CN115785288B

CN115785288B - 一种小反刍兽疫病毒h-n的抗原表位融合蛋白及其应用

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Publication number: CN115785288B
Application number: CN202211663353.0A
Authority: CN
Inventors: 任立松; 郑金来; 赵兵; 杜皓云; 杜前丽; 李华斌; 李丽燕; 郝金宝; 张卉; 卢小雨; 吕鲁杰; 陈国庆; 莫燕; 许元元
Original assignee: Beijing Standard Zai Hui Bio Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Standard Zai Hui Bio Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-23
Filing date: 2022-12-23
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2042-12-23
Also published as: CN115785288A

Abstract

本发明公开一种小反刍兽疫病毒H‑N的抗原表位融合蛋白及其应用，属于生物技术领域。本发明提供的小反刍兽疫病毒H‑N的抗原表位融合蛋白为小反刍兽疫病毒的H蛋白和N蛋白的多个疏水区远端抗原表位经串联得到。由本发明提供的融合蛋白制备的抗体检测试剂盒对小反刍兽疫病毒抗体的阳性检出率明显提高，从而可以避免漏检。

Description

一种小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白及其应用，尤其涉及一种用于小反刍兽疫病毒抗体检测的融合蛋白及其在检测小反刍兽疫病毒抗体中的应用。

背景技术

小反刍兽疫(PPR)是OIE法定报告的传染病，也被我国政府列为一类动物传染病，其是由小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV)引起的一种急性、热性、接触性传染病，具有高发病率和高死亡率的特点。小反刍兽疫的发生不但将给发生国的畜牧业生产带来严重的经济损失，还会对国际贸易产生严重的影响，因此该病引起许多国家的高度重视，对小反刍兽疫病毒进行检测和监测是动物防疫的主要工作之一。

目前对小反刍兽疫病毒进行检测的方法多以免疫学检测方法为主，其是把灭活的小反刍兽疫全病毒、小反刍兽疫病毒H蛋白的表位合成肽(例如专利文献CN112255401A)、小反刍兽疫病毒N蛋白(例如专利文献CN102967710A)、或小反刍兽疫病毒H、N蛋白的串联融合蛋白NH(参见孙雨等人，小反刍兽疫病毒双抗原夹心时间分辨荧光免疫，动物医学进展，2019，40(4)：1-8)作为包被原，建立间接ELISA或竞争ELISA方法，检测动物血清中的PPRV病毒抗体，通过血清抗体效价，判定动物是否携带小反刍兽疫病毒或接种疫苗后的动物产生抗体状况。然而，一方面，小反刍兽疫全病毒获取比较困难，全病毒需要分离、培养、纯化、灭活等，都需要在等级较高的实验室或生产车间完成，而检测试剂盒生产厂家大部分不具备分离培养纯化病毒的能力，因此检测成本过高；另一方面，虽然小反刍兽疫病毒H、N蛋白或两者的串联融合蛋白可以避免全病毒生产的弊端，但当单独以H、N蛋白或其表位合成肽作为包被抗原时，由于其抗原表位的局限性，可能产生漏检现象；简单地以全长H和N蛋白的串联融合蛋白作为包被抗原时，也可能会产生漏检现象。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白，其由小反刍兽疫病毒H蛋白的4个疏水区远端抗原表位H1、H2、H3和H4中的至少2个，和小反刍兽疫病毒N蛋白的4个疏水区远端抗原表位N1、N2、N3和N4中的至少3个按照任意顺序经接头串联融合而成；其中：

所述抗原表位H1、H2、H3和H4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示，所述抗原表位N1、N2、N3和N4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-8所示。

在一些实施方式中，所述接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在一些实施方式中，所述小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白还携带有用于蛋白纯化的标签。

在一些实施方式中，所述标签包括His标签。

在一些实施方式中，所述小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:10-16、22-23中任一个所示。

本发明另一方面提供一种编码上述的小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白的基因。

本发明的再一方面提供了上述的小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白在制备检测小反刍兽疫病毒抗体的试剂盒或试剂中的应用。具体地提供一种用于检测小反刍兽疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其中使用上述的小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白作为包被抗原。

本发明又一方面还提供一种检测小反刍兽疫病毒抗体的非疾病诊断目的方法，其包括使用ELISA试剂盒对待测样品进行检测，并计算所述待测样品的S/P值，其中S/P值的计算公式为：

若S/P≥0.3，则判为小反刍兽疫病毒抗体阳性；若S/P＜0.3，则判为小反刍兽疫病毒抗体阴性。

在一些实施方式中，所述小反刍兽疫病毒抗体包括小反刍兽疫病毒野毒感染后产生的抗体、小反刍兽疫病毒疫苗免疫后产生的抗体、或其组合。

基于以上技术方案，本发明提供的小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白为小反刍兽疫病毒H蛋白的至少2个疏水区远端抗原表位和N蛋白的至少3个疏水区远端抗原表位按照任意顺序经串联融合得到。实施例结果表明，相对于市售由小反刍兽疫病毒N蛋白作为包被抗原的抗体检测试剂盒，利用本发明提供的融合蛋白制备的抗体检测试剂盒(例如ELISA试剂盒)对小反刍兽疫病毒抗体的阳性检出率明显提高，相较于利用其他融合蛋白(实施例中制备的融合蛋白PPRV8-PPRV10)，以及H和N蛋白的全长融合蛋白(实施例中命名为N-H)制备的抗体检测试剂盒，其阳性检出率也明显更高。因此本发明提供的融合蛋白可有助于解决现有技术中存在的小反刍兽疫病毒抗体检测方法对小反刍兽疫病毒抗体漏检而导致的阳性检出率低的问题，这有助于对小反刍兽疫病毒疫苗的免疫效果进行评价或对小反刍兽疫病毒疫苗生产原料进行净化(例如净化被小反刍兽疫病毒野毒感染(即PPRV抗体检测阳性)的原料)，且可在小反刍兽疫病毒的检测与监测中起到重要作用。

附图说明

图1为小反刍兽疫病毒PPRV1蛋白纯化后的SDS-PAGE胶图。

图2为小反刍兽疫病毒PPRV8蛋白纯化后的SDS-PAGE胶图。

图3为小反刍兽疫病毒PPRV1蛋白纯化后的Western Blot胶图。

图4为小反刍兽疫病毒PPRV8蛋白纯化后的Western Blot胶图。

具体实施方式

本发明旨在提供一种能够提高小反刍兽疫病毒抗体检出率的融合蛋白，由此解决现有技术中存在的小反刍兽疫病毒抗体检测方法常出现漏检现象而导致阳性检出率低的问题，并提供了该融合蛋白的制备方法及其在检测小反刍兽疫病毒抗体中的应用。

为了实现上述目的，发明人将该融合蛋白设计为由小反刍兽疫病毒的H蛋白和N蛋白上的多个抗原表位串联，工作过程包括：根据NCBI上PPRV野生毒株的氨基酸序列(对应的全基因组序列的Gene Bank登录号为：NC_006383.2)，选择PPRV的H蛋白和N蛋白的序列，并利用在线抗原分析软件(http://www.iedb.org/和http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/)对PPRV的H蛋白和N蛋白进行B细胞抗原表位分析，共获得42个潜在的抗原表位(其中H蛋白23个，N蛋白19个)。发明人对小反刍兽疫病毒的H蛋白和N蛋白的结构进行分析，设计将H蛋白和N蛋白上疏水区近端的抗原表位、疏水区远端的抗原表位以及其他位置的抗原表位按照不同的组合串联起来，得到众多不同的融合蛋白，并根据这些融合蛋白对PPRV抗体的阳性检出率结果，最终从这些众多的融合蛋白中筛选得到能够有效提高PPRV抗体检出率的融合蛋白，该融合蛋白为由H、N蛋白结构中疏水区远端抗原表位融合而成，包括H蛋白的至少2个疏水区远端抗原表位和N蛋白的至少3个疏水区远端抗原表位。基于此，本发明还提供一种用于检测PPRV抗体的ELISA试剂盒和方法。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

实施例1：小反刍兽疫病毒蛋白的表达及纯化

1.1材料：

质粒PET28a(+)、大肠杆菌BL21感受态细胞、蛋白质分子质量标准均购自Takara公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ均购自NEB公司；HisTrap FF镍柱购自基因公司；LB液体培养基、LB平板培养基(含卡那霉素)、IPTG、卡那霉素、12％SDS-PAGE蛋白胶、咪唑、考马斯亮蓝购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2方法：

1.2.1小反刍兽疫病毒11种融合蛋白的基因合成及重组表达载体的构建和鉴定

为解决现有技术中对小反刍兽疫病毒抗体的检出率低的问题，发明人结合对小反刍兽疫病毒的研究成果，做出如下创新：发明人根据NCBI上PPRV野生毒株的氨基酸序列，选择PPRV的H蛋白和N蛋白的序列，并利用在线抗原分析软件(http://www.iedb.org/和http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/)对PPRV的H蛋白和N蛋白进行B细胞抗原表位分析，共获得42个潜在的抗原表位(其中H蛋白23个，N蛋白19个)。随后利用蛋白分析软件Protean对这些抗原表位进行分析，按照距疏水区位置区分结果有：H蛋白的疏水区远端抗原表位有4个(分别命名为H1、H2、H3和H4，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-4所示)、疏水区近端抗原表位有7个，其他位置抗原表位有12个；N蛋白疏水区远端抗原表位有4个(分别命名为N1、N2、N3和N4，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-8所示)、疏水区近端抗原表位有3个、其他位置抗原表位有12个。设计将H、N蛋白疏水区近端、远端及其他位置抗原表位按交叉、全覆盖原则进行组合，将多个不同的抗原表位(例如通过利于氨基酸序列折叠的柔性肽(G4S)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)串联连接，获得众多的融合蛋白，然后基于对小反刍兽疫病毒抗体的检出率结果，最终从众多融合蛋白中确定了能够提高小反刍兽疫病毒抗体检出率的融合蛋白，其为由H蛋白的至少2个疏水区远端抗原表位(即H1、H2、H3和H4中的至少2个)和N蛋白的至少3个疏水区远端抗原表位(即N1、N2、N3和N4中的至少3个)按照任意顺序串联获得的融合蛋白。

在该实施例中，以众多融合蛋白中的10种融合蛋白的表达和纯化为例，对该实施例做具体说明，这10种融合蛋白分别命名为PPRV1-10，其结构分别如下所示：

PPRV1：H2-H4-N2-N3-N4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；

PPRV2：H2-H3-N1-N2-N3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

PPRV3：H3-H4-N1-N2-N3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；

PPRV4：H1-H3-N2-N3-N4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；

PPRV5：H2-H3-N2-N3-N4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；

PPRV6：H3-H4-N2-N3-N4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；

PPRV7：H1-H4-N1-N2-N4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；

PPRV8：H1-Hm(H蛋白的1个疏水区近端抗原表位)-N1-Nn(N蛋白的2个其他位置的抗原表位)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；

PPRV9：H2-N2-N3-N4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；

PPRV10：H2-H4-N3-N4，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；

另外，该实施例中还同时重组表达和纯化了小反刍兽疫病毒的H和N的全长融合蛋白，命名为N-H融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。因此，该实施例中共制备11种融合蛋白。

该实施例中，还在上述SEQ ID NO:10-20所示的氨基酸序列上连接了利于后期纯化的His标签(HHHHHH，如SEQ ID NO:21所示)，并根据Ecoli宿主细胞密码子的偏好性，将各氨基酸序列翻译为核酸序列，并将这些核酸序列分别与克隆载体PET28a(+)进行连接得到重组表达载体，分别命名为PET28a(+)-PPRV1、PET28a(+)-PPRV2、PET28a(+)-PPRV3、PET28a(+)-PPRV4、PET28a(+)-PPRV5、PET28a(+)-PPRV6、PET28a(+)-PPRV7、PET28a(+)-PPRV8、PET28a(+)-PPRV9、PET28a(+)-PPRV10和PET28a(+)-N-H，采用基因全合成的方式直接合成全基因，以上全基因合成、连接和测序鉴定过程全部委托武汉奥科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2.2BL21感受态细胞转化

将10ng PET28a(+)-PPRV1-10和PET28a(+)-N-H质粒分别与50μL的BL21感受态细胞混匀于1.5mL EP管中，42℃热冲击90s后，置于冰上5min，每管分别加入500μL的LB培养基在37℃，220rpm摇床上培养45min。将适当体积的菌液均匀涂于卡那霉素抗性(质粒抗性)的平板，待菌液被吸收完全，将平皿倒置培养约12-16h，可见单菌落出现。

1.2.3小反刍兽疫病毒11种重组蛋白的表达和提取

将上述步骤1.2.2中转化不同质粒的BL21单菌落分别接种于10mL含0.1mg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养12-16h；取培养过夜的菌液，以1:100的比例分别接种于500mL的卡那霉素LB培养基中，37℃下220rpm培养至OD600＝0.6-0.8(3-4h)；加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，16℃诱导表达12-24h；5000rpm离心10min收集菌体，用10mL PBS洗涤1次再次离心弃去上清，5mL PBS再次重悬沉淀；置冰浴超声仪中超声波裂解30min(200W，间隔5s，每次持续1s)，直至液体澄清透明；超声完毕后于4℃，10000rpm离心10min分离超声产物上清蛋白液和沉淀。

1.2.4小反刍兽疫病毒11种重组蛋白的纯化：

将上述步骤1.2.3获得的离心上清蛋白液各收集约100mL，进行Ni柱亲和层析，具体包括以下操作：

首先使用0.45μm的滤膜对蛋白液进行过滤，将蛋白液缓慢加入到纯化柱中，再用平衡液(PBS，pH7.2)平衡柱子，直到紫外吸收达到稳定基线；

洗脱：用5-10倍柱子体积的洗脱液(含0.5M Imidazole的PBS，pH7.2)洗脱，并收集洗脱液；

选用层析柱HisTrap FF，5mL(GE货号：17531901)，先用0.1M NaOH把柱子洗干净，然后用平衡液平衡，挂镍，再平衡4个柱体积，上样。上样后用平衡液冲洗3个柱体积，在用淋洗液冲洗3个柱体积，再用洗脱液先行洗脱，根据UV收集洗脱液，然后再用0.1M NaOH冲洗3个柱体积，用水冲洗3个柱体积，再用20％乙醇保存层析柱。亲和纯化后的样品利用10KD超滤管进行超滤浓缩换液至1×PBS(含0.1％NaN₃)，0.22μm滤膜无菌过滤，终体积约1-2ml，-20℃保存。最后获得小反刍兽疫病毒的PPSV1-PPSV10蛋白和N-H蛋白。

1.2.5小反刍兽疫病毒11种重组蛋白的纯度和免疫原性测定

1)纯度测定：采用常规还原性SDS-PAGE电泳，其中分离胶为12％，积层胶为8％，对纯化获得的小反刍兽疫病毒的11种重组蛋白进行纯度测定，图1和图2分别示例性示出了PPSV1蛋白和PPSV8蛋白的SDS-PAGE电泳结果，其中M表示Ladder。从图1和图2可以看出，PPSV1蛋白和PPSV8蛋白的纯度均满足需要，仅有一条明显的主带。采用软件BandScan5.0对图1和图2的凝胶图像进行分析，计算融合蛋白纯度，均大于90％。PPSV2-PPRV7、PPSV9-PPRV10和N-H蛋白的电泳结果与PPSV1、PPSV8蛋白类似，也仅有一条明显的主带，纯度大于90％。

2)免疫原性测定：对上述1)的融合蛋白的SDS-PAGE电泳样品不进行染色，转膜后进行Western Blot分析，图3和图4分别示例性示出了PPSV1和PPSV8蛋白的免疫原性结果，其中M表示Ladder，可见PPSV1和PPSV8蛋白均能够识别小反刍兽疫病毒阳性血清。PPSV2-PPRV7、PPSV9-PPRV10和N-H蛋白的免疫原性测定结果与PPSV1、PPSV8蛋白类似，也能够识别小反刍兽疫病毒阳性血清。

实施例2：检测羊血清中的小反刍兽疫病毒抗体

2.1抗原包被微孔板：分别将实施例1制备的11种重组蛋白用pH7.0-7.4的10mMPBS缓冲溶液稀释成1μg/mL，在酶标板的每孔加110μL，4℃下包被过夜；第二天倾去包被液，拍干，然后在每孔中加入300μL 1％BSA(在pH7.0-7.4的10mM PBS缓冲溶液中)，放入4℃封闭过夜后，拍干，干燥，真空包装后备用。

2.2酶标抗体的配制：小鼠抗羊IgG-HRP标记物购自北京博尔西科技有限公司，-20℃保存。用酶标记抗体稀释液按照一定比例稀释即为酶标记抗体工作液。酶标记抗体稀释液的配方为：Na₂HPO₄·12H₂O，2.9g；NaH₂PO₄·2H₂O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；酶稳定剂，5g；Tween-20 0.25mL；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8，2-8℃保存备用。

2.3样品稀释液的配制：用于待测样品的稀释，其配方为Na₂HPO₄·12H₂O，2.9g；NaH₂PO₄·2H₂O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；硫酸庆大霉素，2支(8万单位/支)；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。过滤除菌，2-8℃保存备用。

2.4洗涤液的配制：为20倍的浓缩洗液，用前稀释。其配方为：Na₂HPO₄·12H₂O 58g，NaH₂PO₄·2H₂O 5.92g，NaCl 170g，Tween-20 5.0mL，Proclin 300 0.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4，2-8℃保存备用。

2.5底物A的配制：将无水乙酸钠4.5g、冰醋酸1.2mL和过氧化脲0.8g溶解于双蒸水，并定溶至1000mL，2-8℃保存备用。

2.6底物B的配制：将柠檬酸1.62g、EDTA-2Na 0.372g、甘油100mL、和四甲基联苯胺0.50g溶于双蒸水，并定溶至1000mL，2-8℃保存备用。

2.7终止液的配制：1000mL双蒸水中含有98％硫酸27.8mL，常温保存备用。

2.8小反刍兽疫病毒阳性对照血清(PC)的制备：

2.8.1材料

2.8.1.1疫苗：小反刍兽疫疫苗，为商品化疫苗(购自天康生物制药有限公司)。

2.8.1.2试验羊：2-4月龄健康羊(小反刍兽疫病毒抗体阴性)。

2.8.2制备

2.8.2.1免疫：试验羊经颈部皮下注射小反刍兽疫疫苗，1ml/头。

2.8.2.2血清制备：免后28日采血，分离血清，检测中和抗体(中和抗体不低于1：16)，颈动脉采血，分离血清后无菌分装。

2.9待测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测方法

2.9.1待测样品稀释：将待测羊血清、阳性对照分别用样品稀释液稀释60倍，待测备用。

2.9.2加入抗原包被微孔板中：取出合适数量的抗原包被微孔板，依次向每孔中加入稀释后的待测血清、阳性对照及阴性对照(即样品稀释液，NC)，100μl/孔，贴上板贴，置于37℃培养箱中，温育30分钟。其中，阳性对照和阴性对照各设置复孔。

2.9.3洗板：将20倍的浓缩洗液用纯化水稀释20倍后得到洗涤液，备用。弃去板中反应液，向每孔中加入300μl洗涤液，轻轻震荡10-30秒，弃去板中液体。再次重复4次，最后在吸水纸上轻轻拍干。

2.9.4加酶标抗体：依次向每孔中加入酶标抗体工作液，100μl/孔，贴上板贴，置于37℃培养箱中，温育30分钟。

2.9.5洗板：重复步骤2.9.3。

2.9.6加底物显色：依次向每孔中加入底物A和B各50μl/孔，贴上板贴，置于37℃培养箱中，温育15分钟。

2.9.7终止反应：加入终止液50μL/孔，用酶标仪测量OD450。

2.9.8结果分析：

1)待测样品S/P值计算：

2)结果判定：S/P值≥0.3，为小反刍兽疫病毒抗体阳性；S/P值＜0.3，为小反刍兽疫病毒抗体阴性。

2.10应用11种重组蛋白制成小反刍兽疫病毒抗体ELISA检测试剂盒检测不同的羊血清样品

2.10.1应用实施例1制备的11种重组蛋白按照本实施例的制备方法(上述步骤2.1至2.8)分别制成小反刍兽疫病毒抗体ELISA检测试剂盒(用重组蛋白名称区分各试剂盒)，并利用上述步骤2.9的方法使用该ELISA检测试剂盒检测不同的羊血清样品(待测样品)。

2.10.2待测样品：待测样品一共有3种，均由天康制药(苏州)有限公司协助采集和收集。

1)阴性羊血清样品：健康阴性羊血清，5份，1ml/份，-20℃保存备用。

2)小反刍兽疫病毒野毒感染羊血清样品：中和试验检测为阳性，5份，1ml/份，-20℃保存备用。

3)小反刍兽疫活疫苗(购自天康生物制药有限公司)免后羊血清样品：疫苗免后28天血清，5份，1ml/份，-20℃保存备用。

2.10.3按照本实施例步骤2.9中检测步骤检测。

2.10.4结果计算

采用分别由小反刍兽疫病毒的11种重组蛋白制备的小反刍兽疫病毒抗体ELISA检测试剂盒和市售的通用小反刍兽疫病毒ELISA抗体试剂盒(以小反刍兽疫病毒N蛋白作为包被抗原，该试剂盒的判定标准为：S/P值≥0.5，判定小反刍兽疫病毒抗体阳性；S/P值＜0.5，判定小反刍兽疫病毒抗体阴性)，同时检测2.10.2中的15份羊血清样品，下表1-4仅示例性示出了基于PPRV1、PPRV2、PPRV7-PPRV10和N-H的小反刍兽疫病毒抗体ELISA检测试剂盒和市售的通用小反刍兽疫病毒ELISA抗体试剂盒的检测结果，另外基于PPRV3-PPRV6的小反刍兽疫病毒抗体ELISA检测试剂盒的检测结果与基于PPRV1-PPRV2和PPRV7的小反刍兽疫病毒抗体ELISA检测试剂盒检测结果(判定结果)一致，因此未一一赘述。

表1：由PPRV1和PPRV2蛋白制备的ELISA检测试剂盒检测羊血清样品的结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表2：由PPRV7和PPRV8蛋白制备的ELISA检测试剂盒检测羊血清样品的结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表3：由PPRV9和PPRV10蛋白制备的ELISA检测试剂盒检测羊血清样品的结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表4：由H-N蛋白制备的ELISA检测试剂盒和商业试剂盒检测羊血清样品的结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

2.10.5结果分析

1)针对健康阴性羊血清样品的检测：理论上健康阴性羊血清样品中应不含有小反刍兽疫病毒抗体，因此使用上述11种重组蛋白制成的检测试剂盒和市售试剂盒的检测结果也应均为阴性，实际检测结果与理论一致，说明这12种ELISA检测试剂盒在检测阴性样品均具有较高的准确率。

2)针对PPRV野毒感染的羊血清样品的检测：理论上PPRV野毒感染的羊血清样品中应为小反刍兽疫病毒抗体阳性，因此使用上述11种重组蛋白制成的检测试剂盒和市售试剂盒的检测结果也应均为阳性，但只有基于PPRV1-PPRV7和PPRV10蛋白的试剂盒全部检出为阳性(阳性检出率100％)，而基于PPRV8-PPRV9和N-H蛋白的试剂盒均仅检出4份阳性(阳性检出率80％)，市售试剂盒仅检出3份阳性(阳性检出率60％)。

3)针对PPRV疫苗免疫后羊血清样品的检测：理论上PPRV疫苗免疫后羊血清样品应为小反刍兽疫病毒抗体阳性，因此使用上述11种重组蛋白制成的检测试剂盒和市售试剂盒的检测结果应均为小反刍兽疫病毒抗体阳性，但只有基于PPRV1-PPRV7蛋白的试剂盒全部检出为阳性(阳性检出率100％)，而基于PPRV8-PPRV10和N-H蛋白的试剂盒均仅检出4份阳性(阳性检出率80％)，市售试剂盒仅检出3份阳性(阳性检出率60％)。

综上所述，可见基于PPRV8-PPRV10和N-H蛋白的ELISA试剂盒以及市售通用ELISA试剂盒对阳性羊血清样品检测时均有不同程度的漏检，而基于PPRV1-PPRV7蛋白的ELISA试剂盒均能检出不同来源的羊血清样品中的小反刍兽疫病毒抗体(阳性检出率均为100％)，因此可以明显提高血清样品中的小反刍兽疫病毒抗体的检出率，进而更加适合用于检测血清样品中的PPRV抗体水平，以及对PPRV血清学进行调查。

融合蛋白N-H包含所有的H蛋白和N蛋白的表位，然而基于该融合蛋白N-H的ELISA试剂盒对不同来源的羊血清样品中的小反刍兽疫病毒抗体仍有漏检，推测可能是由于融合蛋白N-H在与微孔板进行疏水性结合时，会导致融合蛋白N-H中一些抗原表位形成疏水性构象或者造成一些抗原表位被包埋等，使得这些抗原表位不能与样品中的抗体有效结合，进而导致漏检。融合蛋白PPRV8包括H蛋白的2个抗原表位(1个为疏水区远端抗原表位、1个为疏水区近端抗原表位)和N蛋白的3个抗原表位(1个为疏水区远端抗原表位，2个为其他抗原表位)，基于该融合蛋白PPRV8的ELISA试剂盒对不同来源的羊血清样品中的小反刍兽疫病毒抗体也存在漏检，推测可能是与选择的抗原表位的位置有关(有疏水区近端抗原表位和其他位置的抗原表位存在)，使得该融合蛋白PPRV8不能有效结合样品中的PPRV抗体，进而产生漏检。融合蛋白PPRV9-10虽然均只含有H蛋白的疏水区远端抗原表位和N蛋白的疏水区远端抗原表位(其中PPRV9的结构为H1-N2-N3-N4，PPRV10的结构为H2-N4-N2-N3)，然而基于该融合蛋白PPRV9-10的ELISA试剂盒对不同来源的羊血清样品中的小反刍兽疫病毒抗体也存在漏检，推测可能是与疏水区远端抗原表位的数量有关，使得该融合蛋白PPRV9-10的抗原抗体结合位点不足，进而造成漏检。

相较而言，基于融合蛋白PPRV1-PPRV7的ELISA试剂盒对不同来源的小反刍兽疫病毒抗体的阳性检出率则可达100％，因此其能够明显提高小反刍兽疫病毒抗体的检出率，也说明融合蛋白PPRV1-PPRV7的独特设计效果显著。对融合蛋白PPRV1-PPRV7的结构进行分析，可见这些融合蛋白包含H蛋白的4个疏水区远端抗原表位(H1、H2、H3和H4)中的任意2个和N蛋白的4个疏水区远端抗原表位(N1、N2、N3和N4)中的任意3个，因此可以推测由小反刍兽疫病毒H蛋白的4个疏水区远端抗原表位(H1、H2、H3和H4)中的至少2个和N蛋白的4个疏水区远端抗原表位(N1、N2、N3和N4)中的至少3个按照任意顺序经串联融合而成的融合蛋白均能够明显提高小反刍兽疫病毒抗体的检出率。为了验证其他融合蛋白也能够明显提高小反刍兽疫病毒抗体的检出率，以下实施例3中利用结构为N3-N1-N2-H1-H4-H2(命名为PPRV11，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示)和N1-H2-N3-H4-H1-N2-N4-H3(命名为PPRV12，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示)的融合蛋白制备小反刍兽疫病毒抗体检测ELISA试剂盒为例进行说明。

实施例3：基于融合蛋白的抗体检测试剂盒检测羊血清中的小反刍兽疫病毒抗体的验证

该实施例中参照上述实施例1的1.2的方法表达和纯化获得了融合蛋白PPRV11和PPRV12，并按照实施例2的方法对2.10.2中的15份羊血清样品进行检测，检测结果如下表5所示，可见基于融合蛋白PPRV11-PPRV12的ELISA试剂盒对不同来源的小反刍兽疫病毒抗体的阳性检出率均可达100％，结合上述实施例2的结果，可证明由小反刍兽疫病毒H蛋白的4个疏水区远端抗原表位(H1、H2、H3和H4)中的至少2个和N蛋白的4个疏水区远端抗原表位(N1、N2、N3和N4)中的至少3个按照任意顺序经串联融合而成的融合蛋白均能够明显提高小反刍兽疫病毒抗体的检出率。

表5：由PPRV11和PPRV12蛋白制备的ELISA检测试剂盒检测羊血清样品的结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

实施例4：基于融合蛋白的小反刍兽疫病毒抗体检测的ELISA试剂盒

下面以实施例1制备的融合蛋白PPRV1为例来描述制备用于对小反刍兽疫病毒抗体进行检测的ELISA试剂盒，并提供该ELISA试剂盒的使用方法。基于其他融合蛋白(例如PPRV2-PPRV7，PPRV11-PPRV12)的小反刍兽疫病毒抗体检测ELISA试剂盒的制备均可以按照以下操作进行，不同之处仅在于使用不同的融合蛋白。

3.1抗原包被微孔板：将融合蛋白PPRV1用pH7.0-7.4的10mM PBS缓冲溶液稀释成1μg/mL，在酶标板的每孔加110μL，4℃下包被过夜；倾去包被液，拍干，然后在每孔中加入300μL 1％BSA(在pH7.0-7.4 10mM PBS缓冲溶液中)，放入4℃封闭过夜后，拍干，干燥，真空包装，1块/盒。

3.2酶标抗体的配制：小鼠抗羊IgG-HRP标记物购自北京博尔西科技有限公司，-20℃保存。用酶标记抗体稀释液按照一定比例稀释即为酶标记抗体工作液。酶标记抗体稀释液的配方为：Na₂HPO₄·12H₂O，2.9g；NaH₂PO₄·2H₂O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；酶稳定剂，5g；Tween-200.25mL；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。无菌分装10ml/瓶，1瓶/盒。

3.3样品稀释液的配制：用于待测样品的稀释，其配方为Na₂HPO₄·12H₂O，2.9g；NaH₂PO₄·2H₂O，0.296g；NaCl，8.5g；Proclin 300，0.6mL；BSA，10g；胎牛血清，150mL；硫酸庆大霉素，2支(8万单位/支)；双蒸水，定溶至1000mL；调整pH至7.6-7.8。过滤除菌，无菌分装30ml/瓶，1瓶/盒。

3.4洗涤液的配制：为20倍的浓缩洗液，用前稀释。其配方为：Na₂HPO₄·12H₂O 58g，NaH₂PO₄·2H₂O 5.92g，NaCl 170g，Tween-20 5.0mL，Proclin 300 0.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值至7.2-7.4，无菌分装30ml/瓶，1瓶/盒。

3.5底物A的配制：无水乙酸钠4.5g，冰醋酸1.2mL，过氧化脲0.8g，用双蒸水定溶至1000mL，无菌分装6ml/瓶，1瓶/盒(白色塑料瓶)。

3.6底物B的配制：柠檬酸1.62g，EDTA-2Na 0.372g，甘油100mL，四甲基联苯胺0.50g，用双蒸水定溶至1000mL，无菌分装6ml/瓶，1瓶/盒(棕色瓶)。

3.7终止液的配制：1000mL双蒸水中含有98％硫酸27.8mL，分装6ml/瓶，1瓶/盒。

3.8阳性对照(PC)的制备：同实施例2中步骤2.8。

3.9成品试剂盒的组装

取3.1-3.8各组份，每种1瓶或1支，装入试剂盒纸盒中，贴好标签，得到用于小反刍兽疫病毒抗体检测的ELISA试剂盒，置于2-8℃中保存。

3.10试剂盒的使用方法

3.10.1试剂盒回温：自冰箱2-8℃中取出成品试剂盒，置于室温平衡30分钟，备用。

3.10.2待测样品稀释：将待测羊血清、阳性对照分别用样品稀释液稀释60倍，待测备用。

3.10.3加入抗原包被微孔板中：取出合适数量的抗原包被微孔板，依次向每孔中加入稀释后的待测羊血清、阳性对照及阴性对照(即样品稀释液，NC)，100μl/孔，贴上板贴，置于37℃培养箱中，温育30分钟。其中，阳性对照和阴性对照各设置复孔。

3.10.4洗板：将20倍的浓缩洗液用纯化水稀释20倍后得到洗涤液，备用。弃去板中反应液，向每孔中加入300μl洗涤液，轻轻震荡10-30秒，弃去板中液体。再次重复4次，最后在吸水纸上轻轻拍干。

3.10.5加酶标抗体：依次向每孔中加入酶标抗体工作液，100μl/孔，贴上板贴，置于37℃培养箱中，温育30分钟。

3.10.6洗板：重复步骤3.10.4。

3.10.7加底物显色：依次向每孔中加入底物A和B各50μl/孔，贴上板贴，置于37℃培养箱中，温育15分钟。

3.10.8终止反应：加入终止液50μL/孔，用酶标仪测量OD450。

3.10.9结果分析：

1)待测样品S/P值计算：

实施例5：本试剂盒与市售商品化试剂盒的敏感性比较

对上述实施例2中表1中样品编号为7和10的样品分别使用样品稀释液按照1:100、1：200、1：400、1：800、1：1600比例稀释，然后按照上述实施例4的试剂盒和市售的通用小反刍兽疫病毒ELISA抗体试剂盒(同实施例2，判定标准为：S/P值≥0.5，判定小反刍兽疫病毒抗体阳性；S/P值＜0.5，判定小反刍兽疫病毒抗体阴性)进行检测，结果如下表6所示(表6中列出的本试剂盒为基于融合蛋白PPRV1的数据)。可见本试剂盒对上述2种样品可检测至1:800，而市售的通用试剂盒仅能检测至1:400，表明本试剂盒对小反刍兽疫病毒抗体的检测敏感性显著高于市售的通用试剂盒。

表6：本试剂盒与市售商品化试剂盒的敏感性比较

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应属于本发明公开的内容。

Claims

1.一种小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白，其由小反刍兽疫病毒H蛋白的4个疏水区远端抗原表位H1、H2、H3和H4中的至少2个，和小反刍兽疫病毒N蛋白的4个疏水区远端抗原表位N1、N2、N3和N4中的至少3个按照任意顺序经接头串联融合而成；其中：

2.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白，所述接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

3.根据权利要求1或2所述的小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白，其还携带有用于蛋白纯化的标签。

4.根据权利要求3所述的小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白，所述标签包括His标签。

5.根据权利要求1或2所述的小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10-16、22-23中任一个所示。

6.一种编码权利要求1-5中任一项所述的小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白的基因。

7.权利要求1-5中任一项所述的小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白在制备检测小反刍兽疫病毒抗体的试剂盒或试剂中的应用。

8.一种用于检测小反刍兽疫病毒抗体的ELISA试剂盒，其中使用权利要求1-5中任一项所述的小反刍兽疫病毒H-N的抗原表位融合蛋白作为包被抗原。

9.一种检测小反刍兽疫病毒抗体的非疾病诊断目的方法，其包括使用权利要求8所述的ELISA试剂盒对待测样品进行检测，并计算所述待测样品的S/P值，其中S/P值的计算公式为：

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述小反刍兽疫病毒抗体包括小反刍兽疫病毒疫苗免疫后产生的抗体。