CN102154260A

CN102154260A - 一种高效克隆抗菌肽编码基因的新方法

Info

Publication number: CN102154260A
Application number: CN2010106177986A
Authority: CN
Inventors: 马向东; 梁苏
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102154260B

Abstract

本发明提出了一种高效克隆抗菌肽编码基因的新方法。它是利用绿色荧光蛋白（GFP）具有独特的发光性质，并采用猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)定点突变外壳蛋白（EDDIE）为融合蛋白，构建了一种能高效克隆抗菌肽的载体pET30a-EDDIE-GFP。在该载体的基础上克隆抗菌肽时，我们可以直接在蓝光仪下观察发光与否来筛选重组子，以实行高效克隆抗菌肽。采用本发明克隆小DNA片断,实验过程简单，操作方便，节省了实验时间和费用，是快速高效的克隆抗菌肽基因的好方法，同时克隆在该载体上的基因，表达后能够被准确剪切。本发明特别适合于克隆和表达大小在30个氨基酸组成的小肽基因。

Description

一种高效克隆抗菌肽编码基因的新方法

技术领域

本发明涉及的是生物工程高效克隆和准确表达的载体，特别适用于高效克隆小片段DNA，如编码抗菌肽的基因等，并能对克隆的抗菌肽基因的表达产物进行准确剪切，为新抗菌肽的预测以及对其功能研究打下了基础。

背景技术

抗菌肽是宿主防御系统产生的一类抵抗外界病原体感染的肽类物质，也是宿主免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽不仅具有广泛的抗菌谱，而且有抑制癌细胞生长的作用及不易产生耐药性的特点,这使得抗菌肽开发利用成为近来的研究热点。但是抗菌肽的研究和利用并非易事，首先，抗菌肽天然资源有限，提取非常复杂；其次，化学合成，不但成本很高，还对环境造成严重污染，因此迫切需要一种高效表达抗菌肽的工程菌。在构建抗菌肽工程菌的过程中，最需要解决的关键技术问题是如何快速高效克隆，和如何准确表达抗菌肽。

高效克隆是现在研究抗菌肽的第一个瓶颈，由于抗菌肽的分子量比较小，抗菌肽编码基因的cDNA片段较小，通常仅有几百bp以下，有的甚至只有几十bp，给抗菌肽基因工程操作带来极大困难。常规的酶切酶连方法构建表达载体不仅费时而且不经济，另外，抗菌肽基因非常小，实验室一般的质粒检测和PCR检测的方法对于验证表达载体很困难。所以如何高效克隆抗菌肽成为了制约抗菌肽发展应用的又一个障碍。

目前采用的抗菌肽表达系统，基本上都存在N端剪切不准确，直接影响到抗菌肽的活性；在真核表达系统中同时还存在对表达的抗菌肽进行修饰的问题，如糖基化、甲基化等。在原核表达系统的大肠杆菌表达系统中具有生长快、表达量高、对表达抗菌肽不存在修饰等优势，但抗菌肽在大肠杆菌中直接表达、对大肠杆菌本身具有毒性，一般采用融合表达策略。现在通用的大肠杆菌融合表达方式是采用大肠杆菌的RepA蛋白、大肠杆菌PurF蛋白的F4片段、GST(谷胱甘肽)，Trx(硫氧还原蛋白)，等作为融合蛋白对抗菌肽实行表达。这些方法虽然提高了抗菌肽的表达水平和稳定性，但是融合蛋白与抗菌肽裂解操作过程复杂，效率低下。如用羟氨、溴化氢的化学方法裂解，用TEV蛋白酶等酶法裂解，这些裂解方法不仅引入了一些有毒的物质，且给后续操作带来了很大麻烦，还为了引入裂解位点和酶切位点，人为的给抗菌肽蛋白质N 端引入了多余的氨基酸，引入的多余的氨基酸会对抗菌肽的活性产生不同程度的影响。因此如何高效准确表达抗菌肽成为了制约抗菌肽发展应用的障碍。

发明内容

本发明的目的是构建一种高效克隆和准确表达的载体pET30a-EDDIE-GFP，在pET30a-EDDIE-GFP载体的基础上再进行克隆抗菌肽时，我们可以直接在蓝光仪下观察发绿色荧光与否来筛选重组子，以实行高效克隆抗菌肽。

本发明的步骤为：

一、构建一种高效克隆和准确表达的载体pET30a-EDDIE-GFP

A、设计两对引物Gf、Gr和Pf、Pr（如表1），引物Gf和Gr为 GFP基因扩增引物；引物Pf和Pr为反扩引物，带有GFP基因片段两端的同源臂；

Figure 2010106177986100002DEST_PATH_IMAGE001

B、将引物Pf和Pr以pET30a-EDDIE-CAD为模板进行反扩，获得去掉编码CAD的基因并带有GFP基因片段两端的同源臂的长基因片段；将引物Gf和Gr以pET23a-GFP为模板扩增，获得GFP基因片段。然后，进行胶回收反扩产物和扩增产物；

C、将B步骤的两种扩增产物以1：4的量转入到XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,涂布带有卡那霉素抗性的LB平板(Kana 50u/ml), 37 ℃培养过夜，在蓝光仪下观察平板（如图1），将发光的绿色荧光单菌落做好标记；

D、将标记好的发绿色荧光光的单菌落接种培养，抽提质粒后进行琼脂糖凝胶检测（如图2）；

E、将上步骤获得的分子量大小在7K左右的质粒进行GFP PCR检测（如图3）,然后将GFP PCR检测为阳性结果的质粒送上海英骏生物公司测序验证，该质粒即为载体pET30a-EDDIE-GFP。

二、高效克隆抗菌肽

A、根据目的抗菌肽分子量和抗菌特点设计引物。目的抗菌肽具体见下表2，相应的引物见下表3；

Figure 2010106177986100002DEST_PATH_IMAGE003

B、将上述引物以第一步构建好的pET30a--EDDIE-GFP载体为模板，进行重叠反向PCR；

C、将反扩产物直接转入XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,涂布带有卡那霉素抗性的LB平板(Kana 50u/ml), 37 ℃培养过夜，次日在蓝光仪下观察平板，将不发绿色荧光的白色单菌落做好标记（如图4）；

D、分别将6种抗菌肽标记的不发绿色荧光的白色单菌落接种含有卡那霉素抗性的LB液体培养基(Kana 50u/ml), 37 ℃培养过夜，抽提质粒后跑琼脂糖凝胶检测（如图6）；

E、将分子量大小正确的质粒送去上海英骏生物公司测序，样品测序全部正确；

F、将测序正确的质粒再次转入到XL-GOLD感受态细胞中，抽提质粒，获得大量含目的抗菌肽的质粒；

G、选取测序正确的六种抗菌肽表达质粒，转化到BL21(DE3)工程菌，进行表达（如图7），检测其抗菌活性（如图8-13）。

利用本发明的方法还可以表达其他的抗菌肽类物质。

本发明的基本原理和特点：

绿色荧光蛋白GFP可以形成自己的发色团，当它与其他蛋白进行融合时，GFP保留其独特的发光性质，并且不干扰目的蛋白的生化特性，因此，绿色荧光蛋白GFP非常适合于基因工程作筛选标记使用。EDDIE蛋白是猪瘟病毒外壳蛋白的突变体，由168个氨基酸组成，它能将连在其C端的蛋白质准确地剪切下来，形成具有原始N端的蛋白质，同时它能在大肠杆菌中高效表达，由于EDDIE蛋白是高度疏水氨基酸组成，所以易形成包含体，因此我们可以利用它的这一特点在体内以包含体表达其融合蛋白，在体外复性准确的切除融合表达的抗菌肽。

本发明使用绿色荧光蛋白GFP作为筛选标记，用同源重组的方法构建了抗菌肽克隆载体pET30a-EDDIE-GFP，以该载体为模板进行反向PCR，反扩产物就是线性化的抗菌肽表达载体。由于GFP基因由1002个碱基对组成，能构成反扩产物与模板的大小差异，不仅提高了反扩产物的胶回收率，并且省去了模板消化酶的使用，减少了成本；同时选用GFP作为筛选标记和质粒验证法，即可准确地筛选出重组子。抗菌肽一般只由几十个氨基酸组成，给抗菌肽基因克隆及表达工程菌的筛选带来极大困难，不仅费时而且不经济，抗菌肽克隆载pET30a-EDDIE-GFP的构建不仅解决了这些问题，更能帮助我们快速且准确地克隆抗菌肽。

本研究构建的克隆载体pET30a-EDDIE-GFP解决了传统的构建抗菌肽表达载体的难题。我们只需设计两条引物进行一次反向PCR,即可获得线性的表达载体，然后将PCR产物直接转入高效大肠杆菌感受态细胞进行同源重组，得到我们需要的完整的表达载体。我们在蓝光仪下用肉眼观察,通过是否发绿色荧光就能很容易的筛选出阳性克隆子。通过这种方法，我们成功的构建了不同大小的抗菌肽表达载体，测序结果和表达结果表明这是一种非常便捷的克隆抗菌肽的方法。

附图说明:

图1是反扩产物和GFP扩增产物以1：4的量转入到XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组涂布平板后，培养16-18小时观察结果。含有GFP基因的菌落由于GFP随着时间的增长表达量也会增多，所以当涂布平板在室温环境放置一段时间后，我们用肉眼就可以看出蓝光仪下显示为绿色荧光的菌落，在外部环境下显示为浅绿色。

图2是转化子质粒抽提电泳图，1泳道：pET30a- EDDIE -CAD质粒；2泳道：pET23a-gfp质粒；3泳道：浅绿色菌落抽提的质粒。从图中三种质粒的分子量大小来看，我们可以初步确定浅绿色菌落抽提的质粒就是我们要构建的pET30a-EDDIE-GFP载体。

图3是转化子GFPPCR检测电泳图，1泳道：以pET23a- EDDIE -GFP为模板进行PCR；2泳道：以抽提的质粒模板PCR验证gfp基因。由图我们可以确定gfp基因与EDDIE基因连接上。

图4 是6种抗菌肽反扩产物转化涂布平板，其中1、2、3、4、5、6分别为抗菌肽027、054、099、801、803、726；平板上有些浅绿色的菌落，而白色的菌落可能就是克隆上目的抗菌肽的的转化子，因此，我们可以将白色菌落标上记号，再进行下一步验证。

图5是以设计的6种抗菌肽引物进行反扩的结果图，其中1、2、3、4、5、6分别为抗菌肽027、054、099、801、803、726安装入载体PET30a--EDDIE-gfp中的反扩产物由图片我们可以初步确定6种小肽基因均已安装到载体上。

图6 是6种抗菌肽转化子的质粒验证电泳图，其中1：pET30a-EDDIE-GFP 质粒 7024bp，2-7：依次为抗菌肽027、054、099、801、803、726安装入载体PET30a--EDDIE-gfp中的质粒；由图中我们可以看出，从白色菌落中抽提出来的质粒分子量比pET30a-EDDIE-GFP质粒分子量小。

图7是克隆抗菌肽诱导表达后，进行的14％ SDS-PAGE检测电泳图。其中1泳道：027诱导表达前；2泳道：027诱导表达6个小时后；3泳道：803诱导表达前；4泳道：803诱导表达6个小时后；5泳道：054诱导表达前；6泳道：054诱导表达6个小时后；7泳道：099诱导表达前；8泳道：099诱导表达6个小时后；9泳道：726诱导表达前；10泳道：726诱导表达6个小时后；11泳道：801诱导表达前；12泳道：801诱导表达6个小时后。由图我们可以看出六种抗菌肽均有表达，并以包涵体的形式存在。

图8为管碟法测定抗菌肽027的抗菌活性图。

图9为管碟法测定抗菌肽054的抗菌活性图。

图10为管碟法测定抗菌肽099的抗菌活性图。

图11为管碟法测定抗菌肽801的抗菌活性图。

图12为管碟法测定抗菌肽803抗菌活性图。

图13为管碟法测定抗菌肽726的抗菌活性图。

其中a：抗菌肽对酵母菌的抑菌活性检测；

b：抗菌肽对大肠杆菌的抑菌活性检测；

c：抗菌肽对藤黄八叠球菌的抑菌活性检测；

B：复性缓冲液； IB：包涵体N(PRO) -抗菌肽；

图片表明用载体PET30a--EDDIE-gfp克隆的六种抗菌肽的抗菌活性菌均正确显示。

具体实施方式

实施例1 （构建pET30a--EDDIE-GFP载体的实施例）

B、将引物Pf和Pr以pET30a-EDDIE-CAD为模板进行反扩，获得去掉编码CAD的基因并带有GFP基因片段两端的同源臂的长基因片段；将引物Gf和Gr以pET23a-GFP为模板扩增，获得GFP基因片段，并且胶回收反扩产物和扩增产物；

C、将B步骤的两种扩增产物以1：4的量转入到XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,涂布带有卡那霉素抗性的LB平板Kana50u/ml, 37 ℃培养过夜，在蓝光仪下观察平板（如图1），将发光的绿色荧光单菌落做好标记；

D、将标记好的发绿色荧光的单菌落接种培养，抽提质粒,琼脂糖凝胶检测（如图2）；

E、将上步骤获得的分子量大小在7K左右的质粒进行GFP PCR检测（如图3）,然后将GFP PCR检测为阳性结果的质粒送上海英骏生物公司测序验证；该质粒即为载体pET30a-EDDIE-GFP。

实施例2（即抗菌肽AP00027的完整制备过程）

A、以实施例1构建好的pET30a--EDDIE-GFP载体为模板，以表1中设计的引物027F和027R进行重叠反向PCR；

B、将反扩产物直接转入XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,涂布带有卡那霉素抗性的LB平板（50u/ml）, 37 ℃培养过夜，次日在蓝光仪下观察平板，将不发绿色荧光的单菌落做好标记（如图4中1）；

C、将标记的不发绿色荧光的单菌落接种含有卡那霉素抗性的LB液体培养基（50u/ml）, 37 ℃培养过夜，抽提质粒，跑琼脂糖凝胶检测（如图6中泳道1）；

D、将分子量大小正确的质粒送去上海英骏生物公司测序，样品测序正确；

E、将测序正确的质粒再次转入到XL-GOLD感受态细胞中，抽提质粒，获得量含目的抗菌肽的质粒；

F、选取测序正确的抗菌肽AP00027表达质粒，转化到BL21(DE3)工程菌，进行表达（如图7），检测其抗菌活性（如图8）。

实施例3（即抗菌肽AP00054的完整制备过程）

A、以构建好的pET30a--EDDIE-GFP载体为模板，以表1中设计的引物054F和054R进行重叠反向PCR；

B、将反扩产物直接转入XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,涂布带有卡那霉素抗性的LB平板（50u/ml）, 37 ℃培养过夜，次日在蓝光仪下观察平板，将不发绿色荧光的单菌落做好标记（如图4中2）；

C、将标记的不发绿色荧光的单菌落接种含有卡那霉素抗性的LB液体培养基（50u/ml）, 37 ℃培养过夜，抽提质粒，跑琼脂糖凝胶检测（如图6中跑泳到2）；

F、选取测序正确的抗菌肽AP00054表达质粒，转化到BL21(DE3)工程菌，进行表达（如图7），检测其抗菌活性（如图9）。

实施例4（即抗菌肽AP00099的完整制备过程）

A、以构建好的pET30a--EDDIE-GFP载体为模板，以表1中设计的引物099F和099R进行重叠反向PCR；

B、将反扩产物直接转入XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,涂布带有卡那霉素抗性的LB平板（50u/ml）, 37 ℃培养过夜，次日在蓝光仪下观察平板，将不发绿色荧光的单菌落做好标记（如图4中3）；

C、将标记的不发绿色荧光的单菌落接种含有卡那霉素抗性的LB液体培养基（50u/ml）, 37 ℃培养过夜，抽提质粒，跑琼脂糖凝胶检测（如图6中泳道3）；

F、选取测序正确的抗菌肽AP00099表达质粒，转化到BL21(DE3)工程菌，进行表达（如图7），检测其抗菌活性（如图10）。

实施例5（即抗菌肽AP00801的完整制备过程）

A、以构建好的pET30a--EDDIE-GFP载体为模板，以表1中设计的引物801F和801R进行重叠反向PCR；

B、将反扩产物直接转入XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,涂布带有卡那霉素抗性的LB平板（50u/ml）, 37 ℃培养过夜，次日在蓝光仪下观察平板，将不发绿色荧光的单菌落做好标记（如图4中4）；

C、将标记的不发绿色荧光的单菌落接种含有卡那霉素抗性的LB液体培养基（50u/ml）, 37 ℃培养过夜，抽提质粒，跑琼脂糖凝胶检测（如图6中泳道4）；

F、选取测序正确的抗菌肽AP00801表达质粒，转化到BL21(DE3)工程菌，进行表达（如图7），检测其抗菌活性（如图11）。

实施例6（即抗菌肽AP00803的完整制备过程）

A、以构建好的pET30a--EDDIE-GFP载体为模板，以表1中设计的引物803F和803R进行重叠反向PCR；

B、将反扩产物直接转入XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,涂布带有卡那霉素抗性的LB平板（50u/ml）, 37 ℃培养过夜，次日在蓝光仪下观察平板，将不发绿色荧光的单菌落做好标记（如图4中5）；

C、将标记的不发绿色荧光的单菌落接种含有卡那霉素抗性的LB液体培养基（50u/ml）, 37 ℃培养过夜，抽提质粒，跑琼脂糖凝胶检测（如图6中泳道5）；

F、选取测序正确的抗菌肽AP00803表达质粒，转化到BL21(DE3)工程菌，进行表达（如图7），检测其抗菌活性（如图12）。

实施例7（即抗菌肽AP00726的完整制备过程）

A、以构建好的pET30a--EDDIE-GFP载体为模板，以表1中设计的引物726F和726R进行重叠反向PCR；

B、将反扩产物直接转入XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,涂布带有卡那霉素抗性的LB平板（50u/ml）, 37 ℃培养过夜，次日在蓝光仪下观察平板，将不发光的单菌落做好标记（如图4中6）；

C、将标记的不发绿色荧光的单菌落接种含有卡那霉素抗性的LB液体培养基（50u/ml）, 37 ℃培养过夜，抽提质粒，跑琼脂糖凝胶检测（如图6中泳道6）；

F、选取测序正确的抗菌肽AP00726表达质粒，转化到BL21(DE3)工程菌，进行表达（如图7），检测其抗菌活性（如图13）。

Claims

1.一种高效克隆抗菌肽编码基因的新方法，其特征在于步骤为：

⑴构建了一种高效克隆载体pET30a--EDDIE-GFP；

A、设计两对引物Gf、Gr和Pf、Pr，引物Gf和Gr为 GFP基因扩增引物；引物Pf和Pr为反扩引物，带有GFP基因片段两端的同源臂；

C、将B步骤的两种扩增产物以1：4的量转入到XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,涂布带有卡那霉素抗性的LB平板Kana50u/ml, 37 ℃培养过夜，在蓝光仪下观察平板，将发光的绿色荧光单菌落做好标记；

D、将标记好的发光的单菌落接种培养，抽提质粒,琼脂糖凝胶检测；

E、将上步骤获得的分子量大小在7K左右的质粒进行GFP PCR检测,然后将GFP PCR检测为阳性结果的质粒送上海英骏生物公司测序验证；该质粒即为载体pET30a-EDDIE-GFP；

⑵高效克隆抗菌肽；

A、根据目的抗菌肽分子量和抗菌特点设计引物；

C、将反扩产物直接转入XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,涂布带有卡那霉素抗性的LB平板Kana50u/ml, 37 ℃培养过夜，次日在蓝光仪下观察平板，将不发光的白色单菌落做好标记；

D、将有标记的不发绿色荧光的白色单菌落接种含有卡那霉素抗性的LB液体培养基(50u/ml), 37 ℃培养过夜，抽提质粒，用琼脂糖凝胶电泳检测；

E、将分子量大小正确的质粒测序；

G、将抗菌肽表达质粒，转化到BL21(DE3)工程菌，进行表达并检测其抗菌活性。

2.根据权利要求1所述的一种高效克隆抗菌肽编码基因的新方法，其特征在于目的抗菌肽为AP00027的完整制备步骤：

A、以pET30a--EDDIE-gfp载体为模板，以设计的相应一对引物进行重叠反向PCR；

B、将反扩产物直接转入XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,涂布带有卡那霉素抗性的LB平板Kana50u/ml, 37 ℃培养过夜，次日在蓝光仪下观察平板，将不发光的单菌落做好标记；

C、将标记的不发绿色荧光的单菌落接种含有卡那霉素抗性的LB液体培养基Kana50u/ml, 37 ℃培养过夜，抽提质粒，用琼脂糖凝胶电泳检测；

D、将分子量大小正确的质粒送测序；

F、选取测序正确的抗菌肽AP00027表达质粒，转化到BL21(DE3)工程菌，进行表达和检测其抗菌活性。

3.根据权利要求1或2所述的一种高效克隆抗菌肽编码基因的新方法，其特征在于目的抗菌肽为AP00054，或抗菌肽AP00099，或抗菌肽AP00027，或抗菌肽AP00726，或抗菌肽AP00801，或抗菌肽AP00803，或其他抗菌肽。