CN116218864B - 一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1及其表达载体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1及其表达载体和应用，涉及生物工程技术领域。本发明选择人Ⅲ型胶原蛋白α链154‑1221序列连接到优化后的载体pcDNA3.1上，优化后的表达载体转染人胚胎肾细胞Expi293F，分泌表达可溶性绿色荧光融合的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1。本发明所表达的绿色荧光蛋白融合的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1具有促进BALB/c3T3细胞迁移的活性，在护肤领域具有巨大应用潜力。
Description
技术领域
本发明属生物工程技术领域，具体为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1及其表达载体和应用。
背景技术
胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质之一，占总蛋白质量的25％～30％，是人各种结缔组织中发现的细胞外基质中的主要结构蛋白。其参与许多人体器官组织的组成，如皮肤、角膜、神经视网膜、骨骼、肌肉等。Ⅲ型胶原蛋白是最丰富的一种原纤维胶原蛋白之一，是由三条α1(Ⅲ)链(Col3A1)形成的同源三聚体。皮肤中的Ⅲ型胶原蛋白随着年龄的增加会逐渐减少，从胎龄阶段的占比降至成年阶段的占比8％～11％。Ⅲ型胶原蛋白由成纤维细胞和其他间充质细胞类型分泌，这使其成为各种炎症相关病理学的主要参与者。如肺损伤，病毒性和非病毒性肝病，肾纤维化，疝气和血管疾病。Ⅲ型胶原蛋白和I型胶原蛋白是间质基质的主要成分，Ⅲ型胶原突变与先天性结缔组织发育不全综合征(Ehlers-Danlos综合征)、血管缺陷以及主动脉和动脉瘤有关。Ⅲ型胶原蛋白除在护肤领域有广泛的应用，还有很多探索研究，有望拓展其前沿应用，如：利用人源Ⅲ型胶原制成的生物合成角膜光学透明，可替代供体疗法或转基因猪治疗方法，并无需使用免疫抑制药物；使用人源Ⅲ型胶原蛋白完成心脏瓣膜人工合成以及子宫内膜灌注修复；向肿瘤微环境中添加III型胶原蛋白，能够促进肿瘤细胞进入并维持在休眠状态，抑制肿瘤增殖。因此，Ⅲ型胶原蛋白潜在巨大的应用市场。
目前工业化使用的胶原蛋白主要是通过酸、碱或者酶法提取猪、牛等的皮肤或骨骼中的胶原蛋白，或是从深海鱼类的鱼皮中进行提取。从动物组织中提取胶原蛋白的技术虽然成熟，但存在着免疫原性和来源有限等，难以满足巨大的市场需求。随着基因工程技术的大规模应用，通过基因工程生成重组胶原蛋白成为解决胶原蛋白来源限制问题最有潜力的方法。与动物来源的胶原蛋白相比，重组胶原蛋白不仅具有生产周期短，成本低，适用于大规模生产的优势，还能避免动物蛋白免疫原性、动物源疾病等问题。因此重组胶原蛋白特别是重组人源胶原蛋白的制备是目前胶原蛋白生产研究的热点。
全长的胶原蛋白分子量大(100kDa)，且具有多种蛋白翻译后修饰，如脯氨酸、赖氨酸羟基化，糖基化等。当前国内生产重组Ⅲ型胶原蛋白选用的是大肠杆菌表达系统或是酵母表达系统，两种表达系统都具有能大规模表达的优势，但大肠杆菌表达的胶原蛋白，多为截短型，片段拼接型或是根据胶原蛋白序列特征人为改造，其与人体真实Ⅲ型胶原蛋白具有较大差异；酵母中蛋白翻译后修饰过程与人体存在差异，酵母表达系统得到的重组胶原蛋白与人体胶原蛋白存在较多不同。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1，所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合绿色荧光蛋白，具有很好的促进细胞迁移的活性，具有很大的应用潜力。
本发明目的还在于提供一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的表达载体，本发明将人胶原蛋白α链154-1221序列连接到优化后的载体pcDNA3.1上构建得到能够表达重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的表达载体。
本发明目的还在于提供一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的表达方法，采用人胚胎肾细胞Expi293F表达重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1链，并使用融合表达质粒提高蛋白表达量，实现Ⅲ型人源化胶原蛋白α1链全长区段表达。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1，所述编码重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的表达载体，所述表达载体包含所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1、分泌信号肽基因序列、绿色荧光蛋白基因序列及TEV酶切序列的DNA。
优选地，所述表达载体通过如下方式制备得到：所述表达载体通过如下方式制备得到：将所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1、分泌信号肽基因序列、绿色荧光蛋白基因序列及TEV酶切序列的DNA，经过密码子优化后，合成的基因插入质粒pcDNA3.1的NheI和XhoI两个酶切位点之间，构成表达载体pcDNA3.1-GFP-CAL3A1。
更优选地，所述分泌信号肽为α-甘露糖苷酶信号肽。
本发明提供了一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白的表达方法，将所述表达载体转染至人胚胎肾细胞Expi293F中表达。
优选地，所述人胚胎肾细胞Expi293F的培养方法包括如下步骤：将人胚胎肾细胞Expi293F于37℃，110rpm，湿度80％，二氧化碳7％的摇床中预先悬浮培养，培养基采用无血清培养基。
优选地，当培养人胚胎肾细胞Expi293F的细胞密度达到2.5～3.0×106/mL，活细胞率>95％时，进行转染。
本发明还提供了一种所述表达方法获得的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白，所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1或所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白在制备促进细胞迁移活性产品中的应用。
本发明还提供了一种所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1或所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白在制备皮肤修复产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明选择人胶原蛋白α链154-1221基因序列连接到载体pcDNA3.1上，通过在目的蛋白N端添加分泌信号肽和绿色荧光蛋白，优化表达载体，优化后的表达载体转染人胚胎肾细胞Expi293F，分泌表达可溶性绿色荧光蛋白融合的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1。本发明绿色荧光蛋白和重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的融合蛋白有促进α1BALB/c3T3细胞迁移的活性。经试验表明，作用6小时，100μg/mL重组胶原蛋白实验组(划痕恢复率为49％)与对照组(划痕恢复率为14％)相比，表现出明显促进细胞迁移的活性。作用12小时，实验组(100μg/mL)划痕恢复率为96％，远高于对照组38％。活性研究表明，本发明所表达的绿色荧光蛋白融合的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1具有很好的促进细胞迁移的活性，具有巨大的应用潜力。
附图说明
图1为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合绿色荧光蛋白表达载体图谱；
图2为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合绿色荧光蛋白的SDS-PAGE电泳图；
图3为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合绿色荧光蛋白促进细胞迁移实验结果图；
图4为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1和重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合绿色荧光蛋白促进细胞迁移实验结果图；
图5为重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合绿色荧光蛋白促进细胞迁移划痕恢复率统计图。
具体实施方式
本发明提供了一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1，所述编码重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述Ⅲ型人源化胶原蛋白α1核苷酸序列经密码子优化后由生工生物工程有限公司合成本发明所述编码重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的核苷酸序列SEQ ID NO.1。
本发明还提供了一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的表达载体，所述表达载体包含所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1、分泌信号肽基因序列、绿色荧光蛋白基因序列及TEV酶切序列的DNA。
在本发明中，所述表达载体通过如下方式制备得到：所述表达载体通过如下方式制备得到：将分泌信号肽基因序列、绿色荧光蛋白基因序列及TEV酶切序列的DNA，经过密码子优化后，合成的基因插入质粒pcDNA3.1的NheI和BamHI两个酶切位点之间，构成表达载体pcDNA3.1-GFP，所述分泌信号肽基因序列、绿色荧光蛋白基因序列及TEV酶切序列的DNA合成基因如SEQ ID NO:2所示。在本发明中，所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的基因序列SEQID NO.1插入上述pcDNA3.1-GFP载体的BamHI和XhoⅠ两个酶切位点之间，构建得到能够表达绿色荧光蛋白和重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白的表达载体pcDNA3.1-GFP-CAL3A1。本发明中，所述pcDNA3.1-GFP表达载体由生工生物工程有限公司合成。在本发明中，绿色荧光蛋白基因表达绿色荧光蛋白，可以提高目的蛋白表达量。TEV酶切序列DNA，表达TEV酶可以识别八个氨基酸序列，被TEV酶切后，释放绿色荧光蛋白，得到不带有绿色荧光蛋白的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1。
在本发明中，所述分泌信号肽为α-甘露糖苷酶信号肽，在本发明中，所述分泌信号肽由本公司合成来自克氏锥虫(Trypanosomacruzi)α-甘露糖苷酶的分泌信号肽。本发明在pcDNA3.1载体质粒中融合分泌信号肽可帮助目的基因表达的重组蛋白分泌到细胞培养基中，提高重组蛋白的表达量。完成表达后，分泌信号肽会被信号肽酶切除。
本发明提供了一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白的表达方法，将所述表达载体转染至人胚胎肾细胞Expi293F中表达。在本发明中，所述人胚胎肾细胞Expi293F来源为Thermo：A14528。在本发明中，所述转染采用质粒转染试剂盒，其来源为碧云天：C0518。
在本发明中，所述人胚胎肾细胞Expi293F的培养方法包括如下步骤：将人胚胎肾细胞Expi293F于37℃，110rpm，湿度80％，二氧化碳7％的摇床中预先悬浮培养，培养基采用无血清培养基。在本发明中，所述无血清培养基的来源为吉泰依科赛：HE000-N012。
在本发明中，当培养人胚胎肾细胞Expi293F的细胞密度达到2.5～3.0×106/mL，活细胞率>95％时，进行转染。
本发明还提供了一种所述表达方法获得的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白，所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1或所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白在制备促进细胞迁移活性产品中的应用。本发明对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1进行细胞迁移活性测定，结果表明：作用6小时，100μg/mL重组胶原蛋白实验组(划痕恢复率为49％)与对照组(划痕恢复率为14％)相比，表现出明显促进细胞迁移的活性。作用12小时，实验组划痕恢复率为96％，远高于对照组38％。本发明所表达的绿色荧光蛋白融合的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1具有很好的促进细胞迁移的活性，在制备促进细胞迁移活性产品中具有应用潜力。
本发明还提供了一种所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1或所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白在制备皮肤修复产品中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1表达载体的构建
生工生物工程有限公司合成来自克氏锥虫(Trypanosomacruzi)α-甘露糖苷酶的分泌信号肽基因序列、绿色荧光蛋白(GFP蛋白)基因序列及TEV酶切序列的DNA，经过密码子优化后，合成的基因插入质粒pcDNA3.1的NheI和BamHI两个酶切位点之间，构成绿色荧光蛋白表达载体pcDNA3.1-GFP。生工生物工程有限公司合成III型人源胶原蛋白α1链154-1221氨基酸序列(SEQ ID NO:1)对应的DNA，密码子优化后，基因插入上述pcDNA3.1-GFP载体的BamHI和XhoⅠ两个酶切位点之间，构建得到能够表达绿色荧光蛋白和重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白的表达载体pcDNA3.1-GFP-CAL3A1，见图1。
将上述所构建的质粒载体转化至大肠杆菌DH5α中，接种到LB液体培养基(每升培养基包含10g蛋白胨、5g酵母粉和10gNaCl)，37℃，200rpm，培养2h，涂LB固体培养基平板(0.1mg/mL氨苄)，培养箱37℃倒置培养12h，挑取单个菌落加入到50mLLB液体培养基(0.1mg/mL氨苄)中，37℃，200rpm，培养12h。利用质粒大量抽提试剂盒(碧云天：D0025-3)提取质粒，Nanodrop仪器检测载体的浓度，4℃可保存一个月，建议一周内用完。
实施例2重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1蛋白表达、纯化
Expi293F细胞在37℃，110rpm，湿度80％，二氧化碳7％摇床中预先悬浮培养，培养基采用无血清培养基。当细胞密度达到2.5-3.0×106/mL，活细胞率>95％时，进行质粒转染。使用质粒转染试剂盒进行Expi293F细胞转染(以40mL为例)：80μL转染试剂加入1mL细胞培养基，轻柔混匀，为溶液A；40μg实施例1提取得到的质粒加入1ml细胞培养基，轻柔混匀，为溶液B。溶液B加入溶液A中，轻柔混匀，静置15min。将A和B的混合液加入到40mL悬浮培养的Expi293F细胞中，继续培养6～7天，每天检测活细胞率，待活细胞率低于50％，收集细胞。
将上述收集得到的细胞混悬液经4℃，11000rpm离心10min，取上清培养基，与5mL镍柱孵育(赛默飞：88221)，利用重力洗脱，含10mM咪唑的PBS溶液50mL洗镍柱，分别用30mM、50mM、100mM、200mM和300mM咪唑的PBS溶液进行梯度洗脱，SDS-PAGE检测蛋白，将含有目标蛋白且纯度好的PBS洗脱液合并，超滤管(Millipore，UFC9010)除去咪唑，见图2。根据图2可以看出，无绿色荧光蛋白时，基本无胶原蛋白表达(左)。绿色荧光蛋白融合载体表达时，有明显条带，镍柱纯化后得到较纯的绿色荧光蛋白和重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的融合蛋白。结果表明，本发明获得的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白的表达量高于非融合蛋白。
实施例3重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1促进细胞迁移活性测定
马克笔在6孔板背后，用直尺均匀划横线，每隔0.5～1cm一道，每孔画5条线。每孔加入约5*105个BALB/c3T3细胞，培养过夜使细胞贴壁。第二天用无菌枪头比着直尺划细胞，用PBS洗3次，去除划下的细胞，加入(1～2％FBS)的DMEM培养基，设置对照组(只添加PBS溶液)、5μg/mL、10μg/mL和100μg/mL三种浓度的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白(实施例2纯化后的目的蛋白)的实验组，细胞放回培养箱。按0、6、12、24小时取样拍照。每个实验条件拍三张照片，ImageJ软件分析计算划痕面积，得到不同时刻划痕恢复率。恢复率％＝(0时刻划痕面积-对应时刻划痕面积)/0时刻划痕面积*100。图5三次独立实验数据(均数±标准差)，t-test，P<0.05为*(有统计学意义的显著差异)，P<0.01为**，P<0.001为***。
根据图5可以看出，作用6小时，100μg/mL重组胶原蛋白实验组(划痕恢复率为49％)与对照组(划痕恢复率为14％)相比，表现出明显促进细胞迁移的活性。作用12小时，实验组(100μg/mL)划痕恢复率为96％，远高于对照组38％。
按本实施例的试验步骤，设置对照组(只添加PBS溶液)、15μg/mL重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白(实施例2纯化后的目的蛋白)、15μg/mL重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1。
本发明获得的融合蛋白与切除绿色荧光蛋白后的非融合蛋白的活性相当(图4)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白，其特征在于，所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白是由包含重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的核苷酸序列、分泌信号肽基因序列、绿色荧光蛋白基因序列及TEV酶切序列的DNA的表达载体转染至人胚胎肾细胞Expi293F中表达获得；
所述重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白，其特征在于，所述表达载体通过如下方式制备得到：将所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1、分泌信号肽基因序列、绿色荧光蛋白基因序列及TEV酶切序列的DNA，经过密码子优化后，合成的基因插入质粒pcDNA3.1的NheI和XhoI两个酶切位点之间，构成表达载体pcDNA3.1-GFP-CAL3A1。
3.根据权利要求2所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白，其特征在于，所述分泌信号肽为α-甘露糖苷酶信号肽。
4.根据权利要求1所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白，其特征在于，所述人胚胎肾细胞Expi293F的培养方法包括如下步骤：将人胚胎肾细胞Expi293F于37℃，110rpm，湿度80％，二氧化碳7％的摇床中预先悬浮培养，培养基采用无血清培养基。
5.根据权利要求4所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白，其特征在于，当培养人胚胎肾细胞Expi293F的细胞密度达到2.5～3.0×106/mL，活细胞率>95％时，进行转染。
6.权利要求1～5任意一项所述的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白α1融合蛋白在制备皮肤修复产品中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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Denomination of invention: A recombinant type III humanized collagen protein a 1 and its expression vector and application Granted publication date: 20240109 Pledgee: Heze rural commercial bank Limited by Share Ltd. Pledgor: Shandong duomeikang biomedical Co.,Ltd. Registration number: Y2024980005916 |
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