CN115975052B - 一种猪瘟病毒的融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种猪瘟病毒的融合蛋白及其应用，属于生物技术领域。本发明提供的猪瘟病毒的融合蛋白为猪瘟病毒的C蛋白、Erns蛋白和NS3蛋白的部分抗原表位经串联得到，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或由其组成。本发明提供的融合蛋白在原核表达系统中的表达量明显提高，且由其制备的抗体检测试剂盒对猪瘟病毒抗体的阳性检出率显著提高，并可准确鉴别区分猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗免疫抗体与猪瘟病毒野毒感染抗体，有助于猪场净化。

Description

一种猪瘟病毒的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒的融合蛋白及其应用，尤其涉及一种用于猪瘟病毒抗体检测的融合蛋白及其在检测猪瘟病毒抗体、鉴别免疫抗体来源中的应用。

背景技术

猪瘟(Infection with classical swine fever virus，简称CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的、发生在猪上的一种高度急性、热性、接触性传染病。该病有最急性型、急性型、亚急性型、慢性型、温和型之分。该病以发病急、发生高热稽留和细小血管壁变性、全身泛发性小点出血、脾梗死为特征。

目前对猪瘟的防控，主要采用疫苗免疫的方式，一般是兔化弱毒株制成的疫苗，包括细胞苗或脾淋苗等。这两种疫苗均为全病毒疫苗，与猪瘟病毒野毒感染产生的抗体类似，因此难以进行鉴别诊断，即猪瘟病毒细胞苗和脾淋苗免疫产生的抗体无法与野毒感染产生的抗体进行区分。从蛋白质学上看，猪瘟病毒表达多种蛋白，包括E2、Erns、C、NS2、NS3、NS4、NS5，其中E2蛋白被公认为是能够产生中和抗体的蛋白，也是猪瘟病毒亚单位疫苗的首选靶标。因此，目前一些疫苗厂家开始研制或生产猪瘟亚单位E2疫苗，由于该亚单位疫苗仅产生E2的抗体，不产生其他蛋白比如C蛋白、Ern蛋白等的抗体，这就为猪瘟净化和鉴别诊断提供了可能。

目前市售商品化的用于猪瘟病毒抗体检测的ELISA试剂盒基本都是采用Erns蛋白作为检测靶标，但是基于Erns蛋白的试剂盒都存在抗体检出率低的现象，尤其是猪瘟疫苗细胞苗或脾淋苗免疫后，抗体阳性率远远低于预期，一般仅能达到10-30％的水平，这明显与免疫预期不符。也有文献报道(请参见刘春红，猪瘟病毒C、NS5A、NS5B蛋白原核表达及应用，硕士学位论文，湖南农业大学，网络出版时间：2011-02-16—2011-03-15)，也可采用C蛋白作为检测靶标，且实际使用效果略好于Erns蛋白，但是C蛋白产生的抗体持续时间短，存在因抗体转阴而误判的现象。也有人用NS3、NS4等蛋白作为检测的靶标(例如专利文献CN102841209A或CN104098658A)，但尚无市售的基于NS3、NS4等蛋白的ELISA试剂盒。然而，以上这些蛋白作为检测靶标都存在不同程度的检出率低的现象，而且难以准确鉴别猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫抗体与野毒感染抗体，也难以准确鉴别区分猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫抗体(仅产生E2的抗体)与猪瘟细胞苗或脾淋苗的疫苗免疫抗体。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种猪瘟病毒的融合蛋白，其包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方式中，所述猪瘟病毒的融合蛋白还进一步携带有用于蛋白纯化的标签。

在一些实施方式中，所述标签包括His标签。

本发明另一方面提供一种编码上述的猪瘟病毒的融合蛋白的基因。

在一些实施方式中，所述基因包含如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或由其组成。

上述的猪瘟病毒的融合蛋白在制备检测猪瘟病毒抗体的试剂盒或试剂中的应用也属于本发明的内容，具体地，本发明另一方面还提供一种用于检测猪瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，其中使用上述的猪瘟病毒的融合蛋白作为包被抗原。

本发明再一方面提供一种检测猪瘟病毒抗体的非疾病诊断目的方法，其包括使用上述的ELISA试剂盒对待测样品进行检测，并计算所述待测样品的S/P值，其中S/P值的计算公式为：

若S/P≥0.4，则判为猪瘟病毒抗体阳性；若S/P＜0.4，则判为猪瘟病毒抗体阴性。

在一些实施方式中，所述猪瘟病毒抗体包括猪瘟病毒野毒感染抗体、和猪瘟病毒细胞苗或脾淋苗免疫后抗体。

本发明再一方面提供一种鉴别区分猪瘟病毒野毒感染抗体与猪瘟病毒亚单位E2疫苗免疫后抗体的非疾病诊断目的方法，其包括使用上述的ELISA试剂盒对待测样品进行检测，并计算所述待测样品的S/P值，其中S/P值的计算公式为：

若S/P≥0.4，则判为猪瘟病毒野毒感染抗体；若S/P＜0.4，则判为猪瘟病毒亚单位E2疫苗免疫后抗体。

本发明再一方面还提供一种鉴别区分猪瘟病毒细胞苗或脾淋苗免疫后抗体与猪瘟病毒亚单位E2疫苗免疫后抗体的非疾病诊断目的方法，其包括使用权利要求7所述的ELISA试剂盒对待测样品进行检测，并计算所述待测样品的S/P值，其中S/P值的计算公式为：

若S/P≥0.4，则判为猪瘟病毒细胞苗或脾淋苗免疫后抗体；若S/P＜0.4，则判为猪瘟病毒亚单位E2疫苗免疫后抗体。

基于以上技术方案，提供的猪瘟病毒的融合蛋白为猪瘟病毒的C蛋白、Erns蛋白和NS3蛋白的部分抗原表位经串联得到，其可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或由其组成。实施例结果表明，本发明提供的融合蛋白在原核表达系统中的表达量明显提高，且由其制备的抗体检测试剂盒(例如ELISA试剂盒)对猪瘟病毒抗体(可包括猪瘟病毒野毒感染抗体、猪瘟病毒细胞苗或脾淋苗免疫抗体)的阳性检出率显著提高，并可准确鉴别区分猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗免疫抗体与猪瘟病毒野毒感染抗体，以及准确鉴别区分猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗免疫抗体与猪瘟病毒细胞苗或脾淋苗免疫抗体。因此本发明提供的融合蛋白可有助于解决现有技术中存在的猪瘟病毒抗体检测试剂盒对猪瘟病毒野毒感染抗体、猪瘟病毒细胞苗或脾淋苗免疫抗体等的检出率低的问题，这有助于对猪瘟病毒疫苗(例如细胞苗或脾淋苗)的免疫效果进行评价，且可在猪瘟病毒净化(通过与猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗免疫结合使用，以净化猪瘟病毒野毒感染的个体)的检测与监测中起到重要作用。

附图说明

图1为猪瘟病毒C蛋白、Erns蛋白、NS3蛋白、融合蛋白PS1和PS2纯化后的电泳胶图。

具体实施方式

本发明旨在提供一种能够提高猪瘟病毒野毒感染的抗体检出率，且能够用于猪瘟病毒抗体的鉴别区分的融合蛋白，并提供了该融合蛋白的制备方法及其在鉴别区分猪瘟病毒抗体中的应用。

为了实现上述目的，发明人将该融合蛋白设计为由猪瘟病毒的C蛋白、Erns蛋白和NS3蛋白的部分抗原表位串联得到，工作过程包括：根据NCBI上猪瘟病毒Alfort/187毒株的氨基酸序列(YP_009508222.1)，选择猪瘟病毒的C蛋白、Erns蛋白和NS3蛋白的序列，利用在线抗原分析软件(http://www.iedb.org/和http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/)特别对猪瘟病毒的非E2区域(包括C蛋白，Erns蛋白，NS3蛋白)进行B细胞抗原表位分析，共获得20个潜在的抗原表位(其中C蛋白5个，Erns蛋白13个，NS3蛋白2个)，随后将这些抗原表位按照不同的组合串联起来，得到众多不同的融合蛋白(例如当串联表达5个不同的抗原表位作为融合蛋白时，存在接近20*20*20*20*20种可能的融合蛋白(即320000种可能性))。发明人根据前期的研究结果以及使用这些融合蛋白鉴别猪瘟病毒抗体的检出率结果，最终从这些众多的融合蛋白中筛选得到一种能够有效解决猪瘟病毒抗体检出率低且无法准确鉴别区分猪瘟病毒抗体的问题的融合蛋白，还出乎意料的是，相对于猪瘟病毒的C蛋白、Erns蛋白、和NS3蛋白的重组表达，该融合蛋白在原核表达系统中的表达量显著提高。基于此，本发明还提供一种用于检测、或鉴别区分猪瘟病毒抗体的ELISA试剂盒及方法。以下将结合实施例详述。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

实施例1：猪瘟病毒蛋白的表达及纯化

1.1材料：

质粒PET28a(+)、大肠杆菌BL21感受态细胞、蛋白质分子质量标准均购自Takara公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ均购自NEB公司；HisTrap FF镍柱购自基因公司；LB液体培养基、LB平板培养基(含卡那霉素)、IPTG、卡那霉素、12％SDS-PAGE蛋白胶、咪唑、考马斯亮蓝购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2方法：

1.2.1猪瘟病毒5种蛋白的基因合成及重组表达载体的构建和鉴定

为解决现有技术中对猪瘟病毒抗体的检出率低、无法准确鉴别区分猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫抗体与野毒感染抗体，以及猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫抗体与猪瘟细胞苗或脾淋苗的疫苗免疫抗体的问题，发明人结合对猪瘟病毒的研究成果，做出如下创新：根据NCBI上猪瘟病毒Alfort/187毒株的氨基酸序列(YP_009508222.1)，选择猪瘟病毒的C蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)、Erns蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)和NS蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)的序列，利用在线抗原分析软件(http://www.iedb.org/和http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/)对以上3种猪瘟病毒蛋白(C蛋白、Erns蛋白、NS3蛋白)进行抗原表位分析，共获得20个潜在的抗原表位，其中C蛋白5个、Erns蛋白13个、NS3蛋白2个抗原表位。利用蛋白分析软件Protean对这20个抗原表位进行随机组合(将多个不同的抗原表位(例如通过利于氨基酸序列折叠的柔性肽(G4S))串联连接)，获得众多的融合蛋白，通过结构分析锁定某些融合蛋白，表达后用其进行猪瘟病毒抗体检测(参见实施例2，检测操作及指标为本发明特别设计)，基于对猪瘟病毒抗体的检出率结果，从众多融合蛋白中确定出能够提高猪瘟病毒野毒感染的抗体检出率，且能够准确鉴别区分猪瘟病毒抗体的融合蛋白。

该实施例以众多融合蛋白中的两种融合蛋白(分别命名为PS1和PS2，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示)的表达和纯化为例做具体说明。另外，该实施例中还同时重组表达和纯化了猪瘟病毒的C蛋白、Erns蛋白和NS3蛋白。

该实施例中，还在上述SEQ ID NO:1-5所示的氨基酸序列上连接了利于后期纯化的His标签(HHHHHH，如SEQ ID NO:6所示)，并根据Ecoli宿主细胞密码子的偏好性，将各氨基酸序列翻译为核酸序列，分别如SEQ ID NO:7-11(分别对应SEQ ID NO:1-5)所示，并将这些核酸序列分别与克隆载体PET28a(+)进行连接得到重组表达载体，分别命名为PET28a(+)-C，PET28a(+)-Erns，PET28a(+)-NS3，PET28a(+)-PS1和PET28a(+)-PS2，采用基因全合成的方式直接合成全基因，以上全基因合成、连接和测序鉴定过程全部委托武汉奥科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2.2BL21感受态细胞转化

将10ng PET28a(+)-C、PET28a(+)-Erns、PET28a(+)-NS3、PET28a(+)-PS1和PET28a(+)-PS2质粒分别与50μL的BL21感受态细胞混匀于1.5mL EP管中，42℃热冲击90s后，置于冰上5min，每管分别加入500μL的LB培养基在37℃，220rpm摇床上培养45min。将适当体积的菌液均匀涂于卡那霉素抗性(质粒抗性)的平板，待菌液被吸收完全，将平皿倒置培养约12-16h，可见单菌落出现。

1.2.3猪瘟病毒5种重组蛋白的表达和提取

将上述步骤1.2.2中转化不同质粒的BL21单菌落分别接种于10mL含0.1mg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养12-16h；取培养过夜的菌液，以1:100的比例分别接种于500mL的卡那霉素LB培养基中，37℃下220rpm培养至OD600＝0.6-0.8(3-4h)；加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，16℃诱导表达12-24h；5000rpm离心10min收集菌体，用10mL PBS洗涤1次再次离心弃去上清，5mL PBS再次重悬沉淀；置冰浴超声仪中超声波裂解30min(200W，间隔5s，每次持续1s)，直至液体澄清透明；超声完毕后于4℃，10000rpm离心10min分离超声产物上清蛋白液和沉淀。

1.2.4猪瘟病毒5种重组蛋白的纯化：

将上述步骤1.2.3获得的离心上清蛋白液各收集约100mL，进行Ni柱亲和层析，具体包括以下操作：

首先使用0.45μm的滤膜对蛋白液进行过滤，将蛋白液缓慢加入到纯化柱中，再用平衡液(PBS，pH7.2)平衡柱子，直到紫外吸收达到稳定基线；

洗脱：用5-10倍柱子体积的洗脱液(含0.5M Imidazole的PBS，pH7.2)洗脱，并收集洗脱液；

选用层析柱HisTrap FF，5mL(GE货号：17531901)，先用0.1M NaOH把柱子洗干净，然后用平衡液平衡，挂镍，再平衡4个柱体积，上样。上样后用平衡液冲洗3个柱体积，在用淋洗液冲洗3个柱体积，再用洗脱液先行洗脱，根据UV收集洗脱液，然后再用0.1M NaOH冲洗3个柱体积，用水冲洗3个柱体积，再用20％乙醇保存层析柱。亲和纯化后的样品利用10KD超滤管进行超滤浓缩换液至1×PBS(含0.1％NaN₃)，0.22μm滤膜无菌过滤，终体积约1-2ml，-20℃保存。最后获得猪瘟病毒的C蛋白、Erns蛋白、NS3蛋白、PS1蛋白和PS2蛋白。

1.2.5猪瘟病毒5种重组蛋白的浓度测定

采用常规BCA方法测定蛋白(上述步骤1.2.4纯化获得的C蛋白、Erns蛋白、NS3蛋白、PS1蛋白和PS2蛋白)浓度，操作方案按照试剂盒说明书进行，测量结果如下表1所示。可见猪瘟病毒的5种重组蛋白都成功表达且纯化获得，其中相对于猪瘟病毒的C蛋白、Erns蛋白、NS3蛋白和融合蛋白PS1，PS2的表达量明显提高。

表1：猪瘟病毒5种重组蛋白的含量测定

	蛋白名称	蛋白浓度	体积
				1	C	2.1mg/ml	2.2ml
2	Erns	2.0mg/ml	1.8ml
				3	NS3	1.9mg/ml	1.5ml
4	PS1	1.7mg/ml	1.8ml
				5	PS2	2.6mg/ml	2.0ml

1.2.6猪瘟病毒5种重组蛋白的纯度测定

采用常规还原性SDS-PAGE电泳，其中分离胶为12％，积层胶为8％，对纯化获得的猪瘟病毒的5种重组蛋白进行纯度测定，电泳结果如图1所示。从图1可以看出，猪瘟病毒的5种重组蛋白纯度均能够满足需要，仅有一条明显的主带。采用凝胶成像分析仪软件判断，纯度均≥90％。

实施例2：检测猪血清中的猪瘟病毒抗体

2.1抗原包被微孔板：分别将实施例1制备的5种重组蛋白用pH7.0-7.4的10mM PBS缓冲溶液稀释成1μg/mL，在酶标板的每孔加110μL，4℃下包被过夜；第二天倾去包被液，拍干，然后在每孔中加入300μL 1％BSA(在pH7.0-7.4的10mM PBS缓冲溶液中)，放入4℃封闭过夜后，拍干，干燥，真空包装后备用。

2.2酶标抗体的配制：小鼠抗猪IgG-HRP标记物购自北京鑫科安星科技有限公司，-20℃保存。用酶标记抗体稀释液按照一定比例稀释即为酶标记抗体工作液。酶标记抗体稀释液的配方为：Na₂HPO₄·12H₂O，2.9g；NaH₂PO₄·2H₂O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；酶稳定剂，5g；Tween-20 0.25mL；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8，2-8℃保存备用。

2.3样品稀释液的配制：用于待测样品的稀释，其配方为Na₂HPO₄·12H₂O，2.9g；NaH₂PO₄·2H₂O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；硫酸庆大霉素，2支(8万单位/支)；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。过滤除菌，2-8℃保存备用。

2.4洗涤液的配制：为20倍的浓缩洗液，用前稀释。其配方为：Na₂HPO₄·12H₂O 58g，NaH₂PO₄·2H₂O 5.92g，NaCl 170g，Tween-20 5.0mL，Proclin 300 0.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4，2-8℃保存备用。

2.5底物A的配制：将无水乙酸钠4.5g、冰醋酸1.2mL和过氧化脲0.8g溶解于双蒸水，并定溶至1000mL，2-8℃保存备用。

2.6底物B的配制：将柠檬酸1.62g、EDTA-2Na 0.372g、甘油100mL、和四甲基联苯胺0.50g溶于双蒸水，并定溶至1000mL，2-8℃保存备用。

2.7终止液的配制：1000mL双蒸水中含有98％硫酸27.8mL，常温保存备用。

2.8阳性对照(PC)的制备：将购自天康制药(苏州)有限公司的ST猪瘟病毒传代细胞苗免疫阴性猪，免后28天采集血液，分离血清。经IDEXX猪瘟抗体ELISA检测试剂盒检测PI值(阻断率)为50-70％即为阳性，分装小份，100μl/支，-20℃保存备用。

2.9待测猪血清中猪瘟病毒抗体的检测方法

2.9.1待测样品稀释：将待测猪血清、阳性对照分别用样品稀释液稀释60倍，待测备用。

2.9.2加入抗原包被微孔板中：取出合适数量的抗原包被微孔板，依次向每孔中加入稀释后的待测血清、阳性对照及阴性对照(即样品稀释液，NC)，100μl/孔，贴上板贴，置于37℃培养箱中，温育30分钟。其中，阳性对照和阴性对照各设置复孔。

2.9.3洗板：将20倍的浓缩洗液用纯化水稀释20倍后得到洗涤液，备用。弃去板中反应液，向每孔中加入300μl洗涤液，轻轻震荡10-30秒，弃去板中液体。再次重复4次，最后在吸水纸上轻轻拍干。

2.9.4加酶标抗体：依次向每孔中加入酶标抗体工作液，100μl/孔，贴上板贴，置于37℃培养箱中，温育30分钟。

2.9.5洗板：重复步骤2.9.3。

2.9.6加底物显色：依次向每孔中加入底物A和B各50μl/孔，贴上板贴，置于37℃培养箱中，温育15分钟。

2.9.7终止反应：加入终止液50μL/孔，用酶标仪测量OD450。

2.9.8结果分析：

1)待测样品S/P值计算：

2)结果判断：当S/P≥0.4时判为猪瘟病毒抗体阳性；当S/P＜0.4时判为猪瘟病毒抗体阴性。

2.10应用5种重组蛋白制成猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒检测不同的猪血清样品

2.10.1应用实施例1制备的5种重组蛋白(分别是C、Erns、NS3、PS1和PS2)按照本实施例的制备方法(上述步骤2.1至2.8)制成猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒，并利用上述步骤2.9的方法使用该ELISA检测试剂盒检测不同的猪血清样品(待测样品)。

2.10.2待测样品：待测样品一共有3种，均由天康制药(苏州)有限公司协助采集和收集。

1)阴性猪血清样品：健康阴性猪血清，10份，1ml/份，-20℃保存备用；采用IDEXX猪瘟抗体ELISA试剂盒检测均为猪瘟抗体阴性(阻断率PI＜40％)，也未免疫疫苗。

2)猪瘟传代细胞苗免后猪血清样品：用ST猪瘟活疫苗(来源广东永顺生物制药有限公司)免后28天血清，10份，1ml/份，-20℃保存备用。

3)猪瘟E2亚单位疫苗免后猪血清样品：用猪瘟E2亚单位疫苗(天康生物制药有限公司)免后28天血清，10份，1ml/份，-20℃保存备用。

2.10.3按照本实施例步骤2.9中检测步骤检测。

2.10.4结果计算

采用分别由猪瘟病毒的5种重组蛋白制备的猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒，同时检测2.10.2中的30份猪血清样品，检测结果如下表2所示。

表2：由5种重组蛋白制备的ELISA检测试剂盒检测猪血清样品的结果

2.10.5结果分析

1)针对健康阴性猪血清样品的检测：理论上健康阴性猪血清样品中应不含有猪瘟病毒抗体，因此使用上述5种重组蛋白制成的检测试剂盒的检测结果也应均为阴性(S/P＜0.4)，但是使用由C蛋白、Erns蛋白和NS3蛋白制成的检测试剂盒均检出了一定比例的阳性(S/P≥0.4)，而只有由PS1和PS2蛋白制成的检测试剂盒的检测结果均为阴性(S/P＜0.4)，说明这两种融合蛋白制成的ELISA检测试剂盒对阴性猪血清样品进行检测时不会出现假阳性结果。

2)针对猪瘟细胞苗免后猪血清样品的检测：理论上猪瘟细胞苗免后猪血清样品中应为猪瘟病毒抗体阳性，因此使用上述5种重组蛋白制成的检测试剂盒的检测结果也应均为阳性(S/P≥0.4)，但基于C蛋白的试剂盒仅检出5份阳性，基于Erns蛋白的试剂盒仅检出4份阳性，基于NS3蛋白的试剂盒也仅检出4份阳性，基于PS1蛋白的试剂盒检出6份阳性，而基于PS2蛋白的试剂盒可检出9份阳性。表明相对于基于C蛋白、Erns蛋白、NS3蛋白或PS1蛋白的试剂盒，基于PS2蛋白的试剂盒的阳性检出率更高，达到90％(9/10)。

3)针对猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫后猪血清样品的检测：理论上猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫后猪血清样品应仅为猪瘟病毒E2抗体阳性，因此使用上述5种重组蛋白制成的检测试剂盒的检测结果应均为阴性(S/P＜0.4)，但基于C蛋白的试剂盒检出3份阳性，基于Erns蛋白的试剂盒也检出3份阳性，基于NS3蛋白的试剂盒检出2份阳性，基于PS1蛋白的试剂盒检出2份阳性，而基于PS2蛋白的试剂盒检出0份阳性。表明基于C蛋白、Erns蛋白、NS3蛋白或PS1蛋白的试剂盒均存在不同程度的假阳性结果，相比之下，基于PS2蛋白的试剂盒没有假阳性结果，准确率高。

综上所述，相对于猪瘟病毒的C蛋白、Erns蛋白、NS3蛋白或PS1蛋白作为检测猪瘟病毒抗体的靶标，以PS2蛋白为靶标检测猪瘟病毒抗体具有明显更高的阳性检出率，且检测准确率更高。另一方面，根据以上2)和3)的结果可知，基于PS2蛋白的试剂盒能够检出猪瘟细胞苗免疫后抗体，而不能检出猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫后抗体，因此可以利用该基于PS2蛋白的试剂盒鉴别区分猪瘟细胞苗免疫后抗体与猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫后抗体。

在另外一次实验中，临床筛选获得了18份猪瘟病毒野毒感染后的猪血清样品以及10份猪瘟病毒脾淋苗免疫后猪血清样品，以PS2为靶标进行猪瘟抗体检测同样全部为阳性。结合以上2)的结果，表明以PS2蛋白作为靶标进行猪瘟病毒抗体检测时，针对猪瘟病毒细胞苗、脾淋苗免疫后血清样品或野毒感染后血清样品均具有非常高的猪瘟病毒抗体阳性检出率，而针对猪瘟E2亚单位疫苗免疫后猪血清样品均为阴性(结合以上3)的结果)。因此，一方面，可以利用该基于PS2蛋白的试剂盒鉴别区分猪瘟细胞苗/脾淋苗免疫后抗体与猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫后抗体，从而可以鉴别区分猪瘟病毒抗体的来源。另一方面，还可以利用该基于PS2蛋白的试剂盒鉴别区分猪瘟病毒野毒感染抗体与猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫后抗体，从而可以对猪瘟病毒进行净化。具体的猪瘟病毒净化方法例如包括以下两种情形：(1)对于某一猪场，已知其所有猪只均未接种任何类型的疫苗，采集所有猪只的血清作为待测样品，利用上述基于PS2蛋白的试剂盒根据上述步骤2.9的方法对待测样品中的猪瘟病毒抗体进行检测，并计算每个待测样品的S/P值，若S/P≥0.4，则判为猪瘟病毒抗体阳性，表明待测样品来源的猪只受到猪瘟病毒野毒感染，应剔除出去；若S/P＜0.4，则判为猪瘟病毒抗体阴性，表明待测样品来源的猪只未受猪瘟病毒野毒感染，基于以上判定结果还可以用于非疾病诊断目的，例如筛选猪瘟病毒疫苗的生产原料。(2)对于某一猪场，已知其所有猪只均全部接种猪瘟病毒E2亚单位疫苗，采集所有猪只的血清作为待测样品，利用上述基于PS2蛋白的试剂盒根据上述步骤2.9的方法对待测样品中的猪瘟病毒抗体进行检测，并计算每个待测样品的S/P值，若S/P≥0.4，则判为猪瘟病毒抗体阳性，表明待测样品来源的猪只在接受猪瘟病毒E2亚单位疫苗后仍受到猪瘟病毒野毒感染，猪只接受疫苗后不能实现保护效果，应剔除出去；若S/P＜0.4，则判为猪瘟病毒抗体阴性，表明待测样品来源的猪只未受猪瘟病毒野毒感染，可对疫苗的免疫保护效果进行评价。

实施例3：基于融合蛋白PS2的猪瘟病毒抗体检测的ELISA试剂盒

该实施例利用实施例1制备的融合蛋白PS2制备用于对猪瘟病毒抗体进行鉴别检测的ELISA试剂盒，并提供了该ELISA试剂盒的使用方法，具体包括以下操作。

3.1抗原包被微孔板：将融合蛋白PS2用pH7.0-7.4的10mM PBS缓冲溶液稀释成1μg/mL，在酶标板的每孔加110μL，4℃下包被过夜；倾去包被液，拍干，然后在每孔中加入300μL1％BSA(在pH7.0-7.4 10mM PBS缓冲溶液中)，放入4℃封闭过夜后，拍干，干燥，真空包装，1块/盒。

3.2酶标抗体的配制：小鼠抗猪IgG-HRP标记物购自北京鑫科安星科技有限公司，-20℃保存。用酶标记抗体稀释液按照一定比例稀释即为酶标记抗体工作液。酶标记抗体稀释液的配方为：Na₂HPO₄·12H₂O，2.9g；NaH₂PO₄·2H₂O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；酶稳定剂，5g；Tween-200.25mL；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。无菌分装10ml/瓶，1瓶/盒。

3.3样品稀释液的配制：用于待测样品的稀释，其配方为Na₂HPO₄·12H₂O，2.9g；NaH₂PO₄·2H₂O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；硫酸庆大霉素，2支(8万单位/支)；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。过滤除菌，无菌分装30ml/瓶，1瓶/盒。

3.4洗涤液的配制：为20倍的浓缩洗液，用前稀释。其配方为：Na₂HPO₄·12H₂O 58g，NaH₂PO₄·2H₂O 5.92g，NaCl 170g，Tween-20 5.0mL，Proclin 300 0.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4，无菌分装30ml/瓶，1瓶/盒。

3.5底物A的配制：无水乙酸钠4.5g，冰醋酸1.2mL，过氧化脲0.8g，用双蒸水定溶至1000mL，无菌分装6ml/瓶，1瓶/盒(白色塑料瓶)。

3.6底物B的配制：柠檬酸1.62g，EDTA-2Na 0.372g，甘油100mL，四甲基联苯胺0.50g，用双蒸水定溶至1000mL，无菌分装6ml/瓶，1瓶/盒(棕色瓶)。

3.7终止液的配制：1000mL双蒸水中含有98％硫酸27.8mL，分装6ml/瓶，1瓶/盒。

3.8阳性对照(PC)的制备：将购自天康制药(苏州)有限公司的ST猪瘟病毒传代细胞苗免疫阴性猪，免后28天采集血液，分离血清。经IDEXX猪瘟抗体ELISA检测试剂盒检测为阳性，PI值(阻断率)为50-70％，分装小份，100μl/支，1支/盒。

3.9成品试剂盒的组装

取3.1-3.8各组份，每种1瓶或1支，装入试剂盒纸盒中，贴好标签，得到用于猪瘟病毒抗体检测的ELISA试剂盒，置于2-8℃中保存。

3.10试剂盒的使用方法

3.10.1试剂盒回温：自冰箱2-8℃中取出成品试剂盒，置于室温平衡30分钟，备用。

3.10.2待测样品稀释：将待测猪血清、阳性对照分别用样品稀释液稀释60倍，待测备用。

3.10.3加入抗原包被微孔板中：取出合适数量的抗原包被微孔板，依次向每孔中加入稀释后的待测猪血清、阳性对照及阴性对照(即样品稀释液，NC)，100μl/孔，贴上板贴，置于37℃培养箱中，温育30分钟。其中，阳性对照和阴性对照各设置复孔。

3.10.4洗板：将20倍的浓缩洗液用纯化水稀释20倍后得到洗涤液，备用。弃去板中反应液，向每孔中加入300μl洗涤液，轻轻震荡10-30秒，弃去板中液体。再次重复4次，最后在吸水纸上轻轻拍干。

3.10.5加酶标抗体：依次向每孔中加入酶标抗体工作液，100μl/孔，贴上板贴，置于37℃培养箱中，温育30分钟。

3.10.6洗板：重复步骤3.10.4。

3.10.7加底物显色：依次向每孔中加入底物A和B各50μl/孔，贴上板贴，置于37℃培养箱中，温育15分钟。

3.10.8终止反应：加入终止液50μL/孔，用酶标仪测量OD450。

3.10.9结果分析：

1)待测样品S/P值计算：

2)结果判断：S/P≥0.4判为猪瘟病毒抗体阳性；S/P＜0.4判为猪瘟病毒抗体阴性。

实施例4：本方法与市售商品化试剂盒的比较

目前用于猪瘟病毒抗体检测的市售商品化试剂盒基本都采用Erns蛋白为靶标制成，多项研究显示Erns蛋白存在猪瘟病毒抗体阳性检出率低的问题，以及无法真正用于猪瘟病毒抗体鉴别区分和净化使用的问题。而本发明涉及的基于PS2融合蛋白的猪瘟病毒抗体检测的ELISA试剂盒能够解决这些问题。

申请人委托天康制药(苏州)有限公司进行了超过1年的临床观察和评价，结果如下表3所示，可见基于Erns蛋白的猪瘟病毒抗体检测的ELISA试剂盒(INDCAL生产的进口猪瘟Erns抗体ELISA检测试剂盒)在检测猪瘟病毒细胞苗/脾淋苗免后抗体时，阳性率仅为10-30％的水平，而本发明中的基于PS2蛋白的猪瘟病毒抗体检测的ELISA试剂盒检测猪瘟病毒细胞苗/脾淋苗免后抗体时，阳性率可达80-95％水平，对猪瘟病毒野毒感染抗体的阳性检出率更是接近100％(而INDCAL试剂盒的阳性检出率仅为15-30％)，因此显著提高了猪瘟病毒抗体阳性检出率，而且对猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫后的猪血清进行抗体检测时的阴性率可达80-100％水平，因此可有效鉴别区分猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫后抗体与猪瘟病毒细胞苗/脾淋苗免后抗体，以及有效鉴别区分猪瘟病毒E2亚单位疫苗免疫后抗体与猪瘟病毒野毒感染抗体。

表3：本方法与INICAL试剂盒方法比较

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猪瘟病毒的融合蛋白，其包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或由其组成。

2.根据权利要求1所述的猪瘟病毒的融合蛋白，其还进一步携带有用于蛋白纯化的标签。

3.根据权利要求2所述的猪瘟病毒的融合蛋白，其中所述标签包括His标签。

4.一种编码权利要求1-3中任一项所述的猪瘟病毒的融合蛋白的基因。

5.根据权利要求4所述的基因，其包含如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或由其组成。

6.权利要求1-3中任一项所述的猪瘟病毒的融合蛋白在制备检测猪瘟病毒抗体的试剂盒或试剂中的应用。

7.一种用于检测猪瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，其中使用权利要求1-3中任一项所述的猪瘟病毒的融合蛋白作为包被抗原。

8.一种检测猪瘟病毒抗体的非疾病诊断目的方法，其包括使用权利要求7所述的ELISA试剂盒对待测样品进行检测，并计算所述待测样品的S/P值，其中S/P值的计算公式为：

若S/P≥0.4，则判为猪瘟病毒抗体阳性；若S/P＜0.4，则判为猪瘟病毒抗体阴性；

可选地，所述猪瘟病毒抗体包括猪瘟病毒野毒感染抗体、和猪瘟病毒细胞苗或脾淋苗免疫后抗体。

9.一种鉴别区分猪瘟病毒野毒感染抗体与猪瘟病毒亚单位E2疫苗免疫后抗体的非疾病诊断目的方法，其包括使用权利要求7所述的ELISA试剂盒对待测样品进行检测，并计算所述待测样品的S/P值，其中S/P值的计算公式为：

若S/P≥0.4，则判为猪瘟病毒野毒感染抗体；若S/P＜0.4，则判为猪瘟病毒亚单位E2疫苗免疫后抗体。

10.一种鉴别区分猪瘟病毒细胞苗或脾淋苗免疫后抗体与猪瘟病毒亚单位E2疫苗免疫后抗体的非疾病诊断目的方法，其包括使用权利要求7所述的ELISA试剂盒对待测样品进行检测，并计算所述待测样品的S/P值，其中S/P值的计算公式为：

若S/P≥0.4，则判为猪瘟病毒细胞苗或脾淋苗免疫后抗体；若S/P＜0.4，则判为猪瘟病毒亚单位E2疫苗免疫后抗体。

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