CN114075292A - 一种抗人kl-6蛋白单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗人KL‑6蛋白单克隆抗体的制备方法，使用免疫法制备特异性识别血浆蛋白的KL‑6的单克隆抗体。使用本发明的抗人KL‑6蛋白单克隆抗体的制备方法，成功的生产了高活性、高质量的KL‑6蛋白抗体，且本发明的制备方法简单、高效、成本低。

Description

一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明具体涉及一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法。
背景技术
KL-6对判断Ⅱ型肺泡上皮细胞的功能具有特异性。若肺部基底膜的损害，可致血管通透性增加，使KL-6入血。血清中KL-6可反映肺泡损伤，II型肺泡细胞再生和多种间质性肺疾病的活动度。KL-6水平能敏感地反映肺泡上皮和间质的损伤程度。近年的多项研究报道了KL-6高水平表达可能与间质性肺疾病、急性肺损伤、放射性肺炎、病毒性肺炎、药物相关性间质性肺炎、肿瘤等疾病相关联,其作用可能是促进成纤维细胞增殖和迁徙,从而影响纤维化的发生和发展。
目前，传统的生产抗体的方法已经相当成熟且在大多数情况下非常有效，但是对血浆中的这些糖蛋白抗体的产生，传统的方法往往存在一定的不足，因为具有天然糖基化修饰的蛋白难以获得，而且糖蛋白的抗原一般都不强，原核表达的蛋白不具有糖基化的修饰，免疫出的抗体往往不能很好的识别血液中的糖蛋白。糖蛋白抗体的生产通常可以通过富集和纯化生物体内的天然糖蛋白作为抗原，采用传统的抗体生产方法进行抗体制备。但是这样不仅工序复杂，而且所需要的血清很难大量获得且含量很低，这对于纯化的糖蛋白并不合适。而且更重要的是，经过一系列的纯化过程可能会对糖蛋白造成影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明第一方面提供一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：使用免疫法制备能够特异性识别血浆蛋白的KL-6的单克隆抗体。
优选地，其将带有外源目的基因的稳定细胞株与弗氏完全佐剂混合后，对小鼠进行免疫，待效价≥20000后，将多肽与弗氏完全佐剂混合后，对小鼠进行免疫加强。
进一步优选地，所述外源基因为C端融合有GFP基因的人KL-6基因。
更为优选地，所述的人KL-6基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
更为优选地，所述的人KL-6基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
优选地，所述的带有外源目的基因的稳定细胞株通过将所述外源基因瞬时转染CHO细胞制得。
进一步优选地，所述瞬时转染为电击转染，转染条件为电压150～170V,时间20～30ms，电压为方形波电压。
进一步优选地，在所述瞬时转染46～52小时后进行小鼠免疫。
本发明第二方面提供一种所述的制备方法制得的能够特异性识别血浆蛋白的KL-6的单克隆抗体在试剂盒中的应用。
本发明中，使用的CHO细胞为上皮贴壁型细胞，具有不死性，可以传代百代以上。另外，CHO属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利，哺乳动物细胞表达可形成有活性的二聚体，具有糖基化的功能，是表达复杂生物大分子的理想宿主。
本发明对标签蛋白绿色荧光蛋白GFP的引入同时考虑到三个方面的因素：1.由于GFP基因是融合在KL-6基因的C端，并不会对蛋白的分泌有所影响。2.在整个转染、感染和筛选的过程中，在荧光显微镜下可以直接观测到绿的荧光，可以免除了细胞裂解后进行的表达确认检测。3.作为一种载体蛋白，GFP可以增加肌体对糖蛋白的免疫，类似于多肽交联于BSA蛋白产生的作用。
本发明使用瞬转后培养48h后进行免疫小鼠，因为在转染后48h细胞的表达量达到最高，增加抗体的产生。在效价达到20000的时候，采用多肽来进行免疫位点强化，加强区域的免疫应答。通过转染细胞免疫后进行配合肽位点的强化，极大的提高了免疫效率和免疫应答，使抗体的迅速上升但不会降低抗体的质量，是一种节约大量成本且极大提高免疫效率的方法。
本发明人以KL-6为例，建立了一套真核表达糖蛋白，并结合多肽来进行免疫位点强化的高效免疫体系，以获得高活性和高质量、低成本的抗体。将外源的糖蛋白基因与GFP融合之后在CHO细胞中通过瞬时转染表达，并将转染后的细胞用于小鼠免疫，在后续的免疫中加入多肽来进行免疫位点的强化，最后选取阳性血清老鼠，进行融合，通过多次筛选，获得高质量、高亲和性的抗体，该抗体可以特异性识别外源糖蛋白的。此方法与传统生产单克隆抗体的方法具有非常明显的优势，因为瞬间过程简单，并获得具有正确的糖基化修饰的蛋白，也解决了糖蛋白富集和难以纯化的难题。我们使用该方法成功的生产了KL-6的抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
使用本发明的抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法，成功的生产了高活性、高质量的KL-6蛋白抗体，且本发明的制备方法简单、高效、成本低。
附图说明
附图1：本发明的KL-6-GFP质粒电瞬转染CHO细胞后的荧光显微镜图；
具体实施方式
下面结合具体的相关实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。但是所描述的实施例仅为本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在未做出创造性的劳动前提下所获得的所有其它实施例都属于本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法。如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
稳定表达并分泌KL-6蛋白的细胞株的构建
根据已公布的人KL-6的基因进行真核密码子优化后全序列合成KL-6(24-224aa)-GFP(SEQ ID NO：1)基因，将KL-6(24-224aa)-GFP基因连接到质粒pcDNA3.1上，选用的酶切位点是Hind III和Bam HI，化学转化感受态细胞Ecoli DH5α，挑单克隆提取质粒进行测序，验证序列无误。
使用天根质粒大量抽提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP117)对KL-6-GFP质粒进行大量抽提，过程如下：取100ml(过夜培养的菌液加入离心管，室温下8,000rpm(～8,228×g)离心3min收集细菌，尽量吸除上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml裂解液，向离心管中加入8ml溶液中和液，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8,000rpm(～8,228×g)离心5-10min，使白色沉淀离至管底，向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇来沉淀DNA，通过吸附柱吸附，再洗涤吸附柱后将KL-6-GFP质粒洗脱。
将上述提取好的KL-6-GFP质粒，按照每1000万细胞数量的量和10ug DNA的比例进行电击转染CHO细胞，电击转染条件为电压165v时间25ms，方形波，电击一次。电击后细胞立即进行培养8小时后进行更换培养基，因为电转染容易导致细胞的死亡和大量细胞碎片，所以需要更换培养基。在培养48h后在4摄氏度下，2000rpm离心收集细胞，即单克隆稳定株细胞。
图1为KL-6-GFP质粒电瞬转染CHO细胞后的单克隆稳定株细胞荧光显微照片，图1显示单克隆稳定株细胞已经成功表达融合蛋白。
实施例2
抗人KL-6单克隆抗体制备
将收集的单克隆稳定株细胞经PBS洗涤三次后，用无血清的培养基重悬，进行细胞计数。按照等体积的比例将10万个细胞与弗氏完全佐剂反复吹打几次，混匀。混匀后的混合物经注射器注射到小鼠脾脏侧腰窝处的皮下。以后，每隔7天在小鼠腹部皮下注射弗氏完全佐剂进行免疫加强。
一个月后，通过尾部取血，对血液中的抗血清进行细胞ELISA检测，过程如下：将处于对数生长期的细胞弃培养基，用预热(37℃)的PBS洗涤一次，弃去后烘干，烘箱温度不能超过60℃。4％多聚甲醛每孔100ul，室温固定30min，弃多聚甲醛，烘干，PBST洗涤2次，烘干。滴加0.1％曲拉通，静置10-15min，PBST洗3遍，待其室温后，0.25％的胰酶修复，每孔100ul，室温15min，弃胰酶，PBST洗3遍。1％干酪素封闭，每孔200μL，37℃封闭1小时，吸去干酪素，扣干。加酶标一抗1:1000的稀释血清，每孔100ul反应37℃，1h。PBST洗三遍或者自来水冲洗3遍并敲干。加对应的二抗，用PBST(1：1000)稀释，每孔100ul，37℃，1h。PBST洗五遍或者自来水冲洗5遍并敲干。同时观察细胞脱落情况。加显色底物，每孔100uL，37℃，显色10min终止液终止反应每孔100ul终止液，酶联免疫检测仪450nm波长下读数。ELISA检测结果见表1。
表1
1 2 3 4 5 6 7 8
1.322 1.102 0.963 0.77 0.564 0.44 0.394 0.314 KL-6-GFP
1.272 1.169 0.97 0.726 0.553 0.434 0.359 0.324 KL-6-GFP
0.315 0.234 0.204 0.202 0.162 0.17 0.176 0.166 GFP
0.317 0.245 0.207 0.193 0.171 0.165 0.178 0.16 GFP
表1显示读数呈梯度减小，说明注射了单克隆细胞株的小鼠血清中已经可以产生抗KL-6(1-200bp)蛋白单克隆抗体。并通过ELISA检测效价，当待其效价达到1:20000后使用多肽(SEQ ID NO：3)混合弗氏完全佐剂反复吹打几次，混匀来进行第五次免疫。
制备杂交瘤细胞：免疫效价达到1:100000后，采用现有常规B淋巴细胞杂交瘤技术，将第五次免疫后的小鼠的脾脏细胞与同种系小鼠的骨髓细胞SP2/0进行融合，融合后的细胞用甲基纤维素半固定培养基培养，经HAT进行筛选，挑出500个单克隆细胞在96孔板中继续培养，对单克隆细胞的培养基的上清进行ELISA筛选，得到的阳性克隆细胞，注射小鼠产生腹水，然后进行冻存。
具体实验过程如下：无菌取脾：D-Hank’s液洗一次，脾脏研磨后过细胞筛转移到15ml离心管中1000rpm离心3-5min，取沉淀细胞用冻存液重悬冻存。弃SP2/0细胞培养瓶中上清，加D-Hank’s液收集处于对数生长期的SP2/0细胞，1000rpm 5min离心后弃上清，用手弹50ml离心管底部，并加45ml D-Hank’s成SP2/0悬液。将冻存或刚制备的脾细胞加至上述SP2/0悬液中(SP2/0：脾细胞＝1：5-10)充分混匀，1000rpm离心5min。弃尽上清用手弹离心管底部，使细胞分散。
加1ml PEG4000至混合细胞中，先缓慢逐滴加至离心管并不断慢慢转动离心管，再稍微加快滴速。然后静置1.5min，立即加D-Hank’s至45ml。1000rpm离心5min后，迅速颠倒离心管弃上清，用吸管将细胞团吹散后，再加D-Hank’s至45ml，颠倒混匀，1000rpm离心5min。弃上清用吸管将细胞吹散，再加含10％小牛血清的HAT1640培养基分散至预先制备feeder的96孔板中，每孔加100ul。细胞融合后7-8天开始给细胞换HT1640培养基，后面检测细胞时仍用HT培养基培养细胞，不能立即更换为1640培养基，细胞需要逐步适应。
杂交瘤亚克隆筛选：克隆前一天用小鼠制备饲养细胞，用含有10％的HT PRMI-1640培养基培养，铺到96孔板中，每孔100ul。将阳性中的融合细胞从96孔板中吸出来计数，取出100个细胞。将100个细胞悬于10ml培养液中，将细胞悬液铺到准备好的含有饲养细胞的96孔板中，每孔100ul。在第10天左右，可见细胞克隆形成后，细胞ELISA检测，筛选到的阳性克隆细胞，注射小鼠产生腹水，然后进行冻存。
ELISA检测过程如下：将处于对数生长期的细胞弃培养基，用预热(37℃)的PBS洗涤一次，弃去后烘干，烘箱温度不能超过60℃。4％多聚甲醛每孔100ul，室温固定30min，弃多聚甲醛，烘干，PBST洗涤2次，烘干。滴加0.1％曲拉通，静置10-15min，PBST洗3遍，待其室温后，0.25％的胰酶修复，每孔100ul，室温15min，弃胰酶，PBST洗3遍。1％干酪素封闭，每孔200μL，37℃封闭1小时，吸去干酪素，扣干。加酶标一抗1:1000的稀释血清，每孔100ul反应37℃，1h。PBST洗三遍或者自来水冲洗3遍并敲干。加对应的二抗，用PBST(1：1000)稀释，每孔100ul，37℃，1h。PBST洗五遍或者自来水冲洗5遍并敲干。同时观察细胞脱落情况。加显色底物，每孔100uL，37℃，显色10min终止液终止反应每孔100ul终止液，酶联免疫检测仪450nm波长下读数。
实施例3
单克隆抗体的纯化：
从液氮罐中迅速取出冻存管；迅速放入水浴锅中快速搅动，使冻存液在2分钟内全部融化成液体。用75％酒精擦拭冻存管。往15mL离心管中加入3mL血清培养基，将冻存液吸入离心管，1500转/分钟，离心5分钟。弃上清，用完全培养基悬起细胞，培养于6孔板或瓶中，6孔板中培养基为3mL，第二天换液，再补足3mL；培养瓶培养基为5mL。对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起；计数大约5X 105/mL悬浮的细胞腹腔注射小鼠。一般7-10天后便可开始收集腹水，每隔2、3天可重复取，最终可收集I-10mL/只，每次取出的腹水以4000转，10分钟离心，中间层为腹水，小心吸出腹水收集于离心管中，4℃保存。
将腹水在4℃条件下，10000转离心10分钟，去除脂类物质。离心后吸取上清，过0.22um膜去除腹水的可见杂质，纯化单克隆抗体。用5-10柱体积的缓冲液平衡protein-A柱子后上样，再用5倍柱体积的缓冲液洗柱，在收集管中加入2倍柱体积洗脱缓冲液洗脱抗体，得到纯度高的单克隆抗体。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 张家港博泽利斯生物技术有限公司
<120> 一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
ggtgtctggt gcgctagtca cgccgtgggc gggtggggct gtgctgccag gggctggcct 60
agtatcggga gcggaggtga cgccatgggc agggggagct gtggagcctg gagctggtct 120
tgtgtcgggt gcggatgtga ctccgtgtgc gggaggagcg gtgctcccag gtgcgggtct 180
agtgtcagga gcgctggtca ctccatgtgc tgggggtgca gtggaccctg gtgcaggtct 240
ggtatcaggg gcggaggtca ccccatgagc aggtggtgcg gtggagcctg gggcaggttt 300
attgtctggg gcgcttgtga catcatgggc tggaggggta gtgcttccca gtgcgggcct 360
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ggaggacctc tgtgtggcgg aagtttcttt ctcgccgcct ggtgtggagc tagcgtggcc 600
gct 603
<210> 2
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala
1 5 10 15
Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser
20 25 30
Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser
35 40 45
Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln Asp Val Thr Ser Val Pro Val
65 70 75 80
Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr Pro Pro Ala His Asp Val Thr
85 90 95
Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala
100 105 110
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
115 120 125
Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala
130 135 140
Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp
145 150 155 160
Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr
165 170 175
Ser Ala Pro Asp Thr
180
<210> 3
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
Cys Gly Gly Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly Gly Glu Lys Glu Thr
1 5 10 15
Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser Thr Glu Lys Asn Ala
20 25 30
Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Gly
35 40 45
Ser Ser Thr Thr Gln Gly
50

Claims (10)

1.一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：使用免疫法制备能够特异性识别血浆蛋白的KL-6的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：其将带有外源目的基因的稳定细胞株与弗氏完全佐剂混合后，对小鼠进行免疫，待效价≥20000后，将多肽与弗氏完全佐剂混合后，对小鼠进行免疫加强。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述外源基因为C端融合有GFP基因的人KL-6基因。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的人KL-6基因的DNA序列如SEQID NO：1所示。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的人KL-6基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述的带有外源目的基因的稳定细胞株通过将所述外源基因瞬时转染CHO细胞制得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述瞬时转染为电击转染，转染条件为电压150～170V，电击时间20～30ms，电压为方形波电压。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：在所述瞬时转染46～52小时后进行小鼠免疫。
10.一种如权利要求1至9中任一项所述的制备方法制得的能够特异性识别血浆蛋白的KL-6的单克隆抗体在试剂盒中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102422159A (zh) * 2009-06-30 2012-04-18 积水医疗株式会社 用于kl-6测定的免疫测定试剂
CN110940814A (zh) * 2019-12-06 2020-03-31 湖南永和阳光生物科技股份有限公司 一种定量检测kl-6的试纸条和试剂盒

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