브셋의 강도, 이어서 본 연구의 모든 샘플의 중앙으로 기초 전환에 의해 수행하였다. MAS5에 의해 마이크로어레이에 대한 이의 완전 매치(PM) 및 미스 매치(MM) 프로브 디자인을 기준으로 바탕 보정을 수행하였다. 결과를 오해하는 가능성을 최소화하기 위해, 신호 강도가 낮고, 샘플 전체에 걸쳐 AFFYMETRIX MAS5 알고리즘에 의해 '부재'로서 표지한 프로브 세트를 추가 분석에서 제외시켰다. P<0.05인 유전자가 상당히 다른 것으로서 정의한 분화구 도표 방법을 사용하여 다르게 발현된 유전자를 걸렀다.

변경된 전사 프로파일에 의해 표시된 생물학적 테마를 해부하기 위해, 2개의 독립적인 경로 해석법을 적용하였다. 첫째, 식사에 의해 상당히 변경된 생물 과정과 신호 전달 경로를 확인하기 위해 정의된 유전자 세트에서 상당한 변화의 측정을 가능하게 하는 계산법인 유전자 세트 강화의 파라미터 해석(PAGE)을 수행하였다(예를 들어, Kim & Volsky, 2005 참조). 적어도 10개 및 최대 1,000개 유전자가 있고, 레벨 3 이하인 이들 유전자 온톨로지(GO) 텀만을 분석하였다. 식사 Se 상태와 관련된 전사 변경을 특성화하는 기능 클러스터를 추가로 확인하기 위해, 인저뉴어티 패스웨이즈 어날리시스 소프트웨어(IPA, Ingenuity Systems, 미국 캘리포니아 주 레드우드 시티)를 사용하여 상당히 변화된 유전자를 추가로 네트워크, 기능 및 표준 경로로 그룹화하였다. 유전자 및 제공된 네트워크, 생물 기능 또는 표준 경로 사이의 관계에 대한 유의성을 결정하는데 피셔의 직접 확률 검정을 사용하였다.

총 단백질 측정.

전자저울을 사용하여 비복근 조직 중량을 측정한 다음, 기재한 바와 같이 균질화하였다(예를 들어, Lan et al, 1998 참조). 제조사 프로토콜에 따라 피어스 660nm 단백질 시험 키트(Thermo Scientific-Pierce Biotechnology, 미국 일리노이 주 록포드)를 사용하여 호모게네이트에서 단백질 수준을 측정하였다. 각 샘플에서 총 단백질 수준을 조직 중량에 의해 표준화하였다. 데이터를 샘플 수의 평균±sem으로서 표시한다. 실험을 2회 반복하였다.

통계 분석

실시간 PCR 및 웨스턴 블럿 분석을 위해, 2 그룹 사이의 통계 차이를 결정하는데 스튜던트 t 검정을 수행하였고, 반면에 다중 그룹 중 차이를 결정하는데 일 방향 ANOVA 이어서 스튜던트 t 검정을 수행하였다. 0.05 미만의 p 값을 유의한 것으로 고려하였다.

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌으로 처리한 대상은 높은 골격근 단백질을 나타낸다

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여가 골격근 조성 및/또는 양에 영향을 미칠 수 있는지를 조사하기 위해, 3개월 기간에 걸쳐 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌으로 보충한 사료를 급식한 마우스(SP) 대 셀렌으로 보충하지 않은 사료를 급식한 마우스(SD)에서 총 골격근 단백질을 검측하였다. 도 29에 도시한 바와 같이, 골격근의 총 단백질은 SD식을 투여한 마우스와 비교하여 SP식을 투여한 마우스에서 상당히 높았다. 이러한 데이터는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌 보충이 골격근에서 총 단백질 수준을 증가시킨다는 것을 나타낸다.

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여는 근육 위성 세포 성숙 및/또는 생성과 골격근 재생을 활성화한다

영양 신호에 대응하여 성숙 근육 세포를 생성하는 근육 위성(줄기) 세포의 활성화 부족은 근감소증의 한 원인이다(예를 들어, Ryall et al., 2008 참조). 활성화 위성 마커 유전자, 근원성 인자 6(Myf6) 및 데스민(Des)의 발현을 측정함으로써 대조 대상에 대해 셀렌 처리된 골격근에서 근육 위성(줄기) 세포 활성화를 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. 대조와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(SP) 및 아셀렌산나트륨(SS)의 형태로 셀렌을 투여한 마우스의 골격근에서 이들 활성화 위성 마커 유전자의 발현이 상당히 하향 조절되었음이 밝혀졌다(도 34 참조). 따라서 본원은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하는 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 셀렌이 근육 위성 세포의 성숙(예를 들어, 성숙 근육 세포를 생성하는 것)을 촉진하며, 이로써 근감소증을 약화시키는 것을 제공한다.

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여는 골격근에서 단백질 합성을 제어하는 신호 전달 경로를 변경한다

mTOR / S6K 및 MAPK / S6K 신호 전달

mTOR에 의한 신호 전달은 성장(질량 축적) 및 증식과 같은 세포 거동을 양성으로 및 음성으로 둘 다 조절할 수 있는 몇몇 주요 세포 기능에 영향을 미친다(예를 들어, Laplante, Cell. 2012, 149(2):274-93 참조). 단백질 합성은 mTOR에 의해 제어된 최상의 특성화 과정 중 하나이다. mTOR에 의한 S6K의 활성화는 mTOR 신호 전달 경로를 통한 단백질 합성에 중요한 단계이다(예를 들어, Laplante, Cell. 2012, 149(2):274-93 참조). mTOR 경로에 의한 S6K의 활성화 외에, 단백질 합성은 또한 MAPK/ERK3 매개 경로를 통해 S6K를 활성화함으로써 자극될 수 있다(예를 들어, Kenessey and Ojamaa, J Biol Chem, 2006, 281(30) 20666-20672 참조). 미토겐 활성화 단백질 키나아제 키나아제 2(MAP2K2)는 MAPK1/ERK2 경로를 활성화하는 효소이며, 인간에서 MAP2K2 유전자에 의해 코딩된다(예를 들어, Biochim Biophys Acta. 2007, 1773(8):1150-60 참조). 그 후 MAPK는 RSK를 활성화하고, 이는 다음에 리보솜 단백질 S6K를 인산화한다(예를 들어, Pende et al. Mol Cell Bio, 2004. 24(8): p. 3112-3124 참조). 단백질 합성과 관련된 경로의 부(negative) 조절인자는 GSK3β이다. GSK3β의 억제는 단백질 합성에 연관되어 있는 진핵생물 개시 인자 2B(eIF2B)를 차단한다. GSK3β의 불활성 형태 발현은 골격 근관에서 비대의 극적인 증가를 유발한다고 알려졌으며, 심장에서 야생형 GSK3β의 과도 발현은 심장 크기의 30% 감소를 유도한다(예를 들어, Santri, Physiology (Bethesda). 2008; 23: 160-70 참조).

대조와 비교하여 셀렌 강화 효모(SP)의 형태로 셀렌을 투여한 마우스의 골격근에서 mTOR의 유전자 발현 수준에서 상당한 감소가 관찰되었다(도 31 참조). 셀렌 강화 효모(SP)의 형태로 셀렌을 투여한 마우스의 골격근에서 MAP2K2 유전자 발현의 더더욱 극적인 감소가 관찰되었고, SD식을 투여한 마우스와 비교할 때 -3.03 배수 변화를 나타냈다(도 36).

2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(SELPLEX)의 투여는 대조와 비교할 때 S6K 발현을 하향 조절하였다는 결과(예를 들어, 도 31 참조)는 SELPLEX가 마우스의 골격근에서 mTOR 및 MAPK2K 발현을 감소시켰다는 발견과 관련이 있었다. 그러나 SELPLEX가 SELPLEX를 투여한 마우스의 비복근 조직에서 GSK3β 발현을 상당히 하향 조절하였다는 결과는 GSK-3β의 비활성이 단백질 활성을 자극할 수 있다는 것을 고려할 때 놀라운 일이었다. 이들 결과는 근육에서 단백질 합성을 촉진한다고 알려져 있는 유전자(예를 들어, mTOR, MAPK2K, 및 S6K)의 하향 조절에도, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하는 1 이상의 셀렌 함유 조성물)가 총 골격근 단백질(예를 들어, 골격 근육량)을 다른 경로(들)를 통해 증가시킨다는 것을 나타낸다.

mTOR의 억제인자인 Ampk는 또한 단백질 합성에 관련되어 있다(예를 들어, Gordon et al, 2008; Thomson et al, 2008 참조). S6K와 mTOR의 발현 감소와 일관하여, Ampk의 서브유닛인 Prkaa2의 높은 발현이 또한 대조와 비교하여 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 마우스의 골격근에서 관찰되었다(도 31 참조). 따라서 일부 실시형태에서, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 셀렌 함유 화합물 구성물)의 형태로 셀렌은 본원에서 기재한 바와 같이 대상의 골격 근육량을 증가시키는데 사용된다.

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여는 골격 근육량의 형성에서 칼시뉴린의 발현을 상향 조절한다

칼시뉴린 / NFAT 네트워크

칼시뉴린/활성화 T 세포의 핵 인자(NFAT) 신호 전달은 운동과 칼슘 신호 전달에 대응하여 골격 근육량의 증가와 관련된 중요 경로이다(예를 들어, Glass, 2003 참조). 비대 유전자를 제어하는 칼시뉴린/NFAT 신호 전달 분자의 발현을 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. 칼시뉴린의 촉매 서브유닛(Ppp3cb 및 Ppp3cc, 및 칼시뉴린 B 서브유닛 Ppp3rl)을 코딩하는 유전자의 발현이 모두 대조와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 마우스의 골격근에서 상당히 높았다고 밝혀졌다(하기 표 6 참조). 추가로, 칼시뉴린 B의 다른 서브유닛인 Ppp3r2의 발현 증가 경향이 또한 관찰되었다(하기 표 6 참조).

[표 6] 셀렌을 보충하지 않은 대조식과 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(SP)의 형태로 셀렌을 보충한 사료를 3개월 동안 급식한 정상 마우스의 골격근에서 높은 칼시뉴린

단백질 수준 증가와 골격근 성장에 기여하는, 단백질 신장 인자를 코딩하는 다중 유전자(Eef1a1, Eef1b2, Eef1e1, Eef1g, Eef2)가 대조와 비교하여 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 마우스의 골격근에서 상향 조절되었다는 것이 또한 관찰되었다(도 30 참조).

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여는 골격근에서 단백질 합성을 억제하는 신호 전달 네트워크를 변경한다

미오스타틴 / Acvr2b 네트워크

미오스타틴 및 이의 수용체, 악티빈 A는 근위축을 제어하는 또 다른 중요한 경로이다. Acvr2b의 유전자 제거(특히 근섬유에서)는 위성 세포 활성화의 부재 하에서도 근육 비대를 유도하는데 충분하다(예를 들어, Lee et al, PNAS 2012 참조). 추가로, 미오스타틴/Acvr2b 복합체는 Akt/mTOR 신호 전달 경로를 파괴함으로써 단백질 합성을 억제한다(예를 들어, Sakuma and Yamaguchi, J Aging, 2012 참조).

따라서 대조식 대 셀렌 함유 식사를 투여한 대상으로부터 골격근의 Acvr 발현을 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. Acvr2b 발현이 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 대상에서 상당히 하향 조절되었다는 것이 결정되었다(도 33 참조).

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여는 위축 유전자 발현을 하향 조절하고,골격근에서 단백질 분해를 억제한다

세 갈래 모티브(tripartite motif) 함유 63(Trim63) 및 유비퀴틴(ubiquitin) E3 리가아제 아트로긴(atrogin)-1(Fbxo32)와 같은 위축 유전자의 높은 발현은 근감소증에서 단백질 분해를 유발한다고 입증되었다(예를 들어, Sakuma and Yamaguchi, 2012 참조). 따라서 셀렌 결핍 식사를 투여한 대상에 대해 셀렌 함유 실험식을 투여한 대상에서 골격근의 위축 유전자 발현을 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. Trim63과 Fbxo32 둘 다 대조와 비교하여 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 마우스의 골격근에서 하향 조절되었음이 밝혀졌다(도 32 참조). Trim63과 Fbxo32의 발현 감소는 대조와 비교하여 2년간 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 정상 마우스로부터 골격근에서 또한 입증되었다.

따라서 일부 실시형태에서, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 셀렌 함유 화합물 구성물)의 형태로 셀렌은 본원에서 기재한 바와 같이 골격근 위축을 억제하는데 사용된다.

실시예 4

셀렌을 포함하는 조성물의 투여는 비만에 관련한 분자의 발현을 상당히 약화시킨다

근감소증과 비만은 선진국에서 기대 수명과 건강관리 비용에 대한 영향이 증대하는 2개의 독립적인 아직 상호 연결되는 상태이다. 증가한 지방량과 줄어든 근육량의 조합은 "근감소성 비만"으로서 언급된다(예를 들어, Parr, E., Maturitas, 2013. 74: p. 109-113 참조). 비만은 골격근에서 단백질 합성을 줄이고, 아미노산 통합을 방지하는 지방량과 지질 축적 증가를 촉진함에 따라 근감소증을 악화시킨다(예를 들어, Parr, E., Maturitas, 2013. 74: p. 109-113 참조). 다음에, 골격 근육량이 전신 글루코오스 처리와 인슐린 감수성에서 기본적인 역할과 함께 대사 건강에 결정적이므로, 근감소증은 비만을 악화시킨다(예를 들어, Parr, E., Maturitas, 2013. 74: p. 109-113 참조). 근감소증 외에, 비만은 흔히 II형 당뇨병, 고혈당증, 등과 같은 다른 대사 질환과 연관된 부작용이다. 유전적 소인과 비만 관련 분자의 발현은 또한 기여 인자라는 사실이 잘 이해되고 있다. 비만은 선진국에서 기대 수명과 건강관리 비용에 대한 영향이 증대하고 있다(예를 들어, Parr, E., Maturitas, 2013. 74: p. 109-113 참조).

흔히 "비만 유전자"로서 언급된 지방량과 비만 관련 유전자(FTO)는 어린이와 성인에서 증가한 체질량 지수 및 비만에 대한 소인과 강력하게 연관되어 있다(예를 들어, Gulati et al, PNAS, 2013. 110(7): p. 2557-2562 참조). FTO 유전자는 편재적으로 발현되지만, 뇌에서, mRNA 수준은 해마, 소뇌 및 시상하부 내에서 특히 높으며, 식품 섭취, 전신 대사 및 비만의 조절에서 뇌 FTO의 잠재적인 역할을 제안하고 있다(예를 들어, Church, PLoS Genetics, 2009 참조).

대상에 셀렌의 투여가 FTO의 발현을 변경할 수 있는지를 결정하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다.

실시예 3에서 기재한 동물 모델을 사용하여, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌을 투여한 대상은 SD식을 투여한 대조 대상과 비교할 때 하여 피질 조직(배수 변화 = -1.70)에서 뿐만 아니라 비복근 조직(배수 변화 = -3.33)에서도 상당히 감소한 수준의 FTO 유전자 발현을 나타냈다고 결정되었다(도 36 및 37 참조).

실시예 5

2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 투여 시 페르옥시솜(Peroxisome) 증식인자 활성화 수용체 감마( PPARg ) 보조 활성화 인자 1 알파(PGG-1α) 발현의 골격근 대 간 발현 사이의 반비례 관계

재료 및 방법

동물 및 치료

수컷 C57BL/6J 마우스를 한 마리씩 가두어 윌리엄 에스 미들톤 기념 퇴역군인국 의료 센터(미국 위스콘신 주 매디슨)의 공동 노화 설치류 시설에서 길렀다. 온도와 습도를 일정한 수준으로 유지하였다. 12 시간 주기의 명암을 제공하도록 실내조명을 조절하였다. 마우스에게 물을 제공하고, 이들의 실험식을 자유재량으로 급식하였다. 실험식(할란 테클라드(미국 위스콘신 주 매디슨)에 의해 제조)을 4℃에서 암실에 보관하였고, 신선한 음식을 공급기에 매주 2회 첨가하였다.

마우스 한 군은 셀렌 농도가 <0.01 mg/kg(SD)인 기초식을 받았고, 제2 군은 SD식과 동일하지만 아셀렌산나트륨(SS)의 형태로 1.0 mg/kg의 셀렌이 첨가된 식사를 받았으며, 제3 군은 SD식과 동일하지만 셀레노메티오닌(SM)의 형태로 1.0 mg/kg의 셀렌이 첨가된 식사를 받았고, 제4 군은 SD식과 동일하지만 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모((SP), SELPLEX, ALLTECH, Inc., 미국 켄터키 주 렉싱턴)의 형태로 1.0 mg/kg의 셀렌이 첨가된 식사를 받았다. 각 SS, SM 및 SP식의 최종 셀렌 농도는 일(1) 백만당부이었다. 사료 프리믹스 중 셀렌 농도는 원자 흡광 분석에 의해 평가하였고(예를 들어, Conolly, Power, Hynes, 2004 참조); 실험식에서, 코반스사(미국 위스콘신 주 매디슨)에 의해 평가하였다. 기초 SD식은 15 g/100 g 총 지방, 및 538.6 g/kg 수크로오스, 300 g/kg 토룰라 효모, 140 g/kg 옥수수유, 3.0 g/kg DL 메티오닌, 15.4 g/kg 미네랄 믹스(g/kg 식사 기준으로, 탄산칼슘, 2.02; 염화나트륨, 2.6; 시트르산칼륨(일수화물), 7.7; 황산칼륨, 1.82; 산화마그네슘, 0.84; 시트르산제이철, 0.21; 탄산제일망간, 0.12; 탄산아연, 0.056; 황산칼륨크롬, 0.019; 탄산제이구리, 0.011; 요오드산칼륨, 0.0004를 함유하는) 및 3.0 g/kg 비타민 믹스(mg/kg 식사 기준으로, 타르타르산수소콜린, 2800; 니아신, 30; 판토텐산칼슘,16; 피리독신 HCl, 7; 티아민 HCl, 6; 리보플라빈, 6; 폴산, 2; 비오틴, 0.2; 비타민 B-12(만니톨에서 0.1%), 25; dl-α-토코페릴아세테이트(500 ㎍), 100; 비타민 A 팔미테이트(500,000 ㎍), 8; 콜레칼시페롤(500,000 ㎍), 0.4; 필로퀴논, 3을 함유하는)를 함유하였다.

마우스를 조직 수집 전에 경추 탈골에 의해 희생시켰다.

조직 제조:

교차 조직 유전자 발현 연구를 위해, 심장, 간, 및 비복근 시편을 모으고, 액체 질소에서 급속 냉동시키며, -80℃에서 보관하였다. 뇌 특이 발현 연구를 위해, 대뇌 피질을 주위 뇌 조직에서 분리하고, 액체 질소에서 급속 냉동시키며, -80℃에서 보관하였다.

RNA 추출.

QIAGENT 티슈 럽터(Tissure Ruptor)(QIAGEN, 미국 캘리포니아 주 발렌시아)를 사용하여 동결된 조직 샘플을 균질화하고, 회사가 추천한 프로토콜 하에 RNEASY 미니 키트(QIAGEN)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 나노드롭 ND-1000 분광광도계(Thermo Scientific, 미국 델라웨어 주 월밍턴)를 사용하여 단리된 RNA의 완전성과 순도를 평가하였고, AGILENT 2100 바이오어날라이저 시스템(AGILENT Technologies, 미국 캘리포니아 주 산타 클라라)에 의해 추가로 확인하였다.

T7-(dT)₂₄ 프라이머 및 T7 RNA 중합효소 프로모터가 있는 GeneChip 발현 3'-증폭 시약 원 사이클 cDNA 합성 키트(AFFYMETRIX, 미국 캘리포니아 주 산타 클라라)를 사용하여 정제된 RNA를 이중 가닥 cDNA로 전환하였다. 제조사의 추천 과정에 따라 AFFYMETRIX GeneChip 발현 3'-증폭 원 사이클 타깃 라벨링 키트(AFFYMETRIX)를 사용하여 이중 가닥 cDNA를 비오틴 표지 cRNA로 전환하였다. Genechip 샘플 클린업 모듈을 사용하여 비오틴 표지 cRNA를 세정하였고, 가열(94℃에서 35 분)에 의해 단편화하였다.

마이크로어레이 및 바이오인포매틱스 경로 분석.

표지된 cRNA를 마우스 게놈 MG-430_2.0 GeneChip 어레이(AFFYMETRIX)에 45℃에서 16 시간 동안 하이브리드화 하였고, 이어서 세척, 스트렙트아비딘-피코에리트린(SAPE) 염색 및 끝으로 GeneChip 스캐너 3000 7G(AFFYMETRIX)에서 주사하였다.

마이크로어레이 데이터를 유효화하고, 표준화하는데 그리고 통계적 및 유전자 발현 패턴 분석을 수행하는데 GeneSpring GX 12.5(AGILENT)를 사용하였다. 간략하게는, 표준화를 제1 스케일 500의 평균 타깃 강도에 대해 어레이의 프로브셋의 강도, 이어서 본 연구의 모든 샘플의 중앙으로 기초 전환에 의해 수행하였다. MAS5에 의해 마이크로어레이에 대한 이의 완전 매치(PM) 및 미스 매치(MM) 프로브 디자인을 기준으로 바탕 보정을 수행하였다. 결과를 오해하는 가능성을 최소화하기 위해, 신호 강도가 낮고, 샘플 전체에 걸쳐 AFFYMETRIX MAS5 알고리즘에 의해 '부재'로서 표지한 프로브 세트를 추가 분석에서 제외시켰다. P<0.05이고, 신호 강도 배수 변화(FC)>1.2 또는 FC<-1.2에 상응하는 유전자가 상당히 다른 것으로서 정의한 분화구 도표 방법을 사용하여 다르게 발현된 유전자를 걸렀다.

변경된 전사 프로파일에 의해 표시된 생물학적 테마를 해부하기 위해, 2개의 독립적인 경로 해석법을 적용하였다. 첫째, 식사에 의해 상당히 변경된 생물 과정과 신호 전달 경로를 확인하기 위해 정의된 유전자 세트에서 상당한 변화의 측정을 가능하게 하는 계산법인 유전자 세트 강화의 파라미터 해석(PAGE)을 수행하였다(예를 들어, Kim & Volsky, 2005 참조). 적어도 10개 및 최대 1,000개 유전자가 있고, 레벨 3 이하인 이들 유전자 온톨로지(GO) 텀만을 분석하였다. 식사 Se 상태와 관련된 전사 변경을 특성화하는 기능 클러스터를 추가로 확인하기 위해, 인저뉴어티 패스웨이즈 어날리시스 소프트웨어(IPA, Ingenuity Systems, 미국 캘리포니아 주 레드우드 시티)를 사용하여 상당히 변화된 유전자를 추가로 네트워크, 기능 및 표준 경로로 그룹화하였다. 유전자 및 제공된 네트워크, 생물 기능 또는 표준 경로 사이의 관계에 대한 유의성을 결정하는데 피셔의 직접 확률 검정을 사용하였다.

실시간 PCR 분석.

제조사의 추천 과정에 따라 어플라이드 바이오사이언스의 예비 설계된 TAQMAN 프로브와 프라이머(INVITROGEN)를 사용하여 실시간 PCR 분석을 수행하였다. 각 샘플에서 Actb 수준에 의해 데이터를 표준화하였고, 샘플 수의 평균±sem으로서 표시하였다.

통계 분석

실시간 PCR 및 웨스턴 블럿 분석을 위해, 2 그룹 사이의 통계 차이를 결정하는데 스튜던트 t 검정을 수행하였고, 반면에 다중 그룹 중 차이를 결정하는데 일 방향 ANOVA 이어서 스튜던트 t 검정을 수행하였다. 0.05 미만의 p 값을 유의한 것으로 고려하였다.

배경

골격근과 간은 글루코오스 항상성의 유지에서 2개의 주요 인슐린 반응성 기관이다. 인슐린 저항 상태로 이들 기관의 전이는 II형 당뇨병이 있는 환자에서 보인 글루코오스 대사 변화의 대부분을 설명한다(예를 들어, Lowell and Shulman, 2005 참조). 이들 2 기관 중에서, 골격근은 인슐린 저항성 발생에서 생기는 결과 면에서 더 중요하다. 이는 골격근이 1일 섭취 글루코오스의 80 내지 90%를 처리하거나 대사한다고 밝혀졌기 때문이다(예를 들어, DeFronzo et al., 1985 참조).

미토콘드리아 산화적 인산화(OXPHOS) 유전자가 전당뇨병 및 당뇨병 개체에서 건강한 대조와 비교하여 발현 감소를 나타내고, 이들 유전자가 많은 경우에 전사 보조 활성화 인자 증식 인자 활성화 수용체 감마 보조 활성화 인자, PGC1-α(예를 들어, Mootha et al., 2003 참조)의 타깃이라는 사실이 게놈 광범위 발현 해석에 의해 입증되었다. 이들 연구에서, OXPHOS 유전자에 대한 전형적인 발현 감소는 크지 않지만(대략 20%) 매우 일관되어 있었고, 연구된 유전자의 89%는 정상 글루코오스 내성이 있는 개체에 비해 불충분한 글루코오스 내성 또는 II형 당뇨병이 있는 개체에서 더 낮은 발현을 나타냈다.

따라서 대상에게 셀렌의 투여가 대상의 간 및/또는 골격근에서 OXPHOS 활성을 변경할 수 있는 지(예를 들어, 2형 당뇨병에 대한 치료법으로서)를 연구하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. 본원의 실시형태의 개발 중에 생성된 실험상의 데이터로부터 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(Trt)의 형태로 셀렌의 투여가 대조 대상(Con)과 비교하여 골격근에서 PGC1-α 발현의 상당한 향상을 얻었다는 사실을 발견했다(도 38 참조).

본원에서 기재한 바와 같이, PGC1-α는 골격근에서 미토콘드리아 활성을 향상시키는 강력한 전사 보조 활성화 인자이다. 그러나 골격근 외의 조직에서 높은 PGC1-α 수준의 발현은 대상에서 유해한 및/또는 해로운 작용이 있을 수 있다. 예를 들어, 간에서, PGC1-α는 이것이 골격근에서 수행하는 역할과 상이한 역할을 수행한다. 특히, 간에서 높은 PGC1-α 수준은 글루코오스를 대사할 수 없는, 인슐린 감수성이 부족한 당뇨병 대상에서 일어나는 매우 바람직하지 못한 이벤트인, 글루코오스 신생 합성(글루코오스 생성; 예를 들어 Liang and Ward, 2006 참조) 증가를 유발한다.

따라서 대상에게 셀렌의 투여가 비골격근 조직에서 PGC1-α의 발현에 관해 만약에 있다면 어느 활성이 있을 수 있는지 연구하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. 의외로, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(Trt)의 형태로 셀렌의 투여가 대조 대상(control)과 비교하여 간에서 PGC1-α 발현의 상당한 감소를 얻었다는 사실이 발견되었다(도 39 참조). 이러한 발견은 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여가 대조 대상과 비교하여 골격근에서 PGC1-α 발현의 상당한 향상을 얻었다는 관찰에 근거하여 놀라운 일이었다. 따라서 본원은 대상에서 동시에 PGC1-α 발현을 감소시키면서 대상의 골격근에서 PGC1-α 발현을 향상시키는 방법(예를 들어, 이로써 대상에게 골격근에서 향상된 글루코오스 대사와 처리(예를 들어, 향상된 OXPHOS를 통해) 및 간에서 억제된 글루코오스 생성을 제공한다)에서 사용하기 위한 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 1 이상의 셀렌 함유 화합물)를 포함하는 조성물을 제공한다.

대상의 상이한 조직에서 동일한 분자(예를 들어, PGC1-α)의 발현에 대한 이러한 이질적인 영향을 가지는, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모를 포함하는 조성물의 능력을 추가로 특성화하고, 증명하기 위해, 실험을 수행하여 셀렌을 포함하는 조성물을 투여한 대상에서 COUP 전사 인자 2(또한 핵 수용체 아과 2, 그룹 F, 멤버 2(Nr2F2)로서 알려진)의 발현을 분석하였다. Nr2F2는 PGC1-α의 추정 직접 저해제이다(예를 들어, Lin et al., 2011 참조).

다시, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(Trt)의 형태로 셀렌의 투여가 대조 대상(Con)과 비교하여 골격근에서 Nr2F2 발현의 상당한 감소를 얻었고(도 38 참조), 반면에 대조와 비교하여 간 조직에서 Nr2F2의 상당한 향상이 있었다(도 39 참조)는 사실을 발견한 것은 놀라운 일이었다. 이러한 데이터는 대상의 다수 조직(예를 들어, 골격근 조직과 간 조직)에서 글루코오스 항상성을 조절하는데 사용하기 위한, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모(또는 이의 1 이상의 수용성 분획 또는 이의 1 이상의 수 불용성 분획 또는 이의 내부에 존재하거나 이로부터 유도되는 1 이상의 셀렌 함유 화합물)의 형태로 셀렌을 포함하는 조성물의 유용성에 관한 제1 증거를 제공한다.

실시예 6

셀렌 강화 효모의 형태로 셀렌의 투여는 글루코오스 이용에 관련된 분자의 발현을 향상시킨다

실시예 2에 기재한 동물 모델을 사용하여, 셀렌을 포함하는 조성물을 투여한 대상의 간에서 산화적 인산화(OXPHOS)를 조절하는 분자의 발현을 분석하기 위해 실험을 수행하였다. 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 투여를 통해 간 특이 미토콘드리아 활성을 우선적으로 그리고 차별적으로 조절하는 것이 가능하며, 반면에 아셀렌산셀렌 또는 셀레노메티오닌은 효과가 꽤 적었다는 것이 밝혀졌다. 특히, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모를 투여한 마우스는 ATP 합성효소; ATP아제, H+ 수송, VI 서브유닛 A; 시토크롬 c 산화효소, 서브유닛 Va; 시토크롬 c-1, NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 알파 부복합체(subcomplex) 10; NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 알파 부복합체 1; NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 알파 부복합체 3; NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 알파 부복합체 4; NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 알파 부복합체 아아제; NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 베타 부복합체 4; NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 베타 부복합체 8; NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 베타 부복합체 10; NADH 탈수소효소(유비퀴논) Fe-S-단백질 4; NADH 탈수소효소(유비퀴논) Fe-S-단백질 6; 및 숙신산 탈수소효소 복합체, 서브유닛 C의 발현에서 상당한 증가를 나타냈고; 또한 ATP아제 억제 인자 1; ATP아제, H+ 수송 리소솜, VI 서브유닛 H; NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 알파 부복합체 4; 및 아연 핑거(finger) CCHC 도메인 함유 2의 발현을 상당히 감소시켰다고 관찰되었다.

비교하여, 아셀렌산나트륨을 투여한 마우스는 ATP아제, H+ 수송, VI 서브유닛 A; ATP아제, H+ 수송, VI 서브유닛 D; 시토크롬 c 산화효소, 서브유닛 Va; NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 알파 부복합체 10; NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 알파 부복합체 1 ; NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 베타 부복합체 10; 및 숙신산 탈수소효소 복합체, 서브유닛 C의 발현에서 상당한 증가를 나타냈고; 또한 ATP아제 억제 인자 1; ATP아제, H+ 수송 리소솜, VI 서브유닛 H; 및 NADH 탈수소효소(유비퀴논) 1 알파 부복합체 4의 발현을 상당히 감소시켰다.

셀레노메티오닌을 투여한 마우스는 ATP 합성효소 및 시토크롬 c 산화효소 서브유닛 Va의 발현에서 상당한 증가를 나타냈고; 또한 ATP아제 억제 인자 1; ATP아제, H+ 수송 리소솜, VI 서브유닛 H; 및 ATP아제, H+ 수송, VI 서브유닛 A의 발현을 상당히 감소시켰다.

실시예 7

단리된 셀렌 함유 화합물은 미토콘드리아 활성을 조절한다

임의의 복잡한 생물 혼합물에서, 이의 내부에 존재한 분자 군은 부가적으로 작용할 수 없으며; 오히려, 이들은 상승적으로 또는 심지어 길항적으로 작용할 수 있어서 최종 제제의 활성을 조합하는 것이 가능하다. 예를 들어, 본원에서 기재한 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 생물 활성은 셀렌 종/내부 셀렌 함유 화합물의 일부 또는 전부의 효과에 대한 합에 기인할 수 있다.

상기 실시예 1에 기재한 바와 같이, 셀렌 농후 효모의 Se 메타볼롬과 프로테옴을 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다. 실시예 1에서 동정과 특성화가 이전에 알려지지 않았던 Se 함유 화합물(예를 들어, 분자, 대사 물질 및 단백질/펩티드)의 동정과 특성화가 제공된다.

따라서 본원의 실시형태의 개발 중에 실시예 1에서 동정한 특이 셀렌 함유 화합물이 생물 활성(들)을 소유했는지를 알아내기 위해(예를 들어, 셀렌 함유 화합물이 생물 활성을 나타낼 것인 지 및/또는 셀렌 함유 화합물이 효모 세포의 속박물(constraint) 및/또는 다른, 셀렌 비함유, 세포 성분으로부터 단리되고, 정제되면 생물 활성이 더 클(또는 더 적을) 수 있는지를 알아내기 위해) 실험을 수행하였다. 실시예 1에서 셀렌 강화 효모로부터 동정한, 다수의 가장 풍부한 셀렌 함유 화합물과 분자를 합성하거나 얻었다. 실험들 중 한 주안점은 실시예 1에 기재한 바와 같이 셀렌 강화 효모에 존재하는 총 셀렌의 25%까지 구성한 수용성 추출물에 있었다. 수용성 추출물 유래 셀렌 함유 화합물이 대상에 의한 소비와 이의 장관 통과 시 셀렌 강화 효모로부터 유리되고/소화될 첫 번째일 것으로 가정하였다. 또한 상기에 실시예 1에 기재한 바와 같이, 컴퓨터 지원 예측 모델링을 사용하여 셀렌 강화 효모에 존재하는 셀렌 함유 단백질을 동정하였다. 더구나, 실험에서는 소화 효소(예를 들어, 트립신)의 작용에 의해 유리되는 소형의, 셀렌 함유 펩티드를 동정하였다.

분석과 특성화를 위해 셀렌 함유 화합물 중 9개의 패널을 얻었다. 이 패널은 하기 셀렌 함유 화합물을 포함하였다: LVSe-MR(C₁₆H₃₃N₆O₄Se)(#5); LVSe-MR (C₂₂H₄₄N₇O₅Se)(#6); LTGSe-MAFR(C₃₅H₅₉N₁₀O₉Se)(#7); 셀레노글루타티오닌 이합체(C₂₀H₃₂N₆O₁₂Se₂)(#8); 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se)(#9); 글루타밀셀레노시스테인(C₁₆H₂₆N₂₄O₁₀Se₂)(#10); 효모 pH 6.0(#25); (3X) 글루타티온, 산화(시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 얻어짐)(#28); 및 글루타밀시스테엔(시그마 알드리치로부터 얻어짐)(#30).

사용된(및 각각에 대해 임의로 숫자가 부여된) 셀렌 함유 화합물은 다음과 같았다: (#l) L-셀레노시스틴(C₆H₁₂N₂O₄Se₂)를 시그마 알드리치로부터 구입하였으며(Cat# 545996, 순도 97%); (#2) L-셀레노호모시스틴(CgH₁₆N₂O₄Se₂). 합성 반응식과 방법은 다음과 같았다:

교반 하에 -78℃(건조 얼음 아세톤 조)에서 액체 암모니아(80 mL, 60 g) 중 L-(+)-셀레노메티오닌(1.96 g, 10.0 mM)의 용액에, 소편의 금속 나트륨(0.575 g, 25.0 mM)을 용액이 15분 동안 청색으로 유지될 때까지 80분 내에 조심스럽게 첨가하였다. 용액을 -78℃에서 50분 더 교반하였고, 고체 염화암모늄(3.0 g, 56 mM)을 첨가하여 나트륨아미드를 중화시켰다. 반응 혼합물을 공기에 개방하고, 주위 온도까지 밤새 천천히 가열하였다. 얻어진 황색 고체를 100 mL의 물과 혼합하고, pH ~9.0을 1N HCl(6.0 mL)의 첨가에 의해 6.7로 조정하였다. 메탄올(50 mL)을 첨가하고, 혼합물을 기류 하에 오전 9시(04/28/11)부터 오전 9시(04/29/11)까지 세게 교반하였다. 여과에 의해 수집된 담황색 침전물(1.652 g, 91.2% 수율)은 셀레노메티오닌(R_f=0.8) 오염 없이 청정한 셀레노호모시스틴(Rf=0.52)을 구성하였다. TLC: Si0₂:MeOH:H₂O:NH₄OH/18:2:0.2. 5% KMnO₄에 의한 처리 및 가열 후 황색 스폿. MS (M+H⁺) =433. NMR, 400MHz, IN DC1, D₂O에서, δ=0.0ppm (Me₃Si-CD₂CD₂CO₂Na): 5.238 br. S 모든 ND₃ ⁺, 7.13 H/D; 4.259 t, J=6.4Hz, 1H, C-l; 3.058 dt, J=3.2&6.4Hz, 2H, C-3; 2.446 dp, J=6.4&13.6&6.4, 2H, C-2 (광학 활성).

(#3) 메틸셀레노-L-시스테인(C₄H₉NO₂Se)을 시그마 알드리치로부터 염산염으로서 구입하였다(Cat# M6680, 순도 95%). (#4) L-셀레노메티오닌(C₅H₁₁NO₂Se)을 시그마 알드리치로부터 염산염으로서 구입하였다(Cat# S3132, 순도 98%). (#5) VSe-MR(C₁₆H₃₃N₆O₄Se)을 바이오마틱(Biomatik, 미국 델라웨어 주 월밍턴)이 합성하고, 이로부터 얻었다. (#6) LVSe-MR(C₂₂H₄₄N₇O₂Se)을 바이오마틱(미국 델라웨어 주 월밍턴)이 합성하고, 이로부터 얻었다. (#7) LTGSe-MAFR(C₃₅H₅₉N₁₀O₉Se)을 바이오마틱(미국 델라웨어 주 월밍턴)이 합성하고, 이로부터 얻었다.

(#8) 셀레노글루타티온 이합체(C₂₀H₃₂N₆O₁₀Se₂)를 바이오마틱(미국 델라웨어 주 월밍턴)이 합성하고, 이로부터 얻었다. 합성 반응식과 방법은 다음과 같았다:

MOB-셀레노시스테인(665-71)의 합성

셀레노시스틴 3.341 g(10 Mmol)을 10 mL의 0.5N 수산화나트륨(얼음 조, Ar⁰, 30 분, 용액의 황색)에 용해시키고, 이어서 1.35 g(30 Mmol)의 수소화붕소나트륨을 완전 탈색까지 부분 첨가한다. 2N 수산화나트륨(30 mL)을 가한 자석 교반에 의해 반응 혼합물에 첨가하고, 순(neat) p-메톡시벤질 클로라이드 7.831 g(50 Mmol)을 얼음 냉각하면서 첨가한다. 교반, 냉각 및 Ar⁰ 플로를 4 시간 유지한다. 이후 ~7.0 mL의 진한 염산을 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 8.5로 조정한다. 형성되는 백색 침전물을 여과하고, 2x 10 mL 및 5x 10 mL의 에틸에테르로 세척한다. 생성물을 고 진공 하에 P₂O₅ 위에서 20 시간 건조시켜 8.29 g의 비정질 백색 침전물을 얻고, 임의 추가 정제 없이 합성의 다음 단계에서 사용한다.

Boc-Glu(OtBu)-Se(MOB)CysOH(655-72)의 합성

50 mL의 1,4-디옥산 중 6.55 g(16.357 Mmol)의 Boc-Glu(OtBu)-NHS 에스테르의 용액을 자석 교반하면서 12.5 mL의 물과 2.3 mL(16.5 Mmol)의 트리에틸아민의 혼합물 중 4.68 g(16.25 Mmol)의 MOB-셀레노시스테인의 현탁액에 주위 온도(22℃)에서 첨가하고, 효율적인 교반에 의해 50 시간 방치한다. 이후 혼합물을 얼음 조에서 냉각시키고, 8.6 mL의 물과 1.4 mL의 진한 염산의 혼합물을 적가한다. 과량의 용매를 T<25℃에서 진공 회전 증발에 의해 제거하고, 용액을 20 mL의 물(pH 6.5)로 희석하며, 3x 50 mL의 에틸에테르, 3x 50 mL의 에틸아세테이트 및 3x 50 mL의 디클로로메탄으로 추출한다. 용액을 증발 건조시켜 9.2 g의 미정제 생성물을 얻고, 임의 추가 정제 없이 합성의 다음 단계에서 사용한다.

Boc-Glu(OtBu)-Se(MOB)Cys-NHS 에스테르(655-75)의 합성

Boc-Glu(OtBu)-Se(MOB)CysOH 9.2 g(16.0 Mmol), N-히드록시숙신이미드 1.841 g(16.0 Mmol) 및 N,N-디메틸벤질아민 130 μL를 200 mL의 무수 에틸에테르에 용해시킨다/현탁시킨다. 그후 100 mL의 무수 에틸에테르 중 디시클로헥실디카르보이미드 3.404 g(16.5 Mmol)의 용액을 잘 교반하면서 적가 깔때기에 의해(공기 평형으로) 주위 온도(22℃)에서 용액에 첨가한다. 반응물을 교반하면서 24 시간 방치하고, 형성되는 백색 침전물을 여과하고, 3x 20 mL의 무수 에틸에테르로 세척하고, 버린다. 여과액을 농축하여 12.95 g의 황색 점성 오일을 얻고, 임의의 추가 정제 없이 합성의 다음 단계에 사용한다.

완전 보호된 셀레노글루타티온의 합성(반응식 참조, 655-77)

이전 단계로부터 Boc-Glu(OtBu)-Se(MOB)Cys-NHS 에스테르 모두 12.97 g(~16. Mmol), 3.2 g(19.1 Mmol)의 염산글리신-O-tBu 에스테르 및 4.2 mL의 트리에틸아민을 130 mL의 무수 에틸에테르에 용해시키고, 주위 온도(22℃)에서 교반하면서 주말에 방치한다. 형성되는 백색 침전물(트리에틸아민 염산염)을 여과에 의해 분리하였고, 여과기에서 2x 25 mL의 무수 에테르로 세척하였다. 회전 증발기를 사용하여 진공 하에 여과액을 농축하여 12.9 g의 오일을 얻었고, 톨루엔:에틸아세테이트:아세토니트릴(7:2:1)의 용매 혼합물 11 mL로 희석하였고, 400 mL의 동일 용매 혼합물 중 350 mL SiO₂의 현탁액으로부터 제조된 SiO₂ LC 칼럼(50 cm 층)의 상단에 적용하였다. 저 극성 불순물을 처음 500 mL의 용출액에 모았다. 5:2:1 톨루엔:에틸아세테이트:아세토니트릴 500 mL 이어서 동일 혼합물 4:2:1의 400 mL로서 칼럼을 용출함으로써 생성물을 모았다. 4:2:1 용매 혼합물에서 생성물 R_f 0.55. 플레이트를 5% KMnO₄(황색)에 침지시킴으로써 스폿을 드러냈다. 생성물을 함유한 분획을 모두 결합하고, 회전 증발기를 사용하여 진공 하에 농축시키고, 끝으로 고 진공 하에 건조시켜 C₃₁H₄₉N₃O₉Se의 셀레노글루타티온에 대한 계산치와 완전히 일치한 MW=686.7 m/e인 생성물 4.658 g을 수득하였다.

셀레노글루타티온 이합체(655-83)의 합성

이전 단계에서 유성의, LC 정제 생성물을 50 mL의 트리플루오로아세트산과 30 mL의 티오아니솔의 혼합물에 용해시켰다. 얻어진 용액을 교반하고, 60℃로 5 시간 가열하였다. 이후 가스 발생이 중단되었다. 그 후 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반한다. 다음날 아침에 회전 증발을 사용하여 트리플루오로아세트산을 진공 하에 T<37℃에서 제거한다. 유성 잔류물을 ~1.5 mL 부분으로 기계적으로 매우 잘 교반된 400 mL의 무수 에틸에테르로 첨가한다. 상층액을 버리고, 이때 침전물을 4x 50 mL의 무수 에틸에테르 부분으로 세척하고, 끝으로 고 진공 하에 건조시킨다. 얻어진 백색 침전물(3.16 g)을 예비 HPLC에 의해 정제하여 순수한 셀레노글루타티온(MW 594.87) m/e 1.1 g을 수득하였다.

(#9) 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se). 합성 반응식 및 방법은 다음과 같았다:

자석 교반기가 구비되고, 얼음 냉각 조에 위치한, 20 mL의 무수 에틸알코올을 함유한 200 mL 둥근바닥 플라스크에 수소화붕소나트륨(227 mg, 6.0 mM, Ar⁰ 하에)을 넣는다. 냉각, 교반하면서, Ar 플로 하에 주사기로부터 디메틸디셀레나이드(190 μL, 376 mg, 2.0 mM)를 첨가한다. 노르스름한 용액의 탈색 후 고체 5'-클로로-5'데옥시아데노신(1.143 g, 4.0 mM)을 첨가한다. 5-Cl-Ade는 에틸알코올에서 난용성이다. 100 mL의 에틸알코올을 더 첨가하여 침전물을 용해시켰다. 실온에서 혼합물의 교반을 다음 4일간 계속하였다. 전환율을 검측하는데 MS를 사용하였다. 5일 후에 ~75% 전환율이 달성되었다. 용매를 증발시키고, 생성물 3.22 g(SM의 ~20%로서)을 모으고, 역상(C-8) 예비 크로마토그래피에 의해 정제하여 분자량이 질량분석법에 의해 확인된 순수 생성물 1.1 g을 수득하였다.

(#10) 글루타밀셀레노시스테인 이합체(C₁₆H₂₆N₂O₁₀Se₂). 합성 반응식과 방법은 다음과 같았다:

N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OSu(639-37)의 합성

N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OH(2.712 g, 9.0 mM), N-히드록시숙신이미드(1.047 g, 9.1 mM) 및 디시클로헥실 카르보디이미드(1.888 g, 9.15 mM)를 300 mL의 무수 에틸에테르에 현탁시키고/용해시키고, 50 μL의 디메틸에틸벤질아민을 주사기로부터 반응 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 교반을 24 시간 유지하였다. 혼합물을 여과하고, 침전물을 3x 20 mL의 에틸에테르로 세척하였다. 여과액을 농축시키고, 고 진공 하에 건조시켜 백색 결정 생성물(3.6 g, 100% 수율)을 수득하였다. MS (M+Na⁺)= 423.17; NMR 400MHz 바리안(Varian), CDC1₃, ppm: 5.152 2H, d, J=7.6Hz, NH; 4.255 1H, q, J=4.4Hz; 2.838 4H, br s; 2.734 1H, ddd(?) 7 라인; 2.673 1H, ddd(?) 7 라인; 2.272 1H, 옥텟, J=5.2Hz; 2.021 1H, m; 1.478 9H, s; 1.450 9H, s.

N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-L-Secys-OH 이합체(639-39)의 합성

셀레노시스틴(1.5 g, 4.49 mM)을 물(25 mL)에 용해시킨다/현탁시킨다. 혼합물을 자석으로 교반하고, 얼음 조에 냉각시키며, 혼합물에 트리에틸아민(1.324 mL, 0.961 g, 9.5 mM)을 첨가한다. 50 mL의 1.4-디옥산 중 N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OSu(3.6 g, 8.99 mM)의 용액을 제조하고, 교반되고, 냉각된 반응 혼합물에 적가한다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하면서 그대로 둔다. 황색 침전물의 일부를 용액으로부터 분리하고, 걸러냈다. 여과액을 진공 하에 증발시키고, 고 진공 하에 건조시켜 백색 고체(5.388 g)를 수득하였다. 이 물질을 8 mL의 메틸알코올에 용해시키고, 2:1→1:2/AcOEt:MeOH + 0.5% AcOH를 사용하여 SiO₂ 위 크로마토그래피 처리하였다. N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-L-Secys-OH 이합체(1.212 g, KOH/고 진공 건조 후)를 단일 분획으로서 분리하였다(R_f=0.32, 1:1/AcOEt:MeOH + 0.5% AcOH). MS(M+H⁺) =909.11; NMR 400MHz 바리안, DMSO d⁶, ppm: 7.658 1H, d, J=6.4Hz, NH; 7.206 1H, d, J=7.2Hz, NH; 4.20 1H, m; 3.759 1H, m; 3.455 1H, ABX₂의 파트 A; 3.404 ABX₂의 파트 B; 2.18 2H, br pent; 1.877 1H, m; 1.75 1H, m; 1.391 9H, s; 1.379 9H, s.

L-Glu-Secys-OH 이합체(639-46)의 합성

TFA:CH₂Cl₂:티오아니솔:H₂O/47:47:3:3(25 mL)의 혼합물을 실온에서 고체 N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-L-Secys-OH 이합체(1.21 g)에 첨가한다. 얻어진 용액을 3.5 시간 동안 실온에서 교반하고, 물(50 mL)에 붓는다. 물(상부) 층을 분리하고, 5x 50 mL의 에틸에테르로 세척한다. 물 층을 40℃보다 낮은 온도에서 진공 증발시키고, NaOH 펠릿 위에서 고 진공 건조시킨다. L-Glu-Se-Cys-OH 이합체(0.717 g, 99.8% 수율). MS (M+H⁺)=592.92.

(#11) 셀레노아데노실호모시스테인(C₁₄H₂₀N₆O₅Se). 합성 반응식 및 방법은 다음과 같았다:

5'-클로로-5'-데옥시아데노신(639-62)

89 g(0.366 mol, 1 당량)의 아데노신, 59.3 mL(58 g, 1.833 mol, 2 당량)의 무수 피리딘 및 1 L의 무수 아세토니트릴을 적가 깔때기, 교반기, 가스 주입구/출구 및 온도계가 구비된, 오븐 건조 2L 4구 플라스크에 넣는다. 반응 세트를 얼음/염 조에 넣는다. 교반을 개시하고, 용액의 온도가 3℃보다 낮게 떨어질 때 염화티오닐의 매우 느린 첨가를 시작한다(강한 발열). 반응 혼합물의 온도는 염화티오닐 첨가 중에 5℃보다 낮게 그리고 4 시간 더 유지할 필요가 있다(이때 용액은 황색이고, 하부에 있는 침전물은 백황색이다). 그 후 반응을 주위 온도에서 밤새 그대로 둔다. 다음날 아침 소결 유리 여과기를 사용하여 다량의 침전물을 여과시키고, 침전물 색이 백색으로 변화는 동안 3회 100 mL 용량의 건조 아세토니트릴로서 여과기 위에서 세척한다. 그 후 습윤 침전물을 다시 800 mL의 메탄올과 160 mL의 물의 혼합물을 함유한 2L 반응 플라스크로 이동시키고, 여기에 80 mL의 진한 수산화암모늄 용액을 기계적 교반과 수조에 의해 냉각하면서 적가한다. 혼합물을 주위 온도에서 45 분간 교반하고, 형성되는 백색 침전물을 진공 여과에 의해 액체로부터 분리한다. 진공 회전 증발기를 사용하여 여과액을 농축 건조시키고, 이때 침전물을 ~560 mL의 열수로부터 결정화하고, 얼음 수조에서 냉각시키며, 제1 결정 수확물을 여과시키고, 동결 건조한다. 그 후 여과액을 제1 여과액의 회전 증발로부터 얻어진 고체의 결정화에서 용매로서 사용하여 또한 동결 건조되는(2일) 생성물의 제2 수확물을 얻는다. 양쪽 결정 수확물을 끝으로 진공 건조기에서 오산화인 위에 2일간 건조시킨다. 84 g의 백색 결정(80.5% 수율)을 얻는다. MS (286-M+H), mp. 187℃.

셀레노아데노실호모시스테인(655-40)

9.806 g(50 mM, 1 당량)의 L-셀레노메티오닌을 온도계, 대형 냉각 핑거(finger)(출구에 버블 미터(bubble-meter)가 있는), 암모니아 가스 주입구(플라스크 바닥에 도달) 및 자석 교반 바가 구비되고, 2.5L 듀아(duar) 용기 포함 CO₂-아세톤 냉각 조에 넣어진, 2L 3구 플라스크에 충전한다. 아세톤 조와 냉각 핑거로 고체 CO₂를 넣기 전에 Ar⁰를 플라스크에 통과시킨다. 플라스크 내부 온도가 -35℃보다 낮게 떨어질 때 무수 암모니아(가스)의 플로를 시작하고, 액체 암모니아 수준이 800 mL의 용적에 도달할 때 기류를 중단한다. 이때 소편의 금속 나트륨을 용액의 청자색이 ~30 초간 지속될 때까지 잘 교반된 용액에 첨가한다. 총 2.645 g(115 mM, 2.3 당량)의 나트륨을 45 분 내에 첨가한다. 교반과 냉각을 30 분 더 유지한다. 이때 모든 성분은 용액 중에 있다. 14.856 g(52 mM, 1.04 당량)의 무수 5'-클로로-5'-데옥시아데노신을 단일 부분으로 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 교반하면서 매우 느린 Ar⁰ 플로에 의해 방치한다. 다음날 아침(모든 암모니아가 사라지면) 350 mL의 무수 메탄올을 플라스크에 존재하는 백색 고체에 첨가한다. 플라스크를 오일 조에 넣고, 환류 냉각기를 설치하며, Ar⁰ 기류를 유지하고, 오일 조를 후속 24 시간 동안 50℃로 가열한다. 이때 1 mL의 용액을 몇 방울의 0.1N HCl로서 pH 3.5로 산성화하고, 질량 분석법을 사용하여 기질의 존재에 대해 샘플을 분석한다. 이들이 5%보다 적으면 혼합물을 1N HCl로서 pH 3.5로 산성화하고, 염으로부터 여과시키며, 진공 회전 증발기를 사용하여 농축 건조시킬 수 있고, 미정제 생성물을 물 에탄올 혼합물로부터 결정화에 의해 정제할 수 있다. 15.98 g(74% 수율)의 셀레노아데노실호모시스테인 제1 결정 수확물은 ~95% 순수하고, 추가 정제 없이 생물학적 연구에 사용될 수 있다.

(#39) γ-글루타밀-메틸셀레노시스테인(C₉H₁₆N₂O₅Se). 합성 반응식과 방법은 다음과 같았다:

N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OSu(655-90)의 합성

N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OH(303 mg, l.0 Mmol), N-히드록시숙신이미드(121 mg, 1.05 Mmol) 및 디시클로헥실 카르보디이미드(227 mg, 1.1 Mmol)를 15 mL의 무수 에틸에테르에 현탁시키고/용해시키고, 10 μL의 디메틸에틸벤질아민을 주사기로부터 반응 혼합물에 첨가하였다. 주위 온도(22℃)에서 교반을 48 시간 유지하였다. 혼합물을 여과하고, 침전물을 10x 10 mL의 에틸에테르로 세척하였다. 여과액을 농축하고, 고 진공 하에 건조시켜 백색 결정 생성물(570 mg, ~90% 수율)을 수득하였다. MS (M+Na⁺) = 423.17;

N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-MeSe-Cys-OH(655-90)의 합성

N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OSu(570 mg, 0.9 Mmol), 메틸셀레노시스테인(175 mg, 0.8 Mmol), 트리에틸아민(152 mg, 209 μL, 1.5 Mmol)을 6 mL의 1,4-디옥산 및 2 mL의 물의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물의 자석 교반을 100 시간 동안 유지하였다. 이때 1.21N HCl(1.65 mL)을 첨가하고, 반응 후 혼합물을 3x 20 mL의 에틸에테르로 추출하며, 진공 회전 증발기를 사용하여 추출물을 농축 건조시켜 예비 HPLC로 처리되는 649 mg의 왁스 생성물을 수득하였다. 283 mg의 생성물을 모았다(75.6% 수율). 질량 스펙트럼에서는 생성물의 분자량 및 내부에서 단일 Se 원자의 존재를 확인하였다. C₁₈H₃₂N₂O₇Se에 대한 계산된 Ms=468.42; 실측치 469.24 m/e(M+H⁺) 및 491.24 m/e(M+Na⁺).

γ-글루타밀-메틸셀레노시스테인(655-92)의 합성

283 mg(0.6 Mmol)의 N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-MeSe-Cys-OH, 2mL의 티오아니솔 및 5 mL의 트리플루오로아세트산의 혼합물을 오일 조에서 자석 교반하면서 6 시간 동안 및 63℃에서 가열하였고, 밤새 주위 온도(22℃)에서 방치하였다. 이때 반응 혼합물을 세게 교반한 에틸에테르(20 mL)에 첨가하였다(한 방울씩). 형성된 침전물을 2x 20 mL의 에틸에테르로 세척하여 138.3 mg의 크림상 침전물을 수득한 다음 예비 HPLC에 의해 정제하였다.

(#25) 비 셀렌 강화 효모의 추출물은 미국특허출원 공개 제20120164234A1에 기재된 바와 같이 pH 6.0에서 제조하였다. (#28) (3X) 글루타티온은 산화되었다. 시그마 알드리치로부터 얻었다.

(#30) 글루타밀시스테인. 시그마 알드리치로부터 얻었다.

셀렌 함유 화합물은 하기 도 40 및 표 7에서 숫자에 의해 확인된다.

개별 셀렌 함유 화합물이 미토콘드리아 생체 에너지 요법에 대해 만약 있다면 어떤 잠재적인 효과가 있는지를 결정하기 위해, 분리된 미토콘드리아를 사용하여 셀렌 함유 화합물을 직접 시험하였다. a) 미토콘드리아가 연조직, 예컨대 뇌로부터 분리될 수 있다는 용이성 및 b) 뇌 조직이 글루코오스와 산소에 대해 수요가 크다는 사실을 포함하여, 다수의 이유로 쥐의 뇌로부터 분리된 미토콘드리아를 이 목적으로 선택하였다.

실험을 다음과 같이 수행하였다: 저(50 ppb), 중간(500 ppb) 및 고(1 ppm)로부터 범위인 다양한 농도의 셀렌 함유 화합물을 시험하였다. 중간 범위에서 미토콘드리아에 대해 관찰될 수 없는 독성을 기초로, 일차 결과 판정법으로서 미토콘드리아 생체 에너지 요법을 사용하여 스크리닝/활성 검사를 수행하기 위해 농도 500 ppb(5 μM)를 사용하였다. 성체 쥐 뇌 피콜(ficoll) 정제 미토콘드리아를 분리하고, 시호스 바이오사이언시스(Seahorse Biosciences) 플럭스 분석기로 적재하기 전에 37C에서 30 분간 개별 셀렌 함유 화합물에 의해 세 차례 배양하였다. ATP 합성(상태 III), 복합체 I 의존(NADH 구동) 최대 호흡 용량(상태 V _FCCP) 및 복합체 II(FADH 구동) 의존 최대 호흡 용량(상태 V_succ)를 포함하는 3개 호흡 상태에서 OCR(산소 소비 속도) 파라미터를 측정하였다. 해마 검사를 기재된 바와 같이 실시하였다(예를 들어, Sauerbeck et al, J Neurosci Methods. 2011 May 15; 198(1): 36-43; Seahorse XF, Seahorse Bioscience Inc 참조).

미토콘드리아 생체 에너지 요법 결과를 도 40에 제공한다. 9종 화합물 중 2종(셀렌 함유 펩티드 LVSe-MR(C₂₂H₄₄N₇O₅Se)(#6) 및 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se) (#9))은 3 상태의 호흡 모두에서 양의 증가 및 증가한 미토콘드리아 생체 에너지 요법 프로파일을 나타냈다는 것이 관찰되었다(도 40a 참조, 셀렌 함유 화합물 없이 배양한 동일 수의 분리된 미토콘드리아를 대조로서 사용하였다). 특히, LVSe-MR(C₂₂H₄₄N₇O₅Se)은 대조와 비교하여 상태 III(10.3%), 상태 V_FCCP(21.2%) 및 상태 V_succ(7.6%)를 증가시켰다. 메틸셀레노아데노신은 대조와 비교하여 상태 III(17.3%), 상태 V_FCCP(15.6%) 및 상태 V_succ(25%)를 증가시켰다.

옥시섬(oxytherm)(클라크형 전극)을 사용하여 셀렌 함유 펩티드 LVSe-MR(C₂₂H₄₄N₇O₅Se)(#6) 및 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se)(#9)의 생물 활성을 분석하였다(예를 들어, Chance and Williams, J Biol Chem, 1955, 217, 383-393; Sullivan et al, J. Bioenerg. Biomembr. 36, 353-356 참조). 옥시섬 분석은 미토콘드리아 및 세포 흡수를 포함하여 광범위한 응용 분야에 걸쳐 산소 흡수 또는 발생 측정 결과의 결정을 가능하게 한다. 이러한 실험을 위해, 옥시섬 챔버에 주입 전에 30분간 LVSe-MR(C₂₂H₄₄N₇O₅Se) 또는 메틸셀레노아데노신(500 ppb) 또는 이들의 각 대조에 대해 상응하는 균등 농축물(각각, LVMR 및 메틸티오아데노신)에 의해 60 ㎍의 미토콘드리아 단백질을 동시 배양하였다. 미토콘드리아 활성(미토콘드리아 단백질의 nmolsO₂/min/mg에서 % 변화로서 관찰된 미토콘드리아 호흡 속도로서 측정되고, 표시된)을 각 화합물의 존재 하에 측정하였다. 도 40b에 나타낸 바와 같이, 셀렌 함유 펩티드 LVSe-MR은 대조와 비교하여 상태 III(7.7%), 상태 V_FCCP(13.3%) 및 상태 V_succ(9.6%)를 증가시켰다. 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se)(#9)은 대조와 비교하여 상태 III(29.9%), 상태 V_FCCP(17.3%) 및 상태 V_succ(15.3%)를 증가시켰다.

따라서 본원은 셀렌 함유 화합물(예를 들어, LVSe-MR(C₂₂H₄₄N₇O₅Se), 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se), 및 상기 실시예 1에서 확인된 다른 화합물) 및 미토콘드리아 활성/생체 에너지 요법을 조절하는데 있어서 대상(예를 들어, 이를 필요로 하는 대상(예를 들어, 2형 당뇨병 대상))에서 사용하기 위한 이를 포함하는 조성물을 제공한다.

본원의 실시형태의 개발 중에 생성된 데이터와 정보는 유일하고, 전례가 없는 결과이다. 특히, 본원은 미토콘드리아 기능장해 또는 부전(예를 들어, 당뇨병(예를 들어, II형 당뇨병), 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병성 심근병증, 등에 관련된)에 대한 신규 조성물 및 치료 방법(예를 들어, 예방적 및/또는 치료적 요법)을 제공한다.

[표 7] 미토콘드리아 생체 에너지 요법에 대한 셀렌 함유 화합물 효과(쥐 뇌 정제 미토콘드리아 5 ㎍/웰))

또 다른 놀랄만한 결과는 특정 셀렌 함유 화합물(예를 들어, LVSe-MR(C₂₂H₄₄N₇O₅Se)(#6) 및 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se)(#9))는 미토콘드리아에 의해 배양될 때 미토콘드리아 활성 향상 특성이 있지만, 이는 동정되고, 특성화된 다수의 다른 셀렌 함유 화합물에 대해 그렇지 않았다는 사실이었다. 예를 들어, 표 7에 제시한 바와 같이, 셀렌 함유 화합물 중 3종(예를 들어, LTGSe-MAFR(C₃₅H₅₉N₁₀O₉Se)(#7); 글루타밀셀레노시스테인(C₁₆H₂₆N₂₄O₁₀Se₂)(#10); 효모 pH 6.0(#25))은 시호스(Seahorse) 기구를 사용하여 평가했을 때 미토콘드리아 활성에 대해 부정적 영향을 나타냈다.

특히, 전체 구조에서 일부 유사성을 공유하는 일부 셀렌 함유 화합물이 미토콘드리아 활성의 활성화에 관해 대단히 상이한 결과를 나타냈다고 알아내는 것은 놀라운 일이었다. 예를 들어, 글루타밀셀레노시스테인(C₁₆H₂₆N₂₄O₁₀Se₂)(#10)은 비록 그 전체 구조가 ATP 합성을 17.3% 증가시킨 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se)(#9)과 유사하고/크게 다르지 않더라도 ATP 합성(상태 III)을 거의 19% 감소시켰으며; 이는 셀렌 강화 효모에 존재하는 이들 2종의 셀렌 함유 화합물 사이에 미토콘드리아 활성에 대한 작용에서 36% 초과 변동폭이다(표 7 참조). 따라서 일부 실시형태에서, 본원은 결합하여 바람직한, 특이 미토콘드리아 활성 향상 능력을 생성하는 2 이상의 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 셀렌 강화 효모의 수용성 분획, 셀렌 강화 효모의 수 불용성 분획, 셀렌 강화 효모에 존재하고/하거나 이로부터 유도되는 셀렌 함유 화합물)을 포함하는 조성물을 제공한다.

실시예 8

2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모에 존재한 단리된 셀렌 함유 화합물은 피루브산 탈수소효소 효소 복합체 활성 및 미토콘드리아 복합체 I 활성을 상당히 증가시킨다

본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험에서는 단리될 때 에너지 대사를 확실히 조절할 수 있는 생물 확성을 나타내는(예를 들어, 미토콘드리아 호흡 및/또는 미토콘드리아 ATP 생성을 증가시키는)(실시예 1과 7 참조), 셀렌 강화 효모에 존재한 셀렌 함유 화합물을 발견하였고, 특성화하였다(예를 들어, 미토콘드리아 생체 에너지 요법을 사용하여). 예를 들어, 그리고 본원에서 기재한 바와 같이, 셀렌 함유 화합물 LVSe-MR(C₂₂H₄₄N₇O₅Se)(#6) 및 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se)(#9)은 둘 다 500 ppb의 농도에서 미토콘드리아 생체 에너지 요법 프로파일을 상당히 증가시킬 수 있었다.

따라서 미토콘드리아 활성을 변경하는, 셀렌 강화 효모로부터 단리되고/되거나 이로부터 유도된 셀렌 함유 화합물의 능력을 추가로 특성화하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 추가 실험을 수행하였다. 예를 들어, 메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se)(#9)을 사용한 추가 실험을 하기에 기재한다.

피루브산 탈수소효소 복합체(PDHC) 활성 및 미토콘드리아 복합체 I 활성을 측정하기 위해, 피콜 기울기 방법을 사용하여 성체 SD 쥐로부터 피질 미토콘드리아를 분리하였다. 메틸셀레노아데노신을 4개 농도 범위(0, 50, 500 및 1000 PPB)에서 시험하였다. 96 웰 형광 플레이트 리더(plate reader)에서 표준 기술을 사용하여 100 μL 측정 장치에서 미토콘드리아(60 ㎍ 미토콘드리아 단백질/웰)와 함께 개별 화합물의 동시 배양으로서 모든 시험을 3회 수행하였다.

메틸셀레노아데노신(C₁₁H₁₅N₅O₃Se)(#9), 또는 대조 화합물 메틸티오아데노신(#31)의 0, 50, 500, 및 1000 십억당부(PPB)의 존재 하에 미토콘드리아 효소 활성을 도 41에 도시한다. 화합물 #9(0-1000 PPB)는 농도에 따라, 메틸셀레노아데노신 부재 하에 PDHC 효소 활성이 없는 것과 비교하여 PDHC 효소 활성을 ~30-57% 상당히 향상시켰다(1000 PPB의 농도에서 p<0.05). 복합체 IV 효소 활성에서 변화는 시험 농도에서 검측되지 않았다. 메틸티오아데노신은 PDHC, 복합체 I 또는 복합체 IV 활성을 변경하지 않았다.

이들 실험은 메틸셀레노아데노신이 미토콘드리아 복합체 I과 PDHC 활성을 증가시켰다는 것을 입증하였다. 따라서 일부 실시형태에서 본원은 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 실시예 1에서 동정된)을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원은 대상에서 PDHC 효소 활성을 증가시키고/시키거나 미토콘드리아 복합체 I 활성을 증가시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상(예를 들어, II형 당뇨병 대상)에게 미토콘드리아 복합체 I 및/또는 PDHC 활성을 증가시키는(예를 들어, 이로써 대상(예를 들어, 골격근 및/또는 간에서)에서 미토콘드리아 호흡을 증가시키는) 셀렌 함유 화합물(예를 들어, 실시예 1에 기재한)을 포함하는 조성물(예를 들어, 약학 조성물)의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

실시예 9

2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모에 존재한 단리된 셀렌 함유 화합물은 항산화능과 미토콘드리아 활성을 상당히 증가시킨다

본원의 실시형태의 개발 중에 수행한 실험에서는 셀렌 강화 효모 내에 존재하거나 이로부터 유도된 특정의, 단리된 셀렌 함유 화합물이 미토콘드리아 활성(예를 들어, ATP 생성 증가, 미토콘드리아 복합체 I 활성 및/또는 PDHC 활성 증가)을 향상시켰다는 것을 알아냈다(실시예 1, 6-8 참조). 따라서 본원에서 개시하고, 기재한 셀렌 함유 화합물을 추가로 특성화하기 위해(예를 들어, 만약 있다면 화합물의 생물 활성(예를 들어, 자극 활성, 억제 활성, 상승 활성, 길항 활성, 등)을 확인하기 위해(예를 들어, 미토콘드리아 활성에 대해 바람직한 효과를 나타내는 셀렌 함유 화합물을 동정하기 위해)) 추가 실험을 수행하였다.

본원의 셀렌 함유 화합물 중 일부가 미토콘드리아 복합체 I의 활성을 향상시키는 능력을 나타냈다는 사실로 인해, 미토콘드리아 자극이 셀렌 함유 화합물에 의해 유해 반응성 산소 종(ROS)의 제거를 통해 일어날 수 있는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 따라서 셀렌 함유 화합물의 항산화능을 평가하기 위해 본원의 실시형태의 개발 중에 실험을 수행하였다.

따라서 항산화능을 지닌/나타낸 본원의 셀렌 함유 화합물을 동정하는데 키트 베이스 항산화 시험(산소 라디칼 흡수능(ORAC))을 사용하였다. 사용된 ORAC 시험 키트(BioTek, 미국 버몬트 주)에서, 트롤록스(Trolox)의 항산화 특성이 다양한 물질의 항산화 능력이 관련되는 표준이다. 따라서 ORAC 결과는 트롤록스 검정 곡선과 비교로부터 계산된 트롤록스 당량(TE, Trolox Equivalent)으로서 흔히 언급된다. 수행한 시험에서, 케르세틴(Quercetin)(공지된 강력한 항산화제)은 내부 참조 기준으로서 포함되었다.

간략하게는, 제조사의 설명서에 따라, 트롤록스 시험 키트를 사용하여 셀렌 함유 화합물의 샘플(예를 들어, 실시예 1에서 동정한)을 분석하였다. 화합물을 단독으로 또는 조합하여(0.05 내지 5 μM 범위 농도에서) 시험하여 잠재적인 상승작용, 길항작용 또는 순수 상가효과에 대해 조사하였다. 대표적인 결과를 표 8에 제시한다.

다양한 셀렌 함유 화합물의 항산화 활성

화합물	TE 값	케르세틴 TE	이론 상가효과	상승작용 비 실험치/이론치
#3 L-메틸셀레노시스테인	1.075	6.451	4.014	1.72
#26 셀레노아데노실호모시스테인	2.939
#3 + #26	6.899
#9 메틸셀레노아데노신	0.722	3.87	1.95	1.2
#4 셀레노메티오닌	1.228
#9 + #4	2.332
#26 셀레노아데노실호모시스테인	2.012	3.222	2.961	-1.14
#39 감마 글루타밀메틸시스테인	0.949
#26 + #39	2.592

표 8에서 데이터가 나타내듯이, 셀렌 함유 화합물의 일부는 항산화 능력(예를 들어, 양의 TE 값)을 지니는/나타내는 것이 발견되었다. 더구나, 셀렌 함유 화합물의 일부는 부가적이거나 약간 상승적인(예를 들어, #9 및 #4 조합하여); 약간 길항적인(#26 및 #39 조합하여) 또는 상승적인(#3 및 #26 조합하여) 항산화 능력을 지닌다/나타낸다(예를 들어, 산소 라디칼 포집 능력 면에서). #3 및 #26의 조합 경우에, 이들 화합물의 효과가 바로 부가적이었던 것보다 증가가 대략 70% 더 컸다.

본원에서 언급된 모든 공보와 특허를 본원에서 참조로서 원용한다. 본원의 기재한 방법과 조성물에 대한 다양한 변형과 변화는 본원의 범위 및 정신을 벗어나지 않고서 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본원이 바람직한 특정 실시형태에 관해 기재되었지만, 본원은 당연히 이러한 특정 실시형태로 지나치게 한정되지 않는다. 실제로, 통상의 기술자에게 명백한, 본원을 실시하기 위한 기재된 모드의 다양한 변형은 하기 청구범위 내에 속하는 것으로 의도된다.

Claims (16)

1. 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 유효량의 셀렌 강화 효모(selenium enriched yeast)를 포함하는, 대상에서 근감소증, 근육 단백질 손실 및 심근병증의 치료를 위해 근육 세포의 단백질 함량을 증가시키는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 셀렌 강화 효모는 무기 셀렌 염을 함유하는 배지에서 배양되는 임의의 효모이고, 상기 조성물의 유효량은 근육 세포에서 단백질의 양을 증가시키는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 2% 이하의 무기 셀렌을 포함하는 셀렌 강화 효모의 유효량이 하루에 대상당 25∼800 ㎍의 셀렌인 조성물.
3. 단리된 5' 메틸셀레노아데노신, LVSe-MR, 셀레노아데노실 호모시스테인, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 미토콘드리아 기능장해와 관련된 질병 또는 상태의 치료를 위해 대상의 세포에서 미토콘드리아 기능을 증가시키는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 유효량은 조성물에 노출되지 않은 세포와 비교할 때 세포에서 미토콘드리아 기능을 증가시키며, 상기 질병 또는 상태는 암, 심혈관 질환과 심부전, 2형 당뇨병, 알츠하이머병과 파킨슨병, 지방간 질환, 백내장, 골다공증, 근육 위축(muscle wasting), 수면장해, 건선, 관절염 및 대장염으로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 건조된 형태 또는 캡슐 형태인 조성물.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 경구 투여되는 것인 조성물.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 부형제 또는 담체를 포함하는 것인 조성물.
7. 제1항에 있어서, 대상이 근감소증을 갖는 것인 조성물.
8. 메틸 셀레노 아데노신, 셀레노(히드록실)-셀레노펜-(3'-데옥시-아데노신), N-아세틸시스테인-셀레노호모시스테인, 알릴셀레노아데노실 호모시스테인, 셀레노-아데노실 호모시스테인, 셀레노-히드록시 아데노실 호모시스테인, 셀레노 아데노신, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀레녹시드, 아데노실-히드록시 셀레녹시드, 에틸 셀레노아데노신, 셀레노-(히드록시)-셀레노펜-(3'-데스옥시-아데노신), LVSe-MR, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 단리된 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 미토콘드리아 기능장해와 관련된 질병 또는 상태의 치료를 위해 대상의 세포에서 미토콘드리아 기능을 증가시키는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 질병 또는 상태는 암, 심혈관 질환과 심부전, 2형 당뇨병, 알츠하이머병과 파킨슨병, 지방간 질환, 백내장, 골다공증, 근육 위축, 수면장해, 건선, 관절염 및 대장염에서 선택되는 조성물.
9. 제8항에 있어서, 메틸셀레노아데노신, LVSe-MR, 셀레노아데노실 호모시스테인, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 단리된 화합물을 포함하는 것인 조성물.
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