CN101914601A - 一种高效生产2-o-葡萄糖基抗坏血酸的方法 - Google Patents

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陈坚
堵国成
李江华
刘龙
张子臣
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Abstract

本发明公开了一种高效生产2-O-葡萄糖基抗坏血酸的方法。该方法以L-抗坏血酸和β-环糊精为底物转化合成2-O-葡萄糖基抗坏血酸，合成条件为温度35℃-45℃，pH 4.5-6.5，β-环糊精浓度25-100g/L，抗坏血酸浓度25-100g/L，糖基转移酶用量50-200U/mL。本发明的方法操作简单，容易控制，转化条件要求宽泛，2-O-葡萄糖基抗坏血酸产量高，产量可达8.5g/L，为生物转化法大规模生产2-O-葡萄糖基抗坏血酸提供了可能。

Description

一种高效生产2-O-葡萄糖基抗坏血酸的方法
技术领域
本发明涉及一种生产2-O-葡萄糖基抗坏血酸的方法，尤其是采用生物法高效生产2-O-葡萄糖基抗坏血酸的方法。
背景技术
L-抗坏血酸(简称VC)在体内发挥着重要的生理作用，但其还原性强，极不稳定，这使得它在应用上受到了很大的限制。VC的衍生物则大大提高了它的稳定性，而不影响它的生理功能。本专利就其衍生物之一2-O-葡萄糖基抗坏血酸在糖基转移酶的作用下的生物合成。
2-O-葡萄糖基抗坏血酸是L-抗坏血酸的一种重要衍生物，有着比L-抗坏血酸更广泛的应用价值。1990年日本林原生物化学研究所与冈山大学药学系共同发现2-O-葡萄糖基抗坏血酸AA-2G，并已确定大量合成这种维生素C衍生物的方法。目前，能进行规模化生产的也只有Hayashibara有限公司。
当前，对2-O-葡萄糖基抗坏血酸的研究主要集中于其生理功能。对于产量的提高主要通过筛选能产糖基转移酶和优化发酵过程中的参数等来提高转化效率。曹新志(曹新志，刘芳，明红梅，武玉娟.2008.酶法合成葡萄糖基-L-抗坏血酸的产酶条件及转化条件优化，农产品加工.学刊，124：19-24.)提出了一种利用环糊精转移酶转化L-抗坏血酸和β-环糊精生成-葡萄糖基L-抗坏血酸的方法，优化条件后其产量仅为95.36mg/L。黄敏(黄敏，裘娟萍.2004.生物转化法生产2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸的研究进展，工业微生物，34：41-44)等通过对酶法生产葡萄糖基维生素C的产酶条件及转化条件的优化得到AA-2G产量为420mg/L。较低的产量影响了2-O-葡萄糖基抗坏血酸的大规模生产。
发明内容
本发明的所要解决的技术问题是提供一种高效生产2-O-葡萄糖基抗坏血酸的方法。本发明利用环糊精葡萄糖苷转移酶高效的转化合成2-O-葡萄糖基抗坏血酸的性质，优化生产工艺，显著提高了2-O-葡萄糖基抗坏血酸产量，取得了意想不到的效果。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
利用环糊精葡萄糖苷转移酶催化抗坏血酸与β-环糊精的混合溶液合成2-O-葡萄糖基抗坏血酸。
所述催化参数为：pH 4.5-6.5；温度为：35℃-45℃；振荡速率：100-250转/分钟；时间：12-48h。
所述抗坏血酸与β-环糊精的混合溶液为：抗坏血酸浓度25-100g/L；β-环糊精浓度25-100g/L。
所述环糊精葡萄糖苷转移酶用量为50-200U/mL。
所述环糊精葡萄糖苷转移酶来源于产环糊精葡萄糖苷转移酶菌株。
所述菌株为软芽孢杆菌(Peanibacillus macerans JFB05-01)，保藏编号为CCTCC NO：M208063。
所述菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
本发明提供的技术方案以廉价的β-环糊精为底物，降低了生产成本。利用环糊精葡萄糖苷转移酶，优化生产工艺，使2-O-葡萄糖基抗坏血酸产量提高了进10倍，达到8.5g/L，取得了意想不到的效果。
具体实施方式
实施例1Paenibacillus macerans环糊精葡萄糖苷转移酶的制备
软芽孢杆菌(Peanibacillus macerans JFB05-01)，保藏编号为CCTCC NO：M 208063，可在中国典型培养物保藏中心购买，为本实验室提交菌株。取一环斜面菌体接种至装有80mL种子培养基的500mI。三角瓶中培养，摇床转速为200r/min，37℃培养18h。将培养好的种子培养液按照10％(体积比)的接种量，接种至装有80mL发酵培养基的500mL三角瓶中，37℃发酵培养24h，HYG II型回转式恒温调速摇瓶柜的转速为200r/min。停止发酵后将发酵液经12000r/min离心20min，取上清即为粗酶。
种子培养基(g*L-1)组成为：可溶性淀粉40，蛋白胨25，玉米浆5，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.7，K2HPO4·3H2O 1，NaH2PO4·2H2O 2，NaNO32，pH值7.0。
发酵培养基(g*L-1)组成为：玉米淀粉20，蛋白胨5，玉米浆浸出汁5，硫酸铵8，K2HPO4·3H2O 1，NaH2PO4·12H2O 2，NaNO32，pH值7.0，121℃灭菌15min。
实施例2Bacillus licheniformis环糊精葡萄糖苷转移酶的制备
取一环斜面菌体接种至装有40mL种子培养基的250mL。三角瓶中培养，摇床转速为200r/min，38℃培养12h。将培养好的种子培养液按照10％(体积比)的接种量，接种至三角瓶(250mL)装产酶培养基40mL中，接种后于38℃恒温振荡培养96h后，4000r/min离心20min，上清液即为粗酶液。
种子培养基(g*L-1)组成为：可溶性淀粉10，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO4·7H2O0.2，K2HPO4·3H2O 1，NaH2PO4·2H2O 1，NaCO35，pH值7.0，121℃灭菌15min。
发酵培养基(g*L-1)组成为：可溶性淀粉10，蛋白胨5，酵母膏5，MgSO4·7H2O0.2，K2HPO4·3H2O 1，NaH2PO4·2H2O 2，Na2CO32，pH值7.0，121℃灭菌15min。
实施例3合成2-O-葡萄糖基抗坏血酸
将抗坏血酸与β-环糊精溶于100mM的醋酸缓冲中，制备其混合溶液，加入环糊精葡萄糖苷转移酶粗酶液，使抗坏血酸浓度为50g/L，β-环糊精浓度为50g/L，环糊精葡萄糖苷转移酶浓度为160U/mL。
调整pH为5.5，温度为37℃，避光避氧，100转/分钟振荡反应24h。反应的过程中取样，利用HPLC检测2-O-葡萄糖基抗坏血酸生成情况，当反应到达24h时，2-O-葡萄糖基产量达到7g/L。
2-O-葡萄糖基抗坏血酸测定方法(HPLC法)：
液相仪：Agilent 1200液相仪
色谱柱：Agilent SB-Aq
流速：0.5mL/min
检测器：DAD
柱温：25℃
检测波长：238nm
流动相：6.86g KH2PO4，5mL甲醇，溶于1000mL超纯水，用磷酸调pH至2.0。
实施例4合成2-O-葡萄糖基抗坏血酸
将抗坏血酸与β-环糊精溶于100mM的醋酸缓冲中，制备其混合溶液，加入环糊精葡萄糖苷转移酶粗酶液，使抗坏血酸浓度为50g/L，β-环糊精浓度为25g/L，环糊精葡萄糖苷转移酶浓度为100U/mL。
调整pH为4.5，温度为45℃，避光避氧，150转/分钟振荡反应24h。反应的过程中取样，利用HPLC检测2-O-葡萄糖基抗坏血酸生成情况，当反应到达24h时，2-O-葡萄糖基产量达到7.5g/L。
2-O-葡萄糖基抗坏血酸测定方法(HPLC法)同实施例3。
实施例合5成2-O-葡萄糖基抗坏血酸
将抗坏血酸与β-环糊精溶于100mM的醋酸缓冲中，制备其混合溶液，加入环糊精葡萄糖苷转移酶粗酶液，使抗坏血酸浓度为100g/L，β-环糊精浓度为100g/L，环糊精葡萄糖苷转移酶浓度为200U/mL。
调整pH为6.5，温度为35℃，避光避氧，250转/分钟振荡反应12h。反应的过程中取样，利用HPLC检测2-O-葡萄糖基抗坏血酸生成情况，当反应12h时，2-O-葡萄糖基产量达到8.5g/L。
2-O-葡萄糖基抗坏血酸测定方法(HPLC法)同实施例3。
实施例合6成2-O-葡萄糖基抗坏血酸
将抗坏血酸与β-环糊精溶于100mM的醋酸缓冲中，制备其混合溶液，加入环糊精葡萄糖苷转移酶粗酶液，使抗坏血酸浓度为100g/L，β-环糊精浓度为100g/L，环糊精葡萄糖苷转移酶浓度为50U/mL。
调整pH为5，温度为38℃，避光避氧，150转/分钟振荡反应48h。反应的过程中取样，利用HPLC检测2-O-葡萄糖基抗坏血酸生成情况，当反应到达48h时，2-O-葡萄糖基产量达到7g/L。
2-O-葡萄糖基抗坏血酸测定方法(HPLC法)同实施例3。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种高效生产2-O-葡萄糖基抗坏血酸的方法，其特征在于利用环糊精葡萄糖苷转移酶催化抗坏血酸与β-环糊精的混合溶液合成2-O-葡萄糖基抗坏血酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述环糊精葡萄糖苷转移酶来源于产环糊精葡萄糖苷转移酶菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述菌株为软芽孢杆菌(Peanibacillus maceransJFB05-01)，保藏编号为CCTCC NO：M 208063。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述环糊精葡萄糖苷转移酶用量为50-200U/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述催化参数为：pH 4.5-6.5；温度为：35℃-45℃；振荡速率：100-250转/分钟；时间：12-48h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述抗坏血酸与β-环糊精的混合溶液为：抗坏血酸25-100g/L；β-环糊精25-100g/L。
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