CN116948961A - 一种白细胞提取物、抗皱紧致面霜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种白细胞提取物、抗皱紧致面霜及其制备方法。所述白细胞提取物的制备方法包括以下步骤：采集：采集产后马或驴脐带血；分离：对脐带血进行离心处理，得到白细胞层上清液；病毒检测：对白细胞层上清液进行RT‑PCR荧光和/或PCR荧光定量检测病毒;微生物检测：对白细胞层上清液进行内毒素和细菌培养检测微生物；提取：对病毒检测和微生物检测合格的白细胞层上清液进行离心处理，提取得到白细胞提取物。本发明以动物脐带血为原料，分离生产出白细胞提取物，然后添加到含有透皮成分的面霜基础液里制备成富含多种生长和细胞因子的白细胞提取物抗皱紧致面霜。

Description

一种白细胞提取物、抗皱紧致面霜及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术、美容抗衰技术领域，尤其是涉及一种白细胞提取物、抗皱紧致面霜及其制备方法。

背景技术

白细胞是一类无色有核的血细胞，根据其形态、功能和来源部位可以分为粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。通常，机体受到侵犯和损伤时会刺激白细胞分泌细胞因子。细胞因子是一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，通过结合相应受体调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。白细胞提取物是从白细胞中提取的一种混合物，其中包含许多生物活性分子，如细胞因子、生长因子、蛋白质、核酸等。

由于白细胞提取物中富含多种生长因子、细胞因子和免疫因子等，因此具有了许多生物学效应而得到广泛应用，如：1. 抗炎作用：白细胞提取物中含有多种细胞因子和生长因子，这些因子可以调节免疫反应和减轻炎症反应。2. 促进细胞增殖和修复：白细胞提取物中的生长因子可以促进细胞增殖和修复，有助于治疗损伤和疾病。3. 抗氧化作用：白细胞提取物中的抗氧化物质可以减少细胞氧化应激，有助于保护细胞免受自由基的损害。4. 抗衰老作用：白细胞提取物中的成分可以延缓皮肤细胞老化，有助于保持皮肤的健康和年轻。

近年来，有人开始尝试在美容护肤品中添加白细胞提取物而应用到美业中用以对付随年龄增长而发生的皮肤衰老。由于白细胞提取物含有多种生长因子和细胞因子等，当在美容护肤品中添加了白细胞提取物后，这些产品就可通过调节新细胞的再生对衰老皮肤进行修复，而从根本上解决因衰老发生的皱纹、松弛、损伤等多种问题，这也是目前市场上大多数护肤品都难以企及的。

虽然白细胞提取物有如此强大的作用，但应用到护肤品时需要渗透到皮肤深层起作用。本发明首次除了选用不受限制的动物脐带血白细胞提取物外，还在护肤霜中还添加了透皮成分以协助白细胞提取物渗透进入皮肤而最大化地发挥作用。白细胞提取物中富含多种生长和细胞因子，这些因子可用于修复衰老、损伤和炎性的组织，达到消炎和促进再生的作用。用于面部美容可刺激衰老的皮肤组织再生而达到年轻化的美容效果，也可用于问题皮肤的修复。但制备人白细胞提取物，需要采集人血，因此人源白细胞提取物的利用受到伦理和产量的限制。

CN114191373A公开了一种快速简单的从脐带血中提取白细胞提取物的方法，包括如下步骤：S1、人脐带血的采集；S2、对步骤S1获取的脐带血进行离心处理，获取白膜层上清液，即含白细胞层的脐带血血浆，对血浆进行冷冻保存；S3、解冻步骤S2中冷冻的血浆，并进行传染病抗体检测、病毒RT-PCR荧光或PCR荧光定量检测；S4、对血浆中的内毒素进行检测；S5、对步骤S3、S4检测都合格的血浆进行离心处理，并在离心后进行抽滤，最后冷冻保存。该方法为从需要采集人血制备人白细胞提取物，产量较少。

CN108567719A公开了一种白细胞提取物的制备方法，直接以新生儿脐带血为原料，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心得到PBMC细胞，并通过脐带血中分离的脐带血浆扩增培养，然后离心分离得到上清液。该发明的方法制备的白细胞提取物，含有丰富的天然人细胞因子。但其通过脐带血中分离的脐带血浆扩增培养，扩增培养后的已经不是原白细胞。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种白细胞提取物的制备方法，所述白细胞提取物的制备方法选用的白细胞提取物源于动物脐带血，因此可解决产量和伦理限制问题而实现可规模化生产。

本发明的目的之二在于提供一种由上述方法制备得到的白细胞提取物，以动物脐带血为原料，分离生产出白细胞提取物，富含更多的生长和细胞因子，且具有极强的抗皱和修复效果。

本发明的目的之三在于一种所述白细胞提取物在制备化妆品中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种抗皱紧致面霜，所述抗皱紧致面霜添加上述方法制备得到的动物白细胞提取物，选取具有细胞损伤修功能的白细胞提取物为主要活性成分的同时，还有效合理地选用了能够增进细胞新陈代谢提高机体防御机能的皮肤调理剂，从而进一步提高面霜的抗皱紧致、促进细胞生长，加快伤口愈合的能力。

本发明的目的之五在于一种抗皱紧致面霜的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将所述抗皱紧致面霜中的各水溶性成分混合，得到水相；将所述抗皱紧致面霜中的各油溶性成分混合，得到油相；将水相和油相混合进行乳化，得到乳化液；将乳化液和所述白细胞提取物混合，得到所述的抗皱紧致面霜。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种白细胞提取物的制备方法，所述白细胞提取物的制备方法包括以下步骤：

采集：采集产后马或驴脐带血；

分离：对脐带血进行离心处理，得到白细胞层上清液；

病毒检测：对白细胞层上清液进行RT-PCR荧光和/或PCR荧光定量检测病毒;

微生物检测：对白细胞层上清液进行内毒素和细菌培养检测微生物；

提取：对病毒检测和微生物检测合格的白细胞层上清液进行离心处理，提取得到白细胞提取物。

在本发明中，首次选用动物脐带血为原料，经过检测确认无传染病和微生物污染后，从中分离提取获得动物白细胞提取物，该动物白细胞提取物制备方富含多种生长和细胞因子，这些因子可用于修复衰老、损伤和炎性的组织，达到消炎和促进再生的作用。此外，本发明选用的白细胞提取物源于动物脐带血，因此可解决产量和伦理限制问题而实现可规模化生产。

优选地，所述分离中离心处理的参数为：离心力为300-600 g，例如可以是300 g、350 g、400 g、450 g、500 g、550 g、600 g等，离心的时间为10-20 min，例如可以是10 min、12 min、15 min、16 min、18 min、20 min等。

优选地，所述白细胞层上清液需在-85℃～-75℃（例如可以是-85℃、-92℃、-80℃、-78℃、-75℃等）的温度条件下冷冻保存。

优选地，所述病毒包括甲1型马流行性感冒病毒、2型马流行性感冒病毒、马传染性贫血病毒、马疱疹病毒、马动脉炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、东西部马脑髓炎病毒、口蹄疫病毒和非洲马瘟病毒。

优选地，所述内毒素检测采用内毒素鲎试法；所述细菌培养检测采用琼脂平板培养法。

优选地，所述合格的白细胞层上清液的标准为：PCR检测均为阴性，内毒素检测低于0.125 EU/mL，细菌检测无检出。

所述提取中离心处理的参数为：离心力为4500-5500 g，例如可以是4500 g、4600g、4800 g、5000 g、5200 g、5500 g等，离心的时间为25-30 min，例如可以是25 min、26min、28 min、30 min等。

所述离心处理上清液需依次经过0.45 μm和0.1 μm的滤膜进行抽滤。

所述白细胞提取物需在-85℃～-75℃（例如可以是-85℃、-92℃、-80℃、-78℃、-75℃等）的温度条件下冷冻保存。

第二方面，本发明提供一种白细胞提取物，所述白细胞提取物由第一方面所述白细胞提取物的制备方法制备得到。

第三方面，本发明提供一种如第二方面所述白细胞提取物在制备化妆品中的应用。

第四方面，本发明提供一种抗皱紧致面霜，所述抗皱紧致面霜包括：第二方面所述白细胞提取物。

优选地，所述抗皱紧致面霜还包括：溶剂、保湿剂、皮肤调理剂、乳化剂、增稠剂、螯合剂、填充剂、防腐剂、香料中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述溶剂包括水相溶剂和油相溶剂。

优选地，所述水相溶剂包括水。

优选地，所述油相溶剂包括辛酸/癸酸甘油三酯。

优选地，所述保湿剂包括丁二醇、丙二醇、甘油或透明质酸钠中的任意一种或至少两种的组合，优选为丁二醇、丙二醇、甘油和透明质酸钠。

在本发明中，所述紧致面霜在添加动物白细胞提取物的同时，还添加了多种保湿剂成分，协同增效，从而改善皮肤水合程度，减少经皮水分流失，减少皮肤细纹，改善皮肤粗糙。

优选地，所述皮肤调理剂包括烟酰胺、卵磷脂、尿囊素、库拉索芦荟叶提取物、角鲨烷、牛油果树果脂、澳洲坚果籽油、生育酚乙酸酯、红没药醇或阿魏酸乙基己酯中的任意一种或至少两种的组合，优选为烟酰胺、卵磷脂、尿囊素、库拉索芦荟叶提取物、角鲨烷、牛油果树果脂、澳洲坚果籽油、生育酚乙酸酯、红没药醇和阿魏酸乙基己酯的组合。

在本发明中，选取具有细胞损伤修功能的白细胞提取物为主要活性成分的同时，还有效合理地选用了能够增进细胞新陈代谢提高机体防御机能的角鲨烷、皮肤营养成分烟酰胺、含有丰富的不饱和脂肪酸、蛋白质、矿质元素及多种维生素等的牛油果油、具有促进细胞生长，加快伤口愈合，软化角质等生理功能的尿囊素、抗癌消炎的红没药醇、具有吸收紫外线和防止氧化并抑制黑色素生成的阿魏酸、具有保湿、抑菌消炎的芦荟提取物、皮肤营养成分澳洲坚果籽油、促进细胞生长的野大豆籽提取物、抗氧化维生素E衍生物。

在本发明中，所述紧致面霜在添加动物白细胞提取物的同时，还添加了多种皮肤调理剂成分，多种成分协同增效，进一步修复皮肤中受损的胶原纤维和弹性纤维，修护皮肤弹性，促进细胞生长，加快伤口愈合，实现抗皱的功效。

优选地，所述乳化剂包括丙烯酸类共聚物钠、环五聚二甲基硅氧烷、鲸蜡硬脂醇、PEG-100硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯或鲸蜡硬脂基葡糖苷中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述增稠剂包括卡波姆。

优选地，所述螯合剂包括EDTA二钠。

优选地，所述填充剂包括麦芽糊精。

优选地，所述防腐剂包括苯氧乙醇、羟苯甲酯、羟苯乙酯或乙基己基甘油中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述pH调节剂包括三乙醇胺。

优选地，所述抗皱紧致面霜包括：第二方面所述白细胞提取物、任选的水相溶剂、任选的油相溶剂、任选的保湿剂、任选的皮肤调理剂、任选的乳化剂、任选的增稠剂、任选的螯合剂、任选的填充剂、任选的防腐剂、任选的pH调节剂、任选的香料。

优选地，所述抗皱紧致面霜包括：第二方面所述白细胞提取物、水相溶剂、油相溶剂、保湿剂、皮肤调理剂、乳化剂、增稠剂、螯合剂、填充剂、防腐剂、香料。

优选地，所述抗皱紧致面霜按重量份数计包括如下组分：第二方面所述白细胞提取物0.1-0.5份、水相溶剂30-80份、油相溶剂3-10份、保湿剂1-20份、皮肤调理剂0.1-10份、乳化剂0.1-10份、增稠剂0.1-1份、螯合剂0-0.1份、填充剂0-0.1份、防腐剂0-1份、pH调节剂0-1份、香料0-0.1份。

所述抗皱紧致面霜中，白细胞提取物的含量为0.1-0.5份，例如可以是0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份等。

所述抗皱紧致面霜中，水相溶剂的含量为30-80份，例如可以是30份、40份、50份、60份、70份、80份等。

所述抗皱紧致面霜中，油相溶剂的含量为3-10份，例如可以是3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份等。

所述抗皱紧致面霜中，保湿剂的含量为1-20份，例如可以是1份、2份、4份、6份、8份、10份、12份、14份、16份、18份、20份等。

所述抗皱紧致面霜中，皮肤调理剂的含量为0.1-10份，例如可以是0.1份、1份、2份、4份、6份、8份、10份等。

所述抗皱紧致面霜中，乳化剂的含量为0.1-10份，例如可以是0.1份、1份、2份、4份、6份、8份、10份等。

所述抗皱紧致面霜中，增稠剂的含量为0.1-1份，例如可以是0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份、1份等。

所述抗皱紧致面霜中，螯合剂的含量为0-0.1份，例如可以是0份、0.001份、0.005份、0.01份、0.05份、0.1份等。

所述抗皱紧致面霜中，填充剂的含量为0-0.1，例如可以是0份、0.001份、0.005份、0.01份、0.05份、0.1份等。

所述抗皱紧致面霜中，防腐剂的含量为0-1，例如可以是0份、0.001份、0.01份、0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份、1份等。

所述抗皱紧致面霜中，pH调节剂的含量为0-1，例如可以是0份、0.001份、0.01份、0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份、1份等。

所述抗皱紧致面霜中，香料的含量为0-0.1，例如可以是0份、0.001份、0.005份、0.01份、0.05份、0.1份等。

优选地，所述抗皱紧致面霜按重量份数计包括如下组分：

A组分：水30-80份、丁二醇5-8份、甘油1-5份、烟酰胺1-5份、丙烯酸类共聚物钠0.5-1份、卵磷脂0.1-0.5份、野大豆籽提取物0.1-0.5份、卡波姆0.1-0.5份、尿囊素0.1-0.3份、库拉索芦荟叶提取物0.01-0.05份、麦芽糊精0.01-0.05份、EDTA二钠0.01-0.05份、透明质酸钠0.01-1份。

所述A组分中，水的含量为30-80份，例如可以是30份、40份、50份、60份、70份、80份等。

所述A组分中，丁二醇的含量为5-8份，例如可以是5份、5.5份、6份、6.5份、7份、7.5份、8份等。

所述A组分中，甘油的含量为1-5份，例如可以是1份、2份、3份、4份、5份等。

所述A组分中，烟酰胺的含量为1-5份，例如可以是1份、2份、3份、4份、5份等。

所述A组分中，丙烯酸类共聚物钠的含量为0.5-1份，例如可以是0.5份、0.6份、0.7份、0.8份、0.9份、1份等。

所述A组分中，卵磷脂的含量为0.1-0.5份，例如可以是0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份等。

所述A组分中，野大豆籽提取物的含量为0.1-0.5份，例如可以是0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份等。

所述A组分中，卡波姆的含量为0.1-0.5份，例如可以是0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份等。

所述A组分中，尿囊素的含量为0.1-0.3份，例如可以是0.1份、0.15份、0.2份、0.25份、0.3份等。

所述A组分中，库拉索芦荟叶提取物的含量为0.01-0.05份，例如可以是0.01份、0.02份、0.03份、0.04份、0.05份。

所述A组分中，麦芽糊精的含量为0.01-0.05份，例如可以是0.01份、0.02份、0.03份、0.04份、0.05份。

所述A组分中，EDTA二钠的含量为0.01-0.05份，例如可以是0.01份、0.02份、0.03份、0.04份、0.05份。

所述A组分中，透明质酸钠的含量为0.01-1份，例如可以是0.01份、0.05份、0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份、1份等。

B组分：辛酸/癸酸甘油三酯3-10份、角鲨烷1-5份、环五聚二甲基硅氧烷1-3份、牛油果树果脂1-5份、鲸蜡硬脂醇1-5份、PEG-100硬脂酸酯0.2-0.5份、甘油硬脂酸酯0.2-0.5份、鲸蜡硬脂基葡糖苷0.1-0.5份、澳洲坚果籽油0.1-1份、生育酚乙酸酯0.5-1份、红没药醇0.1-0.3份、阿魏酸乙基己酯0.05-0.1份、丙二醇0.001-0.01份。

所述B组分中，辛酸/癸酸甘油三酯的含量为3-10份，例如可以是3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份等。

所述B组分中，角鲨烷的含量为1-5份，例如可以是1份、2份、3份、4份、5份等。

所述B组分中，环五聚二甲基硅氧烷的含量为1-3份，例如可以是1份、1.5份、2份、2.5份、3份等。

所述B组分中，牛油果树果的含量为1-5份，例如可以是1份、2份、3份、4份、5份等。

所述B组分中，鲸蜡硬脂醇的含量为1-5份，例如可以是1份、2份、3份、4份、5份等。

所述B组分中，PEG-100硬脂酸酯的含量为0.2-0.5份，例如可以是0.2份、0.3份、0.4份、0.5份等。

所述B组分中，甘油硬脂酸酯0.2-0.5份，例如可以是0.2份、0.3份、0.4份、0.5份等。

所述B组分中，鲸蜡硬脂基葡糖苷的含量为0.1-0.5份，例如可以是0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份等。

所述B组分中，澳洲坚果籽油的含量为0.1-1份，例如可以是0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份、0.6份、0.8份、1份等。

所述B组分中，生育酚乙酸酯的含量为0.5-1份，例如可以是0.5份、0.6份、0.7份、0.8份、0.9份、1份等。

所述B组分中，红没药醇的含量为0.1-0.3份，例如可以是0.1份、0.15份、0.2份、0.25份、0.3份等。

所述B组分中，阿魏酸乙基己酯的含量为0.05-0.1份，例如可以是0.05份、0.06份、0.07份、0.08份、0.09份、0.1份等。

所述B组分中，丙二醇的含量为0.001-0.01份，例如可以是0.001份、0.002份、0.004份、0.006份、0.008份、0.01份等。

C组分：苯氧乙醇0.1-1份、羟苯甲酯0.01-0.1份、羟苯乙酯0.01-0.1份、乙基己基甘油0.01-0.1份、三乙醇胺0.1-0.5份、所述白细胞提取物0.1-0.5份、香料0.01-0.05份。

所述C组分中，苯氧乙醇的含量为0.1-1份，例如可以是0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份、0.6份、0.8份、1份等。

所述C组分中，羟苯甲酯的含量为0.01-0.1份，例如可以是0.01份、0.02份、0.04份、0.06份、0.08份、0.1份等。

所述C组分中，羟苯乙酯的含量为0.01-0.1份，例如可以是0.01份、0.02份、0.04份、0.06份、0.08份、0.1份等。

所述C组分中，乙基己基甘油的含量为0.01-0.1份，例如可以是0.01份、0.02份、0.04份、0.06份、0.08份、0.1份等。

所述C组分中，三乙醇胺的含量为0.1-0.5份，例如可以是0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份等。

所述C组分中，白细胞提取物的含量为0.1-0.5份，例如可以是0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份等。

所述C组分中，香料的含量为0.01-0.05份，例如可以是0.01份、0.02份、0.03份、0.04份、0.05份等。

第五方面，本发明提供一种第四方面所述的抗皱紧致面霜的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

将所述抗皱紧致面霜中的各水溶性成分混合，得到水相；将所述抗皱紧致面霜中的各油溶性成分混合，得到油相；

将水相和油相混合进行乳化，得到乳化液；

将乳化液和所述白细胞提取物混合，得到所述的抗皱紧致面霜。

优选地，所述抗皱紧致面霜的制备方法包括以下步骤：

S1 将所述抗皱紧致面霜中A组分混合，得到水相；将所述抗皱紧致面霜中的B组分混合，得到油相；

S2 将水相和油相混合进行乳化，得到乳化液；

S3 将乳化液降温后和C组分中除白细胞提取物外的其他成分混合；

S4 将S3得到的混合液和所述白细胞提取物混合，得到所述抗皱紧致面霜。

优选地，所述水相的混合温度、油相的混合温度各自独立地为60-80℃，例如可以是60℃、65℃、70℃、75℃、80℃等。

优选地，所述乳化的温度为60-80℃，例如可以是60℃、65℃、70℃、75℃、80℃等。

优选地，乳化液降温至45℃以下，例如可以是45℃、40℃、35℃、30℃、25℃等。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明首次选用动物脐带血为原料，经过检测确认无传染病和微生物污染后，从中分离提取获得动物白细胞提取物，该动物白细胞提取物制备方富含多种生长和细胞因子，这些因子可用于修复衰老、损伤和炎性的组织，达到消炎和促进再生的作用。此外，本发明选用的白细胞提取物源于动物脐带血，因此可解决产量和伦理限制问题而实现可规模化生产；

（2）本发明提供一种抗皱紧致面霜，在选取具有细胞损伤修功能的白细胞提取物为主要活性成分的同时，还有效合理地选用了能够增进细胞新陈代谢提高机体防御机能的皮肤调理剂，从而进一步提高面霜的抗皱紧致、促进细胞生长，加快伤口愈合的能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为使用应用例1制备的抗皱紧致面霜修复手臂晒伤效果对比图。

图2为使用应用例1制备的抗皱紧致面霜修复颈部晒伤效果对比图。

图3为使用应用例1制备的抗皱紧致面霜修复肌肤的点阵激光损伤效果对比图。

具体实施方式

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。

实施例1

本实施例提供一种白细胞提取物的制备方法，所述白细胞提取物的制备方法包括以下步骤：

（1）采集产后马脐带血，室温运送到实验室；

（2）离心分离含白细胞层上清，并置于-80℃冰箱冷冻保存；

离心处理的参数为：离心力为300 g，离心的时间为10 min；

（3）RT-PCR荧光或PCR荧光定量检测马流行性感冒病毒（甲1型和2型）、马传染性贫血病毒、马疱疹病毒、马动脉炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、东西部马脑髓炎病毒、口蹄疫病毒、非洲马瘟病毒；

（4）通过内毒素和细菌培养检测微生物污染；所述内毒素检测采用内毒素鲎试法；所述细菌培养检测采用琼脂平板培养法；

（5）解冻没有污染的白细胞上清，分离提取白细胞提取物；

所述没有污染的白细胞层上清液的标准为：PCR检测均为阴性，内毒素检测低于0.125 EU/mL，细菌检测无检出；

所述离心处理的参数为：离心力为5000 g，离心的时间为28 min；

（6）将离心处理得到的上清液经过0.45 μm和0.1 μm抽滤除菌后，于-80℃长期保存备用。

实施例2

本实施例提供一种白细胞提取物的制备方法，所述白细胞提取物的制备方法包括以下步骤：

（1）采集产后驴脐带血，室温运送到实验室；

（2）离心分离含白细胞层上清，并置于-80℃冰箱冷冻保存；

离心处理的参数为：离心力为350 g，离心的时间为15 min；

（3）RT-PCR荧光或PCR荧光定量检测马流行性感冒病毒（甲1型和2型）、马传染性贫血病毒、马疱疹病毒、马动脉炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、东西部马脑髓炎病毒、口蹄疫病毒、非洲马瘟病毒；

（4）通过内毒素和细菌培养检测微生物污染；所述内毒素检测采用内毒素鲎试法；所述细菌培养检测采用琼脂平板培养法；

（5）解冻没有污染的白细胞上清，分离提取白细胞提取物；

所述没有污染的白细胞层上清液的标准为：PCR检测均为阴性，内毒素检测低于0.125 EU/mL，细菌检测无检出；

所述离心处理的参数为：离心力为5000 g，离心的时间为28 min；

（6）将离心处理得到的上清液经过0.45 μm和0.1 μm抽滤除菌后，于-80℃长期保存备用。

测试例1

弹性蛋白酶抑制率测试

测试样品：实施例1-2提供的白细胞提取物、阳性对照组黄岑素；

将实验样品均稀释成5%的水溶液于96孔盘中，在依序加入弹力受质溶液及弹力蛋白酶。混合均匀后，静至于室温20 min，通过405 nm处的吸亮度测量，每个测定采三重复进行；

弹性蛋白酶抑制率(%)＝(1-C-D/A-B)×100；

A:有弹性蛋白酶，无样品、B:无弹性蛋白酶，有样品、C:有弹性蛋白酶，无样品、D:无弹性蛋白酶，有样品；

具体测试结果如表1所示：

表1

由表1测试结果可知，本发明方法提取得到的动物白细胞提取物5%的水溶液的弹性蛋白酶抑制率高达66.67%以上，显著抑制弹性蛋白酶活性，防止弹性蛋白纤维分解，具有很好的抗皱紧致功效。

应用例1

本应用例提供一种抗皱紧致面霜，所述抗皱紧致面霜按质量百分含量包括如下组分：

所述抗皱紧致面霜的制备方法包括以下步骤：

S1 将所述抗皱紧致面霜中A组分在70℃下混合，得到水相；将所述抗皱紧致面霜中的B组分在75℃下混合，得到油相；

S2 将水相和油相混合在80℃进行乳化，得到乳化液；

S3 将乳化液降温至45℃以下后和C组分中除白细胞提取物外的其他成分混合；

S4 将S3得到的混合液和所述白细胞提取物混合，得到所述抗皱紧致面霜。

应用例2

本应用例提供一种抗皱紧致面霜，所述抗皱紧致面霜按质量百分含量包括如下组分：

所述抗皱紧致面霜的制备方法包括以下步骤：

S1 将所述抗皱紧致面霜中A组分在70℃下混合，得到水相；将所述抗皱紧致面霜中的B组分在75℃下混合，得到油相；

S2 将水相和油相混合在80℃进行乳化，得到乳化液；

S3 将乳化液降温至45℃以下后和C组分中除白细胞提取物外的其他成分混合；

S4 将S3得到的混合液和所述白细胞提取物混合，得到所述抗皱紧致面霜。

应用例3

本应用例提供一种抗皱紧致面霜，与应用例1的区别仅在于，不添加角鲨烷，牛油果树果脂含量增至4%、澳洲坚果籽油含量增至1.5%，其他组分含量及制备方法与应用例1完全相同。

应用例4

本应用例提供一种抗皱紧致面霜，与应用例1的区别仅在于，不添加牛油果树果脂，角鲨烷含量增至3%、澳洲坚果籽油含量增至2.5%，其他组分含量及制备方法与应用例1完全相同。

应用例5

本应用例提供一种抗皱紧致面霜，与应用例1的区别仅在于，不添加野大豆籽提取物，库拉索芦荟叶提取物含量增至0.4%，其他组分含量及制备方法与应用例1完全相同。

应用例6

本应用例提供一种抗皱紧致面霜，与应用例1的区别仅在于，不添加库拉索芦荟叶提取物，野大豆籽提取物含量增至0.4%，其他组分含量及制备方法与应用例1完全相同。

应用例7

本应用例提供一种抗皱紧致面霜，与应用例1的区别仅在于，不添加烟酰胺，阿魏酸乙基己酯含量增至2.5%，其他组分含量及制备方法与应用例1完全相同。

应用例8

本应用例提供一种抗皱紧致面霜，与应用例1的区别仅在于，不添加阿魏酸乙基己酯，烟酰胺含量增至0.5%，其他组分含量及制备方法与应用例1完全相同。

应用例9

本应用例提供一种抗皱紧致面霜，与应用例1的区别仅在于，将卵磷脂替换为等质量胆固醇，其他组分含量及制备方法与应用例1完全相同。

应用例10

本应用例提供一种抗皱紧致面霜，与应用例1的区别仅在于，将尿囊素替换为等质量泛醇，其他组分含量及制备方法与应用例1完全相同。

对比应用例1

本对比应用例提供一种抗皱紧致面霜，与应用例1的区别仅在于，不添加实施例1提供的白细胞提取物，其他组分含量及制备方法与应用例1完全相同。

对比应用例2

本对比应用例提供一种抗皱紧致面霜，与应用例1的区别仅在于，不添加市售的白细胞提取物，其他组分含量及制备方法与应用例1完全相同。

测试例2

化妆品安全性测试

测试样品：应用例1提供的抗皱紧致面霜；

测试标准：

（1）理化检验：按照《化妆品安全技术规范》（2015年版）化妆品安全性评价结果方法进行，检测结果见表2；

表2

（2）微生物检验：按照《化妆品安全技术规范》（2015年版）化妆品安全性评价结果方法进行，检测结果见表3；

表3

（3）农药残留检测：检测方法参考GB/T 5009.19-2008第一法，检测结果见表4；

表4

（4）化妆品安全性评估，依据QB/T 1857-2013《润肤膏霜》、《化妆品安全技术规范》（2015年版）进行。评估结果见图见表5；

表5

测试例3

抗皱测试

测试样品：应用例1-10提供的抗皱紧致面霜、对比应用例1-2提供的面霜；

测试标准：根据GDJY-TD1501-2022 化妆品抗皱、紧致功效评价----弹性蛋白酶抑制试验进行；

具体测试结果如表6所示：

表6

由表6测试数据可知，本发明提供一种抗皱紧致面霜，在选取具有细胞损伤修功能的白细胞提取物为主要活性成分的同时，还有效合理地选用了能够增进细胞新陈代谢提高机体防御机能的皮肤调理剂，从而进一步提高面霜的抗皱紧致的能力。

测试例4

临床测试

测试方法：（1）肤弹性变化测试：

测试样品：应用例1-10提供的抗皱紧致面霜、对比应用例1-2提供的面霜；

选取志愿者，男女比例各占一半，随机分组，志愿者每日早、晚洁面后在眼部肌肤涂抹祛皱组合物，连续使用1个月，通过皮肤测试仪(MC750，德国CK)测定皮肤弹性；每个数据测试三次，取平均值后，计算每组平均值，保留小数点后两位，按照如下公式计算皮肤弹性变化值：

皮肤弹性变化值＝使用后1个月皮肤弹性参数-使用前皮肤弹性参数；

具体测试结果如表7所示：

表7

由表7测试数据可知，本发明所述抗皱紧致面霜具有优异的抗皱效果，在选取具有细胞损伤修功能的白细胞提取物为主要活性成分的同时，还有效合理地选用了能够增进细胞新陈代谢提高机体防御机能的皮肤调理剂，从而进一步提高面霜的抗皱紧致、促进细胞生长，加快伤口愈合的能力。

（2）修复损伤测试

测试样品：应用例1提供的抗皱紧致面霜；

图1为使用应用例1制备的抗皱紧致面霜修复手臂晒伤效果对比图，如图1所示，志愿者手臂存在较大晒伤区域，而刚涂覆本申请应用例1制备的抗皱紧致面霜后（第0天）晒伤区域就得到明显缓解，只需要1天手臂晒伤基本完全修复，基本无红色斑伤、或黑色暗沉，手臂白皙；而未使用应用例1制备的抗皱紧致面霜的手臂，志愿者手臂存在较大晒伤区域。

图2为使用应用例1制备的抗皱紧致面霜修复颈部晒伤效果对比图，如图2所示，志愿者颈部存在较大晒伤区域，而刚涂覆本申请应用例1制备的抗皱紧致面霜后（第0天）晒伤区域就得到明显缓解，只需要1天颈部晒伤基本完全修复。

图3为使用应用例1制备的抗皱紧致面霜修复肌肤的点阵激光损伤效果对比图。点阵激光的损伤包括1、色素沉着；2、灼伤；3、瘢痕形成；患者肌肤出现严重的大面积红肿和烧灼感的症状；而刚涂覆本申请应用例1制备的抗皱紧致面霜后（第0天）受伤区域就能得到缓解，只需要3天肌肤受伤区域就得到了极大的缓解。

综上所述，添加本发明所述白细胞提取物得到的面霜，能显著增强皮肤的抗损伤能力，显著增强肌肤的修复能力，有助于维持皮肤细胞组织正常的机能；用于修复激光灼伤、热灼伤(如水烫伤、火烫伤等)、冷灼伤、外伤皮肤物理化学性损伤的修复，也可以快速缓解和修复皮肤的过敏、红、肿、脱皮、瘙痒等。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种白细胞提取物的制备方法，其特征在于，所述白细胞提取物的制备方法包括以下步骤：

采集：采集产后马或驴脐带血；

分离：对脐带血进行离心处理，得到白细胞层上清液；

病毒检测：对白细胞层上清液进行RT-PCR荧光和/或PCR荧光定量检测病毒;

微生物检测：对白细胞层上清液进行内毒素和细菌培养检测微生物；

提取：对病毒检测和微生物检测合格的白细胞层上清液进行离心处理，提取得到白细胞提取物。

2. 根据权利要求1所述的白细胞提取物的制备方法，其特征在于，所述分离中离心处理的参数为：离心力为300-600 g，离心的时间为10-20 min；

且所述白细胞层上清液需在-85℃～-75℃的温度条件下冷冻保存。

3.根据权利要求1所述的白细胞提取物的制备方法，其特征在于，所述病毒包括甲1型马流行性感冒病毒、2型马流行性感冒病毒、马传染性贫血病毒、马疱疹病毒、马动脉炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、东西部马脑髓炎病毒、口蹄疫病毒和非洲马瘟病毒。

4.根据权利要求1所述的白细胞提取物的制备方法，其特征在于，所述内毒素检测采用内毒素鲎试法；所述细菌培养检测采用琼脂平板培养法。

5. 根据权利要求1所述的白细胞提取物的制备方法，其特征在于，所述合格的白细胞层上清液的标准为：PCR检测均为阴性，内毒素检测低于0.125 EU/mL，细菌检测无检出；

所述提取中离心处理的参数为：离心力为4500-5500 g，离心的时间为25-30 min；

所述离心处理上清液需依次经过0.45 μm和0.1 μm的滤膜进行过滤；

所述白细胞提取物需在-85℃～-75℃的温度条件下冷冻保存。

6.一种白细胞提取物，其特征在于，所述白细胞提取物由权利要求1-5中任一项所述白细胞提取物的制备方法制备得到。

7.一种根据权利要求6所述的白细胞提取物在制备化妆品中的应用。

8.一种抗皱紧致面霜，其特征在于，所述抗皱紧致面霜包括：权利要求6所述白细胞提取物、水相溶剂、油相溶剂、保湿剂、皮肤调理剂、乳化剂、增稠剂、螯合剂、填充剂、防腐剂、pH调节剂、香料。

9.根据权利要求8所述的抗皱紧致面霜，其特征在于，所述抗皱紧致面霜按重量份数计包括如下组分：

A组分：水30-80份、丁二醇5-8份、甘油1-5份、烟酰胺1-5份、丙烯酸类共聚物钠0.5-1份、卵磷脂0.1-0.5份、野大豆籽提取物0.1-0.5份、卡波姆0.1-0.5份、尿囊素0.1-0.3份、库拉索芦荟叶提取物0.01-0.05份、麦芽糊精0.01-0.05份、EDTA二钠0.01-0.05份、透明质酸钠0.01-1份；

B组分：辛酸/癸酸甘油三酯3-10份、角鲨烷1-5份、环五聚二甲基硅氧烷1-3份、牛油果树果脂1-5份、鲸蜡硬脂醇1-5份、PEG-100硬脂酸酯0.2-0.5份、甘油硬脂酸酯0.2-0.5份、鲸蜡硬脂基葡糖苷0.1-0.5份、澳洲坚果籽油0.1-1份、生育酚乙酸酯0.5-1份、红没药醇0.1-0.3份、阿魏酸乙基己酯0.05-0.1份、丙二醇0.001-0.01份；

C组分：苯氧乙醇0.1-1份、羟苯甲酯0.01-0.1份、羟苯乙酯0.01-0.1份、乙基己基甘油0.01-0.1份、三乙醇胺0.1-0.5份、权利要求6所述白细胞提取物0.1-0.5份、香料0.01-0.05份。

10.一种根据权利要求8或9所述的抗皱紧致面霜的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

将所述抗皱紧致面霜中的各水溶性成分混合，得到水相；将所述抗皱紧致面霜中的各油溶性成分混合，得到油相；

将水相和油相混合进行乳化，得到乳化液；

将乳化液和所述白细胞提取物混合，得到所述的抗皱紧致面霜。