CN115261333B - NT-proBNP杂交瘤细胞株及单克隆抗体、试纸条及检测试剂盒 - Google Patents

NT-proBNP杂交瘤细胞株及单克隆抗体、试纸条及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种NT‑proBNP杂交瘤细胞株及单克隆抗体、试纸条及检测试剂盒。本发明涉及生物标记物免疫检测技术领域，特别是涉及NT‑proBNP杂交瘤细胞株及单克隆抗体、试纸条及检测试剂盒。本发明提供的NT‑proBNP单克隆抗体杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.45158。本发明取得的技术效果为：此细胞株分泌的单克隆抗体，对NT‑ProBNP具有较好的检测灵敏度，可用于制备NT‑ProBNP的免疫检测试剂盒以及试纸条，用于心脑血管疾病的早期快速诊断。

Description

NT-proBNP杂交瘤细胞株及单克隆抗体、试纸条及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物标志物免疫检测技术领域，具体涉及NT-proBNP杂交瘤细胞株及单克隆抗体、试纸条及检测试剂盒。
背景技术
人氨基端B型利钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)是心肌细胞在合成多肽类激素B型利钠肽(BNP)过程中产生的生物活性未知的由76个氨基酸组成的直链多肽片段。我国发布的《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》中推荐对心衰高危人群(A群)进行利钠肽BNP/NT-proBNP筛查及干预，截点值为NT-proBNP≥125pmol/L或BNP≥35pg/mL。
NT-proBNP作为检测心衰的特异性标志物，其检测方法主要有胶体金免疫层析、荧光免疫层析、上传换发光免疫层析、磁性纳米粒子免疫层析等即时检测技术(POCT)，以及酶联免疫吸附剂测定(ELISA)技术和基于各种传感器的其他生物检测技术。
POCT是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、步骤少、检测成本低而且操作简便，适用于个体现场快速检测，因此在疾病检测领域得到了广泛应用。而使用试纸条的前提是得到对NT-proBNP具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，然而，目前常规方法获得的单克隆抗体通常难以满足POCT检测的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了NT-proBNP杂交瘤细胞株及单克隆抗体、试纸条及检测试剂盒，该NT-proBNP单克隆抗体杂交瘤细胞株能够分泌的NT-proBNP单克隆抗体，具有特异性和灵敏度高、稳定性好、检测成本低、操作便捷等优点。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一株NT-proBNP单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2022年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株2A7，保藏编号：CGMCC No.45158，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明第二方面提供了一种NT-proBNP单克隆抗体，由前述的NT-proBNP单克隆抗体杂交瘤细胞株产生。
本发明第三方面提供了一种试纸条，含有前述的NT-proBNP单克隆抗体。
本发明第四方面提供了一种检测试剂盒，含有前述的NT-proBNP单克隆抗体杂交瘤细胞株，或前述的NT-proBNP单克隆抗体。
本发明第五方面提供了一种检测试剂盒，含有前述的试纸条。
本发明取得的有益效果是：本发明利用pET-21a(+)、pGEX-4T-2基因载体和BL21(DE3)蛋白表达菌株，采用IPTG诱导表达NT-proBNP的N端添加GST标签和C端添加HIS标签的基因重组全抗原，将GST标签的重组全抗原用于免疫抗原，HIS标签基因重组全抗原为检测抗原，以PEG为融合剂将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，利用HTS-ELISA方法筛选融合杂交瘤细胞，再经过多次亚克隆，最终得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体对NT-proBNP具有较好的检测灵敏度(IC50值为0.078ng/mL)，可用于制备NT-proBNP的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，用于心脑血管疾病的早期快速诊断。
附图说明
图1是完全抗原NT-proBNP-GST的质粒图谱；
图2是纯化的GST标签蛋白样品的SDS-PAGE结果图；
图3是纯化的HIS标签蛋白样品的SDS-PAGE结果图。
图4是NT-proBNP单克隆抗体对NT-proBNP的抑制标准曲线
具体实施方式
本发明公开了NT-proBNP杂交瘤细胞株及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中涉及的实验所需试剂耗材以及仪器设备如下表所示：
Figure GDA0003920648710000031
Figure GDA0003920648710000041
实施例
由于NT-proBNP分子量小、免疫原性弱，不易刺激小鼠产生免疫应答。为此，本实施例通过基因工程技术，采用IPTG诱导表达NT-proBNP，在C端添加HIS标签、在N端添加GST标签，通过基因重组获得免疫完全抗原NT-proBNP-GST。
第一、在NT-proBNP的N端加入GST标签。
NT-proBNP的氨基酸序列为公知的。其中，载体：pGEX-4T-2，菌株：BL21(DE3)，质量：35.5KDa。将制备好的菌株进行培养及诱导表达，步骤为：
S1、大肠杆菌的培养：含有目标蛋白载体的大肠杆菌BL21的扩增及培养。
S2、大肠杆菌的诱导表达：通常情况下采用IPTG(半乳糖)诱导系统进行诱导表达。
S3、大肠杆菌表达蛋白的提取：大肠杆菌的破碎及蛋白提取。
S4、大肠杆菌的纯化：利用GST标签纯化柱进行纯化。
以上步骤S1～S4的详细过程为：
利用微量移液器(1-200ul)，提取大约50ul的甘油菌-菌液(GST标签+NT-proBNP)，将菌液和枪头直接打入到带有LB完全培养基的试管中(5mlLB完全培养基)37度，摇床过夜培养(200转速)。
过夜培养后，继续加10倍的培养基37度继续培养1小时。
进行检测，菌液的OD600达到0.5-0.7，并且OD600最好接近0.6，可进行下一步诱导操作。
加入高浓度IPTG(1M)至终浓度为1mM，继续培养4-5小时，诱导温度30度。收集菌液至离心管中，4℃、4,000g离心20min或4℃、15,000g离心1min，弃上清，收集沉淀。
对于新鲜的或解冻的细菌沉淀，按照每ml收集的细菌沉淀加入100ul-200ul非变性裂解液的比例加入裂解液，充分重悬菌体。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物。
加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20℃保存。
冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。(重复操作1次)。
4℃、10,000g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。取20μl上清留作后续检测用。注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。
取1ml混合均匀的50％中科森辉GST-tag Purification Resin，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入0.5ml非变性裂解液混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，再重复重复平衡1-2次，弃去液体。将约4ml细菌裂解液上清加入其中，4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min-3h。
将裂解液和中科森辉GST-tag Purification Resin的混合物装入试剂盒提供的亲和层析柱空柱管中。
将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20微升穿流液作后续分析用。
洗柱5次，每次加入0.5-1ml非变性洗涤液，每次均收集约20微升穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。洗柱及下一步洗脱过程中可以用SDS-PAGE胶检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。
洗脱目的蛋白6-10次，每次用0.5ml非变性洗脱液洗脱。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的GST标签蛋白样品。
图1是制备的NT-proBNP-GST的质粒图谱。
图2是纯化的GST标签蛋白样品的SDS-PAGE结果图。
第二、在NT-proBNP的C端加入HIS标签。
其中，载体：pET21，菌株：BL21(DE3)，质量：9.3KDa。
将制备好的菌株进行培养及诱导表达，步骤为：
S1、大肠杆菌的培养：含有目标蛋白载体的大肠杆菌BL21的扩增及培养。
S2、大肠杆菌的诱导表达：通常情况下采用IPTG(半乳糖)诱导系统进行诱导表达大肠杆菌的破碎及蛋白提取。
S3、大肠杆菌的纯化：利用HIS标签纯化柱进行纯化。
以上步骤S1～S3的详细过程为：
利用微量移液器(1-200ul)，提取大约50ul的甘油菌-菌液(NT-proBNP+HIS标签)，将菌液和枪头直接打入到带有LB完全培养基的试管中(5mlLB完全培养基)37度，摇床过夜培养(200转速)。
过夜培养后，继续加10倍的培养基37度继续培养1小时。
进行检测，菌液的OD600达到0.5-0.7，并且OD600最好接近0.6，可进行下一步诱导操作。
加入高浓度IPTG(1M)至终浓度为1mM，继续培养4-5小时，诱导温度30度。
收集菌液至离心管中，4℃、4,000g离心20min或4℃、15,000g离心1min，弃上清，收集沉淀。
对于新鲜的或解冻的细菌沉淀，按照每ml收集的细菌沉淀加入100ul-200ul非变性裂解液的比例加入裂解液，充分重悬菌体。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物。
加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。需要说明的是，溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20℃保存。
冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。(重复操作1次)
4℃、10,000g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。取20μl上清留作后续检测用。需要说明的是，上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。
取1ml混合均匀的50％中科森辉HIS-tag Purification Resin，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入0.5ml非变性裂解液混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，再重复重复平衡1-2次，弃去液体。将约4ml细菌裂解液上清加入其中，4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min-3h。
将裂解液和中科森辉HIS-tag Purification Resin的混合物装入试剂盒提供的亲和层析柱空柱管中。
将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20微升穿流液作后续分析用。
洗柱5次，每次加入0.5-1ml非变性洗涤液，每次均收集约20微升穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。洗柱及下一步洗脱过程中可以用SDS-PAGE胶检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。
洗脱目的蛋白6-10次，每次用0.5ml非变性洗脱液洗脱。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的HIS标签蛋白样品。
图3是纯化的HIS标签蛋白样品的SDS-PAGE结果图。
第三、免疫动物与细胞融合。
其中，SP2/0细胞购于广州赛库生物技术有限公司，BABL/C小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2016-0009，SPF级，雄性。
(1)动物免疫
选用8只6周龄BABL/C小鼠进行免疫，免疫原为完全抗原NT-proBNP-GST，每次免疫剂量为30μg/只，皮下及腹腔注射，每两周免疫一次。初次免疫采用弗氏完全佐剂乳化完全抗原，2-3次免疫采用弗氏不完全佐剂乳化完全抗原。第3次免疫10天后断尾采血，用间接ELISA法检测血清效价。
用包被液(碳酸盐缓冲液)将NT-proBNP-HIS稀释到0.1ng/ml浓度后，按每孔100μl/孔包被酶标板，常温过夜后用洗涤液(含0.05％吐温-20的PBS)洗板3次。加封闭液(1％牛血清蛋白液)100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。待检血清样品倍比稀释后，100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。酶标二抗以1：5000倍PBS稀释后加入100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。加入TMB底物溶液100μl/孔，避光静置10min，加终止液(2M的H2SO4)50μl/孔,采用酶标仪测定450nm处OD值。当OD值大于或等于阴性对照OD值2倍时的最高血清稀释倍数为血清效价。经实际检测发现，第3次免疫后小鼠血清平均效价可超过1：105以上。
(2)细胞融合、筛选与克隆
SP2/O骨髓瘤细胞的准备：融合前36-48h将培养好处于对数生长期的骨髓瘤细胞扩大培养，融合前用弯头吸管将细胞从细胞培养瓶壁上吹下，收集于50ml离心管中，1200rpm离心4分钟，弃上清。再加入20ml的1640培养液，重悬混匀，1200rpm离心4分钟，弃上清，加10ml的1640培养液，重悬混匀。取细胞悬液0.1ml，再加入0.9ml的1％台盼兰，混匀，滴于计数板上显微镜下计数，备用。
脾细胞的准备：选择抗血清效价1：105以上的BABL/C小鼠于融合前3天腹腔加强免疫1次，免疫原为NT-proBNP-GST，20ug/只，不加佐剂。融合前摘小鼠眼球放血，颈部脱臼处死，75％酒精浸泡消毒，然后将小鼠固定于生物安全柜的鼠板上。无菌打开腹腔，取出脾脏，于含10ml的1640培养液的平皿中洗涤两次，去掉周围的脂肪组织与结缔组织，置于含10ml的1640培养液的平皿中。取200目网筛放于平皿中，加1640培养液至浸没网筛，将脾脏置于网筛上培养液中，用L型棒轻轻挤压脾脏，使脾细胞完全进入培养液中。将脾细胞液吸入50ml离心管中，1400rpm离心4分钟，弃上清液，再加10ml的1640培养液，重悬混匀。同上细胞计数，备用。
细胞融合：取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞按1:1细胞数融合后，利用添加1％HAT和10％FBS的1200mL的1640培养基稀释融合细胞后280uL/孔均分到45块96孔平底细胞培养板中，在5％ CO2和37℃的培养箱中封闭培养10-12天。10-12天后利用Transtar-96移液器在无菌净化操作台内分别取上清液50μL/孔分别转移到预先准备好的与细胞培养板相对应的并包被有NT-proBNP-HIS和GST的各45块ELISA板中，利用HTS-ELISA高通量检测方法筛选阳性杂交瘤细胞孔。
阳性克隆的筛选和克隆：10天后在吸取上清液进行阳性孔的筛选，筛选采用在预先准备好的GST和NT-proBNP-HIS包被板各45块96孔板分别添加上清液后孵育，基于经典的间接ELISA的洗板、加2抗、加显色液、加终止液后用酶标仪测定OD值，选择在NT-proBNP-HIS包被板中的显阳性而在GST包被板中显阴性的细胞孔为第一次筛选对象，利用显微操作技术分别吸取阳性孔的各个融合细胞集落转入新的96孔培养板中培养，培养基变色后进行Confirm-ELISA，收集确认的阳性细胞株进行培养，取单个克隆孔的细胞上清液进行抗体检测，检测结果为阳性的克隆继续扩大培养后冻存以及用于制备抗体。
(3)单克隆抗体的制备和纯化
将确认的阳性细胞株扩大培养后转入1升转瓶中培养14天，收集培养液离心后1：1与PBS缓冲液混合过蛋白A/G柱，用pH3.7的洗脱液进行洗脱，通过Amicon搅拌式超滤装置利用3万分子量的超滤膜进行浓缩，浓缩液利用GE公司的超微量紫外分光光度计定量后分装后进行冷冻干燥并保存。
(4)单克隆抗体与其他蛋白之间交叉反应率的测定
以包被原NT-proBNP-HIS包被酶标板，100ul/孔，4℃过夜，倒出孔内液体，洗涤液(含0.05％吐温20的PBS液)洗涤3次。加封闭液(1％牛血清蛋白液)100ul/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次。取不同稀释浓度(100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml、0ng/ml)的NT-proBNP标准品以及其他蛋白表达物与等体积适度浓度(0.1ug/ml)的单抗1:1混合添加到包被板中，100ul/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤三次。再加酶标二抗(1：2000倍稀释)，100ul/孔，37℃温育1h，洗涤3次。加入TMB底物溶液150ul/孔，避光静置10min，加终止液(2MH2SO4)50ul/孔，采用酶标板测定450nm处各孔的吸光率(A)。结果表明，本发明细胞株分泌的单克隆抗体与非NT-proBNP物质的交叉反应率小于1％。
综上可知，本发明利用pET-21a(+)、pGEX-4T-2基因载体和BL21(DE3)蛋白表达菌株，采用IPTG诱导表达NT-proBNP的N端添加GST标签的免疫全抗原和C端添加HIS标签的检测抗原作为单克隆抗体分泌细胞株的筛选抗原，将N端添加GST标签的免疫全抗原使用弗氏佐剂乳化后，注射免疫BALB/c小鼠。经三次免疫和一次加强免疫，选血清效价高的小鼠脾细胞，通过PEG诱导融合方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，利用HTS-ELISA方法筛选出特异性识别NT-proBNP的融合杂交瘤细胞；再经过四次亚克隆，最终得到单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体对NT-proBNP具有较好的检测灵敏度，IC50值为0.078ng/mL(见图4)，适用于NT-proBNP的免疫分析，进而可用于制备心脑血管疾病的早期诊断试剂盒。
此外，利用本发明中上述方法产生的NT-proBNP单克隆抗体或者NT-proBNP单克隆抗体杂交瘤细胞株，制成包含该NT-proBNP单克隆抗体杂交瘤细胞株或者其所分泌的NT-proBNP单克隆抗体的试纸条或者检测试剂盒，或者使用该试纸条的检测试剂盒，用于对NT-ProBNP进行检测，都属于现有技术，在此不再赘述。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一株NT-proBNP单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，已于2022年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株2A7，保藏编号为：CGMCC No.45158，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种NT-proBNP单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的NT-proBNP单克隆抗体杂交瘤细胞株产生。
3.一种试纸条，其特征在于，含有权利要求2所述的NT-proBNP单克隆抗体。
4.一种检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的NT-proBNP单克隆抗体杂交瘤细胞株，或权利要求2所述的NT-proBNP单克隆抗体。
5.一种检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的试纸条。
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