CN112126620B - 基因编辑提高脂肪干细胞分化效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因编辑提高脂肪干细胞分化效率的方法。本发明筛选优化得到最佳的gRNA序列后将miR‑221敲除获得了转基因的脂肪干细胞后，针对RUNX2筛选获得了特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够抑制RUNX2的活性，将所述单抗加入到诱导培养基后，能够特异性的促进脂肪干细胞分化为软骨细胞，具有较好的诱导效率和应用价值。

Description

基因编辑提高脂肪干细胞分化效率的方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的涉及基因编辑提高脂肪干细胞分化效率的方法。

背景技术

关节软骨病变特别是膝关节病变的治疗一直是最具挑战性的临床难题之一。关节软骨属于透明软骨，有缓冲机械应力和保证关节的灵活运动等重要功能。但成年人的关节软骨组织缺乏血管、神经，无淋巴回流，并且组织细胞类型单一、高度分化，软骨细胞包埋于大量致密基质中，限制了其增殖、迁移能力。因此，组织的自愈能力有限，即使较小的软骨损伤也可能导致骨关节炎，并发展为进行性炎症从而导致关节退化和运动能力丧失。目前，手术治疗关节软骨损伤的方法主要包括软骨下钻孔、微骨折、磨削成形术、关节置换术和自体软骨细胞移植等，但这些方法因受技术难度、组织整合差和发育形成纤维软骨的影响存在局限性，而软骨组织工程为解决这些难题提供了新的思路。

软骨组织工程的主要目标是通过种子细胞、具有诱导分化能力的生物活性分子以及能为细胞生长创造适当环境的生物材料(如支架)的有效组合产生与天然软骨生物学功能相近的新透明软骨，实现组织结构和功能的再生。种子细胞可来源于软骨细胞、胚胎干细胞或组织干细胞，是修复或替换受损组织的关键，其中成体多功能干细胞的应用不涉及伦理问题，来源相对充足且增殖修复能力较强，成为较理想的研究对象。脂肪干细胞ADSCs是软骨组织工程中研究最为深入的MSCs类型， ADSCs的主要优点在于组织来源丰富且易获取，ADSCs在特异性诱导因子的作用下可分化为软骨细胞。

体外诱导ADSCs成软骨分化所需的分化培养基通常为含有一系列生长因子的混合物。其中，转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是ADSCs成软骨分化培养基中最重要的组分，其在哺乳动物体内有3种亚型：TGF-β1，-β2和-β3。TGF-β通过与ADSCs表面受体结合，使I型受体即激活素受体激酶-5(activin receptor-like kinase-5，ALK-5)磷酸化，进而激活Smad通路，启动软骨特异性基因的转录。TGF-β1具有双相作用：在100pg/mL-1 ng/mL的浓度范围内增强内皮细胞的增殖和侵袭效应，在5-10 ng/mL范围内抑制内皮细胞侵袭和毛细血管形成，诱导ADSCs的成软骨分化。TGF-β的3种亚型对ADSCs都有一定的成软骨诱导效应，但3种亚型诱导效应的不同之处暂无定论，目前研究表明对ADSCs而言TGF-β1与TGF-β3的诱导效应并无显著差异。

因应用外源性生长因子效率低、半衰期短，有学者提出了一种长期稳定的诱导方式，即利用基因转染上述生长因子的目的基因得到内源性生长因子，通过分泌途径发挥作用。尽管基因操作可控制特定生长因子的分泌，但由于软骨形成是由多种生长因子和其他信号分子协调操控的，所以一次只能靶向一种基因限制了基因转染的应用潜力，但是目前研究还不够多，还有很大的改进空间。

发明内容

本发明克服现有技术的缺陷，提供一种改进的诱导干细胞成为软骨细胞的方法。

具体的，发明人发现在脂肪干细胞中，通过将miR-221敲除以及抑制RUNX2的活性，能够特异性的促进脂肪干细胞分化为软骨细胞。

一方面，本发明提供一种基因编辑修饰的脂肪干细胞。

所述修饰为将脂肪干细胞的miR-221进行敲除。

具体的，根据miR221的前体序列，设计了多组gRNA序列，其中筛选获得最优的g4-RNA作为实验序列。具体的gRNA序列如SEQ ID NO：1所示, gRNA4:TGTAGATTTCTGTGTTCGTTAGG。

另外一方面，本发明提供一种特异性靶向RUNX2的单克隆抗体，所述抗体能够特异性的结合RUNX2进而影响RUNX2的活性。

更进一步的，所述靶向RUNX2的单克隆抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。

更进一步的，提供一种诱导脂肪干细胞分化为软骨细胞的方法，所述包括将miR-221敲除的脂肪干细胞在软骨诱导培养基(高糖DMEM，1％胎牛血清，5μg/L R单抗，5μg/LTGF-β1，5μg/L TGF-β3，10μg/L BMP-6，50nmol/L抗坏血酸，2mg／L胰岛素，1％青链霉素原液)诱导分化10d，每2d换液一次，即得分化的软骨细胞。

本发明诱导软骨细胞生成的方法无需低氧环境即可高水平诱导软骨分化，而且诱导时间显著缩短，从正常2周时间缩短到10天，具有较好的诱导效果。

有益效果

本发明在脂肪干细胞中，通过涉及筛选优化得到最佳的gRNA序列后将miR-221敲除获得了基因编辑的脂肪干细胞后，针对RUNX2筛选获得了特异性的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够抑制RUNX2的活性，将所述单抗加入到诱导培养基后，能够特异性的促进脂肪干细胞分化为软骨细胞，具有较好的诱导效率和应用价值。

附图说明

图1 RT-PCR检测miR-221的表达水平图

图2 单抗ELISA 检测结果图

图3 单抗Western blot 检测结果图

图4 RT-qPCR检测aggrecan和Co2A1mRNA水平结果图

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明， 而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文 献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 脂肪干细胞的制备

将无菌条件下用真空抽脂术提取的腹部皮下脂肪，取10 g，用含有500 U/ml 双抗的PBS 充分漂洗3遍，剔除肉眼可见的血管及结缔组织，用眼科剪将其充分剪碎，再用PBS反复冲洗，尽量除去红细胞。加入2倍体积的0.2%Ⅰ型胶原酶，振荡混匀后，于37 ℃的恒温水浴箱消化60 min。加入等体积的含有10% FBS 的低糖DMEM 培养基终止消化。1800 r/min离心10 min。弃上层和中层，加入2 ml 完全培养基（ 低糖DMEM+10% FBS +100 U/ml 青霉素-链霉素）重悬细胞沉淀，70μm 细胞筛网过滤，将滤过后的滤液调整细胞浓度为1×10⁸/L接种至60 mm 细胞培养皿中，于37℃、5% CO₂ 细胞培养箱中培养24 h 后进行半量换液，48h 后进行全量换液，去除残存的红细胞、细胞碎片等。之后每2 d换液1 次，获得纯化后的ADSCs，培养7-9 d 后，原代ADSCs 可生长融合达到90%，用0.25%胰蛋白酶（含有0.2% EDTA）常规消化后，1∶3传代接种到新的细胞培养皿中持续体外扩增培养到第三代进行检测。取第3代ADSCs 鉴定细胞表面特异性标志物CD34、CD44、CD45、CD105，实验步骤为ADSCs 用胰酶消化后，1000r/min离心4min，用PBS重悬，计数，每个2mlEP管取细胞3×105个细胞，1000r/min离心4min，弃上清，加入50μl或100μlPBS重悬。细胞与抗体孵育：a.空白细胞对照组：加入50μlPBS；b.加入1μlCD44-FITC抗体+99μlPBS；c.加入2.5μlCD105-PE抗体+47.5μlPBS；d.加入2.5μlCD34-APC抗体+47.5μlPBS；e.加入2.5μl CD45-PerCPCyanine5.5抗体+47.5μlPBS；f.将上述4种抗体分别取1μl、5μl、5μl、5μl加入细胞中+84μlPBS。4℃避光孵育45min（每隔15min摇晃1次）。（3）孵育完后，加入1mlPBS重悬，1000r/min离心4min，弃上清，加入1mlPBS再洗一遍，最终加入200μlPBS重悬。（4）应用流式细胞仪进行检测。结果显示CD44和CD105表达阳性，CD34为超低表达，CD45表达为阴性，表明分离获得了脂肪干细胞。

实施例2 靶向miR-221的基因编辑技术

根据miR221的前体序列，设计了多组gRNA序列，其中筛选获得最优的g4-RNA作为实验序列。具体的gRNA序列如SEQ ID NO：1所示, gRNA4:TGTAGATTTCTGTGTTCGTTAGG。

在上海生工公司分别合成了与 gRNA4对应的DNA序列的5’末端加上CACC的正向核苷酸序列，在其互补链的5’末端加上AAAC的反向核苷酸序列，分别将合成的正向和反向核苷酸序列变性、退火，得到双链DNA片段。具体实验条件如下：1ul正向核苷酸序列 (100uM)；1ul反向核苷酸序列(100uM)； 1ul 10×T4 Ligation Buffer(NEB)；6.5ul ddH₂O；0.5ulT4PNK(NEB)。 将反应体系置于PCR仪中，反应条件为：37℃，30min；95℃，5min； 然后以5℃/min的降温速率将反应体系温度降至25℃记得到双链DNA片段。 将CRISPR/Cas9的慢病毒表达载体lentiCRISPRv2经BbsI酶切30min后，进行 DNA电泳回收。将已经互补连接的DNA引物和回收切好的lentiCRISPRv2质粒 按照1：1的比例在室温进行DNA连接反应，DNA连接反应采用快速连接试剂盒。将连接好的DNA引物和 lentiCRISPRv2质粒转化入感受态细菌。次日，挑选连接阳性克隆进行测序鉴定，确定gRNA/CPRISPR/cas9表达载体构建成功。 取P3代实施例1分离制备的脂肪干细胞，常规消化，将细胞最后悬浮，制备单细胞悬液；利用Lipofectamine 3000 脂质体转染法进行转染至P3代脂肪干细胞中，转染8 h后换液。通过倒置荧光显微镜观察荧光表达情况筛选获得了阳性基因编辑干扰的干细胞，将获得了阳性基因编辑干扰的干细胞培养48h后，进行RT-PCR检测miR-221的表达水平。所述引物为上游引物：GGGAAGCTACATTGTCTGC，下游引物为：CAGTGCGTGTCGTGGAGT。同时设置未转染载体组作为Contro1。结果如图1所示。

从图1可以看出，RT-qPCR结果显示基因编辑后的细胞中miR-221表达明显低于未转染组(P <0.01)，表明经过CRISPR编辑后能有效沉默细胞中miR-221的表达。

实施例3 靶向RUNX2的单克隆抗体的制备

针对RUNX2的保守区，发明人筛选获得了具有高免疫原性的抗原表位，具体序列如下：DENYSAELRNASAVMKNQVARFNDLRFVGRSGRGKSFTLTITVFTNPPQVATYHRAIK VTVDGPREPRRHRQKLDDSKPSLFSDRLSDLGRIPHPSMRVGVPPQNPRPSLNSAPSP FNPQGQSQITDPRQAQSSPPWSYDQSYPSYLSQMTSPSIHSTTPLSSTRGTGLPAITD VPRRISGASELGPFSDPRQFPSISSLTESRFSNPRMHYPATFTYTPPVTSGMSLGMSA

以该序列合成的抗原肽作为免疫原，与等体积的Freund完全佐剂充分混合，BALB/c小鼠皮下多点注射融合蛋白50μg/只。初次免疫4周后背部皮下多点注射加强免疫，4周后再次加强免疫，每次所用免疫原50μg/只。第3次免疫后7～10d尾静脉采血ELISA测血清抗体效价。于融合前4d选择抗体滴度最高的1只小鼠腹腔注射无佐剂抗原150μg加强免疫。无菌取加强免疫BALB/c小鼠脾细胞，以50%聚乙二醇作为融合剂，按1∶5～1∶10将SP2/0骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞进行融合，加入HAT选择性培养液，接种96孔板，置37℃、5%CO₂培养箱中培养，第7～10天后吸取生长克隆孔中的培养上清，用免疫原作为包被抗原用ELISA进行初筛，筛选出只与免疫原反应的阳性杂交瘤细胞37株，用BSA反筛选，选取只与免疫原反应的阳性反应最强的克隆2株R4D5和R3F6，用有限稀释法进行4轮亚克隆，直至单克隆均为阳性时，扩大培养和建株。将2株杂交瘤细胞R4D5和R3F6分别在BALB/c小鼠腹腔注射2×10⁶个/只，约7d后待小鼠腹部显著膨隆，吸取腹水，2000r/min，离心20min，取上清。经平衡缓冲液稀释后，0.45μm滤器过滤。将过滤后腹水以1ml/min流速通过Purify蛋白纯化仪，平衡缓冲液洗去杂蛋白，洗脱液(甘氨酸-盐酸pH2.8100mmol/L)洗脱抗体，收取OD280＞0.5的抗体，经PBS4℃透析后保存备用，调节单抗浓度至100mg/ml备用。

实施例4 针对R4D5单抗ELISA 检测

用免疫原(2μg/ml)包被96孔板，50μl/孔，4℃过夜。次日PBS洗5次，加入5%脱脂奶粉(PBST配制)室温封闭2h，PBS洗5次。将R4D5单抗(2μg/ml) 与IgG（作为对照）分别加入酶标板，50μl/孔，室温反应1h，PBST洗3次，PBS洗2次。加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1：2000)，50μl/孔，室温反应1h，PBST洗3次，PBS洗2次。加入底物显色液TMB，100μl/孔，室温显色15min，加入12.5%H₂SO₄终止，50μl/孔。酶标仪测OD450值。结果如图2所示。

从图2可知，R4D5单抗只特异性地与相应免疫原片段反应，与GST蛋白不反应，保持了较好的特异性。

实施例5 R4D5单抗Western blot 检测

将免疫原蛋白加入2×SDS裂解液，5ng上样（GST蛋白作为对照）。SDS-PAGE后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上;5%脱脂奶粉(TBST配制)室温封闭2h后，与R4D5单抗(2μg/ml)4℃孵育过夜，同时以抗GST单抗作为阳性对照。次日洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1：2000)，室温孵育50min，ECL化学发光显色。结果如图3所示。

从图3的结果可以看出，在Western blot 实验中，R4D5单抗只能与与相应的免疫原蛋白特异结合，与GST不结合(图3) ，表现了较好的特异性。

实施例6 R4D5单抗结合活性检测以及序列分析

为了表征R4D5单抗的结合特性，通过Biacore3000测量了R4D5单抗和纯化的RUNX2蛋白之间的结合动力学，通过使用Biaevaluation 4.0软件确定缔合和解离速率常数(ka和kd)。解离常数KD由确定的速率常数通过关系式KD＝kd/ka计算得出。如表1所示：

表1

抗体	KD（M）
		R4D5单抗	5.23E-10

R4D5单抗可变区基因的克隆分析包括以下步骤：裂解单克隆杂交瘤细胞株，提取杂交瘤细胞的总RNA。用HiFi Script cDNA合成试剂盒将杂交瘤细胞的RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，用简并引物通过PCR方法扩增抗体的重链和轻链的可变区基因。反应在S1000TM热循环仪中以30个循环进行：94℃，1.5分钟变性；50℃，退火1分钟；在72℃和1分钟下进行合成。在第30个循环结束时，将反应混合物在72℃下再温育7分钟加以延伸。将PCR混合物在含有0.5μg/ml溴化乙锭的1％琼脂糖/Tris-硼酸盐凝胶中进行电泳。从凝胶上切出具有预期大小的DNA片段并纯化。将5μl纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化DH5α感受态细胞，涂板并置37℃过夜培养。从培养板上挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，测定抗体的基因序列。得到抗体的重链和轻链的可变区全长氨基酸序列如下所示。

轻链可变区：

DVVMTQTPLTASFTIGQPASISCCSSQSLLVSDGATYLVWLLQRPGQSPKRLIYYVIELDPGVPDRFTGSGSQTDFTLQISRVEAEDLGVYYCYQGTFTPWQFGGGTKLEIKRA

重链可变区：

DVQLQESRPGLVKPSQSLSLTATVTGYSITADYAWSWIRQFPGNKLEWMGGIRNGSTTSYNPQLKRRISITRDTSKNHFFLSLNSVTTEDTATYYCTRQGHHDRFDAWGQGTTLTVSS

实施例7 脂肪干细胞向软骨细胞诱导分化

分别取实施例分离的P3代脂肪干细胞、实施例2基因编辑的脂肪干细胞在以下条件下进行软骨细胞诱导实验：

将上述二种细胞接种于25 cm²培养瓶，待细胞长满后，改用成软骨诱导培养基(高糖DMEM，1％胎牛血清，5μg/L R4D5单抗，5μg/L TGF-β1，5μg/L TGF-β3，10μg/L BMP-6，50nmol/L抗坏血酸，2mg／L胰岛素，1％青链霉素原液)诱导分化10d，每2d换液一次。以不加单抗的相同条件的软骨诱导培养基作为对照，进行同样培养条件的诱导。收集诱导培养10d的软骨细胞团，检测软骨分化相关基因表达。使用Trizo1分别提取各组RNA，按照反转录试剂盒说明书反转录得cDNA，并将所获的cDNA样品分别配置Real-timePCR反应体系，置于Rea1-time PCR仪上进行PCR反应。反应结束后在PCR仪上读取Ct值，以GAPDH为内参分析Collagen 1I与aggrecan的表达，计算各目的基因mRNA相对表达量。其中引物序列为：Col2A1：上游引物：F：5’-TGGTGGAGCAGCAAGAGCAA-3’，下游引物：R：5’-CCGTGGACAGCAGGCGTAGGAAG-3’；aggrecan：上游引物：F：5’-CAGGGTTCCCAGTGTTCAGT-3’，下游引物：R：5’-CTGCTCCCAGTCTCAACTCC-3’；GAPDH上游引物F：5’-GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3’，下游引物R：5’-AAGGTGGAAGAATGGGAGTT-3’。结果如下图4所示。

从图4的结果可以看出，与没有基因编辑以及没有使用含有抗体诱导的脂肪干细胞相比，采用基因编辑的干细胞并且在有抗体的诱导培养基存在的情况下，具有更好软骨分化的效果，RT-qPCR结果也进一步证实aggrecan和Co2A1mRNA水平表达也明显增加(P<0.O5)，见图4。

实施例8 软骨细胞成软骨性能鉴定

以实施例7基因编辑脂肪干细胞在单抗诱导培养基条件下诱导10d制备的软骨细胞进行细胞膜片构建，以实施例7未基因编辑脂肪干细胞在不含有单抗诱导培养基条件下诱导10d制备的软骨细胞作为对照进行细胞膜片构建，具体步骤如下：将软骨细胞在软骨细胞培养液（体积分数10%胎牛血清，谷氨酰胺300 mg/L，L-抗坏血酸 50 mg/L，青、链霉素各100 U/mL配制的Ham’s F-12培养液）连续培养待细胞达到100%汇合状态后，继续培养2周，可见培养皿底出现乳白色薄膜样物质。单层细胞膜片培养2周后，取实施例7诱导制备的软骨细胞，以5×10⁴ /cm²的浓度叠加接种与单层细胞膜片上方，使细胞继续贴覆生长，连续培养2周，形成双层细胞膜片结构。用无菌细胞刮刀从皿底的边缘开始，由外而内小心刮起细胞膜片。细胞膜片刮起后，置于新鲜的软骨细胞培养液（体积分数10%胎牛血清，谷氨酰胺300 mg/L，L-抗坏血酸 50 mg/L，青、链霉素各100 U/mL配制的Ham’s F-12培养液）中，继续培养，将体外培养4周的双层细胞膜片植入BALB/c裸鼠。在每只裸鼠的左右背部制作皮下组织袋，各袋内植入一张双层细胞膜片形成的软骨样结构。动物麻醉采用盐酸赛拉嗪注射液0.5 mL/kg。动物麻醉后，用碘伏擦拭消毒裸鼠背部，用剪刀剪开侧背部皮肤，长约0.5 cm，用止血钳沿皮下钝性剥离，形成皮下组织袋，将细胞膜片团块置入袋内，拉拢缝合伤口。术毕。术后给予正常饮食，不限制活动，连续观察8周。体内培养8周后，注射过量盐酸赛拉嗪注射液，处死动物后取材。将标本与周围包裹软组织剥离，标本用于定量分析DNA和细胞外基质含量。将标本再分为2份，其中一份切碎后用10%蛋白酶K 56 ℃消化过夜，用QiagenDNeasy试剂盒提取并纯化DNA，DNA含量分析应用Picogreen dsDNA法。另一份用于分析细胞外基质成分。低温冻干后称质量，用木瓜蛋白酶(含125 g/L木瓜蛋白酶，10 mmol/L L-半胱氨酸和10 mmol/L EDTA，pH 6.3)60 ℃消化16 h。消化液用于糖胺聚糖和羟基脯氨酸含量。糖胺聚糖含量采用应用二甲基亚甲基蓝染色后分光光度计测量，以硫酸软骨素作为标准液。羟基脯氨酸含量的测量采用Stegemann羟基脯氨酸测定法。正常人鼻中隔软骨被用于消化提取并生化分析DNA和细胞外基质含量，作为正常对照。方法同上。主要观察指标 ①DNA含量：反映人工构建软骨中软骨细胞的密度；②糖胺聚糖和羟基脯氨酸含量：单位质量软骨组织中软骨基质的含量，反映人工软骨软骨基质分泌情况；③通过与天然鼻中隔软骨比较，评价人工软骨的性能。结果如表2所示。

表2

组别	DNA含量（μg/g）	糖胺聚糖（mg/g）	羟基脯氨酸（mg/g）
				天然软骨	154.1±17.5	150.3±11.4	52.4±6.3
基因编辑干细胞+单抗诱导软骨	212.0±25.7	153.1±20.6	64.7±4.5
				未基因干细胞-单抗诱导软骨	162.6±10.3	141.6±13.5	50.7±4.5

从表2的结果可以看出，DNA含量检测结果表明，基因编辑干细胞+单抗诱导的软骨细胞制备的软骨每克组织中的DNA含量高于人体天然鼻中隔软骨，说明人工软骨组织中单位体积内含有的软骨细胞数量更多。糖胺聚糖含量和羟基脯氨酸含量检测结果表明，人工软骨与天然软骨构象基本相同，具有较好的效果。

应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。

序列表

<110> 北京欣颂生物科技有限公司

<120> 基因编辑提高脂肪干细胞分化效率的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtagatttc tgtgttcgtt agg 23

<210> 2

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Ala Ser Phe Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Cys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Val Ser

20 25 30

Asp Gly Ala Thr Tyr Leu Val Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Tyr Val Ile Glu Leu Asp Pro Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gln Thr Asp Phe Thr Leu Gln Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Tyr Gln Gly

85 90 95

Thr Phe Thr Pro Trp Gln Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala

<210> 3

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Arg Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Ala Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ala Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Gly Ile Arg Asn Gly Ser Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Gln Leu

50 55 60

Lys Arg Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe

65 70 75 80

Leu Ser Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gln Gly His His Asp Arg Phe Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

Claims (4)

1.一种诱导脂肪干细胞分化为软骨细胞的方法，其特征在于所述方法包括将miR-221敲除的脂肪干细胞在软骨诱导培养基中诱导分化10d，每2d换液一次，即得分化的软骨细胞；其中培养基由高糖DMEM加1％胎牛血清，5μg/L单克隆抗体，5μg/L TGF-β1，5μg/L TGF-β3，10μg/L BMP-6，50nmol/L抗坏血酸，2mg／L胰岛素，1％青链霉素原液制备而成；所述单克隆抗体为R4D5，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其重链可变区序列如SEQID NO：3所示；所述miR-221敲除的脂肪干细胞为采用CRISPR技术编辑获得的，其中gRNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种诱导脂肪干细胞分化为软骨细胞的培养基，其特征在于培养基由高糖DMEM加1％胎牛血清，5μg/L单克隆抗体，5μg/L TGF-β1，5μg/L TGF-β3，10μg/L BMP-6，50nmol/L抗坏血酸，2mg／L胰岛素，1％青链霉素原液制备而成，所述单克隆抗体为R4D5，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。

3.一种特异性靶向RUNX2的单克隆抗体R4D5，其特征在于所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：3所示。

4.权利要求2所述的培养基或者权利要求3所述的单克隆抗体在体外诱导脂肪干细胞分化为软骨细胞中的用途。

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